JPS5946596B2 - 不溶性酵素の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、１個または１個以上の第一級アミノ基を有す
る可溶性の酵素を、適当な単量体（例えば特願昭５０−
１２９、９７２号に記載されているような単量体）の共
重合により製造され１こ特定の反応性重合体担体に結合
させることによる不溶性酵素の製造方法に関するもので
ある。

不溶性の生物学的活性化合物特に酵素は、数多くの応用
分野においてますます広く応用されている。

種々のその便用方法が開発されており、これらは分析上
および製造上のいずれにおいてもアフイニテイクロマト
グラフイにおいて特に広く応用されている。近年、この
ような化合物に関して数多くの製造方法が開発されてき
た。

このような方法の主たるものは、圧到的に重合体型の適
当な担体の製造および活性化合物の可能な結合を導く変
性に関するものである。この目的を達成するには二つの
ルートがある。すなわち、適当な単量体から共重合体を
製造することにより、簡単な方法で生物学的に活性な化
合物と結合しうる基質をうるか、あるいは化学的変性に
よる活性化合物と結合しうるような適当な反応個所を有
する重合体を製造することである。共有結合した担体一
生物学的試料の生成を生じる数多くの方法がある。

固定した試料の良好な作用のための決定的な役割は、化
合物の活性を規定する乱されない個所により演じられる
。結合生成の全条件は、従つてこの事実にし１こがわな
ければならない。生物学的活性化合物例えば酵素は、た
いていの場合、遊離の第一級アミノ基のうちの一つによ
り化学的に固定される。このアミノ基と反応しうる担体
上の反応個所は、１ことえば、シアン化臭素、ホスゲン
、チオホスゲンなどをヒドロキシル基と反応させること
により生成されるが、この場合不安定な中間生成物を生
ずる。一方、重合体の芳香族第一級アミノ基をジアゾ化
することにより、ジアゾニウム塩を製造することが可能
であり、これは、適当な芳香族系を含有する活性化合物
との結合により共有結合も生じさせる。しかしながら、
生物学的活性の不溶性化合物の前記のような製造方法は
、重合体土の反応個所の生成を生じさせる反応のために
、危険な化合物を使用することが必要となる。

このようなグループは、シアン化臭素、ホスゲン、チオ
ホスゲンなどの反応を含んでいる。さらに、このように
して変性された担体は、熱的にも化学的にもやや不安定
であり、さらに反応する化合物の生物学的活性に危険で
ある反応剤の残余を除去するために特に注意深い洗浄を
早急に作業する必要がある。本発明の目的は、側鎖に活
性結合個所としてｐ−フエニレンジアミンを含有する特
定の重合体担体に、可溶性の酵素を結合させることによ
る不溶性酵素の製造方法を提供することにある。

この系は、つぎの式１によつて小される。（ただし、式
中、Ｒ１は重合体残基、Ｒ２は低級アルキル基であり、
また×＝１〜４である。

）上記芳香族系すなわちｐ−フエニレンジアミンの酸化
は、強力な共有結合を伴なつて酵素のアミノ基と反応し
うる反応性型を生じる。酸化は、酵素の存在下に、かつ
、適当なＰＨ値の条件下で水性媒体中で行なわれる。ア
ルカリ媒体中のフエリシアン化カリウムおよびＣｕ寸イ
オン、ま１こは換言すればレドツクスイオンのコンプレ
ツクス型およびアルカリ金属のヒ酸塩または同様なレド
ツクスポテンシヤルを有する化合物のような反応混合物
中に存在する酵素と抵触しない（活性に悪影響を及ぼさ
ない）種々の酸化剤が使用できる。アルカリ性媒体中の
Ｃｕ＋＋イオンまたは銅のコンプレツクスのようなレド
ツクス系に好適なイオンの存在下に酸化剤である酸素（
同様に空気中の酸素）で適当な媒体中で生物学的に耐え
うる条件下で行なうこともできる。

キノン−ハイドロキノンのような有機レドツクス系も反
応に使用できる。酸化反応の温度は、酵素の熱安定性に
より主として決定され、−５酵〜＋１０℃、好ましくは
００〜＋５℃の範囲で変えうる。上記のタイプの酵素は
、プロツク、プレート、チユーブなどの形で水溶性また
は架橋した共重合体のような種々の形の親水性共重合体
を用いて有利に製造できる。

