JPH0376582A - ｌａｃでオペレートされたプロモーターからの外来遺伝子表現の改良された制御 - Google Patents
ｌａｃでオペレートされたプロモーターからの外来遺伝子表現の改良された制御Info
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- JPH0376582A JPH0376582A JP2198116A JP19811690A JPH0376582A JP H0376582 A JPH0376582 A JP H0376582A JP 2198116 A JP2198116 A JP 2198116A JP 19811690 A JP19811690 A JP 19811690A JP H0376582 A JPH0376582 A JP H0376582A
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N15/72—Expression systems using regulatory sequences derived from the lac-operon
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
ラクトース（ｌａｃ）オペロンはｌａｃ−プロモーター
・オペレーターの制御下の３つの蚤０質生成物からなっ
ている。これらの遺伝子生成物はβ−ガラクトシダーゼ
（Ｚ）、ベルミアーゼ（Ｙ）、及びチオガラクトシドト
ランスアセチラーゼ（Ａ）である。
・オペレーターの制御下の３つの蚤０質生成物からなっ
ている。これらの遺伝子生成物はβ−ガラクトシダーゼ
（Ｚ）、ベルミアーゼ（Ｙ）、及びチオガラクトシドト
ランスアセチラーゼ（Ａ）である。
ａｅ１転写物（リプレッサー）である蛋白質生成物は独
立した遺伝子生成物であって、ｌａｃオペロンのオペレ
ーターと相互作用し、β−ガラクトシダーゼ反応の生成
物であるアロラクトース（１、６−０−β−り一力うク
トビラノシルー〇−グルコース）が細胞中に蓄積しそし
てリプレッサーに結合するまで合成を行なわないように
保っている。アロラクトース・リプレッサーｙ！合体は
変１ヒしたコンファーメーション（立体配位）を有し、
リプレッサーがオペレーターから除去出来るようにする
。次にＲＮＡ転写がｌａｃプロモーターから開始する（
ヘラフライズ ジＸ −、［ｌ９８７１ ｒ大腸菌及び
サルモネラティブヒムリコウム（Ｓａｌｉ＋ｏｎｅｌｌ
ａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）細胞及び分子生物学第２
巻、編集主任ニードハートエフ シーアメリカンソサエ
ティオブマイク バイオロジー ワシントンＤＣ）。
立した遺伝子生成物であって、ｌａｃオペロンのオペレ
ーターと相互作用し、β−ガラクトシダーゼ反応の生成
物であるアロラクトース（１、６−０−β−り一力うク
トビラノシルー〇−グルコース）が細胞中に蓄積しそし
てリプレッサーに結合するまで合成を行なわないように
保っている。アロラクトース・リプレッサーｙ！合体は
変１ヒしたコンファーメーション（立体配位）を有し、
リプレッサーがオペレーターから除去出来るようにする
。次にＲＮＡ転写がｌａｃプロモーターから開始する（
ヘラフライズ ジＸ −、［ｌ９８７１ ｒ大腸菌及び
サルモネラティブヒムリコウム（Ｓａｌｉ＋ｏｎｅｌｌ
ａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）細胞及び分子生物学第２
巻、編集主任ニードハートエフ シーアメリカンソサエ
ティオブマイク バイオロジー ワシントンＤＣ）。
少数のｌａｃオペロン転写物の分子はラクトースの非存
在下においてさえ大腸菌中に存在する。従ってベルミア
ーゼとβ−ガラクトシダーゼは常に少なくヒも低い水準
で存在する。このオペロンの天然の誘導物質（インデュ
ーサー）であるアロラクトースは、ラクトース（１，４
−０−β−Ｄ−グラクトビラノシルートグルコース）が
ベルミアーゼ反応によって細胞に侵入し、モしてβ−ガ
ラクトシダーゼによってトランスガラクトシデーション
を通してアロラクトースに転換された時に造られる。
在下においてさえ大腸菌中に存在する。従ってベルミア
ーゼとβ−ガラクトシダーゼは常に少なくヒも低い水準
で存在する。このオペロンの天然の誘導物質（インデュ
ーサー）であるアロラクトースは、ラクトース（１，４
−０−β−Ｄ−グラクトビラノシルートグルコース）が
ベルミアーゼ反応によって細胞に侵入し、モしてβ−ガ
ラクトシダーゼによってトランスガラクトシデーション
を通してアロラクトースに転換された時に造られる。
（フィルダーディ−、［＋９８７］ Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙジェームスアンドバートレットバプ
リッシャーズインコーボレーテッド、カリフォルニア州
ポートラバリー、上二己べ・ツクウィズ）、β−ガラク
トシダーゼによって作用を受けた２０％を越えるラクト
ースがアロラクトースに転換されると計算された（ジョ
ブニー０、ボージョイスエス、［１９７２］ Ｊ。
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙジェームスアンドバートレットバプ
リッシャーズインコーボレーテッド、カリフォルニア州
ポートラバリー、上二己べ・ツクウィズ）、β−ガラク
トシダーゼによって作用を受けた２０％を越えるラクト
ースがアロラクトースに転換されると計算された（ジョ
ブニー０、ボージョイスエス、［１９７２］ Ｊ。
Ｍｏ１．８ｉｏ１．６９：３９７−４０８）、残りのラ
クトースの大部分はグルコースとガラコースに転換され
る。アロラクトースはラクトースよりもβ−カラクトシ
ダーゼに対しよりよい基質であり（上記ジョブ及びボー
ジョイス）そしてそれ自身急速にグルコース及びガラク
トースに転換される。
クトースの大部分はグルコースとガラコースに転換され
る。アロラクトースはラクトースよりもβ−カラクトシ
ダーゼに対しよりよい基質であり（上記ジョブ及びボー
ジョイス）そしてそれ自身急速にグルコース及びガラク
トースに転換される。
ｌａｃオペロンの別の制御エレメントは代謝分解物によ
る抑制（リプレッション）である、グルコースの存在下
で細胞は多くのオペロンを抑制することができる。たと
えばｌａｃオペロンはグルコースの存在下ではその最大
水準の２％で転写されるにすぎないく上記ベックウィズ
）。
る抑制（リプレッション）である、グルコースの存在下
で細胞は多くのオペロンを抑制することができる。たと
えばｌａｃオペロンはグルコースの存在下ではその最大
水準の２％で転写されるにすぎないく上記ベックウィズ
）。
生体内でｌａｃオペロンを誘導する能力につきいくつか
のβ−ガラクトシドが比較されたとき、ラクトースは非
常に乏しいエフェクター分子としてしか作用しないこと
が分った０合成の非代謝βガラクトシドであるイソプロ
ピル−β−Ｏ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）はラクト
