JPS6049480B2 - ベタイン型ポリマ−による酵素または菌体の固定化方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はベタイン型の架橋性モノマーの架橋重合体を担
体とした酵素または菌体の固定化方法に関するものてあ
る。

酵素は繊維工業、食品加エ工業、医薬品製造工業などの
広い分野において、触媒として利用されている極めて作
用特異性の高い物質である。

しかしながら酵素を利用する反応系においてノは、１
酵素自体が熱、強酸、強アルカリ、有機溶媒などに不安
定で、酵素反応を行うのに適した条件下ても比較的速く
失活し、反応時間の経過とともに反応速度が低下するｉ
２酵素反応においては水に酵素を溶解させた状態で基質
に作用させるバッチ方式が採用されているので、目的と
する反応終了後に、酵素を変性除去せしめ、生成物の取
り出しを行うものてあるので、酵素が使い捨てにされる
ために不経済である３工業的に酵素反応を行う場合の粗
酵素液の使用においては、かかる触媒中に酵素以外の蛋
白質、着色物質等の夾雑物が存在するのでこれを除去す
る操作が必要となり、反応生成物の分離精製が複雑とな
り、収率の低下の原因となる等の欠点を伴うものである
。

そこで、近時上述の様な欠点を除去する目的て、酵素活
性を有する安定な水不溶性のタイプに変え、これを一般
の化学反応に用いる固体触媒と同様に扱い得るようにし
た所謂固定化酵素にする方法が開発されており、その固
定化方法として（ａ）水不溶性の担体に酵素を結合せし
める担体結合法（ｂ）酵素を２官能試薬と反応させて架
橋させる架橋法（ｃ）酵素をゲルの格子の中に包み込む
か半透膜性のポリマーて被覆する包括法等が提案されて
いる。

上記各方法のうち、担体結合法は不溶性の固体表面に酵
素を化学結合、イオン結合あるいは物理的吸着によつて
担持せしめて固定化するものであるが、酵素活性はその
分子構造の変化に鋭敏であつて化学的に他の分子に結合
させる場合著しく失活の確率が増す。

イオン結合あるいは物理的吸着の場合は操作が容易ては
あるもののイオン強度やＰＨの変化等によつて酵素が担
体から脱落しやすく、酵素の固定化という本来の目的が
十分に達成されていない。また架橋法は酵素分子同士を
酵素分子中にある官能基を利用して二官能試薬によつて
、架橋、固定化する方法てあり、化学反応を伴うために
酵素の活性を低下させるだけでなく複雑な工程と高価な
試薬を必要とし、しばしば激しい反応条件をも必要とす
る等の欠点があり、さらに包括法はポリマーのゲルの格
子の中に酵素を取り込むかあるいはナイロンやポリウレ
ア等のポリマーの皮膜でマイクロカプセル化するもので
あるが、現在提案されているポリアクリルアミドのゲル
の中に酵素を取り込む方法は、酵素自体がゲルを作るポ
リマーと化学的に結合していないので、ゲルの格子が大
きすぎると酵素が流出する恐れがあり、また格子が小さ
すぎると酵素反応の速度が遅くなり、格子の大きさの調
節が厄介である等の欠点を有するものである。本発明は
特許請求の範囲に記載した構成とすることにより、酵素
または菌体（以下酵素等と表示する）を閉じ込めるゲル
を、酵素等と極めて親和性の大きなポリマーで構成せし
めるもので、上記のような欠点を有することのない、即
ち酵素等の活性を低下させることなく長期にわつて安定
した効力を発揮しうる固定化酵素等の製造を可能にした
ものである。

即ち、本発明者は、酵素の特異性を利用した酵素反応は
、一般に水系を利用して行われるものであることから、
酵素等を固定化する場合のキャリヤーとして、即ち酵素
等を閉じ込めるゲルとしては水不溶性であることが要求
されるが、酵素が有する活性の発現のためには担体たる
ポリマーが親水性てあることの方が望ましく、しかも酵
素等が存在する雰囲気を酵素等自体と極めて親和性に富
むものにすることにより、酵素等の触媒作用が安定した
状態で長期に亘つて発現されることを見い出し、本発明
を完成するに至つた。

