JPS60100598A - インタ−フエロン活性を有するポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 インターフェロンは、ウィルス感染、免疫刺激および多
様の誘起剤に反応して細胞が合成する蛋白質であって、
現在、主な６つの群、つまり、アルファーまたは白血球
インターフェロン（ＩＦＮ−α）、ヘーターマたは線維
芽インターフェロン（ＩＰ’Ｎ−β）およびがンマーま
たは免疫インターフェロン（ＩＦＮ−γ）に分けられて
いる。インターフェロンは抗ウィルスおよび抗増殖活性
を有し、標的細胞におけるウィルス抵抗性および免疫調
節活性を付与する強力な能力を有する（　Ｊ−Ｌ、　Ｔ
ｏｙ、　Ｃ１１ｎ。

ｅｘｐ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、５４．　１　１　３　Ｃ１９
８３１））、それらの生物学的性状は、インターフェロ
ンをウィルス感染および悪性腫瘍の治療のための治療剤
としての使用へと導びいた。

インターフェロンは、全血のバツフイコート由来白血球
、連続懸濁培養での淋巴芽細胞または線維芽細胞のよう
天然材料より、誘起剤による刺激で得られる。刺激して
ＩＦＮ−αを産生させうる細胞にはＢおよびＴ細胞があ
る。これらの月料より得られるインターフェロンに精製
されて均質となつオペレーター配列の制御のもとに、イ
ンターフェロン遺伝子を含有する発現ベクターで形質転
換された微生物より発現さすのである。組換え技術によ
り産生される白血球、線維芽および免疫インターフェロ
ンは、それぞれ、γＩＦＮ−α、γＩＦＮ−β、および
γＩＦＮ−γ　と呼ばれる。少なくとも１２の異なるＩ
ＦＮ−α遺伝子が同定されたので、相当する蛋白質はγ
工ＦＮ−αｐ、、　ｙＩＦＮ−αＢ１γＩＦＮ−αＣ等
と呼ばれる。

γＩＦＮ−αＡ−Ｌのアミノ酸配列ならびにそれらをコ
ーＰするヌクレオチド配列は記載、されている。

Ｐｅ５ｔｋａ、　Ａｒｃｈｉｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　
Ｂｊｎｐｌ＋ｙｓ、　２２１　、　１（１９８３）およ
びＢｒ１ｔｉｓｈ　Ｐａｔｅｎｔ　５ｐｅｃｉｆｉｃａ
−ｔｉｏｎＡ２０７９２９１をみよ。

Ｇｏｅｃ］、ｄ６１および共同研究者は、はじめて、組
換えプラスミドｐ、Ｌ６１で形質転換させたＥｒ、　ｃ
ｏｌｉ細胞中のγＩＦＮ−α人の発現を完成した（　Ｎ
ａｔｕｒｅ。

２８７．４’１ｌ−４１６［：１９８０〕）。このプラ
スミドは、成熟γＩＦＮ−αＡに対する構造遺伝子（つ
まり、ヒトの細胞、中でふつうは翻訳される２６アミノ
酸のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列が
除かれ、シダノールペプチドに続く第１のアミノ酸に対
するコドンのすぐ前にＡＴＧ−開始Ｉシグナルの挿入さ
れたもの）を含有する。

γＩＦＮ−αインターフェロンは１６５個アミノ酸（γ
ＩＦＮ−αＡの場合）または、１６６個アミノ酸の長さ
である。ただし、それらは、ある場合には、メチオニン
をコードするＡＴＧ　ＩＦＩ始シグナルの翻訳の結果と
して、通常の蛋白質の第１アミノ酸のＮ−末端に付着す
る追加のメチオニンを含有し５る。

バイブリド白血球インターフェロンが、２個または２個
より多いＩＦ’Ｎ−α遺伝子を内部エンｒヌクレアーゼ
切断サイトで切断し、ついで、ひとつの遺伝子のひとつ
またはひとつより多くのフラグメントを、別の遺伝子（
単または複数）のひとつまたはひとつより多くのフラグ
メントと連結させ、別々のＩＦＮ−α種の部分に相当す
る特定のセグメントを有する、１６５または１６６個ア
ミノ酸の完全なＩ　ＦＮ−αをコードする新しい遺伝子
を生成さすことにより得られた遺伝子の発現で産生され
た。

このようにして、たとへは、γＩＦＮ−αＡの１−９１
アミノ酸配列に、９２．−１６６のγＩＦＮ−αＤアミ
ノ酸配列が続く白血球インターフェロンを産生さすこと
が可能となった。同様に、γＩＦＮ−αＤの１−９２ア
ミノ酸にｉ　ＩＦＮ−ａへの９３−１６５のアミノ酸の
続くバイブリドＩＦＮ−αを産生ずることも可能となっ
た。（、ｒ、　ＢｉｏＬ、　Ｃｈｅｍ、２５７．１１４
９７−１１５０２（１９８２］　）。

成熟７ＸＦＮ−βのクローン化および発現、それのアミ
ノ酸構造、ならびにそれをコードするヌクレオチド配列
はＧｏｅｄｄｅｌ等によりＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ　８．　４０５７　（１９８０）によ
り記載されている。

成熟γＩＦＮ−γのクローン化および発現、それのアミ
ノ酸構造およびそれをコードするヌクレオチド配列はＧ
ｒａｙ等、Ｎａｔｕｒｅ　２９５．　５０３（１９８２
）に記載されている。

しかし、上記引用インターフェロンの特定のアミノ酸の
配列のアレリック（ａｌｌｐｌｉｃ　）変化も可能です
でに記載された。たとへばＮａｇａｔｏおよび協同研究
者は、１１４位においてのアミノ酸１個だけγＩＦＮ−
αＤとは異なるポリペプチド（非成熟型）を与えるγＩ
ＦＮ−α遺伝子（γＩＦ’Ｎ−α：１と称する）の発現
を記載した（　Ｎａｔｕｒｅ２８４．３１６　Ｃ１９８
０）　）。

同様に、２６位のアミノ酸だけ１ｉＦＮ−αＡとは異な
るポリペプチドを与える別のγＩＦＩＩ−α（αＩＦＮ
−α２と同定）のクローン化および発現も、ｇｕ、ｒｏ
ｐｅａｎＰａｔｅｎｔ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ａ　
３２１３４．１９８１年７月１５日刊に記載された。

インターフェロンの生産および使用でおこる問題は個々
のインターフェロン分子がオリゴマーを形成することで
ある。これらのオリゴマーσ）原因は完全には理解され
ていないけれど高圧液体クロマトグラフィーまたはモノ
クローン抗体アフイニテイクロマトグラフイーのような
、治療用のためのインターフェロン精製に用いる方法が
、インターフェロンの２量体、６量体またはより高いオ
リゴマーを形成する原因になっているのかもしれない。

特に白血球および線維芽インターフェロンに関連して観
察されたこれらのオリゴマー型は、ジスルファイド結合
のような分子間共有結合で相互に非可逆的に結合する２
個または２個より多くの分子に結果する。

インターフェロンの２量体は生物活性を保持すると信じ
られるが、それより高いオリゴマーでは、多くの例で、
単量体に比して、生物活性レマな℃・力・または著しく
減少する。さらに、オリゴマーは、治療に用いられると
有害な副作用をおこす可能性がある。

既知ノγＩＦＮ−αＳ１　γＩＦＮ−βおよびｒＩＦＮ
ゴはすべてシスティン残基を含有し、それらのスルフヒ
ドリル側鎖は分子内および分子間ジスルファイド結合を
形成し、これがオ＋）Ｄ’）マー形成の原因となる。

γＩＦＮ−αＡのアミノ酸配列は、１．２９．９８およ
び１６８位にシスティン残基な−、金含有る。Ｗｅｔｚ
ｅｌは１および９８位のシスティン残基および２９およ
び１６８位でのシスティン残基のあいだに分子内ジスル
ファイド結合を認めた（　Ｎａｔｕｒｅ　２８９　＋６
０６１９８１））。

これまでのオリゴマー形成の問題を克服する努力は、オ
リゴマーの形成を防ぐために精製条件を調節したりまた
は操作後の反応条件により分子間のジスルファイド結合
を減少さすことに集中していた。

本発明は、第１の広義の特徴として、ｒＩＦＮ−α、バ
イブリドγＩＦＮ−α、γＩＦＮ−βおよびγＩＦＮ−
γより選択したインターフェロンのアミノ酸配列に相当
するアミノ酸配列を有しているが、少なくとも１個のシ
スティン残基が他のアミノ酸残基、つまり分子間ジスル
ファイド結合を形成しえないアミノ酸残基におき代わっ
ている、インターフェロン活性を有する新規、［ＩＪペ
プチドに関する。

この広義の特徴の有利な具体化として、本発明は７１Ｆ
Ｎ−αＡのアミノ酸配列を有するが、しかし、１および
９８位のシスティン残基の少なくともひとつが、分子間
ジスルファイド結合を形成しえない別のアミノ酸残基で
におき代わっているポリペプチドに関する。

本発明はさらに、新規ポリペプチドを含有し、２ｉ体以
外のオリゴマーを本質的に含まず、なるべくは安定な単
量体インターフェロンのみを含有する薬剤組成物に関す
る。

第２の広義の特徴として、本発明は、組換えＤＮＡ技術
により、上記の新規の、Ｎ　ＩＪペプチドを生産するた
めの方法および中間体に関する。特に、この特徴は、親
のインターフェロン遺伝子より、望まないシスティン残
基に対するコドンを含有する２本鎖ＤＮＡの部分を、制
限酵素を用いて切り取り、システィンをコードするヌク
レオチドトリデレットが、分子間ジスルファ・ｆド結合
を形成しえない別のアミノ酸残基をコードするヌクレオ
チドトリプレットによりおき代えられた合成オリビデオ
キシヌクレオチドでおき代えることによる、新規ポリペ
プチドをコードする２木鎖ＤＮＡ　（ｄｓＤＮＡ　）を
製造する方法に関する。

従って、本発明は、広義の特徴として、新規ポリペプチ
ド、これらのｄ　ｓ　ＤＮＡ配列を含有する複製しうる
プラスミド発現ビヒクル、これらの複製しうるプラスミ
ド発現ビヒクルで形質転換された微生物およびこれらｄ
ｓＤＮＡ配列なｌ５ｌＩＩｌ製する方法を包含する。

本発明の有利なポリペプチドは、γＩＦＮ−αＢおよび
バイブリドγＩＦＮ−αＳのシスティン残基の置換によ
り得られる。すべてのγＩ　ｌｉ’Ｎ−αＢおよび相当
するバイブリドγＩＦＮ−α８はＮ−末☆１＆１つまり
１の位置にシスティン残基な含有する。さらに追加して
、γＩＦＮ−αＡは、２９．９８および１６８位に、そ
してγＩＦＮ−αＢは２９．１００および１６９位に；
γＩＦＮ−αＣ，Ｆ％Ｇ、　Ｈ，Ｉ、Ｊ、におよびＬは
２１．９９および１３９位に；そしてγＩＦＮ−αＤは
２９．８６．９９および１６９にシスティン残基を含有
する。留意すべきこととして、Ｐｅ５ｔｋａ。

Ａｒｃｈｉｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂ１０ｐｂｙＳ、
　２２１　、１　（１９８３）第１７図は、９８および
１６８位よりむしろ９９および１３９位に、γＩＦＮ−
αＡではシスディン残基があることを示している。この
理由は、配列の表現を、４６位からあとはひとつづらし
て、γＩＦ’Ｎ−αＡ　よりアミノ酸残基を１個多く含
有する他のγＩＦＮ−α種と並ぶようにしたからである
。本明細書中で引用するアミノ酸の位置はすべて順を追
ってつげた番号でアミノ酸を示すとし、そのようなづら
したつけ方は用いない。

理解されるように、本発明のポリペプチドは既知のｒＩ
ＦＮ類に対応するアミノ酸配列を有するが、しかし、こ
こで少なくともひとつのシスティン残基は分子間ジスル
ファイド結合？形成しえない他のアミノ酸残基でおき代
えられている。おき代工られるシスティン残基は分子の
インターフェロン活性を保つに必要でない。本明細書で
用いる１インターフエロンＩ活性とは、インターフェロ
ンに特徴的な抗ウィルスおよび抗増殖活性を意味する。

γＩＦＨの特徴的抗ウィルス活性はＦａｍｔｌｌｅｔｔ
ｉ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｒｚｙｍｏｌｏｇｙ　
７８．　３８７　（１９８１）の細胞変性効果阻害試験
を用いて測定しうる。

７ＩＦＨの特徴的な抗増殖活性は、ｌ弓ｖｉｎｇｅｒ、
　Ｍ、　＆Ｐｅ５ｈｃａ、　、Ｓ、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ
　ｉｎ　ＥｎｚｙｍｏＬｏｇｙ　７９　＋　４５（１９
８１）記載の方法で測定しうる。

γＩＦＮ−αＡの２９および１６８位の７ステイン残基
のあいだの分子内ジスルファ・イト橋はインターフェロ
ン活性に必要と信じられたので、これらの残基はおき代
えなかった。同様に、γＩＦＮ−αＢからＬまでの２９
および１６９位のシスティン残基（およびそれらのアレ
イツク変化物）はおき代えるべきでない。

５ｈｅｐａｒｄ等が示したように（Ｎｆｌｔｕｒｅ　２
９４　ｒ５６３−５６５（１９８１））γＩＦＮ−βの
１４１位のシスティンをおき代えると生物活性は低下す
る。それで、このシスティン残基はおき代えるべきでな
い。

本発明によると、γＩＦＮ−αＡの１位のシスティン残
基およびγＩＦＮ−αＡの１および９８位の両方のシス
ティン残基をおき代えても、インターフェロン活性の減
少を伴なわない。同様に、１および（または）９９位（
γＩＦＮ−αＣからＬまで）のシスティン残基および１
および（または）１００位（γＩＦＮ二αＢの場合）も
おき代えうる。バイブリドγＩＦＮ−αの場合、親のγ
ＩＦＮおよび用いるセグメントで事情は変わるが、これ
らの位置に相当するシスティン残基なおき代えうる。８
７位にシスティン残基な有するγＩＦＮ−αＤのアミノ
酸配列を含有するγＩ　Ｆ’Ｎ−αＤまたはバイブリド
γＩＦＮ−αの場合、このシスティン残基もまたおき代
えうる。

本発明のポリペプチドにおいて、親のインターフェロン
のシスティン残基をおき代えるアミノ酸残基は、分子間
ジスルファイド結合を形成しえぬものならいずれでもよ
い。Ｎ−末端システィン残基の場合、つまり位置１の残
基では、これをグリシンでおき代えるのが有利である。

内部システィン残基の場合、たとへばγＩＦＮ−αＡの
９８位での残基では、これらはセリンでおぎ代えるのが
有利である。その理由は、セリン側りｉはシスティン側
鎖の空間配列にもつともよく似るからである。つます、
セリンでおき代えても、分イのコンホメーションを損な
う恐れはもつとも少ない。

γＩＦＮ−αＳ、ハイデリドγＩＦＮ−αＳおよびγＩ
ＦＮ−αはシスティン残基を有するが、このシスティン
残基が除かれてもインターフェロン活性は保たれる。

この型の新規ポリペプチドは、組換えＤＮＡの方法で製
造しうる。つまり、例Ｉ　ＮＣ，載のようにして、親イ
ンターフェロン遺伝子σ月４−末端をコードする部分を
、あとから例１に示すように、第１のシスティン残基の
存在しない合成オリゴデオキシヌクレオチド配列でおき
代える。この場合、ＡＴＧ翻訳開始シグナルに、ただち
に、親インターフェロンの２位のアミノ酸残基なコード
するヌクレオチドトリプレットが続くよう圧する。生ず
るｄｓＤＮＡは発現ビヒクルに入れこんで微生物を形質
転換する発現ビヒクルとなしうる。形質転換された微生
物はついで増殖させ、適当な反応条件でｄｅｓ（Ｃｙｓ
　１　）　−１工ＦＮ−ａ、パイプリドｄｅｓ　（ｃｙ
Ｓ　１　）　−ｒＩＦＮ−ａまたはｄｅｓ　（ｃｙＳ　
Ｌ）−７Ｔ、ＦＮ−７のアミノ酸配列を有し、インター
フェロン活性のある新規ポリペプチドを発現させる。

本発明の有利な具体例として、γＩＦＮ−αＡをコード
する遺伝子をあとから詳記する方式で変型し、そして発
現させて１および９８位のひとつまたは双方のシスティ
ン残基が分子間ジスルファイド結合を形成しえないアミ
ノ酸残基でおき代えられたγＩＦＮ−αＡとした。それ
で本発明の有利な具体例は式 ％式％ （ただし式中、Ｒ１およびＲ２はアミノ酸残基とするが
、ただし、Ｒ１およびＲ２の少なくともひとつは、分子
間ジスルファイド結合に関与しえないアミノ酸残基とす
る）を有する１１髪リペデチドである。

まず、γＩＦＮ−αＡの遺伝子を変型するのに、１位に
あるシスティンをコードするヌクレオチドトリプレット
を含めた、ポリペプチドのＮ〜末端なコードする遺伝子
の部分を切り取り、１位においてグリシンをコードする
合成オリゴデオキシヌクレオチドでおきかえる。９８位
においてシスティンに対するヌクレオチドトリプレット
を含有する遺伝子部分は不変のままである。プラスミド
発現ビヒクル中のこの変型遺伝子はＥ、　ｃｏｌｉ中で
発現させて、１位においてシスティンに代えてグルシン
を含有すること以外はγＩＦＮ−αＡのアミノ酸配列に
対応するアミノ酸配列のポリペプチドを与える。

この変型ポリペプチドは以降γＩＦＮ−αＡ（（）１ｙ
１）と称する。細胞より抽出しそしてモノクＩ′ｌＩ−
ン抗体イムノアフィニティークロマトグラフィーカラム
で精製し、得られたインターフェロンはナトリウムドデ
シルスＡ／７エートポリアクリル／ミドデル（ｓｐｓ　
−ＰＡＧＥ　）上の電気泳動に処した。インターフェロ
ンは、モノマーに相当する大量バンドとダイマーに相当
する小量バンドに分かれた。未変型γＩＦＮ−α人遺伝
子より発現されるγＩＦＮ−αＡを同じ電気泳動に処し
た。モノマー、ダイマーおよびそれ以上のオリゴマーっ
まりトリマー、テトラマー等に相当するいくつかのバン
ドに分れた。

大部割合（半分より多（）σ）単量体γＩＦＮ−αＡ（
Ｇｌｙｌ）および小量割合のγｊ＋ｒＮａＡ（（）ＩＹ
　１　）を含有する生成物は、ＭＤＢＫ細胞−１−でγ
ＩＦＮ−αＡの特徴となる完全な抗ウィルス活性な７１
；シた。

１位においてグリシンをコードする合成オリゴデオキシ
ヌクレオチドを含有−（る遺伝子は、９８位におけるシ
スティンのコドンを含む遺伝子のセグメントナ切り取り
、それを９８位においてセリンをコードする類似の合成
オリゴデオキシヌクレオチドでおき代えた。この変！（
す遺伝子はＥ、　ｃｏｌｉにおいて発現させて、１位に
１．１いてグリシンを含有しそして９８位においてセリ
ンを含有すること以外にはγＩＦＮ−αＡのアミノ酸配
列に相当するアミノ酸配列のポリペプチドを生産し７た
。変型ポリペプチドは以降γ工ＦＮ−αＡ（Ｇｌ’ｙ　
１　、　Ｓｅｒ　９８　）と称する。

細胞より抽出しそしてモノクロナールイムノアフィニテ
ィークロマドグ２フイーカラムより精製したあと、得ら
れたインターフェロンはＳＤＳ　−ＰＡＧＥＫ処する。

インターフェロンはシングルバンドとして移動し、本質
的にただひとつの単ｍ体の存在を示す。

単量体１工ＦＮ−ａｈ　（ＧＩＹ　１　、　Ｓｅｒ　９
８　）より本質的に成立つ生成物は、ＭＤＢＫ細胞上の
γＩＦＮ−αＡと大体同じの抗ウィルス活性を示す。

本発明の有利な具体例では、形質転４（（操作に用いら
れる微生物は特に断わらぬ限り、Ｂｒｉ、ｔｉｓｈＰａ
ｔｅｎｔ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｉ（ｘ　２０５５
６８２　Ａ　（ＡＴＣＣＡｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ａ　３１
４４６．１９７８年１０月２８寄託）に記載のＥ、　ｃ
ｏｌｉ　Ｋ　−１２株２９４ならびにＥ、　ｃｏｌｉ　
ＭＡ　２１０またはＲＲＩ　（ＡＴＣＣＡｃｃｓ３ｓｉ
ｏｎＡ３１３４５）である。しかし、公的に入手できる
か公認されている微生物寄託機関たとへばｔｈｅＡｍｅ
ｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃ
ｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ）より入手しうるものも本発明に
準じても使用しうる。

本明細書に使用の組換えＤＮＡ研究はすべて、ｔｈｅ　
Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅ
ａｌｔｈの適応しうるガイドラインに準じて実施した。

