JPS5988092A - ハイブリツドプラスミド - Google Patents
ハイブリツドプラスミドInfo
- Publication number
- JPS5988092A JPS5988092A JP57197360A JP19736082A JPS5988092A JP S5988092 A JPS5988092 A JP S5988092A JP 57197360 A JP57197360 A JP 57197360A JP 19736082 A JP19736082 A JP 19736082A JP S5988092 A JPS5988092 A JP S5988092A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- plasmid
- restriction enzyme
- dna fragment
- hybrid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
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- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はハイブリッドプラスミドに関し、さらに詳しく
は雑種タンパクの発現に好適なハイブリッドプラスミド
に関する。
は雑種タンパクの発現に好適なハイブリッドプラスミド
に関する。
大腸菌の外膜を構成するタンパク質のひとつのＯｍｐ
’！タンパク質は、大腸菌が最も多量に生産するタンパ
ク質のひとつである。その遺伝子ｏｍｐ ’Ｈのプロモ
ーターやりボゾーム結合領域はきわめて効率よく機能し
ているものと考えられる。Ｏｍｐ Ｆ遺伝子の発現は複
雑な制御を受けるが、そのひとつとしてａｍｐ Ｆ遺伝
子発現の正の制御遺伝子Ｏｍｐ Ｂ遺伝子が知られてお
り、９より欠損変異株では因り遺伝子は発現しない。
’！タンパク質は、大腸菌が最も多量に生産するタンパ
ク質のひとつである。その遺伝子ｏｍｐ ’Ｈのプロモ
ーターやりボゾーム結合領域はきわめて効率よく機能し
ているものと考えられる。Ｏｍｐ Ｆ遺伝子の発現は複
雑な制御を受けるが、そのひとつとしてａｍｐ Ｆ遺伝
子発現の正の制御遺伝子Ｏｍｐ Ｂ遺伝子が知られてお
り、９より欠損変異株では因り遺伝子は発現しない。
また培地の浸透圧によっても制御を受け、高浸透圧培地
中では匹１遺伝子の発現は抑制される。
中では匹１遺伝子の発現は抑制される。
ｏｍｐ Ｆ遺伝子の全塩基配列は本発明者らによって決
定されたが、それによればＯｍｐ Ｆ’タンパク質はま
ずアミノ末端にココケのアミノ酸よりなるシグナル・ペ
プチドをつけた前駆体として合成される。このシグナル
・ペプチドはＯｍｐ Ｆタンパク質の細胞質膜からの分
利に必須の役割を担っているものと考えられる。さらに
Ｏｍｐ Ｆタンパク質は外膜中で細胞壁を構成するペプ
チドグリカンと強い親和性をもった非常に安定な形で多
量に存在しており、この性質を利用して菌体から容易に
精製することのできるタンパク質でもある。
定されたが、それによればＯｍｐ Ｆ’タンパク質はま
ずアミノ末端にココケのアミノ酸よりなるシグナル・ペ
プチドをつけた前駆体として合成される。このシグナル
・ペプチドはＯｍｐ Ｆタンパク質の細胞質膜からの分
利に必須の役割を担っているものと考えられる。さらに
Ｏｍｐ Ｆタンパク質は外膜中で細胞壁を構成するペプ
チドグリカンと強い親和性をもった非常に安定な形で多
量に存在しており、この性質を利用して菌体から容易に
精製することのできるタンパク質でもある。
本発明は、上記のような性質を有する大腸菌をはじめと
するダラム陰性菌の外膜タンパク質ｏｍｐ Ｆ遺伝子に
関する研究の一環として、このｏｍｐ ’？遺伝子を含
むプラスミドについて種々検討を行ない、その結果本発
明に到達した。