本発明は、 一般式 （式中Ｒｌ，Ｒ２，Ｒ３はそれぞれ水素またはメチル基
を、Ｘは−ＳＯ３または−ＣＯＯを、ｎは１乃至２０の
範囲内の整数を表わす）で表示されるベタイン型の架橋
性モノマーを重合して得られるベタイン型ポリマー、あ
るいは前記一般式（１）で表示されるベタイン型の架橋
性モノマーを一般式 （式中Ｒ４，Ｒ５はそれぞれ水素またはメチル基を、Ｒ
６は炭素数１乃至２０のアルキル基またはアラルキル基
を、Ｘは−ＳＯ３または−ＣＯＯを、ｍは１乃至２０の
範囲内の整数を表わす）で表示されるベタイン型の非架
橋性のモノマーと共重合させて得られるベタイン型ポリ
マーによるゲルの格子の中に酵素等を閉じ込めることに
より酵素を固定させるものてあるので、担体として利用
されるポリマーには、ベタイン型の架橋性モノマーが有
するトリアリル型の３官能性による架橋及びゲル化によ
る水不溶性とともに、同じく架橋性モノマー及び一般式
〔■〕の共重合体の場合は該一般式〔■〕のモノマーが
有する−ＳＯ３−または−ＣＯＯ−による親水性が付与
されているので、酵素等を固定化する場合の担体たるポ
リマーに必要な水不溶性でしかも親水性という両者の性
質を兼有するものてある。

さらに、本発明においては、担体として生成するポリマ
ーはベタイン型を保持しているので、これと両性電解質
てある酵素等との親和性が極めて大きく、酵素等は周囲
の担体と非常になじみ易い状態に維持されることとなり
、酵素に安定した好ましい環境を与えるものである。

このことは、酵素による触媒作用は、酵素の活性中心（
結合部位）て行われるが、酵素が電場など周囲の環境に
影響されて活性を低下させやすいという性質を有する。
しかも、本発明においては担体として使用されるポリマ
ーがベタイン型であるので、ポリマー自体の有する正、
負の電荷により酵素との親和性を発現する一方て、ポリ
マー自体は全体として中性てあるのて酵素に対しては悪
影響を及ぼすことがないからである。本発明は上記の通
りの構成からなるもので、一般式〔１〕で表示されるベ
タイン型の架橋ｌモノマーを重合させることにより、担
体たるポリマーに水不溶性かつ親水性を発現せしめ、し
かも酵素と親和性の強い環境を酵素に与えるものてある
が、特許請求の範囲第２番目に記載した構成においては
、一般式〔１〕て表示されるベタイン型の架橋性モノマ
ーを、一般式〔旧で表示されるベタイン型の非架橋性モ
ノマーと共重合させて得られるポリマーを酵素固定の担
体とするものてあり、特に酵素が触媒として使用される
場合の酵素反応系の親水性および疎水性の程度を、一般
式〔旧で表示されるベタイン型の非架橋性モノマーの種
類と量によつて加減し得るので、用途を考慮した触媒を
得るための酵素の固定方法としての特徴を有するもので
ある。

この共重合体による酵素の固定においては、一般式〔１
〕で表示されるモノマーにより担体たるポリマーに十分
な水不溶性と親水性とを兼備させるものであるから、一
般式〔１〕て表示されるモノマーは少なくとも１モル％
以上が必要であるが、該モノマーの全てが架橋構造に関
与することはなく、一部はフリーのまま残ると考えられ
ることから５モル％以上を使用するのが好ましい。