本発明の新規ポリペプチドは、薬剤組成物たとへば抗ウ
ィルスおよび抗腫瘍剤として、免疫抑制状態の治療に既
知のインターフェロンと同じ目的に用いうる。投与量お
よび投与の割合は、既知のインターフェロンの臨床応用
と同様に、代表的には約１−２００ｘ１０６単位／日な
用いうる。ポリペプチドは注射投与の形態で用いるのが
便宜である。適当な投与形態は、ポリペプチドを薬剤と
して許容されうる担体ビヒクルと混合する、薬剤として
有用な組成物を製造するための既知の処方方法で調製し
つる。適当な投与形ｆｉ、ｉは、患者、投与方式および
治療しようとする状態で異なるが、ポリペプチドの有効
量を薬剤とし°〔許容されうる担体とあわせて含有する
。

本発明の有利な具体例とし“Ｃｒ１ＦＮ−ＣＡをコード
する遺伝子配列を変型する。変型γＩＦＮ−αＡの発現
のもとになる２本鎖ＤＮＡ配列は、コード鎖と相補鎖と
より成立ち、コード鎖は５′−末端より読んでつぎの配
列を有する。

Ｘ　ＧＡＴ　ＣＴＧ　ＣＣＴ　ＣＡＡ　ＡＣＣＣＡＣＡ
（）ＣＣＴＧ　ＧＧＴ　ＡＧＣＡＧＧ　ＡＧＧＡＣＣＴ
ＴＧ　ＡＴ（）　ＣＴＣＣＴＧ　ＧＣＡ　ＣＡＧ　ＡＴ
Ｇ　ＡＧＧ　ＡＡＡ　ＡＴＣＴＣＴ　ＣＴＴＴＴＣＴＣ
ＣＴＧＣＴＴＧ　ＡＡＧＧＡＣＡＧＡ　ＣＡＴ　ＧＡＣ
ＴＴＴ　（ＩＧＡ　ＴＴＴ　ＣＣＣＣＡＧ　（）ＡＣ）
ＣＡ（）　ＴＴＴ　ＧＧＣＡＡＣＣＡＧ　ＴＴＣＣＡＡ
　ＡＡ（）　（ＩＣＴ　ＧＡＡ　ＡＣＣＡＴＣＣＣＴ　
ＧＴＣＣＴＣＣＡＴ　ＧＡＧ　Ａ’ｒＧ　ＡＴＣＣＡＧ
　ＣＡＧ、ＡＴＣＴＴＣＡＡＴＣＴＣＴＴＣＡＧＣＡＣ
Ａ　ＡＡＧ　ＧＡＣＴＣＡ　ＴＣＴ　ＧＣＴ　ＧＣＴ　
’Ｉ’Ｇ（）　ＧＡＴ　ＧＡＧＡＣＣＣＴＱ　ＣＴＡ　
ＧＡＣＡＡＡ　ＴＴＣＴＡＣＡＣＴ　ＧＡＡ　ＣＴＣ’
１’ＡＣＣＡＧ　ＣＡＧＣＴａ　ＡＡＴ　ＧＡＣＣＴＧ
　ＧＡＡ　ＧＣ’ＣＹ　ＧＴＧ　ＡＴＡ　ＣＡ（）　Ｇ
Ｇ（）　ＧＴＧ　ＧＧＧＧＴＩ）　ＡＣＡ　ＧＡＧ　Ａ
ＣＴ　ＣＣＣＣＴＧ　ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＧＡＧ　ＧＡＣ
’ｒＣＣＡＴ’ｌ！　ＣＴＧＧＣＴ　ＧＴＧ　ＡＧＧ　
ＡＡＡ　ＴＡＣＴＴＣＣＡＡ　ＡＧＡ　ＡＴＣＡＣＴ　
Ｃ’１．’ＣＴＡＴ　ＣＴＧＡＡＡ　ＧＡＧ　ＡＡＧ　
ＡＡＡ　ＴＡＣＡＧＣＣＣＴ　ＴＧＴ　ＧＣＣＴＧＣＧ
ＡＧ　ＧＴＴ　ＧＴＣＡＧＡ　（）ＣＡ　ＧＡＡ　ＡＴ
ＣＡＴＧ　ＡＧＡ　ＴＣＴ　ＴＴＴ　ＴＣＴ　ＴＴＧ　
’、［’ＣＡ　ＡＣＡ　ＡＡＣＴＴＧ　ＣＡＡ　ＧＡＡ
ＡＧＴ　Ｔ’Ｉ’Ａ　ＡＧＡ　ＡＧＴ　ＡＡＧ　ＧＡＡ
（ただし式中、ＸおよびＹはアミノ酸残基なコードする
ヌクレオチドトリプレットとするが、ただし前提として
、ＸおよびＹがコードするアミノ酸残基の少なくともひ
とつは分子間ジスルファイド結合の形成にあづかり得ぬ
ものとする）。

特に、本発明は、インターフェロン活性を有するポリペ
プチドをコードする２本鎖ＤＮＡ配列の製遣方法を枡供
するものでつぎの段階を包含する。

（ａ）　ｒＩＦＮ−ａ、ハイプリドア　Ｉ　ＦＮ−ａ、
γＩＦＮ−β　およびγＩＦＮ−７選択したインターフ
ェロンをコードする配列を含有するｄｓＪ）ＮＡをエン
ドヌク−アーゼで切断して、システィン残、Ｊ１！をコ
ードするヌクレオチドトリプレットを含有する第１のｄ
ｓＤＮＡフラグメントとインターフェロンの残余をコー
ドするひとつまたはひとつより多くの切断フラグメント
とし； （ｂ）　インターフェロンの残余をコードする他の切断
フラグメントより、第１のｄＲＤＮＡフラグメントを分
け； （Ｃ）　分けられた第１のフラグメントに対応するが、
しかし、システィン残基なコードするヌクレオチドトリ
プレットが、分子間ジスルファイド結合を形成するのに
関与しえ／ぷいアミノ酸残基によりおき代えられており
、インターフェロンの残余をコードするｄｓＤＮＡ配列
（単または複数）の末端に相補的の末端を有するｄ　ｓ
　ＤＮＡ配列を調製し；そして （ｄ）　該ｄ　ｓ　ＤＮＡ配列を適正な配向で連結させ
て変型ＩＦＮをコードするｄ　ｓ　ＤＮＡ配列とする。

段階（ａ）で切断されるγＩＦＮをコードするｄｓＤＮ
ＡはＩＦＮ構造遺伝子を含有する発現またはクローニン
グベクターよりうるのが便利でありつる。

γＩＦＮ−αＡ（ＧＩＹｌ）およびγＩＦＮ−αＡ　（
（）ｌｙ　１．５ｅｒ９８　）をコードするｄｓＤＮＡ
を調製する出発材料に用いるｄ　ｓ　ＤＮＡの材料には
、プラスミド１−ＩＬ３１を用いた。

ｐＢＲろ２２に由来するこのプラスミドは、ｔｒｐプロ
モーター−オペレーター、リボ・戸−ム結合サイト、Ａ
ＴＧ翻訳開始シグナル、γＩＦＮ−αへのアミノ酸配列
をコードする構造遺伝子（第１図に示す）および停止コ
ドンにつづく翻訳されないろ′−配列を含有する１１６
０塩基対（ｂ、ｐ、　）挿入物を含有する（　Ｇｏｅｄ
ｄｅｌ等、Ｎａｔｕｒｅ　２８７．　４１１［１９８０
〕）。

段階（ａ）でｄｓＤＮＡを切断するのに用いられうるエ
ンドヌクレアーゼは、組換えＤＮＡ技術の専門家にはよ
く知られている。特にどのエンドヌクレアーゼを用いる
かは、用いる特定のγＩＦＮ遺伝子およびおき代えよう
とする特定のシスティン残基（単または複数で）で変化
する。適当な切断サイトを決め適切なエンドヌクレアー
ゼを選択することは、専門家の智識によりよく成しうる
はづである。切断反応のおこる反応条件ならびにフラグ
メントを分けそして精製するための方法は、この方面の
技術でよく知られている。

γＩＦＮ−αＡ（Ｇｌｙｌ）をコードするｄ　ｓ　ＤＮ
Ａ配列の調製に際しては、１位においてシスティンをコ
ードするヌクレオチドトリプレットのすぐあとでγＩＦ
Ｎ−αＡに構造遺伝子を切断しそしてこのコドンを構造
遺伝子の残りの分より分けうるように、５ａｕ３ＡＩ認
識サイトの存在を利用する。

γＩＦＮ−αＡ（Ｇｌｙｌ）をコードするｄ　ｓ　ＤＮ
Ａを製造するために用いた操作を、特に第２図を参照し
ながらつぎのように記載しうる。γＴ　ＦｔＴ−αＡに
対する構造遺伝子を含有するプラスミドｐｔ、　３１を
、ＰｓｔＩで完全にそしてＳａｕ　３　Ａ　Ｉで完全に
消化した。

８５４　ｂ、ｐ、フラグメントを分際した。８ａｕ３Ａ
Ｉサイトに始まるこのフラグメントのコード鎖は１位に
おしするシスディンの°Ｊ’（円′：ＩドンイＩテ除い
゛（γＩＦＮ−αＡをコードする完全ＤＮＡ配列を含有
し、そしてＴＧＡ停止コドンを超えてろ６０塩基対のと
ころでＰｓｔ　Ｉサイトで終了した。

このように除去したγＩＦＮ−αＡ遺伝子の５７−末端
は、合成オリゴデオキシヌクレオチド ＥＣ０Ｒ１Ｓａｕ　３ＡＩ （ただし式中、グリシンをコードする（）ＱＣコドンが
未変型γＩＦＮ−αＡ遺伝子中のシスティン残基をおき
代えている）に８５４　ｂ、ｐ、セグメントを連結する
ことでおき代えた。そのように生成した８６５ｂ、ｐ、
　ｄＳＤＮＡはγ工ＦＮ−αＡ（Ｇｌｙｌ）ヤコードす
る配列を含有し、コード鎖の５′−末端はＢｃｏＲＩν
゛イトで終わり、他端はＰｓｔ　Ｉサイドで終っている
。

内部のシスティン残基つまりγＩＦＮ−αＡまたはＩＦ
Ｎ−αＡ（Ｇｌｙｌ）　の９８位のシスティン残基をお
き代えるために、望まないシスティン残基なコードする
ヌクレオチドトリプレットの上流つまりコ−ド鎖の５７
−末端の方向におＶ）″る第１のエンドヌクレアーゼ切
断サイトおよび望−Ｉ′ないシスティンをコードするヌ
クレオチドトリプレットの下流つマリコード鎖の６′−
末端側の第２のエンドヌクレアーゼ切断サイトにおいて
切断し望まないヌクレオチドトリプレットを含有するフ
ラグメントな分ける。望ましからぬヌクレオチドトリプ
レット含有フラグメントを、γＩＦＮの残余をコードす
るｄｓＤＮＡより分離する。システィンをコードするヌ
クレオチドトリプレットを異なるアミノ酸残基なるべく
はセリンをコードするヌクレオチドをおき代えること以
外には除かれたセグメントに相当する配列の合成ｄｓＤ
ＮＡ配列を調製する。この合成ｄｓＤＮＡ配列はγＩＦ
Ｎの残りの分をコードするｄ　ｓ　ＤＮＡに対し適切な
配向に連結させる。