ースよりも５倍ラクトースオペロンを誘導することが分
った（モンド ジエ、ジー０、コーエンー・バジール及
びエム、コーン［１９５１］Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ、Ａｃｔａ、７：５８５−５９９）。それでも７
０ラクトース自身はＩＰＴＧと同じくろいのオペロン誘
導物質（インデューサー）である（ミュラー・ヒル、ビ
ー０、エッチ、ブイ、リツケンベルグ及びケイ、ワレン
フエルス［１９６４］Ｊ、Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、ｌＯ：
３０３−３１８；上記ジョブ及びボウジョイス）。
のβ−ガラクトシドが比較されたとき、ラクトースは非
常に乏しいエフェクター分子としてしか作用しないこと
が分った０合成の非代謝βガラクトシドであるイソプロ
ピル−β−Ｏ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）はラクト
ースよりも５倍ラクトースオペロンを誘導することが分
った（モンド ジエ、ジー０、コーエンー・バジール及
びエム、コーン［１９５１］Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ、Ａｃｔａ、７：５８５−５９９）。それでも７
０ラクトース自身はＩＰＴＧと同じくろいのオペロン誘
導物質（インデューサー）である（ミュラー・ヒル、ビ
ー０、エッチ、ブイ、リツケンベルグ及びケイ、ワレン
フエルス［１９６４］Ｊ、Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、ｌＯ：
３０３−３１８；上記ジョブ及びボウジョイス）。
ラクトースのアロラクトースへの変換の効率が与えられ
たならｌａｃオペロンの誘導物質（インデューサー）と
してラクトースが非常によく作用することを予測するか
もしれない、しかしながら本発明の開示以前に於いては
このことは現実には決して起らなかった（上記モノウド
ラ）。
たならｌａｃオペロンの誘導物質（インデューサー）と
してラクトースが非常によく作用することを予測するか
もしれない、しかしながら本発明の開示以前に於いては
このことは現実には決して起らなかった（上記モノウド
ラ）。
ｔａｃなとのｌａｃプロモーター又はｌａｃコンセンサ
スプロモーターからの外来遺伝子表現を制御する現在の
方法（レジンコツ ダブリュ、ニス、及びダブリュ、ア
ール、マツクキュア−［１９８６］ ｒ遺伝子表現の最
大化」ダプリュ、ゼンニコフ及びエル、ゴールド編マサ
チューセッツ州のストーンハムのバターワースパブリッ
シャーズ）はＩＰＴＧ又は別のプロモーター誘導β−ガ
ラクトシドが細胞に加えられるまでｔａｃプロモーター
からの転写がなされない（オフである）ように細胞中に
充分なｌａｃリプレッサーを存在させることである。
スプロモーターからの外来遺伝子表現を制御する現在の
方法（レジンコツ ダブリュ、ニス、及びダブリュ、ア
ール、マツクキュア−［１９８６］ ｒ遺伝子表現の最
大化」ダプリュ、ゼンニコフ及びエル、ゴールド編マサ
チューセッツ州のストーンハムのバターワースパブリッ
シャーズ）はＩＰＴＧ又は別のプロモーター誘導β−ガ
ラクトシドが細胞に加えられるまでｔａｃプロモーター
からの転写がなされない（オフである）ように細胞中に
充分なｌａｃリプレッサーを存在させることである。
Ｉ ＰＴＧは現在の選択される誘導物質（インデューサ
ー〉であるがこれは高価であり発癌性の可能性があるも
のとしてレッテルが貼られている。したがってｌａｃで
オペレートされたプロモーターからの外来遺伝子表現の
制御が使用される商業的な系においてＩ ＰＴＧを置き
換える必要が存在する。
ー〉であるがこれは高価であり発癌性の可能性があるも
のとしてレッテルが貼られている。したがってｌａｃで
オペレートされたプロモーターからの外来遺伝子表現の
制御が使用される商業的な系においてＩ ＰＴＧを置き
換える必要が存在する。
本発明はｌａｃでオペレートされたプロモーターからの
外来遺伝子の表現を制御する改良された方法に間する。
外来遺伝子の表現を制御する改良された方法に間する。
より詳しくは本発明はｌａｃオペロンからＣＡＰ結合位
置及びｌａｃプロモーター／オペレーターを除去するこ
とからなるｌａｃでオペレートされたプロモーターから
の外来遺伝子の表現を制御する方法に間するものである
。本明細書で本発明は、ｌａｃでオペレートされたプロ
モーターからの外来遺伝子の表現を制御するために、ｌ
ａｃオペロンのｌａｃＺ、 Ｙ及びＡ遺伝子を含んでい
る新規な組替えＤＮＡ構築物を使用することとして例示
される。
置及びｌａｃプロモーター／オペレーターを除去するこ
とからなるｌａｃでオペレートされたプロモーターから
の外来遺伝子の表現を制御する方法に間するものである
。本明細書で本発明は、ｌａｃでオペレートされたプロ
モーターからの外来遺伝子の表現を制御するために、ｌ
ａｃオペロンのｌａｃＺ、 Ｙ及びＡ遺伝子を含んでい
る新規な組替えＤＮＡ構築物を使用することとして例示
される。
ｌａｃオペロンのｌａｃＺ、 Ｙ及びＡ遺伝子はｌａｃ
Ｉ構造遺伝子の３′末端に融合されそれによってｌａｃ
オペロンの天然の制御エレメントの全てを除去する。こ
れを行なうことによってｌａｃオペロン遺伝子の生成物
はｌａｃｌプロモーターから構成要素的（コンスティテ
ユーティブ）なモードで造られ、そして代謝分解物の抑
制又はアロラクトースの誘導に応答するものではない。
Ｉ構造遺伝子の３′末端に融合されそれによってｌａｃ
オペロンの天然の制御エレメントの全てを除去する。こ
れを行なうことによってｌａｃオペロン遺伝子の生成物
はｌａｃｌプロモーターから構成要素的（コンスティテ
ユーティブ）なモードで造られ、そして代謝分解物の抑
制又はアロラクトースの誘導に応答するものではない。
ラクトースが加えられた時に構成要素的に合成されたβ
−ガラクトシダーゼは２０％もをアロラクトースへ転換
し、これはざらにｔａｃプロモーターそして任意の関連
する外来遺伝子を脱抑制する。細胞中のアロラクトース
濃度が１０−５Ｍ以上であるかぎるｔａｃプロモーター
は問題の蛋白質の高い表現を与える。本発明のｌａｃ
Ｉ遺伝子のｌａｃＺ、 Ｙ及びＡ遺伝子への転写的な融
合の完全なりＮＡ配列は表１に示されている。
−ガラクトシダーゼは２０％もをアロラクトースへ転換
し、これはざらにｔａｃプロモーターそして任意の関連
する外来遺伝子を脱抑制する。細胞中のアロラクトース
濃度が１０−５Ｍ以上であるかぎるｔａｃプロモーター
は問題の蛋白質の高い表現を与える。本発明のｌａｃ
Ｉ遺伝子のｌａｃＺ、 Ｙ及びＡ遺伝子への転写的な融
合の完全なりＮＡ配列は表１に示されている。
新規なｌａｃ Ｉ ＺＶＡオペロン（表１）は任意のプ
ラスミド中に挿入することができるかまたはこれは任意
の微生物染色体に挿入することができ、（プロモーター
がｌａｃ Ｉ ＺＶＡ転写をドライブするために存在す
る限り） ｌａｃでオペレートされたプロモーターから
の外来遺伝子の表現の制御を改良する。当業者にと、ｔ
ｌｔ！！の構築物が遺伝子を融合するために使用できる