本発明において使用される前記一般式〔１〕て表示され
るモノマーの例としては、スルホメチルトリアリルアン
モニウム、スルホメチルトリメタアリルアンモニウム、
カルボメチルトリメタアリルアンモニウム、スルホエチ
ルトリアリルアンモニウム、スルホエチルトリメタアリ
ルアンモニウム、カルボエチルトリアリルアンモニウム
、カルボエチルトリメタアリルアンモニウム、スルホプ
ロピルトリアリルアンモニウム、スルホプロピルトリメ
タアリルアンモニウム、カルボプロピルトリアリルアン
モニウム、カルボプロピルメタアリルアンモニウム、及
びスルホプチルトリアリルアンモニウム、スルホヘキシ
ルトリアリルアンモニウム、スルホオクチルトリアリル
アンモニウム、スルホドデシルトリアリルアンモニウム
、スルホヘキサデシルトリアリルアンモニウム、スルホ
オクタデシルトリアリルアンモニウム並びにこれらの化
合物のスルホベタイン型化合物に対応するカルボベタイ
ン型化合物、アリル型化合物に対応するメタアリル型化
合物等の化合物が、また前記一般式〔旧で表示されるモ
ノマーの例としては、スルホメチル●メチル◆ジアリル
アンモニウム、スルホメチル・メチル◆ジメタアリルア
ンモニウム、カルボメチル・メチル●ジアリルアンモニ
ウム、カルボメチル・メチル・ジメタアリルアンモニウ
ム、スルホプロピル●エチル●ジアリルアンモニウム、
スルホプロピル●エチル・ジメタアリルアンモニウム、
カルボプロピル●エチル●ジアリルアンモニウム、カル
ボプロピル●エチル●ジメタアリルアンモニウム、スル
ホプロピル●ブチル●ジアリルアンモニウム、スルホプ
ロピル・ブチル・ジメタアリルアンモニウム、カルボプ
ロピル●ブチル●ジアリルアンモニウム、カルボプロピ
ル●ブチル●ジメタアリルアンモニウム、スルホプロピ
ル●ヘキシル◆ジアリルアンモニウム、スルホプロピル
●ヘキシル●ジメタアリルアンモニウム、カルボプロピ
ル・ヘキシル●ジアリルアンモニウム、カルボプロピル
●ヘキシル●ジメタアリルアンモニウム、スルホアミル
●ヘキシル◆ジアリルアンモニウム、スルホアミル●ヘ
キシル●ジメタアリルアンモニウム、カルボアミル・ヘ
キシル・ジアリルアンモニウム、カルボアミル●ヘキシ
ル●ジメタアリルアンモニウム、及びスルホオクチル・
デシル・ジアリルアンモニウム、スルホドデ゛シル●オ
クタデシル◆ジアリルアンモニウム、スルホプロピル●
ベンジル●ジアリルアンモニウム、スルホプロピル●ヘ
キシルベンジル●ジアリルアンモニウム、スルホプロピ
ル●ドデシルベンジル●ジアリルアンモニウム、スルホ
プロピル●フェニルエチル◆ジアリルアンモニウム、ス
ルホプロピル●フェニルブチル●ジアリルアンモニウム
、スルホヘキシル●ベンジル◆ジアリルアンモニウム、
スルホデシル◆ベンジル◆ジアリルアンモニウム並びに
これらの化合物のスルホベタイン型化合物に対応するカ
ルボベタイン型化合物、アリル型化合物に対応するジメ
タアリル型化合物等の化合物が使用できる。

本発明は上記のようなモノマーを酵素を含有する水溶媒
中で（共）重合させるものであるが、この際の重合開始
剤としては、一般のラジカル重合開始剤が全て使用可能
てあり、例えは第３級ブチルパーオキサイド、クメンパ
ーオキサイドのような有機過酸化物、α、α″−アゾビ
スイソブチロニトリルのごとき脂肪族アゾ化合物、過硫
酸アンモニウム、過硫酸カリのごとき無機過酸化物、硝
酸アンモニウム、硝酸カリのごとき硝酸塩等のーー般の
ラジカル重合開始剤を使用することができ、また光重合
も可能てある。