相互に十分に接近している２つの内部システィン残基な
除きたいならば、第１の望まないシスティン残基なコー
ｒするヌクレオチドトリプレットの上流の切断サイトお
よび第２の望まないシスティンをコードするヌクレオチ
ドトリプレットの下て遺伝子を切断し、そのように取り
除いたセグメントを、両方のシスティンが異なるアミノ
酸でおき代えられているアミノ酸配列をコードする相当
する合成ｄｓＤＮＡでおき代える。

第６図を参照にして、ＩｙＮ−ａＡ（Ｇｌｙｌ　、　５
ｅｒ９８　）をコードするｄｓＤＮＡを製造するだめの
っぎの操作を用いた。用いる出発物質は７１ＦＮ−ａＡ
（Ｇｌｙｌ）をコードする８　６９　ｂ、ｐ、　ｄｓｌ
）ＮＡとした。これは、前記した操作で製造した８６５
　ｂ、ｐ、　ｄｓＤＮＡに、発現ベクター中への挿入に
有用な末端ＥｃｏＲＩ　ｒＪ識ササイト作り出すために
６′−末端に追加の４塩基対を連結させたものである。

このｄｓＤＮＡ　ｋ　ＰｖｕＩＩで切断して、γＩＦＮ
−αＡ　（Ｇｌｙ　）のコード鎖の５′末端を含有する
２　７５　ｂ、ｐ、セグメントおよびγ１ＦＮ−αＡ（
ＧＩＹｌ）のコード鎖の６′−末端を含有する５９６ｂ
、ｐ、セグメント（９８位システィンをコードするヌク
レオチドトリプレット含有）とした。５９６ｂ、ｐ、セ
グメントはＨｌｎｆ　Ｉ　で消化して、９８位でシステ
ィンをコードするヌクレオチドをコードする４　Ｆ３　
ｂ、ｐ、フラグメントおよび６′−末端の残余をコード
する５　４８　ｂ、ｐ、フラグメントを生成させた。

４８　ｂ、ｐ、なおき代えるために１つぎの配列Ｐｖｕ
　ＩＩ　Ｂｌｏｃｋ　Ｉ Ｈｉｎｆ　Ｉ Ｂｌｏｃｋ　Ｉｆ ０２つの合成２本＠　ＤＮＡ配列（デロツクエおよび■
）を調製した。

ブロックＩＩ中セリンをコードするＡＧＣヌクレオチド
トリプレットで、除かれた４　８　ｂ、ｐ、フラグメン
ト中７ステインをコードする１’ＧＴ　）リゾレットを
おき代える。ブロックエをもとの構造遺伝子の２７３　
ｂ、ｐ、フラグメントに、そし゛ＣブロックＩＩを５４
８　ｂ、ｐ、フラグメントに連結させた。生ずる２つの
７ラグメントは、９−塩基付着末端を通して連結させて
ｙｘＦＮ−ａＡ（Ｇｌｙ　１．８ｅｒ　９８　）をコー
ドするコード鎖を含有する８　６９　ｂ、ｐ、　ｄｓＤ
ＮＡとした。

本発明の新規ポリペプチドをコーＶするｄｓＤＮＡは、
新規ポリペプチドを発現する目的で用いうる宿主微生物
を形質転換する発現ビヒクル中に加えうる。この目的で
既知のふつうに用いられている発現ベクター、特にプラ
スミド発現ベクターを用いうる。

発現ベクター中へのｄｓＤＮＡの導入は、この方面でよ
く知られている方法を用いて達成しうる。挿入される構
造遺伝子の発現を指令するプロモーター−オペレーター
配列に関して適切に位置している切断サイトにおいてエ
ンドヌクレアーゼで切断して直線状とする。新規ポリペ
プチドをコードするｄｓＤＮＡをベクターの切断された
末端のいずれかの端において連結させベクターを再環化
させた。

もちろん、連結を可能とするには、ｄｓＤＮＡ挿入物の
末端はベクターの切断された端に相補的であらねばなら
ない。必要ならば、構造遺伝子自体およびそれにともな
う開始および停止コドンはインタクトのままに残しそし
てデロモーター−−オペレーター配列に関して遺伝子が
適正な位置および読み枠に留まるという前提で、既知の
操作で末端を継ぎまししたりまたは切り取ったりし℃、
ｄｓＤＮＡ末端を相補的にすることができる。

それで、本発明によれば、 （ａ）　レプリコン； （ｂ）　プロモーター−オペレーター配列；（Ｃ）　翻
訳開始シグナルを含むリボゾーム結合サイトをコードす
るＤＮＡ配列； （ｄ）　該プロモーター−オペレーター配列とインフェ
ースにある、ｒＩＦＮ−α、ハイデリドγＩＦＮ−α、
ｒＩＦＮ−βおよびｒＩＦＮゴより選択したアミノ酸配
列を包含するが、少なくとも１個のシスティン残基が分
子間ジスルファイド結合な形成しえないアミノ酸残基で
おき代えられているインターフェロン活性を有するポリ
ペプチドをコードする、翻訳停止シグナルを含めたＤＮ
Ａ配列を包きする、複製しうるプラスミド発現ビヒクル
が提供される。

本発明の複製しうるプラスミド発現ビヒクルののいずれ
も用いうる。なるべくは、ｐＢＲ３２２に由来スる、Ｐ
Ｌプロモーター−オペレーター配列を含有する発現ベク
ターであるプラスミドｐＢＲ３２２（Ｂｅｒｎａｒｄ、
　Ｈ，Ｕ、およびＨｅ１．１ｎｓｋｉ。

Ｄ、　Ｒ，、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ　６８　、　４８２　）を用いうる。クローニング
および発現ペク４Ｔ）ＲＣ２３の構築についての詳細は
、ＥｕｒｏｐｅａｎＰａｔｅｎｔ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎ　Ａ　８３１０６７３０．１より知りうる。このベ
クターにおいて、強力なＰＬプロモーターはλｃＩレプ
レッサーにより調節される。レプレッサーをコードする
遺伝子は、レプレッサーを温度感受性とする変異を担う
。ろ０℃でレプレッサーは正常に働らき、３７から約４
２℃で不活化される。それでＰＬ−プロモーターは６０
℃でレゾレス（スイッチオフ）され、４２℃で除レゾレ
ス（スイッチオン）すれる。ｐＬ−−１’ロモーターを
調節しうろことから、約３０から６６℃で遺伝子生成物
の発現なしに培養し、ついで温度を約３７から４２℃に
上昇させて、望む遺伝子生成物を産生させうる。プラス
ミドｐＲ０２３は、ＥｃｏＲＩ認識サイトを末端とする
ｄｓＤＮＡ配列を受容するようにデディンする。そＪ」
で、γＩＦＮ−αＡ（ＧＩＹ　１　）またはｒＩＦＮ−
αＡ（ａ］、ｙｌ　、　５ｅｒ９８　）をコードしそし
ていずれかの端がｇｃｏｆｔＩ認識サイトに終る、前記
した８　６９　ｂ、ｐ、　ｄｓＤＮＡ配列は、ＥｃｏＲ
Ｉを用いる切断で直線状としたｐＲｏ　２３に直接に挿
入しつる。既知のりガーゼだとへばＴ４ＤＮＡＩＪが−
ゼを用いて連結を行ないうる。

複製しうるシラスミドは、微生物、なるべはＴＬ、、ｃ
ｏ一旦を形質転換して、本発明のポリペプチドを発現し
うる形質転換物を製造するの圧用いうる。

形質転換は既知の方法で便宜に行ないうる。たとへば約
４°ＣでＣａＣ１２で宿主を処理する。形質転換された
微生物は既知の発酵条件で発育させ新規ポリペプチドを
微生物中九発現させうる。ついで、ポリペプチドは、た
とへば細胞を溶解させ精製することで採取しうる。固体
担体上に結合させた相当する親のｒＩＦＮに対するモノ
クローン抗体を用いたカラム上のイムノアフイニデイク
ロマトグラフイーで精製を行なうのが有利でありうる。

７ＩＦＮ−ｆｆＡ　（Ｇｌｙ　１　）またはγｙＮ−ａ
ｈ　（ＧＩＶｌ　、　５ｅｒ９８　）の精製に用いうる
適尚なモノクローン抗体は、たとへば５ｔａｅｈｅｌｉ
ｎ等により、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏ−ｇｉ
ｃａｌＣｈｅｍ、　２５６．　９７５０　（１９８１）
に記載されている。

複製しうるプラスミド発現ビヒクルを産生さすに用いる
発現ベクターがｐＲｏ　２５の時に、生ずる形質転換微
生物は３０℃で望む密度まで発育させついで温度を４２
℃まで上げてレプレッサー蛋白質を不活化し発現を開始
させ５る。

つぎに実施例を用いて本発明を説明するが、これらをも
って本発明を制限するつもりはない。部およびパーセン
トはすべて重量により、温度はすべせつ氏である。

例１ γＩＦＮ−αＡ（ＧＩＹｌ）の調製 （ａ）　γ工ＦＮ−ａＡ（Ｇｌｙ　１　）をコードする
ｄｓＤＮＡの調製γＩＦＮ−αＡをコードする遺伝子を
含有するデラスミ　ド　ｐＬ３　１　（６μＦ）（Ｎａ
ｔｕｒｅ　２８７．　４　’ｌ　１　−４１６〔１９８
０））を、ＰｓｔＩで完全にそして５ａｕ３ＡＩ　で部
分的に消化した。両方消化共に、６７°Ｃで２０単位Ｐ
ｓｔＩを用い１時間、ツいで５単位Ｓａｕ　３ＡＩを用
い５分間、２Ｕ７ｚｌ容量中で行なった。切断フラグメ
ントは１．５チアガロ−スプル中で分けた。８４５　ｂ
、ｐ、フラグメントを分離した。

これは、γＩＩｉ’Ｎ−αＡの２位のＡｓｐ’？、＜コ
ードするヌクレオチドトリデレソトで始まり、翻訳停止
コドンな超えて３６０　ｂ、ｐ、のＰｓｔ　Ｉ　！Ｊ’
　４　）で終る。