種々の応用分野にこの酵素を使用するためには、球状粒
子の形状で多孔性を有する架橋共重合体が有利であるこ
とが認められた。このような材料は、高い比表面積を有
しているので、酵素の結合後は、非常に有効である。し
たがつて、これらは、種々の形のアフイニテイクロマト
グラフイ、分離および精製法などのような種々の応用方
法に使用される。本発明は、以下の実施例によりさらに
詳細に説明されるが、本発明は以下の実施例によつてな
んら限定されるものではない。

実施例 １ 重合体担体は、グリコールモノメタクリレート、グリコ
ールジメタクリレートおよびＮ−エチル−Ｎ−（２−メ
タクロイルエ手ル）−Ｎ′−アセチル−ｐ−フエニレン
ジアミンよりなる単量体の混合物から不均一懸濁共重合
により製造したところ、最終生成物は、１４％の官能性
単量体を含有しており、かつ、比表面積６５．６イ／ｆ
！の多孔性を有していた。

酸加水分解後、この物質０６５ｇを、４０Ｗ９のトリプ
シンを含有する０．０５モルのボラツクス溶液１０１Ｔ
Ｌｅに懸濁させ１こ（ここで、ボラツクスとはジソジウ
ムテトラボレートＮａ２Ｂ４Ｏ７またはＮａ２Ｏ・２Ｂ
２０３に対する慣用語である）。０．０５モルのボラツ
クスに０．０１モルのフエリシアン化カリウムを溶解し
た溶液２ｄを、１時間にわたつてこの懸濁液に加えた。

酵素を結合したこのゲル状物質を、ついで、０．１Ｎの
アセテート緩衝溶液を含有するＰＨ４．７の１Ｎ塩化ナ
トリウム溶液で、かつ、最後には０．０１Ｎのアセテー
ト緩衝溶液で常法により洗浄した。結合した酵素の活性
を測定し（６．７ミリ単位／η）、結合力を、６Ｎのグ
アニジンハイドロクロライドの溶液で酵素を洗浄し１こ
のち、結合したアミノ酸を測定することによりチエツク
し１こ。実施例 ２ 実施例１で使用した重合体担体０．５９を、グルコース
オキシダーゼの結合用に用いた。

０．０５モルのボラツクス１０ｍ１中の４０〜のグルコ
ースオキシダーゼを、この重合体と混合し、０．０５モ
ルのボラツクスに２ａのフエリシアン化物を溶解した溶
液で１時間にわ１こつて酸化した。

淵過によつて反応媒体を除去したのち、重合体物質をＮ
ａＨＣＯ３中の１Ｎ０ＮａＣ２溶液および蒸留水で洗浄
し、かつ、０．１モルのリン酸塩緩衝溶液中に移し１こ
。

このようにして測定した結合グルコースオキシダーゼの
活性は１８．７ミリ単位／ηであつたＯ実施例 ３ 結合し１こキモトリプシンの製造に使用し１こ重合体担
体は、チエコスロヴアキア特許第ＰＶ７４ｌ３−７４号
の実施例５（特願昭５０−１２９，９７２号明細書の実
施例８）の方法により製造した。

すなわち、３１．９９のエチレングリコールジメタクリ
レート、２９．４９の工手レングリコールモノメタクリ
レート、２０．４９のＮ−工干ル一Ｎ−（２一メタクリ
ロイルエチル）−Ｎ−アセチルーパラフエニレンジアミ
ンおよび０．８２ｙ（単量体当り１重量％）のアゾビス
イソプチロニトリルよりなる重合反応用混合物を９８．
５ｇのシクロヘキサノールおよび９．７ｙのドデカノー
ルとともに反応器中６００ｆ！の水と６９のポリビニル
ピロリドンとの反応媒体中で、まず２時間は５０℃の温
度で、ついで、８時間６５℃で重合反応せしめ１こ。多
孔質のゲル粒子がえられ、その比表面積は１５０イ／ｙ
を示した。蒸留水およびメタノールで洗浄したのち、希
塩酸中で酸加水分解により処理した。洗浄後、重合体（
０．５ｙ）をアンモニウム緩衝液（ＰＨ＝１０）に溶解
した５０〜のキモトリプシンとＣｕ＋＋の存在下に混合
し７Ｃ０この混合物を過剰の空気の下で攪拌した。最初
のＰＨは、炭酸ナトリウムを添加して一定に保つた。反
応２時間後、反応混合物を沢過し、結合したキモトリプ
シンの活性を水洗して測定した（６．２４単位Ａ２８Ｏ
／Ｍｉｎη１０４）。実施例 ４ 実施例１で製造し１こ重合体担体を、トリプシンの結合
に使用した。