さらに例えば過硫酸アンモニウムー亜硫酸ナトリウム系
、過硫酸アンモニウムー亜硫酸ナトリウム−ハイドロキ
ノン系、過硫酸アンモニウムー硫．酸鉄−アスコルビン
酸系のようなレドックス系開始剤を使用することもでき
る。

酸化性のラジカル重合開始剤を使用する際に開始剤の量
が多くなると、重合中に酵素が失活する場合があるから
使用量は適宜抑えなければならな・゛い。

例えばＡＰＳ−カタラーゼの場合には、開始剤がモノマ
ーに対して３〜４％以上になると失活するようである。
また、レドックス系開始剤の使用においては、ハイドロ
キノンの添加がある場合には重合収率が低下する傾向に
ある。

また低温レドックス系開始剤、例えば過硫酸アンモニウ
ムー硫酸鉄−アスコルビン酸系は低温で重合を行うこと
ができるので酵素活性に対する温度の影響を少なくする
ことが゛てきて好ましい。重合時間は使用される開始剤
の種類によつても異なるが、酸化性開始剤の場合には時
間が長くなると酵素が酸化され、その活性が低下するの
で長時間の重合は避けるべきである。

本発明の方法によつて殆んど全ての酵素を固定化し得る
が、その効果が特に顕著な酵素を例示するならば、カタ
ラーゼ、グルコースオキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシ
ダーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、アルギナー
ゼ、コリンエステラーゼ、β−グルコミダーゼ、β−グ
ルクロニダーゼ、インベルターゼ、リパーゼ、ペプシン
、パーオキシダーゼ、リボヌクレアーゼ、トリプシン、
ウレアーゼ、ウリカーゼ等によつて代表される。

次に本発明の酵素の固定化方法ならびに固定化された酵
素の活性について実施例に基いて説明する。

実施例１ スルホプロピルトリアリルアンモニウム（以下ＳＰＴＡ
Ａｍと略記する）の７０％水溶液（溶媒：ＰＨ６．８６
の標準緩衝液）に所定量の水に所定量のカタラーゼを溶
解させた水溶液及び重合開始剤を添加し、３０℃にて、
重合条件の異なる重合反応を行い、ゲル状物質を生成せ
しめ、ＳＰＴＡＡｍ重合体によるカタラーゼの固定を行
つた。

重合反応条件と得られたゲル状物質の湿重量（収量）と
を第１表に示す。

尚、得られたゲルは、予め乳鉢で潰し、ガラスフィルタ
ー中でＰＨ７の緩衝液てよく洗つてから冷蔵庫（５℃）
にて保存し、反応に供した。

幻 グルリ砥里重 前記実施例１に基いて得られた固定化カタラーゼの作用
を確認するために、実験番号Ｂ，Ｃ，Ｄによつて得られ
たそれぞれのゲル状物質からなる固定化カタラーゼ′Ｂ
ｌ，Ｃｌ，Ｄｌを２Ｈ２０２→２ＦＩ２０＋０２ の反応を促進させる触媒として作用させ、過酸化水素の
分解反応の程度を実験１により計測し、固定化カタラー
ゼの活性をみた。

実験１ ３０％の過酸化水素溶液１０ｍ１に、ＰＨ６．８６の標
準緩衝液５０ｍ１を加え、更に水を加えて２５０ｍ１に
調整した溶液から１００７７１１を採取し、前記固定化
カタラーゼたるそれぞれのゲル状物質１ｇを添加し、マ
グネチツクスターラーで攪拌しながら室温にて所定の時
間反応を行ない、得られた反応液２ｍ１をピペットアウ
トし、これをＮＯ．ｌの濾紙で濾過し、得られた濾液を
、５０％ヨウ化カリウム１ｍｔ１１２Ｎ一硫酸２ＴｒＬ
１１水２ｍ１の入つている三角フラスコに採取し、１０
％モリブデン酸アンモニウム２滴を加えて５分間放置後
、１／１０Ｎ−チオ硫酸ナトリウムで滴定し、過酸化水
素の濃度を測定した。