ことが自明である。
ラスミド中に挿入することができるかまたはこれは任意
の微生物染色体に挿入することができ、（プロモーター
がｌａｃ Ｉ ＺＶＡ転写をドライブするために存在す
る限り） ｌａｃでオペレートされたプロモーターから
の外来遺伝子の表現の制御を改良する。当業者にと、ｔ
ｌｔ！！の構築物が遺伝子を融合するために使用できる
ことが自明である。
ｌａｃｌリプレッサーに対して非常に高い親和性を有し
ているｌａｃオペレーターは（ＫＤＮＡ＝２−５Ｘ１０
”Ｍ″′１）、以下の２１の塩基対の長さの配列である
ＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴ （バー
クレー エム、デイ−及びニス、ボーシフイス［１９７
８］ザオベロン （ＴｈｅＯｐｅｒｏｎ）ミラー ジェ
ー、エイチ、及びダブリュ、ニス、セニコフ編、コール
ドスプリングハーバ−〉。
ているｌａｃオペレーターは（ＫＤＮＡ＝２−５Ｘ１０
”Ｍ″′１）、以下の２１の塩基対の長さの配列である
ＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴ （バー
クレー エム、デイ−及びニス、ボーシフイス［１９７
８］ザオベロン （ＴｈｅＯｐｅｒｏｎ）ミラー ジェ
ー、エイチ、及びダブリュ、ニス、セニコフ編、コール
ドスプリングハーバ−〉。
ａＣオペレーター中にｌａｃ Ｉレプレッサーに対しよ
り高いか又はより低い親和性を有している多くの突然変
異が存在する。（上記バークレイ及びボーシフイス、サ
ドラー ジエー、アール、等 ［１９８３］Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ 、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、１ＪｓＡ８０：６７８
５−６７８９；シモンズエ −２等 ［＋９８４］
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、Ｓｅｉ、ｌノ５Ａ８１
：１６２４−＋６２８）、脱抑制（プリプレッション
）に対し有意義な影響なしにｌａｃオペ！／−ターに対
するより高い親和性を可能とする、ｌａｃＩリプレッサ
ー内での多くの突然変異が存在する（上記バークレー及
びボーシフイス）。ｌａｃオペレーターとｌａｃＩリプ
レッサーの多くの異なる組合せの任意の物を使用するこ
とによって当業者には外来遺伝子表現の制御が自明であ
る。多くの異なるプロモーター（真核細胞ならびに原核
細胞）はｌａｃオペレーターの制御下におかれている（
ヤンスラディー、ジー、及びデイ−、ジエー、ヘナー［
１９８４］Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、Ｓｅｉ、Ｕ
ｓＡ８１：４３９−４４３；ヘリンジュニア、ジェー、
エル。
り高いか又はより低い親和性を有している多くの突然変
異が存在する。（上記バークレイ及びボーシフイス、サ
ドラー ジエー、アール、等 ［１９８３］Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ 、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、１ＪｓＡ８０：６７８
５−６７８９；シモンズエ −２等 ［＋９８４］
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、Ｓｅｉ、ｌノ５Ａ８１
：１６２４−＋６２８）、脱抑制（プリプレッション
）に対し有意義な影響なしにｌａｃオペ！／−ターに対
するより高い親和性を可能とする、ｌａｃＩリプレッサ
ー内での多くの突然変異が存在する（上記バークレー及
びボーシフイス）。ｌａｃオペレーターとｌａｃＩリプ
レッサーの多くの異なる組合せの任意の物を使用するこ
とによって当業者には外来遺伝子表現の制御が自明であ
る。多くの異なるプロモーター（真核細胞ならびに原核
細胞）はｌａｃオペレーターの制御下におかれている（
ヤンスラディー、ジー、及びデイ−、ジエー、ヘナー［
１９８４］Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、Ｓｅｉ、Ｕ
ｓＡ８１：４３９−４４３；ヘリンジュニア、ジェー、
エル。
及びジエー、エヌ、ベネット［１９８４］Ｇｅｎｅ３２
：３４９−３５６；トイジュールニー等［１９８６］
Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、＾ｅａｄ、ｓｅｔ。
：３４９−３５６；トイジュールニー等［１９８６］
Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、＾ｅａｄ、ｓｅｔ。
ＵＳＡ８３：４１３４−４１３７；フエム、シー、ティ
ー及びエヌ。
ー及びエヌ。
ダ１どツドソン［１９８８］Ｇｅｎｅ６２：３０１−３
１Ｊ：フ４ ’７グジエー 、専１：１９８８］Ｃｅ１
１５２＋７１３−７２２）、本発明はそのようなｌａｃ
でオペレートされたプロモーターからのラクトースの誘
導を改良することと命名される。
１Ｊ：フ４ ’７グジエー 、専１：１９８８］Ｃｅ１
１５２＋７１３−７２２）、本発明はそのようなｌａｃ
でオペレートされたプロモーターからのラクトースの誘
導を改良することと命名される。
本発明はラクトースを効率的に取上げるために充分なｌ
ａｃＺおよびＶ蛋白質を細胞が造ることができるように
し、そしてこれをグルコースとガラクトースに転換する
ことならびに真のｌａｃ誘導物質（インデューサー〉で
あるアロラクトースに転換することを可能にする。さら
に本発明は細胞が充分なリプレッサー（ｌａｃｌ蛋白質
）を合成できるようにし、外来遺伝子の上流でｌａｃオ
ペレーターに結合させ、そして誘導物質の非存在下で外
来遺伝子の表現をオフに保つ。媒体中に過剰のラクトー
スが存在すると細胞はｌａｃオペレーターの効率的な脱
抑制ζこ充分な濃度の７０ラクトースを蓄積することが
できる。
ａｃＺおよびＶ蛋白質を細胞が造ることができるように
し、そしてこれをグルコースとガラクトースに転換する
ことならびに真のｌａｃ誘導物質（インデューサー〉で
あるアロラクトースに転換することを可能にする。さら
に本発明は細胞が充分なリプレッサー（ｌａｃｌ蛋白質
）を合成できるようにし、外来遺伝子の上流でｌａｃオ
ペレーターに結合させ、そして誘導物質の非存在下で外
来遺伝子の表現をオフに保つ。媒体中に過剰のラクトー
スが存在すると細胞はｌａｃオペレーターの効率的な脱
抑制ζこ充分な濃度の７０ラクトースを蓄積することが
できる。
図面の注釈
第１図−ｐＭＹｃ２００５．ｌａｃｆ及びＺオペロンの
融合。
融合。
ＤＮＡの合成断片をｐｕｃｉｓにり１コーン化しＨｉｎ
ｄＩＩＩ−４０３ないしＨａｅｌｌ−５２４ζこおいて
見出される正常な配列を置き換える。この合成配列はｌ
ａｃプロモーター及びオペレーター配列を除去しそして
これらをＳｈｉｎｅ−Ｄａ１ｇａｒｎｏサイトと置き換
える。
ｄＩＩＩ−４０３ないしＨａｅｌｌ−５２４ζこおいて
見出される正常な配列を置き換える。この合成配列はｌ
