JPS5981559A - 被検体の存在を決定する方法及び螢光を測定する装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本う１３明は、被検体を含有する疑いのある試料中の被
検体の存在を決定する方法及び装置に関する。

ｖＩＣ体念濁故中の粒子を・冷光放射により数えること
に、完投分析法において広い犯囲の適Ｉｆ１住があり、
−叡に生物学的物質の特徴づけに２岡用できる。

しかしながら公知の方法は１性別に６貿計されたオリフ
ィス、流導管又はノじガ１域或いは問題とする粒子を試
料中の異藷の又は望ましくない成分から区別するための
籾雅な計舅法を必要とする。

即ち、　４：ｉＬ子の存在、糸度及び／又は寸法の直接
的な指示を提供する安価であるが、積度の商い技Ｄｒｑ
が必要とされている。

狭い＃Ｌ路を通る細胞懸濁液の注意深く制御されたｉＭ
、　ｔ’１．　（ｉ−含むフロー・シトメータ（ｆｌｏ
ｗ　ｃｌｌｔｏ−ｍｅｔｇｒ’）の１更川ｉｉ、、　Ｍ
ｉｌｌｅｒらｌｌＵｓａｇｅ　ｏｆ　ｔｈｅｆ”ｌｏｗ
　Ｃｙｔｏｍ、ｇｔｐｒ−Ｃｇｌｌ’　、　５ｏｒｔｅ
ｒ、　”Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　　Ｉｎｒｍｕｎｏｌｏｇ
ｉｃａｌ　　ｈｉｇｔｈｏｄｓ、　　４　７　．１　３
〜２４　（１９８１’）　＋Ｈｏｆｆｍ、ａｎら、　”
Ｉｍｍ、ｕｎｏｆｌｗｏ−ｒｅｓｃｅｎｔ　Ａｎａｌｙ
ｓｉｓ　ｏｆ　Ｂｌｏｏｄ　Ｃｅ１ｌｓ　ｂｙ　Ｆｌｏ
ｗ（４）ｔｏｍｇｔｒｌｌ”、Ｉｎｔ、Ｊ、Ｉｎｕｎｕ
ｎｏｐｈａｒｍａｃ、、３（３）　　＋　　２４９　〜
２５　４（１９８１）　　ｊｌｉａｎ、ｓｇｎらの１９
８１年８月１８日付は米国特許第４．２８４゜３５５号
Ｉｔｉａｎｓｇｎらの１９８１年８月１８日イ寸け米１
ｍ％許７４４４．２８４．４１２号Ｉ　Ａｔｂｓｒらの
１９８１年８月４日付は米国特許願第４．２８４．９２
４号。

及びＳｔｇｖｅｎｓの１９６６年９月２７日付は米国特
許第３．２７５．８３４号に記述されている。

粒子を、その相対的寸法に基づいて比較的多い試料谷忙
中の４を光の変動を補正することにより区別するために
レーザ光線及びスリットを出いることば、Ｈｒｉｇｇｓ
ら、　　”Ｈｏｍｏｇｅｒｎｇｏｕａ　Ｆｌｕｏｒｅｓ
ｃｔｔｎｔＩｍｍｕｎｏ−Ａｓｓｏｙ”、　Ｓｃｉｇｎ
ｃｓ、　２１２　、１２６６〜１２６７（１９８１）及
びＮ１ｃｏｌｉら、す°１ｕｏｒｅｓ−ｃｅｎｃｓ　Ｉ
ｎｍｔｕｎｏａｓａａｙ　Ｂａ５ｓｄｏｎ　Ｌｏｎｇ　
Ｉ”ｉｍｇＣｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｎｕｍｂ
＃ｒ　Ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎｓ″。

Ｐｒｏｃ、　　　Ｎａｔｌ、　　Ａ、ｃａｄ、　　　Ｓ
ｃｉ、　　ＵＳＡ、　　　？　　？　　（８）　　＋４
９０４〜４９ｏ８（１９８０１ｒｉｉｒ；述されている
。

本発明によれば、分散散中のｗ子の存在を１問題とする
物質の存在及び脩の検知と関連っけて決定するための方
法及び装置ａが提供される。螢光全検知し且つ計数する
ことのできる比較的小才≠量を明確にするための元学懺
卸・が１丈用される。その件ｂｔは予じめ決められた変
動に帰結する中−の粒子だけが存在するような芥ｋ（“
と関係する。種々の技術、即ち試料中のイ皮検体の存在
と関連して、′、ｆ、光の変凹Ｉ内で変化せしめる技暫
金用いることにより。