するダラム陰性菌の外膜タンパク質ｏｍｐ Ｆ遺伝子に
関する研究の一環として、このｏｍｐ ’？遺伝子を含
むプラスミドについて種々検討を行ない、その結果本発
明に到達した。
すなわち、本発明の要旨は、大腸菌多コピー数プラスミ
ドの制限酵素Ｓａｌ ｌ切断サイトに、？１Ｆ遺伝子を
含み、ｙ呼Ｆ遺伝子より下流にＰｖｕ ［切断サイトを
有するＤＮＡフラグメントを挿入してなることを特徴と
するハイブリッドプラスミドにちる。
ドの制限酵素Ｓａｌ ｌ切断サイトに、？１Ｆ遺伝子を
含み、ｙ呼Ｆ遺伝子より下流にＰｖｕ ［切断サイトを
有するＤＮＡフラグメントを挿入してなることを特徴と
するハイブリッドプラスミドにちる。
以下、本発明の詳細な説明する。
まず、本発明において原料プラスミドとして用いられる
のは、コピー数の多い、太編菌由来のプラスミド、すな
わちいわゆる大腸菌多コピー数プラスミドである。この
ようなプラスミドとしては、Ｓａｄ ｌ切断サイトラ有
するものであれば特に制限されないが、たとえば１：、
ＢＲ，？ココ、ｐＢＲ３コタ、ｐＡＯＹｏ／ｇｌＩ等が
挙げられるが、ｐＢＲＪ−一が最も好ましい。
のは、コピー数の多い、太編菌由来のプラスミド、すな
わちいわゆる大腸菌多コピー数プラスミドである。この
ようなプラスミドとしては、Ｓａｄ ｌ切断サイトラ有
するものであれば特に制限されないが、たとえば１：、
ＢＲ，？ココ、ｐＢＲ３コタ、ｐＡＯＹｏ／ｇｌＩ等が
挙げられるが、ｐＢＲＪ−一が最も好ましい。
本発明のハイブリッドプラスミドは、この原料プラスミ
ドの制限酵素５ａ１１切断サイトに、特定のＤＮＡフラ
グメントを挿入してなる。このＤＮＡフラグメントは、
雪Ｆを含み、ｏｍｐＦ遺伝子より下流にＰｖｕ ＩＩｌ
切断サイト有するものである。このようなりＢ！Ａフラ
グメントは、好適には、大腸菌に一／−のｏｍｐ Ｆ形
質導入λファージであるλｙ駐Ｆ ／ （、Ｔｏｕｒｎ
ａ’ｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ７゜／＋ｊ、
／θざＡ−１０９０）より、制限酵素Ｓａｌ Ｉにより
切断して単離することによって得ることができる。
ドの制限酵素５ａ１１切断サイトに、特定のＤＮＡフラ
グメントを挿入してなる。このＤＮＡフラグメントは、
雪Ｆを含み、ｏｍｐＦ遺伝子より下流にＰｖｕ ＩＩｌ
切断サイト有するものである。このようなりＢ！Ａフラ
グメントは、好適には、大腸菌に一／−のｏｍｐ Ｆ形
質導入λファージであるλｙ駐Ｆ ／ （、Ｔｏｕｒｎ
ａ’ｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ７゜／＋ｊ、
／θざＡ−１０９０）より、制限酵素Ｓａｌ Ｉにより
切断して単離することによって得ることができる。
また、大腸菌（ｙすＦ＋ ＞よシ全染色体ＤＮＡをとり
、Ｓａｌ Ｉで切断して、ｐ ＢＲ３２−の５ａ１１切
断サイトに導入し、宿主大腸菌（！ ” 。
、Ｓａｌ Ｉで切断して、ｐ ＢＲ３２−の５ａ１１切
断サイトに導入し、宿主大腸菌（！ ” 。
μｎｐＦ）に導入して形質転換して！ Ｆ”のものを選
択することによっても得ることができる。
択することによっても得ることができる。
本発明における上記ＤＮＡフラグメントは、第１図に示
されるように、ｏｍｐ Ｆ遺伝子より上流に１ｉｌｃｏ
ＲＩ 切断サイトを一箇所、下流にＨ１ｎｄ■及びＰ
ｖｕ ■切断サイトをそれぞれ／箇所、遺伝子中にＰｙ
ｕ ［切断サイトを／箇所有する。
されるように、ｏｍｐ Ｆ遺伝子より上流に１ｉｌｃｏ
ＲＩ 切断サイトを一箇所、下流にＨ１ｎｄ■及びＰ
ｖｕ ■切断サイトをそれぞれ／箇所、遺伝子中にＰｙ
ｕ ［切断サイトを／箇所有する。
原料プラスミドとしてｐＢＲＪコ、２、ＤＮＡフラグメ
ントとしてλｏｍｐ Ｆ） 由来のものを用いる ３− 場合の製造の概略を第１図に示す。黒の太線さ く■）はＦｆ、 ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ、白抜Ｉの太線