ａｃプロモーター及びオペレーター配列を除去しそして
これらをＳｈｉｎｅ−Ｄａ１ｇａｒｎｏサイトと置き換
える。
第２図−ｐＭＶｃ２＋０１、ｌａｃ Ｉ ＺＹＡオペロ
ンの構築。
ンの構築。
ＤＮＡの３つω断片を連結しそして次にＭＣ１０６１中
に形質転換によって導入しくカサダバンエム、及びニス
、コーエン［１９８０］ Ｊ 、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１
３８：１７９−２０７）そしてプラスミドｐＭＶｃ２１
０１を構築する。
に形質転換によって導入しくカサダバンエム、及びニス
、コーエン［１９８０］ Ｊ 、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１
３８：１７９−２０７）そしてプラスミドｐＭＶｃ２１
０１を構築する。
第一の断片ζよｐＭＹｃ２００５から Ｈ１ｎｄＩＩＩ
−４０３ないしＥａｅ ｌ−４８５の片ヒしてもたら
される。第２の断片はＥｅｏＲＩ−１ないしＥａｅ ｌ
−１１０３の片としてｌ）ＭＣ９からくるものでありそ
して最後の断片は９８８９塩基対のＢｉｎｄｍ−３１な
いしＥｅｏＲＩ−１片としてｐｓＫｓＪＯ７からくるも
のである。いったん構築されればＥｅｏＲＩと５ａｌｌ
末端がオリボンヌクレオチドリン力−を用いてそれぞれ
ＢａｍＨＩ及びＢｇｌｎ末熾に転換され、ｐＭＶｃ２１
０１−８ヲ作ル。
−４０３ないしＥａｅ ｌ−４８５の片ヒしてもたら
される。第２の断片はＥｅｏＲＩ−１ないしＥａｅ ｌ
−１１０３の片としてｌ）ＭＣ９からくるものでありそ
して最後の断片は９８８９塩基対のＢｉｎｄｍ−３１な
いしＥｅｏＲＩ−１片としてｐｓＫｓＪＯ７からくるも
のである。いったん構築されればＥｅｏＲＩと５ａｌｌ
末端がオリボンヌクレオチドリン力−を用いてそれぞれ
ＢａｍＨＩ及びＢｇｌｎ末熾に転換され、ｐＭＶｃ２１
０１−８ヲ作ル。
第３図−ｐＭｖＣ４６７、即ちｔａｅでプロモートされ
に毒素含有プラスミド ｐＭＹｃ４３６（ＮＲＲＬ寄託番号Ｂ−１８２９２）中
に見出されるｔ、ａｃでプロモートされた毒素遺伝子を
ベクターｐＴＪＳ２６０中の４．５キロ塩基対のＢａｍ
ＨＩないしＰｓｔ Ｉ断片と（）でクローン化した。
ｐＴＪｓ２６０又は毒素遺伝子の３′フランキング配列
のすべての配列が入手可能でないので、従って幾つかの
制限場所は第３．４．５及び６図において近似記載され
た。
に毒素含有プラスミド ｐＭＹｃ４３６（ＮＲＲＬ寄託番号Ｂ−１８２９２）中
に見出されるｔ、ａｃでプロモートされた毒素遺伝子を
ベクターｐＴＪＳ２６０中の４．５キロ塩基対のＢａｍ
ＨＩないしＰｓｔ Ｉ断片と（）でクローン化した。
ｐＴＪｓ２６０又は毒素遺伝子の３′フランキング配列
のすべての配列が入手可能でないので、従って幾つかの
制限場所は第３．４．５及び６図において近似記載され
た。
第４図−ｐＭＹｃ４７１、ラクトース誘導可能なプラス
ミド ａｃ Ｉ ＺＹＡオペロンをｐＭＹｃ４６７のＢａａ＋
ＨＩ場所にクローン化した。生じるプラスミド １ＭＭ
Ｃ４７１は次にＭＢＩＯＩすなわちＰ、フルオレッセン
ス中に形質転換することによって誘導した。
ミド ａｃ Ｉ ＺＹＡオペロンをｐＭＹｃ４６７のＢａａ＋
ＨＩ場所にクローン化した。生じるプラスミド １ＭＭ
Ｃ４７１は次にＭＢＩＯＩすなわちＰ、フルオレッセン
ス中に形質転換することによって誘導した。
第５図−９ＭＭＣ４８５、別のラクトース誘導可能なプ
ラスミド ６３８塩基対のＢａｍＨＩないしＡｐａ Ｉ断片として
ｌａｃ■をｌａｃｌＱで置き換えることによってｌａ
ｃ Ｉ ＱＺＹＡオペロンを構築した＊ ｌａｃｌ Ｑ
ＺＹＡオペロンを次に９ＭＭＣ４６７のＢａ−Ｈ１場所
にクローン化した。生じるプラスミドｐＭＶｃ４８５を
ラクトースの誘導可能性についてＭＢＩＯＩ中で試験し
た。ｌａｃ Ｉ ＱＺＹＡオペロンは表１に示されてお
り、ここで表中に示されるように塩基対１６はＣのかわ
りにＴである。
ラスミド ６３８塩基対のＢａｍＨＩないしＡｐａ Ｉ断片として
ｌａｃ■をｌａｃｌＱで置き換えることによってｌａ
ｃ Ｉ ＱＺＹＡオペロンを構築した＊ ｌａｃｌ Ｑ
ＺＹＡオペロンを次に９ＭＭＣ４６７のＢａ−Ｈ１場所
にクローン化した。生じるプラスミドｐＭＶｃ４８５を
ラクトースの誘導可能性についてＭＢＩＯＩ中で試験し
た。ｌａｃ Ｉ ＱＺＹＡオペロンは表１に示されてお
り、ここで表中に示されるように塩基対１６はＣのかわ
りにＴである。
第６ｒ１！Ｊ−ｐＭＹｃ１１６１、輪切ｎ （甲虫ｆｌ
） ｌ１ｆｅ−ラ’）ドース誘導可能なプラスミド プラスミドｐＭＹｃ４７１を ＢａｍＨＩ （１２＋０
３位置）及びにｐｎ Ｉ （７９３３位Ｉりで切断し、
ｔａｃでプロモートされた鞘翅類に活性の毒素を除去し
、そして両方の末端を７４ＤＮＡポリミラーゼで充填し
、プラント末端を生じた。米国特許４７７＋１３１に開
示されたｔａｃでプロモートされた毒素遺伝子をプラン
ト末端化されたＳｅａ Ｉ （ｐＢＲ３２２のもの）と
して上記ＤＮＡ中に挿入し）ｌｉｎｄｌｌｌ断片を充填
する（鞘翅類に活性の配列の３′末端において） 、
ｔａｃプロモーターの５′末端はプラント末端連結によ
ってｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ場所に以前に挿入されて
いる。
） ｌ１ｆｅ−ラ’）ドース誘導可能なプラスミド プラスミドｐＭＹｃ４７１を ＢａｍＨＩ （１２＋０
３位置）及びにｐｎ Ｉ （７９３３位Ｉりで切断し、
ｔａｃでプロモートされた鞘翅類に活性の毒素を除去し
、そして両方の末端を７４ＤＮＡポリミラーゼで充填し
、プラント末端を生じた。米国特許４７７＋１３１に開
示されたｔａｃでプロモートされた毒素遺伝子をプラン
ト末端化されたＳｅａ Ｉ （ｐＢＲ３２２のもの）と
して上記ＤＮＡ中に挿入し）ｌｉｎｄｌｌｌ断片を充填
する（鞘翅類に活性の配列の３′末端において） 、
ｔａｃプロモーターの５′末端はプラント末端連結によ
ってｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ場所に以前に挿入されて
いる。
ＣＡＰ結合場所及びプロモーター／オペレーターをｌａ
ｃオペロンから除去することによって外来遺伝子の表現
の改良された制御が実現する０本明細書に例示されてい
るのは鱗翅類昆虫毒素をコードしているｔａｃでプロモ
ートされた遺伝子を含有するプラスミド中にｌａｃ Ｉ
ＺＹＡ融合構築物を挿入することが例示されている。
ｃオペロンから除去することによって外来遺伝子の表現
の改良された制御が実現する０本明細書に例示されてい
るのは鱗翅類昆虫毒素をコードしているｔａｃでプロモ
ートされた遺伝子を含有するプラスミド中にｌａｃ Ｉ
ＺＹＡ融合構築物を挿入することが例示されている。
プラスミド（１ＭＭＣ４７１）を次にシュウトモナスフ
ルオレッセンスＭＲ４７１（ｐＭＹＣ４７１）と命名さ
れるシュートモナルフルオレッセンスを形質転換するの
に使用した。
ルオレッセンスＭＲ４７１（ｐＭＹＣ４７１）と命名さ
れるシュートモナルフルオレッセンスを形質転換するの
に使用した。
プラスミドｐＭＹｃ４７１の一つの要素はその宿主にｌ