付：在する被検体の址が決定できる。この変！１．Ｉｌ
］は統計学的方法である期１’ｆｉｌに旦り凧いは複数
の谷拵を１式別中に（采取することＶＣより覗祭される
。観察された結果を、公知の夕の被検体を有する分析浴
液で侍た結果と比較することにより、傾検体の知：を定
ｔｉ４−的に決定することができる。

献付する図面は、螢光を発する粒子の存在を伎−（１１
するのに用いるための本発明の装置：の１つの具体・夕
（１クー示す＋７７７年な全体図である。

本発明は、＃横木の畑が・面光の変動の覗祭される様式
に影響するという試料中の被枳体を決定するたν）の方
法及び装置に関する。被イ矢体は配位体及びセの同族受
体からなる特異的結合対の負である。光学繊維ｔま小谷
餡からの螢光全党けるために使用される。この容置は予
じめ決められた最小程度の螢光の変化ケ与えるような容
積中に１個だけの粒子が存在するという確率の酸、いこ
とによって’／に定される。単一の容置を、Ｗ子が容積
の内外へ拡散する長期間に亘って観察することにより、
又に枚数の答ｔｊＪ′全同時に又は連続的に掃引するこ
とにより、或いはその組合せにより、複数のそのような
容置が観察される。即ち、示威された程度からの予じめ
決められた螢光の差ｋＷする。仮娯される谷鼠のパーセ
ントは媒体中の被検体の情に関係つけることができる。

へ螢光の変動は粒子及び連続媒体のいろいろな組合せに
よって堆成することができる。例えばこの組合せけ、螢
光を発しない浴７区中において一定の５１度で／ｉｉ元
を発する粒子、螢光ケ帖しない浴液中に２いて変化する
ｑ！１ｊ＋ｑで螢光を発する粒子、螢光浴液中で螢光を
発しないわｔ子及び螢光浴液中の螢光？発する粒子を含
む。更に螢光の変動は１粒子の凝集、無螢光粒子が螢光
性になること、或いは螢光粒子が無螢光になることの結
果としてであってよい。粒子は天然産又は合成の重合体
、天然の粒子１例えばピリオン（ｖｉｒｉｏｎ”Ｉ及び
、細胞例えば血液細１胆及びバクテリヤなどからなって
いてよい。粒子の寸法は０．０５〜１００μで変化し、
一方付取粒子は一般に直径が約０．１〜１０μであろう
。

光学像ｕｆは、螢光全党は且つ両足しうるような小谷欺
を定義するために用いられる。問題の容置は１分析線体
の容積を１分析線体中に存在する問題の粒子の全数で割
った値に対比でき或いはそれ以下であろう。即ちこね、
は問題の粒子１個が見つけられる半均の′６槓である。

測定さね、る容積は多くの因子によって影響される。１
つの因子は試料答鰯への照射の強度である。

強度が大きければ大きい程、−）と準１ｉ［ｆｆｉがら
の、必賛とされる螢光の岸を与える谷量が大きくなる。

第２の因子は、粒子７５律７子からの螢光の柑゛におい
て均一であるか不均一であるかである。即ち螢光粒子の
分布が１つであるか、変化する程度の螢光全廟する粒子
が分布しているかである。これは螢光お７子の疑果又は
粒子が螢光分子の付層で・５光性になること、・電光＞
、＜ｌ子の部分的クエンチングたけに帰せられる螢光の
クエンチングによる消失の結釆としてであってよい。他
の因子は７１．吹維の断面２問題の処長における谷面の
不透明性、検知器の感度。