反応時間の経過と反応液中の過酸化水素の濃度との関係
を固定化カタラーゼ司について第２表に、また固定化カ
タラーゼＢｌ，ＣｌおよびＤ１を触媒として利用したと
きの過酸化水素の濃度の変化を無触媒下ての濃度の変化
と比較して第１図に掲示する。

固定化カタラーゼの添加量を変えて、該カタラーゼの活
性を次の実験２に基いて測定した。

実験２実験１と同様に３０％の過酸化水素溶液１０ｍ１
に、ＰＨ６．８６の標準緩衝液５０ｍ１を加え、更に水
を加えて２５０ｍ１に調整した溶液から１００ｍ１を採
取し、前記実施例１によつて得られた固定化カタラーゼ
Ｃ１たるゲル状物質をそれぞれ１ｇ，０．５ｇ，０．２
５ｇ，０．１ｇ添加し、以後実験１と同様の方法で反応
時間の経過に伴う過酸化水素の濃度を求めた。

反応溶液中の過酸化水素の濃度を第２図に掲示する。

本発明方法によつて得られる固定化カタラーゼの繰り返
し使用による活性の変化を次の実験３に基いて測定した
。

実験３ 実験１と同様に３０％の過酸化水素溶液１０ｍ１にＰＨ
６．８６の標準緩衝液５０ｍ１を加え、更に水を加えて
２５０ｍ１に調整した溶液から１００ｍ１を採取し、前
記実施例１によつて得られた固定化カタラーゼＣ１たる
ゲル状物質１ｇを添加し、マグネチツクスターラーで攪
拌しながら室温にて３紛間反応を行ない、この間の反応
時間の経過に伴う過酸化水素の濃度の変化を実験１と同
様の方法て求めた。

反応終了後、反応に用いたゲルをガラスフィルターを用
いて回収しＰＨ７の緩衝液て洗つてから上と同様の方法
て活性を測定した。第３図はこのようにして測定した固
定化カタラーゼの１回、５回、１０回目の反応における
活性を示す。図より１０回繰返し使用しても活性はほと
んど低下していな”いことが確認された。本発明方法に
よつて得られる固定化カタラーゼの保存性を、次の実験
４に基いて測定することにより観察した。

実験４前記実施例１によつて得られた固定化カタラーゼ
Ｂ１たるゲル状物質を５℃の冷蔵庫に湿潤状態でそれぞ
れ２日、６日、９日および２２日間保存したものを、実
験１と同様に３０％の過酸化水素溶液１０ｍ１に、ＰＨ
６．８６の標準緩衝液５０ｍ１を加え、更に水を加えて
２５０ｍ１に調整した溶液から採取した１００ｍｔの溶
液に１ｇ宛添加し、以後実験１と同様の方法により反応
時間の経過に伴う過酸化水素の濃度の変化を求めた結果
を第４図に掲示する。

実施例２ ＳＰＴＡＡＴＴ１とスルホプロピルメチルジアリルアン
モニウム（以一μＳＰＭＤＡＡｍと略記する）とのモル
比１：１泪及び１：３．３３の混合モノマーのモノマー
濃度７１％水溶液（溶媒：ＰＨ６．８６の標準緩衝液）
にモノマー１ｇ当り１４．２４ｍ９のカタラーゼ及びモ
ノマーに対して０．７２％のＡＰＳを添加し、３０℃に
おいて８．５〜９時間共重合を行つてゲル状物質を生成
せしめ、ＳＰＴＡＡｍ−ＳＰＭＤＡＡｍｌ共重合体ゲル
によるカタラーゼの固定を行つた。

得られた固定化カタラーゼを用いて、固定化カタラーゼ
添加量０．５ｇ／１００ｍＬ（反応液）、過酸化水素濃
度０．４２５モル／ｅ及び反応温度３０′Ｃにおいて＊
８過酸化水素の分解反応を実施例１と同様に行つた結果
、過酸化水素の分解反応については上記両共重合体ゲル
による固定化カタラーゼはＳＰＴＡＡｒｒｌ重合体ゲル
による固定化カタラーゼと同等の分解促進効果を示した
。