０．５９の重合体を、５ｍ１の蒸留水に５ηのトリプシ
ンを溶解し１こ溶液と混合し１こ。

２２ηのハイドロキノンを含有する５７ＴＬｅのアンモ
ニウム緩衝液を加え、攪拌を、過剰の空気の下に５℃で
３時間続けた。

この重合体物質を洗浄し、結合し１こトリプシンの活性
を測定した（５．０６ミリ単位／η）。実施例 ５ ペプシンを、実施例３で製造した重合体上に、１モルの
酢酸中で酸化剤としてのキノンによる酸化反応経由で結
合させた。

実施例 ６ キモトリプシノーゲンを、実施例３で製造した重合体上
に０．１Ｎ０ＮａＨＣ０３中で実施例１の方法によりフ
エリシアン化物により酸化して結合させ１こ。

生成物の性質は、紫外線域でスペクトロフルオリメトリ
一により調べた。結合し１こキモトリプシノーゲソの量
は、重合体にたいし１００ｍｇ／９であつ１こ。実施例
７ トリプシンを、実施例１で調製した重合体担体土に、０
．０５モルのボラツクス中のヒ酸カリウムで酸化して結
合させ１こ。

前記方法で洗浄して結合したトリプシンの酵素活性を測
定した（６．２ミリ単位／Ｔｆ９）。実施例 ８ キモトリプシノーゲンを、実施例３で調製した重合体上
に、第二銅アンモニウムコンプレツクスの存在下にＰＨ
ｌｌで、過剰の空気による酸化反応により結合させた。

この混合物を０〜５℃で３時間攪拌し１こ。重合体物質
を洗浄して、結合した化合物の量を測定した。結合した
キモトリプシノ−ゲンの量は、重合体当り１２０〜／９
であつた。実施例 ９シクロヘキサノール２ｆ！、ラウ
リルアルコール１ｆ！、エチレングリコールモノメタク
リレート２９、Ｎ−工干ル一Ｎ−（２−メタクロールエ
チル）一Ｎ−アセチル−ｐ−フエニレンジアミン０．５
９、エチレングリコールジメタクリレート０．５ｆ！お
よびアゾビスイソブチロニトリル０．０１５９よりなる
重合混合物を、平行な板の間で５５℃で６時間重合して
厚さ１ｍＴＩＬの多孔性層をえた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式 I ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ）（ただし、
   式中、Ｒ＿１は重合体残基、Ｒ＿２は低級アルキル基で
   あり、また、×は１〜４である。 ）を有する重合体を、混合物中に存在する酵素の活性に
   悪影響を与えない酸化剤を使用するかあるいはレドック
   ス系用イオンの存在下に酸素を使用することにより、第
   一級アミノ基を含有する可溶性の酵素の存在下に酸化し
   て該可溶性酵素のアミノ基を結合させることを特徴とす
   る側鎖にｐ−フェニレンジアミン骨格を有する担体上の
   不溶性酵素の製造方法。２ 上記酸化剤は、フェリシア
   ン化カリウム、アルカリ性媒体中のＣｕ＾＋＾＋イオン
   およびアルカリ金属のヒ酸塩よりなる群から選ばれたも
   のである特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３ 上記レドックス系用イオンは、アルカリ性媒体中の
   Ｃｕ＾＋＾＋イオンまたは銅のコンプレックスである特
   許請求の範囲第１項に記載の方法。