Ｍｉｙｏｓｈｉ等の操作（ＮｕｃｌｅｉｃΔｃｉｄｓ　
Ｒｅｓ、　８　。

５５０７−５５１７［１９８０］）で、合成オリゴデオ
キシヌクレオチド ５’　ＡＡＴＴＣＡＴＧＧＧＣ ６’　ＰＴＡｃｃ’ｃＧｃＴＡＧ を調製しそして５′末端をリン酸化した。Ｔ４りが一ゼ
の存在で７μｍの容量中で１５°Ｃで１６時間をかけて
、上記のリン酸化されたオリゴデオキシヌクレオチドを
先端を切ったｒＩＩｉ’Ｎ−αへＤＮＡフラグメント（
１００ｎｒ）の＋３ａｕ　３ＡＩ　’リーイトに連結さ
せた。連結させたあと７０℃で１０分インキュベートし
てりが−ゼを不活化させ、２０μｍ１１３７°Ｃで２時
間、５０単位のＥｃｏＲＩおよび１０単位のＰｓｔＩで
ＤＮＡを消化した。このように型付着末端〃を再生させ
た。γＩＦＮ−αＡ（Ｇｌｙｌ）のコード配列を含有す
る生成８６５　ｂ、ｐ、　ｄｓＤＮＡフラグメントは、
コード領域の５′−末端にＥｃｏＲＩサイトをそして６
′−末端にＰｓｔエサイトを有した。フラグメントは１
．５１７がロースデルを通して精製し、約５０ｎｆを採
取してクローニングに用いた。

（ｂ）　γ工ＦＮ−αＡ（ＧＩＹｌ）を製造するための
複製しうるプラスミド発現ビヒクルの調製 発育ビヒクルを調製するための操作を第４図に模式的に
示す。γＩＦＮ−αＡ（Ｇｌｙｌ）を製造するだめの複
製しうるプラスミド発現ビヒクルを調製するための発現
ベクターとしてプラスミドｐＲＣ２３を用いた。前記し
たように、このプラスミｒはｐＢＲ６２２に由来し、Ｐ
Ｌ−ｆ′ロモーター−オペレーターを含有した。ｐＲＣ
２３はＥｃｏＲＩ制限サイト上に遺伝子を受け入れるよ
うにデザインされているので、８６５　ｂ、ｐ、フラグ
メントの６’　Ｐｓｔ　ＩサイトなＥｃｏＲＩサイトに
変換する必要する必要があった。

この変型を行なうための十分騙のフラグメントをうるた
めに、テトラサイクリン抵抗性遺伝子を含有するプラス
ミド１）ＢＲ３２２をクローン化ベクターとして用い、
８６５ｂ、ｐ、フラグメントをまずクローン化した。２
０μｌ容量中１ｉｊｃｏＲＩおよびＰｓｔ　Ｉの各１０
単位を用いて５００　ｎｆ（１）　ｐＢＲ３２２ヲ６７
℃で完全に消化した。製造した直線状ベクターは１．０
チアガロースダルを通して精製した。

１５℃で８時間、１０　ｐｌ、中、′１“４リガーゼを
用いて、γＩＦＮ−αＡ（Ｇｌｙｌ）をコー１２する８
　６５　ｂ、ｐ、フラグメント（５ｏ　ｎｆ　）を直線
化ｐＢＲ３２２の１００ｎｆに連結させた。連結させた
あと混合物は７０°Ｃで１０分インキュベー１・しＥ、
　ｃｏＬｉ細胞のコンビテン）　ＭＣ１０６１株の形質
転換に用いた。

細胞は１０μＶ／−のテトッザイクリンを含有するＬＢ
寒天上に塗布し、６７℃でインキュベートして得られた
テトラサイクリン抵抗性コロニーは、プラスミドｐＢＲ
３２２／γＩＦＮ−αＡ、　（ｆ）ｌｙ　１　）の存在
についてスクリーニングした。スクリーニングには、Ｂ
ｉｒｎｂｏｉｍ、　Ｈ，Ｃ，およびＤｏｌｙ、　Ｊ、　
（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ、　Ｒｅｓ、７　、　１５１
３　（１９７９）　’）のアルカリ溶解操作を用いた。

配列 Ｅｃｏ　ＲＩ　Ｐｓｔ　Ｉ を有する合成オリゴデオキシヌクレオチドを、Ｍｉｙｏ
ｓｈｉ等（Ｎｕｃｌｅｉｒ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　８
．５５０７−５５１７（１９８０）：）記載の操作で調
製し、５′末端においてポリヌクレオチドキナーゼの存
在でＡＴＰでリン酸化した。

８６５　ｂ、ｐ、のγＩＦＮ−αＡ（Ｇｌ−ｙｌ）をコ
ードする挿入物を含有するプラスミドｐＢＲ３２２／γ
ＩＦＮ−αＡ（Ｇｌｙｌ）（２００ｎｆ　）を、６７℃
で１時間、２０単位のＰｓｔＩで完全に消化し、直線化
したベクターは１．０％アガロースデルで精製しデルよ
り採取した。５μｍμｍ容量中力５１６時間をかけ７て
、合成オリビデオキシヌクレオチド（各５・Ｏｎ＆）を
２００ｎｆの直線化ベクターに連結させた。リガーゼを
不活化したあと、生ずるｄｓＬＩＮＡは３７℃で３時間
５０単位のＥｃｏＲＩで消化した。γＩＦＮ−αＡ（Ｇ
］、ｙ　１　）をコ−ｖし、両側共Ｋ　ＫｃｏＲ工＋　
イ）　”Ｃ”　終る８　６９　ｂ−ｐ、フラグメントな
１．〔１％アガロースゲル上で精製し、ｐＲ０２３の１
七Ｃｏ１ｔｉサイトにクローニングするために採取した
。

約５００　ｎｆのＴ）ＲＣ２３を、２０μｍ中６７中Ｃ
で１時間１０単位のＲｃｏＲＩで完全Ｗ、消化した。１
μＶのウシ小腸アルカリホスファター・ゼを加えてプラ
スミドのＥｃｏＲＩ末端において脱リン酸しそしてさら
に５０分インキュベーションも：つツケタ。６８℃で１
０分加熱して反応を終結させ、直線化ベクター　ハ１”
、（）％アがロースデルを通して精製し、採取した。１
０　ｐ中１５℃で１０時間をかけて、直線化ベクター（
１００ｎｒ）をγ［ＦＮ−ａＡ（Ｇｌｙ　１　）をコー
ドする８　６９　ｂ、ｐ、フラグメントの５０ｎｒに連
結させた。複製しうるプラスミド発現ビヒクルＴ）ＲＣ
２３／　γＩＦＮ−αＡ　（ｏｌｙｌ）　イ（イ（Ｌ　
た　。

（ｃ）　ｐＲｃ　２５　／　ｒｙトａｈ　（ｏｌｙ　１
　）含有形質転換物の調製 Ｂｅｒｎａｒｄ、　Ｈ，Ｕ、およびＨｅ１ｉｎｓｋｉ、
　Ｄ、　Ｒ。

［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ’ｌｏｇｙ、６
８　、　４８２　］上記のようにして許容されうるプラ
スミドｐＲＫ　２４８ｃＩｔｓを含有するＥ、、　ｃｏ
ｌｉ細胞を連結混合物を用いて形質転換した。許容され
うるシラスミＰは、ｐＲｏ　２　！ｌ上のＰＬプロモー
ターオペレーターのオペレータ一部分を認識しそして結
合するレプレッサー蛋白質の産生をコードする。５０　
ｍｍｏｌのＣａＣ１２の存在で４℃でろ０分をかけて謬
叩、具細胞を形質転換した。細胞はアンぎシリン（５０
μ２／−）を含有するＬＢ寒天上に６０°Ｃで塗布した
。

ｐＲｏ　２３プラスミドはアンぎシリン抵抗性の遺伝子
を含有した。インキュベーションしたあと、アンピシリ
ン抵抗性コロニーヲ選択シ、Ｐ１Ｊフ０ロモーターに関
して適正に配向して挿入されている遺伝子を有している
プラスミドｐＲＣ２３／γＩＦＮ−αＡ（Ｇｌｙｌ）を
スクリーニングした。

（ｄ）　γＩＦＮ−σＡ、（ＧＩＹ　１　）の発現およ
び精製プラスミド１）ＲＣ２３／　ＩｕｒＮ−ａＡ（Ｇ
ＩＹ　１　）および許容されうるシラスミドを含有する
形質転換物のコロニーを、６０°Ｃを超えない温度でア
ンピシリン（５０μ／−）を含有する２ｄのＬＢ寒天上
に発育させた。培養物の０Ｄ６ｏｏ７！ｌ’−０，６に
達したら温度を４２°Ｏとしてレプレッサー蛋白質を不
活化し発現を開始させた。４２℃で２時間後、細胞を採
取し、０°Ｇで１０分間５０／７１０７Ｍグアニジン−
ＨＣｌ中で溶解させた。１２．０００　ｆで５分間抽出
物を遠心した。上清は１：１０ＤＫ希釈し抗ウィルス活
性を分析した。

２ＭグアニジンＭＣＩ　、　２　％　’Ｉ’ｒｉしｏｎ
　ｘ　１００．０．１　Ｍ　’［’ｒｉｓ−ＣＬ、ｐｉ
（７，５含有抽出緩衝液を用い４℃で２時間をかけて、
７　ＩＦＮ−ａＡ、　（Ｇｌｙ　ｉ　）をＥ、　ｃｏｌ
ｉ細胞ペーストより抽出した。抽出混合物は冷蒸留水で
５倍に希釈し、１０，０ＯＯｘｙで１時間遠心し、１×
２６ｎイムノアフイニテイクロマトグラフイー上で精製
した。γＩＦＮ−αＡ、　Ｋ対するモノクローン抗体の
約１３ｑの共有結合さＡｔたアガロースデルの１−０ｍ
１を詰めたイムノアフイニテイ力ラムを用いた。Ｌｌ−
８と称するモノクローン抗体の調製は、５ｔａｅｈｅｌ
ｉｎ等がＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２５６ｘ９７５
０　（１９８１１に記載した。

γＩＦＮ−αＡ（Ｇｌｙｌ）含有抽出緩衝液（２０ｍｌ
　）をカラム上に加えた。その際の流速ｉ　１−Ｏｍｅ
　７分または以下とした。コラムは、つぎの溶液のそれ
ぞれの５ペツト容量宛で順次に洗った。

１、　０．２８６Ｍグアニジン−ＨＣｌ；０．２８６チ
Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　−１００：　０．Ｉ　Ｍ　Ｔｒｉｓ
−ＣＩ、　ｐＨ７，５２、Ｑ、５ＭＮａＣ１：　０．２
　＄ＴｒｉｔｏｎＸ−１００：０．０　’ｌ　５　＋ｔ
　Ｔｒｉｓ　−ａｌ、　ｐＨ７・５３、　１．０Ｍナト
リウムチオシアネー）　；　０．１係Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ
−Ｉ　Ｄ　Ｏ：　０．０２５　Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｃ］、ｐ
Ｈ７，５４、０，１５ＭＮａＣ１；　０．１　％’ｒｒ
ｉｔｏｎＸ−１００ついでγＩＦＮ−αＡ（ＧＩＹｌ）
をま０．２Ｍ酢ｔ１匂、０．１５Ｍ　ＮａＣ１および０
．１　％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１［１０ｐＨ２，５を用
イカラムより溶出シタ。