（ロ）はλフアージＤＮＡを示す。ｐ ＢＲ３ココは細
線で示される。μｎｐＦ、遺伝子の位置は、（＋で示さ
れる（閣は開始点、酬は終止点晃Ｓ、 Ｂ、、Ｆｆ、
Ｈ及びＰは、それぞれ制限酵素８ａｌ Ｉ、Ｂａｍ
ＨＩ、 ＫｃｏＲｌ 、 ’Ｈ１ｎａ ｍ及びＰｖｕ■
切断サイトを示す。また、Ａｐ ｒはアンピシリン耐性
、ＴＣｒはテトラサイクリン耐性を示し、ｏｒｉは複製
起点を示す（λｙ叩−Ｆ／ ＤＮＡにおいては、Ｂａｍ
Ｈ■及び８ａｌ Ｉ 切断サイトのみが示されてい
る）。第１図に示されるように、λ■Ｆ′ノより単離さ
れた約ｌダに’ｔ）の５ａｌｌＤＮＡフラグメントは、
ｐＢＲ３ココをＳａｌ ｌで切断したものと混合され、
Ｔ＋ＤＮＡＩＪガーゼ処理される。目的とするハイブリ
ッドプラスミド４ｐＬｙｘ、ｐＬＦ Ｊ）は上記ＤＮＡ
フラグメントが、 ｐＢＲ３−一の８ａｌ■切断サイト
にそれ、それ逆向きに挿入されたものである。
ントとしてλｏｍｐ Ｆ） 由来のものを用いる ３− 場合の製造の概略を第１図に示す。黒の太線さ く■）はＦｆ、 ｃｏｌｉ染色体ＤＮＡ、白抜Ｉの太線
（ロ）はλフアージＤＮＡを示す。ｐ ＢＲ３ココは細
線で示される。μｎｐＦ、遺伝子の位置は、（＋で示さ
れる（閣は開始点、酬は終止点晃Ｓ、 Ｂ、、Ｆｆ、
Ｈ及びＰは、それぞれ制限酵素８ａｌ Ｉ、Ｂａｍ
ＨＩ、 ＫｃｏＲｌ 、 ’Ｈ１ｎａ ｍ及びＰｖｕ■
切断サイトを示す。また、Ａｐ ｒはアンピシリン耐性
、ＴＣｒはテトラサイクリン耐性を示し、ｏｒｉは複製
起点を示す（λｙ叩−Ｆ／ ＤＮＡにおいては、Ｂａｍ
Ｈ■及び８ａｌ Ｉ 切断サイトのみが示されてい
る）。第１図に示されるように、λ■Ｆ′ノより単離さ
れた約ｌダに’ｔ）の５ａｌｌＤＮＡフラグメントは、
ｐＢＲ３ココをＳａｌ ｌで切断したものと混合され、
Ｔ＋ＤＮＡＩＪガーゼ処理される。目的とするハイブリ
ッドプラスミド４ｐＬｙｘ、ｐＬＦ Ｊ）は上記ＤＮＡ
フラグメントが、 ｐＢＲ３−一の８ａｌ■切断サイト
にそれ、それ逆向きに挿入されたものである。
上記のようにλ部すＦ ／由来のＤ Ｎ Ａ、 ７ラグ
メ ４− ントを用いる場合には、ｏｍｐ Ｆ遺伝子より下流の末
端はλファージＤＩＪＡ部を介してλフアージＤＮＡの
Ｓａｌ ｌ切断サイトにより、ｐＢＲ，？、２コのＳａ
ｌ ｌ切断サイトに結合されることとなる。
メ ４− ントを用いる場合には、ｏｍｐ Ｆ遺伝子より下流の末
端はλファージＤＩＪＡ部を介してλフアージＤＮＡの
Ｓａｌ ｌ切断サイトにより、ｐＢＲ，？、２コのＳａ
ｌ ｌ切断サイトに結合されることとなる。
ｐＬＦｕ、ｐＬＦ ３のような本発明に係るハイブリッ
ドプラスミドは、多コピー数プラスミドに全Ｏｍｐ Ｆ
遺伝子を含むり、ＮＡフラグメントを組み込んでおり、
幻」Ｆ遺伝子のシグナル・ペプチド下流の翻訳領域には
制限酵素Ｂｇｌｌｌ切断サイトを有する。したがって、
このＢｇｌｌｌ切断サイトに医薬的に有益なタンパク質
遺伝子を挿入すると、ｆｆ１Ｆ遺伝子と目的タンパク質
遺伝子との雑種遺伝子を合成し得る。こうして得ら力、
る雑種プラスミドを、形質転換によって正常な０１ｎｐ
Ｂ遺伝子を持つ大腸菌（たとえば、ＨＤ／θ／、Ｘ／
７７４等）に導入すれば、目的タンパク質遺伝子はＯｍ
ｐ Ｆ遺伝子の強力なプロモーターによって効率よく転
写され、多量に合成されるＯｍｐＦタンパク質と目的タ
ンパク質よりなる雑種り７ ハク’Ｊｔを、ＯｍｐＦタ
ンパク質のシグナル・ぺブチドによって細胞質膜外に公
租することができる。
ドプラスミドは、多コピー数プラスミドに全Ｏｍｐ Ｆ
遺伝子を含むり、ＮＡフラグメントを組み込んでおり、
幻」Ｆ遺伝子のシグナル・ペプチド下流の翻訳領域には
制限酵素Ｂｇｌｌｌ切断サイトを有する。したがって、
このＢｇｌｌｌ切断サイトに医薬的に有益なタンパク質