ａｃオペロン遺伝子の生成物の構成要素的な水準を提供
する。この目的にはそのオペロンを種々の利用できる構
成要素的なプロモーターの任意のものに融合できる。こ
の場合はｌａｃ Ｉプロモーターに融合されに、ざらに
ｌａｃｌプロモーターの代りにｌａｃｌＱプロモーター
を含有している新規な構築物がつくられた（ｐＭＹＣ４
８５）−この新規な構築物は高水準のリプレッサーなら
びにｌａｃオペロン遺伝子生成物を提供する。プラスミ
ドｐＭＹＣ４８５はｐ Ｍ Ｙ Ｃ４７１と同様に機能
する。
ａｃオペロン遺伝子の生成物の構成要素的な水準を提供
する。この目的にはそのオペロンを種々の利用できる構
成要素的なプロモーターの任意のものに融合できる。こ
の場合はｌａｃ Ｉプロモーターに融合されに、ざらに
ｌａｃｌプロモーターの代りにｌａｃｌＱプロモーター
を含有している新規な構築物がつくられた（ｐＭＹＣ４
８５）−この新規な構築物は高水準のリプレッサーなら
びにｌａｃオペロン遺伝子生成物を提供する。プラスミ
ドｐＭＹＣ４８５はｐ Ｍ Ｙ Ｃ４７１と同様に機能
する。
ｔａｃプロモーター制御下の特定の遺伝子にラクトース
の誘導可能性が依存していないことを実証することとし
て、鞘翅類に活性の毒素をコードした別の遺伝子をｐＭ
Ｙｃ４７１ベクター中にクローン化し、鱗翅類活性毒素
遺伝子をおきかえ、ｌ）ＭＶＣ−１１６１を生じた。こ
の新規なプラスミドをもっているシュードモナスフルオ
レッセンス菌株ＭＢＩＯ＋も毒素表現のラクトース誘導
を可能とする。このことはｌａｃでオペレートされたプ
ロモーターの制御下の任意の遺伝子についてあてはまる
。
の誘導可能性が依存していないことを実証することとし
て、鞘翅類に活性の毒素をコードした別の遺伝子をｐＭ
Ｙｃ４７１ベクター中にクローン化し、鱗翅類活性毒素
遺伝子をおきかえ、ｌ）ＭＶＣ−１１６１を生じた。こ
の新規なプラスミドをもっているシュードモナスフルオ
レッセンス菌株ＭＢＩＯ＋も毒素表現のラクトース誘導
を可能とする。このことはｌａｃでオペレートされたプ
ロモーターの制御下の任意の遺伝子についてあてはまる
。
この融合の別の面は、ｌａｃオペロンがラクトースと間
違した正常な制御エレメントによってはもはや制御され
ない事である。このことはこれらの構築物（ｐＭＹｃ４
７１、ｐＭＹｃ４８５及びｐＭＶｃ１１６１）中のｌａ
ｃオペロンＺＹＡ遺伝子生成物の合成が構成要素的（コ
ンスティテユティブ）であって細胞中に存在するラクト
ース又はグルコースの濃度と独立に生じることを意味す
る。たとえばＩ ＰＴＧまたはラクトースの存在下又は
非存在下でβ・ガラクトシダーゼのある量に対応してい
る新規な蛋白質バンドが５ＯＳ−ＰＡＧＥ上で見ること
ができ、そしてこれらのクローンがＸ−ｇａｌを開裂し
て同じ条件下で青色のコロ−を形成する。
違した正常な制御エレメントによってはもはや制御され
ない事である。このことはこれらの構築物（ｐＭＹｃ４
７１、ｐＭＹｃ４８５及びｐＭＶｃ１１６１）中のｌａ
ｃオペロンＺＹＡ遺伝子生成物の合成が構成要素的（コ
ンスティテユティブ）であって細胞中に存在するラクト
ース又はグルコースの濃度と独立に生じることを意味す
る。たとえばＩ ＰＴＧまたはラクトースの存在下又は
非存在下でβ・ガラクトシダーゼのある量に対応してい
る新規な蛋白質バンドが５ＯＳ−ＰＡＧＥ上で見ること
ができ、そしてこれらのクローンがＸ−ｇａｌを開裂し
て同じ条件下で青色のコロ−を形成する。
構築を容易にするためにこの明細書で述べられたｌａｃ
Ｉ ＺＹＡを含有しているプラスミドの全てにｌａｃ
Ａ遺伝子が含まれる。 ｌａｃＡ遺伝子生成物はアロラ
クトースの製造には役割を有しておらず（上記）リーフ
エルター）、モしてｌａｃＩＺ’ｉ’Ａオペロンから容
易に除去できる。例えばｌａｃＹ遺伝子のストップコド
ンである独特ではないＡｆ ｌ ｎ （ＣＴＴＡＡＧ）
制限酵素位置が存在する。このＡｆｌＩＩ制限場所を用
いることによってｌａｃＡ遺伝子を除去することが可能
である。１ａｅｉＺＶオペロンはｌａｃ Ｉ ＺＹＡオ
ペロン中に見出されるもと同しラクトース誘導性を有し
ている。
Ｉ ＺＹＡを含有しているプラスミドの全てにｌａｃ
Ａ遺伝子が含まれる。 ｌａｃＡ遺伝子生成物はアロラ
クトースの製造には役割を有しておらず（上記）リーフ
エルター）、モしてｌａｃＩＺ’ｉ’Ａオペロンから容
易に除去できる。例えばｌａｃＹ遺伝子のストップコド
ンである独特ではないＡｆ ｌ ｎ （ＣＴＴＡＡＧ）
制限酵素位置が存在する。このＡｆｌＩＩ制限場所を用
いることによってｌａｃＡ遺伝子を除去することが可能
である。１ａｅｉＺＶオペロンはｌａｃ Ｉ ＺＹＡオ
ペロン中に見出されるもと同しラクトース誘導性を有し
ている。
表２のデーターは毒素生産がラクトース又はＩＰＴＧに
よって制御されることを実証している。誘導に使用され
るラクトースの量はＩＰＴＧ誘導水準よりも１０〜２０
倍高いがＩＰＴＧ （シグマケミカルカンパニー製キロ
当り２００００１Ｂ ）と比較しｋかなり低いラクトー
スのコスト（シグマケミカルカンパニー製キロ当り７．
００８ ）は、後者の誘導物質が経済的に非常に有利で
あることを示している。代謝された基質ラクトースの最
大の製造水準は細胞成長の間新たに補充されなければな
らず、さもなければ培養基はｔａｃでプロモートされた
遺伝子の合成を減少するであろう。
よって制御されることを実証している。誘導に使用され
るラクトースの量はＩＰＴＧ誘導水準よりも１０〜２０
倍高いがＩＰＴＧ （シグマケミカルカンパニー製キロ
当り２００００１Ｂ ）と比較しｋかなり低いラクトー
スのコスト（シグマケミカルカンパニー製キロ当り７．
００８ ）は、後者の誘導物質が経済的に非常に有利で
あることを示している。代謝された基質ラクトースの最
大の製造水準は細胞成長の間新たに補充されなければな
らず、さもなければ培養基はｔａｃでプロモートされた
遺伝子の合成を減少するであろう。
物質及び改良
クローニング及びＤＮＡ操作技術はマニアテスティー０
、イー、エフ、フリシュ及びジエー、サンプルツク（１
９８２）モレキュラークローニング、ラボラトリ−マニ
アル、コールドスプリングハーバーラボラトリーバブリ
ツシャーズ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバ
−に記載されている。
、イー、エフ、フリシュ及びジエー、サンプルツク（１
９８２）モレキュラークローニング、ラボラトリ−マニ
アル、コールドスプリングハーバーラボラトリーバブリ
ツシャーズ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバ
−に記載されている。
ＡＣオペａンｐｓＫｓ１０７を含有しているプラスミド
はユニバーシティーオプシカゴのエム、カサダバン博士
から受けた（シャビラニス、ター１、ジョーチョウエフ
、ブイ、リチョード及びエム、ジエー、カサダバン［１
９８３］Ｇｅｎｅ２５ニア１−８２） 、 ｌａｃオペ
ロンの配列は出版されている（カルニスニー、ター６、
オツトー、ニー、ルター及びび−、ミュラー・ヒル［１
９８３］ ＥＭＢＯＪ、２：５９３−５９７；ヘゲイガ