上記Ｆａ＋ｎ１ｌｌｅｔｔｉ等記載の細胞毒効果阻止試
験を用いて水胞性口内炎ウィルスに対するわ℃ウィルス
活性を試験した。γＩＦＮ−αＡ、（ＧＩＹｌ）を含有
する溶出液の比活性は２×１０８即−位／ｍｙ蛋白質で
、γＩ　ＦＮ−αへのそれ罠相当した。

発現を開始さすために温度を４２°Ｃに上昇さすより前
に、形質転換物を含有する培養物の１部を取り６０°Ｃ
でグリセロール中に保存した。この分は、６０℃を超え
ない温度で′アンピシリン（５０μ２／−）を含有する
ＬＢ寒天含有１０１Ｊットル発酵槽中で発育させた。０
Ｄ６ｏｏを４−５とした。ついで温度を４２°ＣＩＣ上
昇させて発現を開始させた。

０Ｄ６ｏｏが約１２　（２−３時間＞／ＣＭＩ、ｔ、ニ
ーアト、γＩＦＮ−αＡ（Ｇｌｙｌ）を採取し２−培養
物について上記したのと同様に精製した。１０リツトル
培養物より得た精製γＩＦＮ−αＡ（Ｇｌｙｌ）のＭＤ
　Ｂ　Ｋ細胞上での抗ウィルス活性は３．３　Ｘ　１０
′３（±（Ｊ、７６　Ｘ　１０８）単位／■蛋白質であ
る。

イムノアフイニテイカラムよりの精製γＩＦＮ−αＡ（
ＧＩＹ　１　）溶出物は、非還元条件でナトリウムドデ
シルスルフニー）＆リアクリルアミドデル上テ電気泳動
した。ｒＩＦＮ−αＡの１試料は遅く動く単量体、速く
動く単量体、２量体、３敗体および４量体に対応するバ
ンドを示したが、ｒＴ、ＦＮ−αＡ（ＧＩＹＩ）の１試
料はおそく動く単量体および小量の２量体のみを示した
。ｐＨ７，０に中和したγ工ＦＮ−αＡ（Ｇｌｙｌ）で
は９８位のシスティン間の一依存性ジスルファイド形成
による２量体の増加を示す。−１７，０に中和されβ−
メルカプトエタノールで還元されたγＩＦＮ−αＡ（Ｇ
ＩＹｌ）の試料は、２量体がジスルファイド結合形成の
結果であることを示した。

例２ γＩＦＮ−αＡ　（Ｇｌｙ　１　、　Ｓｅｒ　９８　）
の調製５ａ）　γＩＦＮ−αＡ　（Ｇｌｙ　１　、　Ｓ
ｅｒ　９８　）をコードするｄｓＤＮＡの調製 γＩＦＮ−αＡ　（Ｇｌｙ　１　）遺伝子中のシスティ
ンをコードする９８位ヌクレオチドトリプレットの上流
のＰｖｕ　ｎ制限サイトおよびコード鎖上４８塩基だけ
隔てられて、そのヌクレオチドトリプレットより下流の
Ｉ（ｉｎｆ　Ｉ制限サイトを利用してγＩＦＮ−αＡ（
Ｇ１７１．　Ｓｅｒ　９８　）をコードするｄｅｌ）Ｎ
Ａを調製した。

第６図に示すように、γＩＦＮ−αＡ　（Ｇｌｙ　１　
）をコードする例１の８６９　ｂ、ｐ、挿入物を含有す
るｐＲＣ２６／γＩＦＮ−αＡ　（Ｇｌｙ　１　）を出
発物質に用いた。

２０μを中２時間６７℃で２０単位のＥｃｏＲＩおよび
２０単位のＰｖｕＩＩを用い完全に消化させてｐＲＣ２
３より８６９　ｂ、ｐ−セグメントを切り取った。

８６９　ｂ、ｐ、セグメントは、それ自体、９８位シス
ティンコードヌクレオチドトリプレットの丁度上流のＰ
ｖｕ　ＩＩサイトで切断し２つのフラグメント、つまり
γＩＦＮ−γＡ　（Ｇｌｙ　１　）遺伝子の５′−末端
を含有する２　７３　ｂ、ｐ、フラグメントｔｃｔよび
９８位においてシスティンをコードするヌクレオチドフ
ラグメントを含む、遺伝子の６′−末端を含有する５　
９６　ｂ−ｐ−、セグメントに分けた。５９６　ｂ−ｐ
、フラグメントは２０μを中６７℃で５分間５単位のＨ
ｉｎｆ　Ｉで部分消化した。ついで）ＩｉｎｆＩは７０
°Ｃで１０分間加熱すぐに不活化した。γＩＦＮ−αＡ
（ＧＩＹｌ）の３１−末端を含有する５　４８　ｂ、ｐ
、　Ｈｉｎｆ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩフラグメントを分離し
、９８位のシスティンコードトリブレット含有４８　ｂ
−ｐ、フラグメントを除くよう１．５部アがロースデル
上で精製した。

上記引用のＭｉｙｏｓｈｉの操作を用いて、第１のオリ
ゴデオキシヌクレオチドのコード鎖の６′−末端におい
て、および、第２のオリｚ”ｐデオキシヌクレオチドの
コード鎖の５７−末端において相補的な重なる配列を有
する２つの２本鎖合成オリイデオキシヌクレオチドを調
製した。その相補的な配列において連結さすと、これら
の２つのオリゴデオキシヌクレオチドは４８　ｂ、ｐ、
挿入物を与えた。これは、９８位のシスティンをコード
するヌクレオチドトリプレットがセリンをコードするＡ
、ＧＣヌクレオチドトリプレットでおき代えられている
こと以外は、γＩＦＮ−αＡ　（Ｇｌｙ　１　）より切
り出した４　８　ｂ、’ｐ。

フラグメントに同じ４８　ｂ、ｐ、を与えた。

２つの２本鎖合成オリゴデオキシヌクレオチドはつぎの
ヌクレオチド配列を有した。

印す　Ｂｌｏｃｋ　Ｉ ６′ＧＴＣＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡＣＴＧＴＣ１１１Ｃ
ＴＧＡＩＢｌｏｃｋ　ＩＩ それぞれの鎖を相互にアニーリングして２つの２本鎖と
するより前に５′−末端をポリヌクレオチドキナーゼを
用いＡＴＰでリン酸化した。７μＬ１５０Ｃで１６時間
をかけて、ブロックエ（５０ｎｆ　）を、γＩＦＮ−ａ
ｈ　（Ｇｌｙ　１）遺伝子（６００ｎｆ　）の５１−末
端の２７３　ｂ、ｐ、切断フラグメントのＰｖｕ　Ｕサ
イトに連結させた。７μｔ１５°Ｃで１６時間をかけて
、ブロックＩＩ（５０ｎｒ）を、ｙＩＦＮ−ａＡ（（）
ｌｙ　１）遺伝子（１００ｎｌ）の６′末端での５４８
　ｂ、ｐ、のＨｉｎｆ　Ｉサイトに連結させた。これら
の連結で生じた２つのｄｓＤＮＡフラグメントは、１５
°Ｃで１６時間でゾロツクＩおよびブロックＬＩの９％
ｂ、ｐ、相補的に重なる９　ｂ、ｐ、部分を相互に連結
させた。生ずるｙＩＦＮ−ａＡ　（Ｇｌｙ　１　、　Ｓ
ｅｒ　９８　）をコードする８　６９　ｂ、ｐ、　ｄｓ
ＤＮＡを分離し、１．５％アがロースデル上で精製した
。このｄｓＤＮＡは両側にＥｃｏＲＩ認識サイトを有し
た。

（ｂ）　７ｘＦＮ−ａＡ（Ｇ１７　ｌ　、　Ｓｅｒ　９
　Ｂ　）を産生さすための複製しうるプラスミド発現ビ
ヒクルの調製第５図は発現ビヒクルを調製するのに用い
られる操作を模式的に示す。２０ｐＬ中６７℃で１時間
１０単位のＥｃｏＲＩを用いてプラスミドＴ）ＲＣ２６
（５００ｎｒ）を完全に消化した。ウシ小腸アルカリホ
スファターゼの１μｍを加えて、さらに６０分消化をつ
づけた。６８℃で１０分間加熱して反応を止めた。１．
５チアがロースデルを通し精製採取した。直線状とした
ベクター（１００ｎｆ）を、７μを中１５℃で１０時間
をかけて、γＩＦＮ−αＡ　（Ｇｌｙ　ｉ　。

ｓｅｒ　９８　）をコードする８　６９　ｂ、ｐ、フラ
グメントの５０ｎ２と連結させ複製しうるプラスミド性
発現ビヒクルｐＲＣ２３／　ｒＩＦＮ−ａｈ　（Ｇｌｙ
　１　、８ｅｒ　９８　）を生成させた。

（ｃ）　ｐＲＣ２６／　γＩＦＮ−αＡ　（Ｇｌｙ　１
　、３ｅｒ　９８　）を含有する形質転換物の調製 ｐＲＣ２３上のＰＬプロモーター−オペし／−ターのオ
ペレーター配列を認識しそれに結合する温度感受性レプ
レッサー蛋白質の産生をコードする、許容されうるシラ
スミドｐＲＫ　２４８　ｃＩｔｓ　を含有するＥ、　ｃ
ｏｌｉのＲＲＩ株を形質転換するのに１上記の連結混合
物を用いた。５　Ｑ　ｍｍｏｌのＣａＣｌ２の存在で４
℃で２０分間をかけてＥ、　ｃｏｌｉ細胞を形質転換し
た。ＬＢプレート上３０℃で１夜インキユベートしたあ
と生ずるアンピシリン抵抗性コロニーを選択しそしてア
ンピシリン（５０μｆ／ｌｄ）を含有するＬＢ寒天の２
−培養物中に接種した。ＰＬプロモーターに関連して適
切な配位に遺伝子を有している組換えシラスミドｐＩｔ
ｃ　２３　／γＩＦＮ−αＡ（ｃＨ’ｙ　１　、　Ｓｅ
ｒ　９’８　）を、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　（上記引用）の
方法でアルカリ溶解スクリーニングで選択した。

（ｄ）　ＩｘＦＮ−ａｈ　（Ｇｌ’ｙ　１　、　ｓｅｒ
　９８　）の発現および精製 プラスミドＴ）ＲＣ２５／γｕ＞−ａＡ（（）ｌｙ　１
　＋　Ｓｅｒ　９８　）および許容されうるプラスミド
を、アンピシリン（５０μｆ／ｒｎｌ）含有ＬＢ寒天１
０リットル中で３０℃を超えない温度で発育させた。培
養物の０Ｄ６ｏｏが０．６となったら温度を４２℃に上
昇させてレプレッサー蛋白質を不活化し発現を開始させ
た。４２℃で２時間後に細胞を集め溶解させた。