遺伝子を挿入すると、ｆｆ１Ｆ遺伝子と目的タンパク質
遺伝子との雑種遺伝子を合成し得る。こうして得ら力、
る雑種プラスミドを、形質転換によって正常な０１ｎｐ
Ｂ遺伝子を持つ大腸菌（たとえば、ＨＤ／θ／、Ｘ／
７７４等）に導入すれば、目的タンパク質遺伝子はＯｍ
ｐ Ｆ遺伝子の強力なプロモーターによって効率よく転
写され、多量に合成されるＯｍｐＦタンパク質と目的タ
ンパク質よりなる雑種り７ ハク’Ｊｔを、ＯｍｐＦタ
ンパク質のシグナル・ぺブチドによって細胞質膜外に公
租することができる。
以下、実施例により本発明をさらに説明する。
実施例１
ｏｍｐ Ｆ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントの単離／３
７，１０／ −１０７）に従ツ７’（（Ｌ培地、３０℃
）。
７，１０／ −１０７）に従ツ７’（（Ｌ培地、３０℃
）。
λｏｇｐ Ｆ ／のＤＮＡを常法に従いフェノール抽出
によって得た後、エタノール沈殿によって回収した。
によって得た後、エタノール沈殿によって回収した。
λ弄Ｆ ／ Ｄ Ｎ Ａを制限酵累Ｓａｌ Ｉで完全切
断し、アガロースゲル電気泳動にかけた。ｏｍｐ Ｆ遺
伝子を含む／ ４’ ｋｂのフラグメント部分を切り出
し、ＤＮＡフラグメントの溶出精製を行なった。多コピ
ー数プラスミドベクターｐＢＲ３；１２をＳａｌ Ｉで
完全切断し、λｏｍｐ Ｆ ／ より切り出し１０ユ
／−１０１ｋ）に従ってＴ４ＺＤＩＪＡリガーゼ処（μ
ｎｐＢ−）に形質転換して、アンピシリン耐性株を得た
。得られた株よりのプラスミドＤＮＡを解析することに
よって、λｙ■−Ｆ”由来の約／ ４（ｋｌ）のＳａｌ
ＴフラグメントがｐＢＲ３２２の５ａｌＩ切断サイト
にそれぞれ逆向きに挿入されたコ種のプラスミドｐＬＦ
２及びｐＬＦ ３を得ｆｃ、（第１図）。
断し、アガロースゲル電気泳動にかけた。ｏｍｐ Ｆ遺
伝子を含む／ ４’ ｋｂのフラグメント部分を切り出
し、ＤＮＡフラグメントの溶出精製を行なった。多コピ
ー数プラスミドベクターｐＢＲ３；１２をＳａｌ Ｉで
完全切断し、λｏｍｐ Ｆ ／ より切り出し１０ユ
／−１０１ｋ）に従ってＴ４ＺＤＩＪＡリガーゼ処（μ
ｎｐＢ−）に形質転換して、アンピシリン耐性株を得た
。得られた株よりのプラスミドＤＮＡを解析することに
よって、λｙ■−Ｆ”由来の約／ ４（ｋｌ）のＳａｌ
ＴフラグメントがｐＢＲ３２２の５ａｌＩ切断サイト
にそれぞれ逆向きに挿入されたコ種のプラスミドｐＬＦ
２及びｐＬＦ ３を得ｆｃ、（第１図）。
第１図は本発明のハイブリッドプラスミドの製造の概略
を示す説明図である。 出 願 人 水 島 昭 二枚
理 人 弁理士 長谷用 − ほか１名 一フー 図面のｒｆ”ｂ：（内ぜｆに変更なし）第 １ 図 ８− 手続？ｍｍ前書方式） １ 事件の表示 昭和５７年特ｎ願第１９７３６０号 ２ 発明の名称 ハイブリッドプラスミド ３ 補正をする者 事ｆ［との関係 出願人 水島昭二 ４代理人 〒１００ 東京都千代田区丸の内二丁目５番２号 三菱化成工業株式会社内 （ばか１名） ５？１ｍ正命令の日付 昭和５８年２月２２日（発送日
）６ 補正の対象 代理権を証明する書面および願
書、明細書、図面 ７ 補正の内容 別紙の通り委任状を提出する。
を示す説明図である。 出 願 人 水 島 昭 二枚
理 人 弁理士 長谷用 − ほか１名 一フー 図面のｒｆ”ｂ：（内ぜｆに変更なし）第 １ 図 ８− 手続？ｍｍ前書方式） １ 事件の表示 昭和５７年特ｎ願第１９７３６０号 ２ 発明の名称 ハイブリッドプラスミド ３ 補正をする者 事ｆ［との関係 出願人 水島昭二 ４代理人 〒１００ 東京都千代田区丸の内二丁目５番２号 三菱化成工業株式会社内 （ばか１名） ５？１ｍ正命令の日付 昭和５８年２月２２日（発送日
）６ 補正の対象 代理権を証明する書面および願
書、明細書、図面 ７ 補正の内容 別紙の通り委任状を提出する。