−エム。ニー０、デイ−。エフ、ジョンソン、デイ−、
ビー、ニールリイヒ及びアイ７ザビン［１９８５］Ｐｒ
ｏ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｅｉ、８２：６４１４−６４
１８）、 ｐＢＲ３２２中にクローン化された１、７キ
ロベースのＥｃｏＲＩ制限断片上のｌａｃ Ｉ遺伝子は
ｐＭＣ９、カタログＮｏ、３７１９５．３７１９６及び
３７１９７としてＡ Ｔ ＣＣから人手できる＊ｌａｃ
Ｉ遺伝子の配列も出版されている。（ハラバウグビー、
ジｚ −、［１９７８］Ｎａｔｕｒｅ２７４ ニア６５
−７６９）。幅広い宿主範囲のベクターｐＭＭＢ皐はエ
ム、ハグダサリアン博士くバグダサリアン エム、エム
６、イー４７マン、アール、ルッツ、ビールッカート及
びエム、バグダサリアン［１９８３］Ｇｅｎｅ２６：２
７３−２８２）から受取った。 ｐＭＭＢ２２の旧ｎｄ
ｌｌ！断片であって１ａｅＩＱを含有しているものはＢ
ａｔｓＨＩに再リンカ−化された。ｔａｃＩＱの配列も
出版されている（カロスＭＰ［＋９７８コＮａｔｕｒｅ
２７４ニア６２−７６５）。本明細書での分析は主とし
て出版されたＤＮＡ配列にもとすいている。構築物の臨
界的な部分のいくつか、たとえばｌａｃｌ及び１ａｅＩ
Ｑプロモーター及び１ａｅ１転写単位及びｌａｃオペロ
ンの間の融合領域はＤＮＡ配列化によって確認された。
はユニバーシティーオプシカゴのエム、カサダバン博士
から受けた（シャビラニス、ター１、ジョーチョウエフ
、ブイ、リチョード及びエム、ジエー、カサダバン［１
９８３］Ｇｅｎｅ２５ニア１−８２） 、 ｌａｃオペ
ロンの配列は出版されている（カルニスニー、ター６、
オツトー、ニー、ルター及びび−、ミュラー・ヒル［１
９８３］ ＥＭＢＯＪ、２：５９３−５９７；ヘゲイガ
−エム。ニー０、デイ−。エフ、ジョンソン、デイ−、
ビー、ニールリイヒ及びアイ７ザビン［１９８５］Ｐｒ
ｏ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｅｉ、８２：６４１４−６４
１８）、 ｐＢＲ３２２中にクローン化された１、７キ
ロベースのＥｃｏＲＩ制限断片上のｌａｃ Ｉ遺伝子は
ｐＭＣ９、カタログＮｏ、３７１９５．３７１９６及び
３７１９７としてＡ Ｔ ＣＣから人手できる＊ｌａｃ
Ｉ遺伝子の配列も出版されている。（ハラバウグビー、
ジｚ −、［１９７８］Ｎａｔｕｒｅ２７４ ニア６５
−７６９）。幅広い宿主範囲のベクターｐＭＭＢ皐はエ
ム、ハグダサリアン博士くバグダサリアン エム、エム
６、イー４７マン、アール、ルッツ、ビールッカート及
びエム、バグダサリアン［１９８３］Ｇｅｎｅ２６：２
７３−２８２）から受取った。 ｐＭＭＢ２２の旧ｎｄ
ｌｌ！断片であって１ａｅＩＱを含有しているものはＢ
ａｔｓＨＩに再リンカ−化された。ｔａｃＩＱの配列も
出版されている（カロスＭＰ［＋９７８コＮａｔｕｒｅ
２７４ニア６２−７６５）。本明細書での分析は主とし
て出版されたＤＮＡ配列にもとすいている。構築物の臨
界的な部分のいくつか、たとえばｌａｃｌ及び１ａｅＩ
Ｑプロモーター及び１ａｅ１転写単位及びｌａｃオペロ
ンの間の融合領域はＤＮＡ配列化によって確認された。
ベクターＰＩＪＣ１８はファーマシアコ−ポレーション
のカタログＮｏ、２７−４９４９−０１なとの種々の源
から人手できる。幅広い宿主範囲のベクターｐＴＪＳ２
６０は９２０９３カリフオルニア州ラオラ、サンディエ
ゴ、ユニバーシティオブカリフォルニアのへリンスキー
博士から入手出来る（シ１ミドハウダー、ティー。ジェ
ー、［１９８６］博士論文ＵＣ５Ｄ）。
のカタログＮｏ、２７−４９４９−０１なとの種々の源
から人手できる。幅広い宿主範囲のベクターｐＴＪＳ２
６０は９２０９３カリフオルニア州ラオラ、サンディエ
ゴ、ユニバーシティオブカリフォルニアのへリンスキー
博士から入手出来る（シ１ミドハウダー、ティー。ジェ
ー、［１９８６］博士論文ＵＣ５Ｄ）。
次のものは最良の対応を含めた本発明の実施の手順を説
明する。これらの実施例は制限するものと解釈するもの
ではない、すべてのパーセントは重量によりすべての溶
媒混合物割合は他に述べられない限り容量による。
明する。これらの実施例は制限するものと解釈するもの
ではない、すべてのパーセントは重量によりすべての溶
媒混合物割合は他に述べられない限り容量による。
実施例１ １ａｅｌ遺伝子及びｌａｃオペロンの融合１
ａｅＩ遺伝子及びｌａｃオペロンの融合をまずｐｌＪｃ
＋８中で実施した。これを行なうには、ｐＵｃ１８を旧
ｎｄ■で線状化し、次にＨａｅＨで部分的に切断した。
ａｅＩ遺伝子及びｌａｃオペロンの融合をまずｐｌＪｃ
＋８中で実施した。これを行なうには、ｐＵｃ１８を旧
ｎｄ■で線状化し、次にＨａｅＨで部分的に切断した。
このＤ Ｎ Ａ ｅ １．４％アガロースゲル上で電気
泳動によって分けた。 ２４０２塩基対バンドを溶離し
、アブライドバイオシステムズ３８０Ａオリゴンヌクレ
オチドシンセサイザー上でβ−シアノエステル化学によ
って造っに二本鎖合成りＮＡ挿入物に連結し距。
泳動によって分けた。 ２４０２塩基対バンドを溶離し
、アブライドバイオシステムズ３８０Ａオリゴンヌクレ
オチドシンセサイザー上でβ−シアノエステル化学によ
って造っに二本鎖合成りＮＡ挿入物に連結し距。
表１に示されるようにこの配列はｌａｃｌ配列の塩基対
１０７３で出発している（上記フラボ−ビー、ジェー、
）。
１０７３で出発している（上記フラボ−ビー、ジェー、
）。
Ｈａｅ ＩＩ
Ｅａｅ １
上記の合成配列は正常にはｌａｃＩの塩基対＋１２３に
於いて見出されるＰｖｕｎ位置を除去している。
於いて見出されるＰｖｕｎ位置を除去している。
新しいＸｈｏ１場所をｌａｃｌ遺伝子（ｂｐＨ３７）の
３′末端の近くに挿入した。これらの変化は新しい構築
物の同定の容易さのために導入した。上記の２つの制限
場所に対する塩基対変更を行なうのに導入した突然変異
の結果によってアミノ酸が変化することはない、この構
築物に於いてｌａｃ ＩのストップコドンとｌａｃＺの
出発コドンの間の距離は１７塩基対である。この領域は
ｌａｃ１転写物を翻訳しているリポソームが同じ転写物
からｌａｃＺ遺伝子生成物の合成をつづけることができ
るようにリポソーム結合位置くＳ１０と印をしである）
を含有している。ｐＭＹＣ２００５のプラスミドダイア
グラムが第１図に示される。
３′末端の近くに挿入した。これらの変化は新しい構築
物の同定の容易さのために導入した。上記の２つの制限
場所に対する塩基対変更を行なうのに導入した突然変異
の結果によってアミノ酸が変化することはない、この構
築物に於いてｌａｃ ＩのストップコドンとｌａｃＺの
出発コドンの間の距離は１７塩基対である。この領域は
ｌａｃ１転写物を翻訳しているリポソームが同じ転写物
からｌａｃＺ遺伝子生成物の合成をつづけることができ
るようにリポソーム結合位置くＳ１０と印をしである）
を含有している。ｐＭＹＣ２００５のプラスミドダイア
グラムが第１図に示される。
実施例２ 配列の確認
ｐＭＹｃ２００５の合成部分を、その構造を確認するた
めに配列決定し、ｐｓＫｓ＋０７（第２図）で見出され
るｌａｃオペロンに９ＭＣ９の完全なｌａｃｌ遺伝子を