例１（ｄ）の緩衝液の４倍容量を用いてγＩＦＮ−αＡ
（ＧＩＹ　１−、８ｅｒ　９８　）をＥ、　Ｃ−１？−
具細胞より抽出し、１．６　Ｘ　５．Ｏｃｍイムノアフ
イニテイクロマトグラフイーカラムで精製した。イムノ
アフイニテイクロマトグラフイーカラムには、ｒＩＦＮ
−ａＡ対するモノクローン抗体の約１３０■を共有結合
させた１〇−のアガロースデルを詰めた。Ｌｌ−８と称
するモノクローン抗体の調製は５ｔａｅｈｅｌｉｎ等に
よりＪ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２５６．　９７５０　（１９
８１）に記載されている。

γ工ＦＮ−ａＡ（Ｇｌｙ　１　、８ｅｒ　９８　）含有
抽出緩衝液（５，０００ｍｇ　）はカラムに加えた。そ
の際の流速は５．０−／分または以下とした。カラムは
ついで、例１（ｄ）使用の洗浄溶液の５ベツド容員で順
次に洗った。ついで、７１ＦＮ−ａＡ　（ＧＩＹ　１　
、　Ｓｅｒ　９８　）は、カラムより、例１（ｄ）と同
じ溶出溶媒で溶出した。

イムノアフイニテイクロマトグラフイーカラムよりの溶
出物を、Ｆ’ａｍｉｌｌｅｔｔｉ　記載の細胞毒効果阻
害試験（上記引用）で水胞性口内炎ウィルスに対して試
験した。γｙＮ−ａＡ（Ｇｌｙ　１．　Ｓｅｒ　９８）
を含有する溶出物の比活性は、２×１０８単位／り蛋白
質、γＩＦＮ−αへのそれに相当した。

イムノアフイニテイクロマトグラフイーカラムよりの精
製７■ＦＮ−１７Ａ　（Ｇｌｙ　ｌ　、　Ｓｅｒ　、９
３　）溶出物は、還元条件でナトリウムドデシルスルフ
ェートポリアクリルアミドビル上で電気泳動に処した。