Claims (1)
- （１）大腸菌多コピー数プラスミドの制限酵素Ｓａｌ
Ｉ切断サイトに、ｏｍｐ Ｆ遺伝子を含み、ｏｍｐ ’
Ｆ遺伝子より下流にＰｖｕ ＩＩ切断サイトを有するＤ
ＮＡフラグメントを挿入してなることを特徴とするハイ
ブリッドプラスミド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57197360A JPS5988092A (ja) | 1982-11-10 | 1982-11-10 | ハイブリツドプラスミド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57197360A JPS5988092A (ja) | 1982-11-10 | 1982-11-10 | ハイブリツドプラスミド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5988092A true JPS5988092A (ja) | 1984-05-21 |
Family
ID=16373188
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57197360A Pending JPS5988092A (ja) | 1982-11-10 | 1982-11-10 | ハイブリツドプラスミド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5988092A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003016538A1 (en) * | 2001-08-14 | 2003-02-27 | Korea Advanced Institute Of Science And Technology | A method or extracellular production of target proteins employing ompf in e. coli |
| US10065021B2 (en) | 2007-05-17 | 2018-09-04 | Medgenesis Therapeutix, Inc. | Convection-enhanced delivery catheter with removable stiffening member and method for using same |
-
1982
- 1982-11-10 JP JP57197360A patent/JPS5988092A/ja active Pending
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| J.ABCTERIOL=1981 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003016538A1 (en) * | 2001-08-14 | 2003-02-27 | Korea Advanced Institute Of Science And Technology | A method or extracellular production of target proteins employing ompf in e. coli |
| US10065021B2 (en) | 2007-05-17 | 2018-09-04 | Medgenesis Therapeutix, Inc. | Convection-enhanced delivery catheter with removable stiffening member and method for using same |
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