１１１′＋ｌ々の粒子の・ぺ光強度などである。

粒子の電光が均一である階７合、所望の容量が容易に財
界さする。しかしながら、（）ｌ子が続祭さゎ。

る＋（Ｉｋ光の夛化に及ぼすそのＩｔＩ−に閃して不」
リーで２りる）具合には、１昇はより４Ｊ研となる。分
析においてｋｊ　＆１１１３層体のり（味ある？鏡度駆
（］、囲父に消５ノリなｃが、を度が仔イ１−するから
、扱１芙１本の：’ｉ＆　Ｆ’？　＋ｌ＋ｌｌ　ｆ用に
関し“τしきい（＋！−ＣＪ：りも大３い・、イナ光の
変化°を与える分析ｌにＡ、体中に存仕するＴ：あろう
粒子の硬大叔ケ計昇できる。

次いでこの値を光学ｉＷ、＋ｌ＋によす）しし料の移り
の決尼に吸出する。本労明の記述のＬ１１ｊｖｃ対して
、「有′・′刀ｄ夷科谷ｈｆ」とは洋；不４１ｆ↓刀為
らのしきい１１Ｇよりも２悟・の・は光変化が１睨祭さ
ｒｌ、る！Ｉｔｔｉ率の低い７１層・とじて７＋４伐さ
ｔｌ、る。ぞの取←ｎ１単〃フｊりにおいて、こｉＬ汀
ｔ１（］賂Ｉとする粒子の１　ｆＬ−はノ上を有夕）Ｊ
試料イ゛ト前中に見ハ１す確率の倣いこととして考える
ことができる。

タパ光が得らｒｌ７）谷量は元宇馬系１；の（旌造に上
って決められる。芥叶のブレは辿富円錐であろう。元学
熾維は典型的には中心域と１つのクラツディング（ｃｌ
ａｄｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ）からなり、その直径及び
イ）」対屈折部は円錐の半角及び円砺の最小直径（繊維
の端における）の両方を夾雑する。有効軸長さけ励Ｉｉ
ず光佇の５・”α度及び繊維先端からの軸方向の距茄の
増大に伴なう励起光の強ＩＷの低下率によって決尼され
る。この率は円湘の半角に依存し、半角が太きいとづ口
１度の低下率が犬きく、従って有効円錐長が短かくなる
。また強度の低下に影響するものには１．光の散乱及び
媒体の吸光性が存在しよう。

観察もれる信号に影響する（・１■々の因子は、有効試
料存知に対して、パックグラウンドの信号に対する区別
を可能にする合理的なしきい値が存在することを１子Ｍ
＋トするように選択される。抜叡の有効容箱が測定され
る。異なる有効試料容量は１粒子をイイ〃Ｊ試料容量の
内外へ拡散せしめる部長された期曲或１．／−，は各々
がダ叉しない有効’ｇ＋Ｅ料容量からの信号を受ｔする
枚数の光学繊維を有することの精米として存在しうる。

他に、試料が１つ又はそれ以−ヒの光学繊維たけ流れる
或−は１つ又はそれ以上の繊維が試料中を移動するとい
う動的糸も使用することができる。

光学繊維により有幼試浩から受けとられる螢光の伸は多
くの内子によって影響される。媒体の光散乱は試料の起
源並びに分析に用いる試薬に依存して賞化しうる。また
光を吸収する連続７に性媒体中には棟々の可溶性染料が
存在していてもよい。

予じめ決めた波長馳囲以外の光を遮断するフィルターも
使用できる。この方法において、−際される丞早レベル
は分析の必安江に応じて広く変えることができる。

有効試料容ｈｒを育るために使用でれる光学繊維ｒ［、
−敗に約５〜約５００μ、更に晋辿には約１０〜１００
μの［ｌｉ住全全治るでオンろう。有効試料存知の同紙
の半角は一般に約８〜約６０二更に普通には約１０〜約
３０°の範囲にある。軸の有効長も、一般に４＊”’／
Ｍｌミ直径の約０．５〜約１０倍、四に普通には約１〜
約６倍のｍｔ＋、囲でかなり変化するであろう。

イＪ−効試料谷ｈ４′は時間及びＷｆＬの双方の関数で
ある。実１県には予じめ決めた時間間隔に亘り光学繊−
１−によって受けとられる蛍光の’Ｉ４が４☆分される
。

有効試料容箱゛を測定するにに、バックグラウンドに固
有の半均Ｅｌ”ｌな又は通常の≦尖動を７曙える鋭い変
動を↑果す。

有効容重を＋ｒＩ！、　して、多動する２・立子の影筈
は、覗祭きれる光パルスの数（光重、子の数の一部分）
の時１１）１にメ゛」する急速７ｉ−変化である。種々
の手段により。