結びつけるために、３片の連結に使用した。形質転換の
後、ｌａｃＩ／Ｚ融合領域をＬＢ＋Ｘ−ｇａｌ（５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−０−ガラクト
シダーゼの存在の為の比色基質）プレート上で青色のコ
ロニから配列決定した。°調べたこれらの制限場所は予
測された大きさの断片を生じたく第２図〉。ｌａｃ Ｉ
プロモーター領域も配列分析で確認された。
めに配列決定し、ｐｓＫｓ＋０７（第２図）で見出され
るｌａｃオペロンに９ＭＣ９の完全なｌａｃｌ遺伝子を
結びつけるために、３片の連結に使用した。形質転換の
後、ｌａｃＩ／Ｚ融合領域をＬＢ＋Ｘ−ｇａｌ（５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−０−ガラクト
シダーゼの存在の為の比色基質）プレート上で青色のコ
ロニから配列決定した。°調べたこれらの制限場所は予
測された大きさの断片を生じたく第２図〉。ｌａｃ Ｉ
プロモーター領域も配列分析で確認された。
実施例３ クローニング
ｌａｃ Ｉ ＺＹＡ構築物のＥｃｏＲＩ及び５ａｌｌ末
＃（第２図〉をそれぞれ再リンカ−化しＢａ■Ｈ１及び
ＢｇｌＩＩ制限場所を生じた＊ ｌａｃ Ｉ ＺＹＡオ
ペロンをｐＭＹｃ４６７の独特の８ａｍＨＩ ｔａｃ所
（第３図）中にクローン化し、ｐＭＹＣ４７１を生じた
く第４図）、プラスミドｐＭＹｃ４６７は広い宿主範囲
のベクターｐＴＪｓ２６０中にクローン化されている、
ｔａｃでプロモートした鱗翅類の毒素遺伝子ｐＭＹｃ４
３６を含有している（ ｃｒｙｌＡ（ｃ）様の毒素遺伝
子［ＮＲＲＬ寄託番号Ｂ−１８２９２］アダングエム、
ジェ、等［１９８５コＧｅｎｅ３６：２８９−３００）
−ｐＭＹｃ４７１は形質転換によりＰ、フルオレスセン
スＭＢＩＯＩ中に導入され、生じるクローンはＭＲ４７
１と命名された。 ＭＲ４７１は存在するｐＭＹｃ４７
１プラスミドのキーエレメントについて試験された。
ＩＰＴＧまたはラクトースの非存在下では有意義な量の
毒素が造られないので機能的なリプレッサーが合成され
た（表１）０機能的なβ−ガラクトシダーゼが存在する
のでＸ−ｇａｌ上でプレートにしたときに細胞は青色で
ある。ラクトースの存在下でｔａｃプロモーターを細胞
が誘導することができるので、機能的なベルミアーゼ及
びβ−ガラクトシダーゼが存在する（表１）。
＃（第２図〉をそれぞれ再リンカ−化しＢａ■Ｈ１及び
ＢｇｌＩＩ制限場所を生じた＊ ｌａｃ Ｉ ＺＹＡオ
ペロンをｐＭＹｃ４６７の独特の８ａｍＨＩ ｔａｃ所
（第３図）中にクローン化し、ｐＭＹＣ４７１を生じた
く第４図）、プラスミドｐＭＹｃ４６７は広い宿主範囲
のベクターｐＴＪｓ２６０中にクローン化されている、
ｔａｃでプロモートした鱗翅類の毒素遺伝子ｐＭＹｃ４
３６を含有している（ ｃｒｙｌＡ（ｃ）様の毒素遺伝
子［ＮＲＲＬ寄託番号Ｂ−１８２９２］アダングエム、
ジェ、等［１９８５コＧｅｎｅ３６：２８９−３００）
−ｐＭＹｃ４７１は形質転換によりＰ、フルオレスセン
スＭＢＩＯＩ中に導入され、生じるクローンはＭＲ４７
１と命名された。 ＭＲ４７１は存在するｐＭＹｃ４７
１プラスミドのキーエレメントについて試験された。
ＩＰＴＧまたはラクトースの非存在下では有意義な量の
毒素が造られないので機能的なリプレッサーが合成され
た（表１）０機能的なβ−ガラクトシダーゼが存在する
のでＸ−ｇａｌ上でプレートにしたときに細胞は青色で
ある。ラクトースの存在下でｔａｃプロモーターを細胞
が誘導することができるので、機能的なベルミアーゼ及
びβ−ガラクトシダーゼが存在する（表１）。
本発明はｌａｃでオペレートされたプロモーターからの
その表現を制御する為に任意の外来遺伝子とともに使用
することができる０表現生成物（蛋白質〉は、そのよう
な生成物の単離のためにこの技術で知られた手段によっ
て、生産を行なっている微生物の培地から単離できる。
その表現を制御する為に任意の外来遺伝子とともに使用
することができる０表現生成物（蛋白質〉は、そのよう
な生成物の単離のためにこの技術で知られた手段によっ
て、生産を行なっている微生物の培地から単離できる。
別の方法として細胞内に残っている生成物は微生物自身
の形態で例えば生物殺虫剤として使用することができる
。
の形態で例えば生物殺虫剤として使用することができる
。
米国特許４６９５４５５及び４６９５４６２をそのよう
な用途について参照。
な用途について参照。
Ｆ４ Ｆｌ ｒ−１ｒ４ ｒ−４ｒ−１ｒ
−４Ｎ Ｎ Ｎ Ｎ Ｎ Ｎ
Ｎ Ｎ入− Ｖ ；′Ｘ ｒ い − 表２ 種々の構築物のラクトース誘導可能性 Ｒ４７１ ０１，６ｘｌＯ” 検出されず ０ ０ ラクトースな し ＋５ ２０ ９．ｌＸ１
０９２４ ２０ １．２
ＸＩ０１０１５ ４０
１．８Ｘ１０１０２４ ４０
ｆ、ｌＸｌ０１０２３＜３’ ８．
３（４） １．９Ｘ１０ｔ’３９”’８．３（４
’２．０ＸＩＯ” ｐＭＹｃ４８５を含有しているＭＢＩＯＩ２４
４０ ？７５２４ ０
検出されずｐＭＹｃｌＩ（３１を含
有しティる閂旧０１２４ ４０
３００２４ ．０
検出されず（１）培養基は定常期に達してから誘導さ
れた。
−４Ｎ Ｎ Ｎ Ｎ Ｎ Ｎ
Ｎ Ｎ入− Ｖ ；′Ｘ ｒ い − 表２ 種々の構築物のラクトース誘導可能性 Ｒ４７１ ０１，６ｘｌＯ” 検出されず ０ ０ ラクトースな し ＋５ ２０ ９．ｌＸ１
０９２４ ２０ １．２
ＸＩ０１０１５ ４０
１．８Ｘ１０１０２４ ４０
ｆ、ｌＸｌ０１０２３＜３’ ８．
３（４） １．９Ｘ１０ｔ’３９”’８．３（４
’２．０ＸＩＯ” ｐＭＹｃ４８５を含有しているＭＢＩＯＩ２４
４０ ？７５２４ ０
検出されずｐＭＹｃｌＩ（３１を含
有しティる閂旧０１２４ ４０
３００２４ ．０
検出されず（１）培養基は定常期に達してから誘導さ
れた。
＋０１１
３７
８７
０２５
３８
５５５
２ａ＋Ｍ ＩＰＴＧ ２．３Ｘ１０”
１００３（２〉 毒素濃度はクマシー染色蛋白バン
ドのレーザーデンシトメトリーによって５Ｏ５−ＰＡＧ
Ｅ上の破裂した細胞の電気泳動ののちに測定した（ Ｋ
ＬＢインストラクショナルマニュアル２２２２−０１０
） 。
１００３（２〉 毒素濃度はクマシー染色蛋白バン
ドのレーザーデンシトメトリーによって５Ｏ５−ＰＡＧ
Ｅ上の破裂した細胞の電気泳動ののちに測定した（ Ｋ
ＬＢインストラクショナルマニュアル２２２２−０１０
） 。
（３）この実験は１０１ ｉ＄ｉ酵器中養牛育したＭＲ
４７１を使用した。全ての他の実験データーは２５０＋
ｓ ｌのバッフルした振盪フラスコ中で同じ培地を使用
して発生させた。
４７１を使用した。全ての他の実験データーは２５０＋
ｓ ｌのバッフルした振盪フラスコ中で同じ培地を使用
して発生させた。
（４） １１９酵器中で８．３ｍＭラクトース／時を
培養基に仕込んだ０ＭＲ４７１が醗酵養牛でこのラクト
ース水準を代謝しないことがわかり、実験のあいだに濃
度の増加を生じた。振盪フラスコ中で行なった実験では
ラクトース又はＩＰＴＧの単一投与が示された時間に与
えられた。
培養基に仕込んだ０ＭＲ４７１が醗酵養牛でこのラクト
ース水準を代謝しないことがわかり、実験のあいだに濃