γＩＦＮ−αＡ（Ｇｌｙ　１　、　Ｓｅｒ　９８　）の
試料は単量体インターフェロンの単一バンドを示したの
に、γＩＦＮ−αＡの試料は、単量体、２悪体、６量体
およびより高いオリゴマーに相当するバンドを示した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、γＩＦＮ−αＡのアミノ酸配列およびγＩＦ
Ｎ−αＡをコードするヌクレオチド配列を表わす。 第２図はγＩＦＮ−αＡ　（Ｇｌｙ　１　）をコードす
るｄｓＤＮＡを製造するために用いる方法の模式図を示
す。 第６図はｒＴＦＮ−ａＡ（Ｇｌｙ　１　、５（ａｒ　９
８　）をコードするｄｓＤＮＡを製造するために用いる
方法の模式第４図はγＩＦＮ−αＡ、　（ＧＩＹ　１　
）を発現するための複製しうるプラスミド性発現ビヒク
ルを製造−ｔ−るために用いる方法の模式図を示す。 第５図はγＩＦＮ−ａＡ（Ｇｌｙ　１　、０（１ｒ　９
８）を発現するための複製しうるプラスミド性発現ビヒ
クルを製造するために用いる方法の模式図を示す。 図中の星印は、システィンをコードするヌクレオチドト
リジレットをおき代えるヌクレメーブード置換を示す。 代理人　滉　村　皓 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、ＣＩ、’　識別記号　庁内整理番号０発　明
　者　スタンリイ　ジョセフ　アメリカ合衆国ニターノ
ウスキー、ジ　ンド　アベニューユニア ユ−ジャージ−州ナットリイ、ブリーラ１５ 手続補正、ＩＦ輸発） ＋Ｖ＋和５９年７月り１．３Ｆ３ 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭和５９年特許羅１第１１２１６０　号２、発明の名称 インターフェロン活性を’ｆｊするポリペプチド３、補
正をする者 ＋Ｉｉｆ’ｌとの関係　特、１′１出願人４、代理人 ５、補１１：命令の日刊 昭和　年　月　１１ ６、補１１１により増加する発明の数 ７°補“「０対象　明　細　書 ・、・）ハ、１゛′・上１ 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和ｇう２年特許願第１／、＞ｙｌθ　号°１ 、発明の名称 、イ＞ター’７（ｆｌンン表・ｊ往輪巾ポーラへ′づ°
そｏく３、補正をする者 事１’ｌとの関係　特１：′Ｉ出願人 °″−°°人 ５、補正命令の日付 昭和す２年　７月２を日 ６、補正により増加する発明の数　、−一１．７、補正
の５ ［ヌ 内容　別紙のとおり 図面の序口　（内容に変更なし）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　アミノ酸配列が、γＩＦＮ−α、バイブリドγ
   ＩＦＮ−α、γＩＦＮ−βオヨヒγＩＦＮゴ　より選択
   したインターフェロンのアミノ酸配列に相当するが、た
   だし、少なくとも１個のシスティン残基が、分子間ジス
   ルファイド結合を形成しえないアミノ酸残基によりおき
   かえ、られていることを特徴とする、インターフェロン
   活性を有するポリペプチド。 （２）１位のシスティン残基がグリシン残基でおき代え
   られているγＩＦＮ−αまたはバイブリドγＩＦＮ−α
   である上記（１）項記載ポリペプチド。 （３）９８．９９または１００位のシスティン残基がセ
   リン残基によりおき代えらｉｔている上記（２）項記載
   のポリペプチド。 （４）該γＩＦＮ−αがγＩＦＮ−αＤまたは８６位シ
   スティン残基を含めたγＩＦＮ−αＤのフラグメントを
   含有しているバイブリドγＩＦ’Ｎ−α　であって、８
   ６位の該システィン残基はセリン残基によりおき代えら
   れている、上記（２）または（３）項記載のポリペプチ
   ド。 （５）式 ％式％ （ （但し式中、Ｒ１およびＲ２は、Ｒ１およびＲ２の少な
   くともひとつが分子間ジスルファイド結合にあづかりえ
   ないアミノ酸残基であることを前提として、アミノ酸残
   基であるとする）を有するポリペプチド。 （６）　Ｒ”がＧｌｙでＲ２がＣｙｓである上記（５）
   項記載のポリペプチド。 （７）Ｒ１がＧｌｙでＲ２がＳｅｒである上記（５）項
   記載のポリペプチド。 （８）完全配列中での第１アミノ酸を欠如する上記（１
   ）から（７）項記載のポリペプチド。 （９）　アミノ酸配列のアミン末ＹＡＫ追加してメチオ
   ニン残基な有する上記（１）から（７）項記載のポリペ
   プチド。 θ１　γＩＦＮ−α、バイブリドγＩＦＮ−α、γＩｌ
   ？Ｎ−β　およびγＩＦＮ−γより選択したインターフ
   ェロンのアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有する
   が、しかし、少なくともひとつのシスティン残基は分子
   間ジスルファイド結合を形成しえないアミノ酸残基でお
   き代えられているアミノ酸配列を有する単量体型の、イ
   ンターフェロン活性を有するポリペプチドを大量割合に
   含有し、２鎖体よりは高い集合をした、ポリペプチドの
   オリゴマー型は本質的に含有しない薬剤組成物。 （ロ）ポリペプチドが上記（２）から（９）項までのい
   ずれかに記載のものである、上記αり項記載の組成物。 （２）抗ウィルス活性を有する、上記α１または０１）
   項記載の薬剤組成物。 α［有］　γＩＦＮ−α、バイブリドγＩＦＮ−α、ｒ
   ＩＦＮ−β　およびγＩＦＮ−γより選択したインター
   フェロンのそれに対応するアミノ酸配列を有するが、し
   かし、少なくともひとつのシスティン残基は分子間ジス
   ルファイド結合を形成しえないアミノ酸残基でおき代え
   られている、インターフェロン活性を有するポリペプチ
   ドをコードするコード鎖と、相補的な鎖とを包含する２
   本鎖ＤＮＡ配列。 α→　配列 Ｘ　ＧＡＴ　ＣＴＧ　ＣＣＴ　ＣＡＡ　ＡＣＣＣＡＣＡ
   ＧＣＣＴｕ　（）ＧＴ　ＡＧＣＡＧＧ　ＡＧＧＡＣＣＴ
   ＴＧ　ＡＴＧ　ＣＴＣＣＴＧ　ＧＣＡ　ＣＡＧ　ＡＴＧ
   　Ａ、ＧＨＡＡＡ　ＡＴＣＴＣＴ　ＣＴＴ’ｌｌ’Ｔｃ
   　’１’ＣＣＴＧＣＴＴＧ　ＡＡＧ　ＧＡＣＡＧＡ　Ｃ
   ＡＴ　ｆＪＡＣＴＴＴ　ＧＧＡ　ＴＴＴ　ＣＣＣＣＡ（
   ）　ＧＡＧ　ＧＡＧ　’ｒＴＩ’　ＧＧＣＡＡＣＣＡＧ
   　Ｔ’ｌ’ＣＣＡＡ　ＡＡＧ　ＧＣＴ　ＧＡＡ　ＡＣＣ
   Ａ’ｒＣＣＣＴ　ＧＴＣＣＴＣＣＡＴ　ＧＡＧ　ＡＴＧ
   　ＡＴＣＣＡ（）　ＣＡＧ　ＡＴＣＴＴＣＡＡＴＣＴＣ
   Ｔ’Ｉ’ＣＡＧＣＡ、ＣＡ　ＡＡＧ　ＧＡＣＴＣＡ　Ｔ
   Ｃ’Ｊ：’　ｃＪｃＴ　ＧＣＴ　ＴＧＧ　ＧＡＴ　ＧＡ
   ＧＡＣＣＣＴＣＣＴＡ　ＧＡＣＡＡＡ　ＴＴＣＴＡＣＡ
   Ｃ’Ｌ：’　ＯＡＡ　ＣＴＣＴＡＣＣＡＧ　ＣＡＧＣＴ
   Ｇ　ＡＡＴ　ＧＡＣＣＴＧ　ＧＡＡ　ＧＣＣＹ　Ｇ’；
   ＪＧ　Ａ、’ｉ’Ａ　（：ＡＧ　ＧＧＧ　ＧＴＧ　ＧＧ
   ＧｏＴｆ）　ＡＣＡ　ＧＡＧ　ＡＣ’ｒ　ＣＣＣＣＴＧ
   　ＡＴＧ　ＡＡｔｌ　ｔｌＡｔ）　ＧＡ、ＣＴＣＣＡＴ
   Ｔ　ＣＴＧＧＣＴ　ＧＴＧ　Ａ（）Ｌ）　ＡＡＡ　ＴＡ
   ＣＴＴＣＣＡＡ　ＡＧＡ　ＡＴ（、’　ＡＣＴ　ＣＴＣ
   ＴＡＴ　ＣＴＧＡＡＡ　ＧＡＧ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＴＡ
   ＣＡＧＣＣＣ’ｌ’　Ｔ（］ＧＴ（Ｉｃ（！　Ｔ（）Ｃ
   ＧＡＧ　ＧＴＴ　ＧＴＣＡＧＡ　ＧＣＡ　ＧＡＡ　ＡＴ
   ＣＡＴＧ　ＡＧＡ　ＴＣ’ｌ”１”１″ｉ！　’Ｉ’Ｃ
   ’Ｊ”Ｉ’Ｉ’Ｇ　ＴＣＡ　ＡＣＡ　ＡＡＣ’Ｉ’ＴＧ
   　ＣＡＡ　ＧＡＡ　ＡＧ’Ｉ”Ｌ’ＴＡ　ＡＧＡ　ＡＧ
   ’ｌ’　ＡＡ（Ｊ−（３八八（ただし式中、ＸおよびＹ
   のコードするアミノ酸残基の少なくともひとつは分子間
   ジスルファイド結合の形成にあづかり得ないという前提
   で、ＸおよびＹはアミノ酸残基なコードするヌクレオチ
   ドトリプレットであるとする）を包含するコード鎖を有
   する、上記Ｑ３項記載の２本鎖ＤＮＡ配列。 （ト）　ｘＩＪ′−グリシン残基なコードするヌクレオ
   チドトリプレットである、上記Ｑ４１項記載の２本鎖Ｄ
   ＮＡ配列。 （至）　ＸがヌクレオチドトリプレットＧ、ＧＣである
   、上記（ロ）項記載の２本鎖ＤＮＡ配列。 αη　Ｙがセリン残基なコードするヌクレオチドトリプ
   レットである上記◇荀またはＱＯ項記載の２本鎖ＤＮＡ
   配列。 （ハ）　ＹがヌクレオチドトリプレットＡＧＣである、
   上記α→から０９項までに記載の２本鎖ＤＮＡ配列。 ０呻（ａ）　レプリコン； （ｂ）　プロモーター−オペレーター配列；（Ｃ）　翻
   訳開始シグナルを含むりメデーム結合サイトをコードす
   るＤＮＡ配列および （ａ）　該プロモーター−オペレーター配列とインフェ
   ースにある、γＩＦＮ−α、ノ・イブリドγＩＦＮ−α
   、７ＩＦＮ−βおよびｒＩＦＮゴより選択したアミノ酸
   配列を包含するが、しかし、少なくともひとつのシステ
   ィン残基は、分子間ジスルファイド結合を形成しえない
   アミノ酸残基によりおき代えられている、インターフェ
   ロン活性を有するボリペプチドをコードするＤＮＡ配列
   および翻訳停止シグナル を包含する、複製しうるプラスミド性発現ビヒクル。 翰　コードされるポリペプチドが、上記（２）から（８
   ）項までに記載のものである、上記α１項記載の、複製
   しうるプラスミド性発現ビヒクル。 ｆ２１）　５’末端から読んで、ポリペプチドをコード
   するＤＮＡ配列のコード鎖が、上ｉｔ：　（Ｉ→から（
   ハ）項までのいずれかに記載の配列を含有する、上記α
   ９項記載のｖ型しうるプラスミド性発現ビヒクル。 （イ）上記Ｑ窃からＱｌ）項までに記載の複製しうるプ
   ラスミド発現ビヒクルで形質転換された宿主微生物な包
   含する形質転換微生物。 翰　宿主微生物がＥ、　ｃｏｌｉである、上記（２）項
   記載の形質転換微生物。 Ｈ（ａ）　ｙＩＦＮ−ａ、バイブリドγｌｌｉ°ｊＪ−
   ａ、ｙＩＦＮ−βおよびγＩ　ＦＮ−ｒより選択したイ
   ンターフェロンをコードする配列を含有するｄｓｌ）Ｎ
   Ａをエンドヌクレアーゼで切断して、システィン残基な
   コードするヌクレオチドトリプレットを含有する第１の
   ｄ　８ＤＮＡフラグメントと、インターフェロンの残余
   の部分をコードする、ひとつまたはひとつより多くの他
   の切断フラグメントを生成させ：（＋））　システィン
   をコードするヌクし／オチドトリデレットを含有する第
   １のＤＮＡ切断フラグメントを、インターフェロンの残
   余の分をコードする他の切断フラグメントより分離し； （Ｃ）　分離された第１のフラグメントに相当するが、
   しかし、システィン残基をコードするヌクレオチドトリ
   プレットは、分子間ジスルファイド結合を形成しえない
   アミノ酸残基をコードするヌクレオチドトリプレットに
   よりｉ＋５き代えられており、インターフェロンの残余
   の分をコードするｄｓＤＮＡ配列（単または複数）の末
   端に相補的な末端を有するｄｓＤＮＡ配列を調製し；そ
   して （ｄ）　該ｄｓＤＮＡ配列を適正な配向におｔ・て連結
   させて、インターフェロン活性を有し、そして、γＩＦ
   Ｎ−α、バイブリドγＩＦＮ−α、γＩ　ＦＮ−βおヨ
   ヒγｒＦＮ−γ　より選択したインターフェロンのアミ
   ノ酸配列を有するがしかし、少なくともひとつのシステ
   ィン残基が、分子間ジスルファイド結合を形成しえない
   アミノ酸残基でおき代えられているボリペデチＰをコー
   ドする２本鎖（ｄｓ）ＤＮＡを生成さすことを包含する
   、該変型ｄｓＤＮＡの製造方法。 （ハ）配列 Ｘ　ＧＡＴ　ＣＴＧ　ＣＣＴ　ＣＡＡ　ＡＣＣＣＡＣＡ
   、ＧＣＣＴ（Ｉ　ＣＩＧＴ　ＡＧＣＡＧＧ　ＡＧＧＡＣ
   ＣＴＴＧ　ＡＴＧ　ＣＴＣＣＴＧ　ＧＣＡ　ＣｋＧ　Ａ
   ＴＯＡ、Ｉ）（ｌＡＡＡ　ＡＴＣＴＣＴ　ＣＴＴ’ｒＴ
   ＣＴＣＣＴＧＣＴＴＧ　ＡＡＧ　ＧＡＣＡ（）Ａ　ＣＡ
   Ｉ’　ｔｌＡｃ　ＴＴＴ　ＧＧＡ　ＴＴＴ　ＣＣＣＣＡ
   Ｇ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　Ｔ’ＩＴ　ＧＧＣＡＡＣＣＡＧ　
   Ｔ’Ｉ’ＣＩ：ｈＡ−ＡＡＧ　ＧＣＴ　ＧＡＡ　ＡＣＣ
   ＡＴＣＣＣＴ　ＧＴＣＣＴＣＣＡＴ　ＧＡＧ　ＡＴＧ　
   Ａ’ｌ’ＣｃＡｎ　Ｃ！ＡＧ　ＡＴＣＴＴＣＡＡＴＣＴ
   ＣＴＴＣＡＧＣＡＣＡ　ＡＡＧ　ＧＡＣＴＣＡ　ＴＣＴ
   　ｔ、ＩσＪ、’　ＧＣＴ　ＴＧＧ　ＧＡＴ　ＧＡＧＡ
   ＣＣＣＴＣＣＴＡ　ＧＡＣＡＡＡ　ＴＴＣＴＡＣｋＣＴ
   　（］八ＡＡＣＴＣＴＡＣＣＡＧ　ＣＡＧＣＴＧ　ＡＡ
   Ｔ　ＧＡＣＣＴＧ　ＧＡＡ　ＧＣＣＹ　（］ＴＧＧＡ’
   ｌ’＾　ＣＡＧＧＧＧ　ＧＴＧ　ＧＧＧ（）ＴＧ　ＡＣ
   Ａ　ＧＡＧ　ＡＣＴ　ＣＣＣＣＴＧ　ＡＴＯＡＡ（Ｊ　
   ＨＡ（ｊ　（）ＡＣＴＣＣＡＴＴ　ＣＴＧＧＣＴ　ＧＴ
   Ｇ　ＡＧＧ　ＡＡＡ　ＴＡＣＴＴＣＣＡＡ　Ａ（ＪＡ　
   ＡＴＣＣＡＣＴ　ＣＴＣＴＡＪ’　ＣＴＧＡＡＡ　ＧＡ
   ｆｉ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＴＡＣＡＧＣＣＣＴ　ＴＯ’Ｌ
   ’　ＯＣＣＴＧＣＧＡＧ　ＧＴＴ　ＧＴＣＡＧＡ　ＧＣ
   Ａ　ＧＡＡ　ＡＴＣＡＴＧ　ＡＧＡ　ＴＣＴ　Ｔ’Ｉ’
   Ｔ　’ｌ’ｃＴ　ＴＴ（）　ＴＣＡ　ＡＣＡ　ＡＡＣＴ
   ＴＧ　ＣＡＡ　ＧＡＡ　ＡＧＴ　ＴＴＡ　ＡＧＡ　ＡＧ
   Ｔ　ＡＡＧ　０ＡＡ（ただし式中、ＸおよびＹのコード
   するアミノ酸残基の少なくともひとつは分子間ジスルフ
   ァイド結合の形成に関与しえぬという前提で、Ｘおよび
   Ｙはアミノ酸残基をコードするヌクレオチドトリプレッ
   トであるとする）をコード鎖が包含する、上記（ハ）項
   記載の方法。 （イ）　Ｘがグリシンをコードするヌクレオチドトリプ
   レットである上記（ホ）項記載の方法。 ＠　ＸがヌクレオチドトリプレットＧＧＣである上記（
   ハ）項記載の方法。 （ホ）　Ｙがセリン残基をコードするヌクレオチドトリ
   プレットである上記（ハ）または（イ）項記載の方法。 ＠　ＹがヌクレオチドトリプレットＡＧＣである上記（
   ２）から翰項までのいずれかに記載の方法。 （イ）上記（ハ）から翰項までのいずれかに定義のＤＮ
   Ａ配列を含有する発現ビヒクルで形質転換された宿主を
   培養し、宿主に該ポリペプチドを発現させそして該ポリ
   ペプチドを採取することを包含する、インターフェロン
   活性を有し、そして、γＩＦＮ−α、バイブリドγＩＦ
   Ｎ−α、γＩＦＮ−βおよびγＩＦＮゴ　より選択した
   インターフェロンのアミノ酸配列を有するが、しかし、
   少なくともひとつのシスティン残基が、分子間ジスルフ
   ァイド結合しえないアミノ酸残基でおき代えられている
   ７１？　リペデチドを製造する方法。 ＜つ］）該宿主がＥ、　ｃｏｌｉである上記（１）項記
   載の方法。 ０２」二記（１）から（９）項に記載の７１？リペデチ
   ドを抗ウィルスまたは抗腫瘍剤に用いること。 ０３　本明細書中に記載の発明。