実施例３ ＳＰＴＡＡｎ１とスルホプロピルプロピルジアリルアン
モニウムの１：１モル比の混合モノマーの７１％水溶液
（ＰＨ６．８６の標準緩衝液）にカタラーゼ１４．２９
ｍｇ／ｇモノマー）及びＡＰＳ（モノマーに対し０．７
２％）を添加し、実施例２と同様にカタラーゼの固定を
行つた。

得られた固定化カタラーゼを用いて実施例２と同じ条件
で過酸化水素の分解反応を行つた結果、ＳＰＴＡＡｍ重
合体ゲルによる固定化カタラーゼと同等の分解促進効果
が認められた。

実施例４ ＳＰＴＡＡｍ及びＳＰＴＡＡｍ−ＳＰＭＤＡＡｍ混合モ
ノマーの水溶液にグルコースオキシダーゼを添加し、Ａ
ＰＳを開始剤として３０゜Ｃにおいて重合を行つてグル
コースオキシダーゼの固定化を行つた。

重合条件は下記第３表の通りである。得られた固定化グ
ルコースオキシダーゼを用いてβ−Ｄ−（＋）グルコー
スの酸化反応を行つた。

すなわち、β−Ｄ（＋）グルコースをＰＨ６．８６の標
準緩衝液に濃度０．０５モル／ｆで溶解し、これに酸素
を吹き込んでから固定化グルコースオキシターゼ（Ｇ−
２及びＧ−３）を１ｇ／１００ｍ１の割合で添加し、２
５℃において反応を行つた。反応量は所定反応時毎に反
応液を濾過し、生成した過酸化水素をヨード滴定によつ
て測定することによつて求めた。結果を第５図に示す。
＊実施例５ ＳＰＴＡＡｒ］１をＰＨ６．８６の標準緩衝液に溶解し
（濃度７０．４％）、これにＤ−アミノ酸オキシダーゼ
１４．２９ｍ９（モノマー１ｇ当り）及びＡＰＳＯ．７
８％（対モノマー）を加え、３０℃において７時間の重
合を行い、ゲル化させた。

得られた固定化Ｄ−アミノ酸オキシダーゼは次のＤ−ア
ミノ酸の酸化反応に対して十分な活性を保持しているこ
とが確認されている。

【図面の簡単な説明】

第１〜第５図は本発明の方法によつて得られた固定化酵
素の活性度を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 酵素または菌体を含有する水溶媒中にて、一般式▲
   数式、化学式、表等があります▼ ・・・・・・（ I ） （式中Ｒ＿１，Ｒ＿２，Ｒ＿３は水素またはメチル基を
   、Ｘは−ＳＯ＿３または−ＣＯＯを、ｎは１乃至２０の
   範囲内の整数を表わす）で表示されるベタイン型の架橋
   性モノマーをラジカル重合することを特徴とするベタイ
   ン型ポリマーによる酵素または菌体の固定化方法。 ２ 酵素または菌体を含有する水溶媒中にて、一般式▲
   数式、化学式、表等があります▼・・・・・・（ I ）
   （式中Ｒ＿１，Ｒ＿２，Ｒ＿３は水素またはメチル基を
   、Ｘは−ＳＯ＿３または−ＣＯＯを、ｎは１乃至２０の
   範囲内の整数を表わす）で表示されるベタイン型の架橋
   性モノマーと、一般式▲数式、化学式、表等があります
   ▼・・・・・・（II）（式中Ｒ＿４，Ｒ＿５は水素また
   はメチル基を、Ｒ＿６は炭素数１乃至２０のアルキル基
   またはアラルキル基を、Ｘは−ＳＯ＿３または−ＣＯＯ
   を、ｍは１乃至２０の範囲内の整数を表わす）で表示さ
   れるベタイン型の非架橋性モノマーとをラジカル共重合
   させることを特徴とするベタイン型ポリマーによる酵素
   または菌体の固定化方法。