度の増加を生じた。振盪フラスコ中で行なった実験では
ラクトース又はＩＰＴＧの単一投与が示された時間に与
えられた。
第１１！ＩはｐＭＹｃ２００５． ｌａｃ Ｉ及び２オ
ペロンの融合を示す略図である。 第２図はｐＭＹｃ２１０１． ｌａｃ Ｉ ＺＶＡオペ
ロンの構築を示す略図である。 第３図は、ｐＭＹｃ４６７、即ちｔａｃでプロモートさ
れた毒素含有プラスミドを示す略図である。 第４図は、ｐＭＹｃ４７１、ラクトース誘導可能なプラ
スミドを示す略図である。 第５図はｐＭＹｃ４８５、別のラクトース誘導可能なプ
ラスミドを示す略図である。 第６図はｐＭＹｃ１１６１、輪切１１（甲虫Ｉ）毒素−
ラクトース誘導可能なプラスミドを示す略図である。
ペロンの融合を示す略図である。 第２図はｐＭＹｃ２１０１． ｌａｃ Ｉ ＺＶＡオペ
ロンの構築を示す略図である。 第３図は、ｐＭＹｃ４６７、即ちｔａｃでプロモートさ
れた毒素含有プラスミドを示す略図である。 第４図は、ｐＭＹｃ４７１、ラクトース誘導可能なプラ
スミドを示す略図である。 第５図はｐＭＹｃ４８５、別のラクトース誘導可能なプ
ラスミドを示す略図である。 第６図はｐＭＹｃ１１６１、輪切１１（甲虫Ｉ）毒素−
ラクトース誘導可能なプラスミドを示す略図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ｌａｃオペロンからＣＡＰ結合位置及びｌａｃプロ
モーター／オペレーターを取り除くことからなる、ｌａ
ｃでオペレートされたプロモーターからの外来遺伝子表
現を制御する改良法。 ２、親オペロンと同じく、ｌａｃでオペレートされたプ
ロモーターからの外来遺伝子表現を制御する能力を保持
している、表２に示された配列を有する新規なｌａｃ
I ＺＹＡオペロンまたはその突然変異体。 ３、親オペロンと同じく、ｌａｃでオペレートされたプ
ロモーターからの外来遺伝子表現を制御する能力を保有
している、表２でわかるように塩基１６がＣの代りにＴ
である、表２に示される配列を有する新規なｌａｃ I
＾ＱＺＹＡオペロン。 ４、ｌａｃでオペレートされたプロモーターと、ｌａｃ
オペロン中にＣＡＰ結合位置及びｌａｃプロモーター／
オペレーターが存在しない、ｌａｃ I ＺＹＡ又はｌａ
ｃ I ＾ＱＺＹＡオペロンとから表現された外来遺伝子
を含んでいる微生物を培養することからなるｌａｃでオ
ペレートされたプロモーターからの外来遺伝子表現を制
御する方法。 ５、上記微生物が外来遺伝子を含んでいるプラスミドで
形質転換されている特許請求の範囲第４項に記載の方法
。 ６、上記微生物が、ｌａｃオペロン中にＣＡＰ結合位置
及びｌａｃプロモーター／オペレーターが存在しない、
ｌａｃ I ＺＹＡ又はｌａｃ I ＾ＱＺＹＡオペロンを含
んでいる染色体を含んでいる特許請求の範囲第４項に記
載の方法。 ７、ｌａｃオペロン中にＣＡＰ結合位置及びｌａｃプロ
モーター／オペレーターが存在しない、ｌａｃ I ＺＹ
Ａ又はｌａｃ I ＾ＱＺＹＡオペロンを含んでいる運搬
ベクター。 ８、特許請求の範囲第７項に記載の運搬ベクターによつ
て形質転換された微生物宿主。 ９、プラスミドである特許請求の範囲第７項に記載の運
搬ベクター。 １０、ｌａｃプロモーターと、ｌａｃオペロン中にＣＡ
Ｐ結合位置及びｌａｃプロモーター／オペレーターが存
在しない、ｌａｃ I ＺＹＡ及びｌａｃ I ＾ＱＺＹＡオ
ペロンとから表現された蛋白質生成物をコードしている
外来遺伝子を含んでいる微生物を、充分の量の該所望生
成物が作られるまで培養することからなる蛋白質生成物
を製造する方法。 １１、ｌａｃでオペレートされたプロモーターと、ｌａ
ｃオペロン中にＣＡＰ結合位置及びｌａｃプロモーター
／オペレーターが存在しない、ｌａｃ I ＺＹ又はｌａ
Ｃ I ＾ＱＺＹオペロンとから表現された外来遺伝子を
含んでいる微生物を培養することからなるｌａｃでオペ
レートされたプロモーターからの外来遺伝子表現を制御
する方法。 １２、上記微生物が外来遺伝子を含んでいるプラスミド
で形質転換されている特許請求の範囲第１１項に記載の
方法。 １３、上記微生物が、ｌａｃオペロン中にＣＡＰ結合位
置及びｌａｃプロモーター／オペレーターが存在しない
、ｌａｃ I ＺＹ又はｌａｃ I ＾ＱＺＹオペロンを含ん
でいる染色体を含んでいる特許請求の範囲第１１項に記
載の方法。 １４、ｌａｃオペロン中にＣＡＰ結合位置及びｌａｃプ
ロモーター／オペレーターが存在しないｌａｃ I ＺＹ
又はｌａｃ I ＾ＱＺＹオペロンを含んでいる運搬ベク
ター。 １５、特許請求の範囲第１４項の運搬ベクターによって
形質転換された微生物宿主。 １６、プラスミドである特許請求の範囲第１４項に記載
の運搬ベクター。 １７、充分量の所望生成物が作られるまで、ｌａｃプロ
モーターと、ｌａｃオペロン中にＣＡＰ結合位置及びｌ
ａｃプロモーター／オペレーターが存在しない、ｌａｃ
I ＺＹ又はｌａｃ I ＾ＱＺＹオペロンとから表現され
る生成物をコードしている外来遺伝子を含んでいる微生
物を培養することからなる蛋白質生成物を製造する方法
。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US386,821 | 1989-07-27 | ||
| US07/386,821 US5169760A (en) | 1989-07-27 | 1989-07-27 | Method, vectors, and host cells for the control of expression of heterologous genes from lac operated promoters |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0376582A true JPH0376582A (ja) | 1991-04-02 |
Family
ID=23527192
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2198116A Pending JPH0376582A (ja) | 1989-07-27 | 1990-07-27 | ｌａｃでオペレートされたプロモーターからの外来遺伝子表現の改良された制御 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5169760A (ja) |
| EP (1) | EP0410655A1 (ja) |
| JP (1) | JPH0376582A (ja) |
| AU (1) | AU629370B2 (ja) |
| CA (1) | CA2020106A1 (ja) |
| ZA (1) | ZA905390B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007511238A (ja) * | 2003-11-19 | 2007-05-10 | ダウ グローバル テクノロジーズ インコーポレイティド | 改良タンパク質発現系 |
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