肩伎試料谷用のル［１団中における光′目（子の数の急
速の笈化或いは光のバーストを（４’ｌ　’４にするこ
とができる。丞卑饋力・らの予じめ決められたしきい服
の走を越えるバーストを数え、これを有効試料谷棚が正
又は負であると或いはイ１＋１ｔｊＮ的関係で考えられ
るかどう刀・、即ち粒子が有効試料谷ば（中に存在する
又はイ）有ミしないと児なせるかどうかに１ポ［示つけ
ることができる。

「ゲート時間（ｇαｔｅ　ｔｉｍｅ）　Ｊに光ノぐルス
が数えられている期間である。しきい値を越える光のバ
ーストＨ：、典型的には連わＬ的なケ゛−ト時間中の光
叙の変化の１４１１＠を細疋し叶つこの変ｆヒの割合が
、セノる１直をフ感える回４．！１．ｆ記録する装＋Ｉ
ＸＩ／’ｅ二よって数えら才しる。ゲート時間の長さは
Ａ＆度と簡便さの関数である。多数の測定全灯なうこと
ＶｔＣ興味があるから、ケ゛−ト時間にできるだけ短く
すべきである。

１〜かしながらケ゛−ト時間が短かすぎると、光パルス
のｙｖが少なくなりすぎ、大きい誤差が待ちこまｔ］よ
う。これらの考察にノ、（ついて、ケ゛−ト時間は広い
範囲に亘って変えることができ、一般に約０．１〜約１
００　ミＩＪ秒、更に普通には約１〜約２０ミリ秒の転
回にあるであろう。

励起光は全試料又は試料の大部分を励起光で照射するこ
とによって与えてよい。他に及び好１しくに、励起光Ｌ
「有効試料谷餘が照射される容量に比例するように光学
繊維によって与えることができる。廟効試料界側は測定
される各有効試料容量に対してＩ＋）’ｌ−であるとい
うことが軍装であるから、ね；雑によって当てら！１だ
有効試料ｒン、量は壁又に他の機械的押しつけによって
交叉しているべきでない。

有効試料容量゛に起源する螢光は、光学喰糾十段内での
反射に起因しうる励起光を実質的ＶＣ含ぽずに或いにｔ
励起光源からの漏れによって測定さ！しる。

螢光からの励起の分離を促進するために、ムいストーク
ス・シフト（ｓｔｏｋｔｔｓ　５ｈｉｆｔ）（ｒ−有す
る％符に少くとも１０　ｎｍ、好１しくに少くとも１５
ｒｔｍのシフトを有する螢光は好ユ６自である。史にそ
の上うな分離は、実）ｌ的に励起光ｆｔａ除する彼長帝
内で起こる放射だけを（ＩＪｉＪ　”ｒｉすることによ
って佃助することができる。史に、励、弱光は繊維の試
料端と険知器との間に位１畦するフィルタ一手段によっ
て除去される。次いで螢光をｎａｉ　５ｉ：’する７ｈ
めのコＤｎの手段によって検知を付ガう。予じめ決めら
れたレベル以上及び以下の１１１１での区別Ｑ寸、シき
い１＋Ｉ　Ｊｕ上の１ぎ号たけを検知するような区別装
置を用いることによって一達成することカミできる。

符に有用な光学極、維装蒔ば、　　Ａｊ（ｉになってコ
；１１常インプット部（励起光を供給する部分）として
言及される３つの端末部をゼする分岐導体ｆＪ多成する
３本の元孕？４戒紺、試験ＯＩＬ　（試料中に浸される
部分）及び検知部からなるカプラーとして公知の市販の
装置である。本発明で月４いるのに簡便な形において、
４煩維は冥’７Ｈ的にすべてのインプット部に入る光が
試験部ｖｃ（Ｈ達されるように接合される。

試験部に入る元（螢光放射からとして）は得体接会部で
分岐し、１部分はインゾッｌ’　ｔｅｌｓへ及び第２の
部分は検知部へ阪透されよう。１１目に２色性の鏡を接
合点で用いて螢光の実４′１ｌＦＪにすべてを検知部に
向わせることができる。そのような装置は市販されてい
るＩ＝＋えばＫａｐｔｒｏｎ　Ｉｎｃ、　ＣＰａ１ｏ　
Ａｌｔｏ。

Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）　Ｗ。

螢光のｆｔ号はいずれかのｉｌｌ　７にの螢光化せ９ん
を用いることによって侍ることができる。螢光を発する
セｌ子に１．ｌ？光化合物全４：＜（子衣面に結合はせ
ることによりＶスいは検光ｈｚ分を有する自然の状ｊＩ
＞４で表田１上に存在する粒子を用いて得ることかでさ
る。

代表的な螢光体は、キサンテンエＡ″科（例えばフルオ
レラセン、ロザミン及びローダミン）、ナフチルアミン
、クマリン■岑体（例えば３−フェニル−７−イツシア
ナトクマリン％４−メチル−７−ヅメチルアミノクマリ
ン及び４−メチル−７−メドキシクマリン）、スチルベ
ンｄ導体（例えば４−ツメチルアミノ−４′−イソチオ
シアナトスチルベン）及びピレンを含む。・１１″針光
体の記述は。

１１ｒａｎｄら、　Ａｎｎ、　Ｒｇｖ、　Ｂｉｏｃｈｇ
ｒｒｒ、　、　４１　。

８４３〜８６８（１９７２）及びＳｔｒｙｇｒ。

５ｃｉｅｎｃｅ、　　１６２　＋　５２６　（１９６８
）に見出さｔする。

上述の方法′ｆｒ−螢光分析に用いること［より、多く
の工程手１１１ｔ４及び試条全用いることができる。あ
る手順群１７１：栄光粒子を測定することを虐′むであ
ろう。この群は、更に均−ｒｃ帝光吐のま＼でいる粒子
、即ち２Ｅ本的ｖｃは４を光又Ｑす無螢光の２つの粒子
が分′布している粒子、或いはあるレベル以上の螢光を
正又は負の粕朱として足載する広い拘り旧の螢光を営む
駅Ｉ子に分類することができる。

記述しつる箒１の具体例において１粒子は均一に螢光性
である。クエンチャ−標識の粒子へ）結合の結果として
、粒子は無螢光ＶＣなる。例えば螢光′＋）２子は、被
検体の同族体である粒子に結合した１“Ｊ「１１〜γ体
ケ廟°して煕１造できる。活性炭粒子は抗配位体（配位
体（／Ｃ’Ｆｆ鶏的に結合する受体）と共役しうる。破
俟体、■凸）γ体共役渣元粒子汲び抗配ハγ体共役活性
炭７１＼７　（ｋぼむ試料は１分析媒体中で一緒に一４
″ることにより、予じめ決めた１間にげって螢光粒子に
結合する活性体粒子の数が媒体中の彼検体の知ｒ（よっ
て決定されるであろう。ρ１］ちｎａｐ間ｔ。

に２いて、有効試料行用の畝（！−試験し、これらの廟
効試料谷ｒ１１の何・ぞ−セントがしさい１旧よりも大
きいりＰ元に罰せられるかを決定する。ｔ２での時間１
１ｊｌ廟の埃、Ｉ川−の副足を繰返す。有効…（料秤吊
の、Ｌ、Ｐい胆よりも大きいパーセントでの変化の割合
ｌ／ｉＩＪ、に体中の彼恢体のＤｉ、Ｉ／Ｃｌ拘係つＱ
すらｆｔ、る。こ　、の分４９？ば、ン古・註炭粒子の
、Ｖ配位体及び（冗龍１恒体の非共有結付を介しての螢
光粒子への結合が・８九柁子の光全な又は笑智的に光竺
なりエンチングに帰虐するということを仮Ｗした。全蛍
光の小割せだけが活性炭粒子によってクエンチング訟ｉ
′ｒるツノ）脅、この分析は変化するボ光をイづ゛する
Ｓ、＜−子の不均一な分布と九本的に同一であろう。

催光粒子の不均一な分イｆ５は椿くの方法で生じつる。

例えば、粒子′！ｉ７侠果芒せる又は竹屑させることが
できる。例えば扱４ｔＡ体は帖せ点において多価である
受体又は抗体であってよい。・５！光粒子は。

−４画の受体がネ子間で儲かけとして１助〈ように配Ｉ
ｆＬ体と共役していてもよい。この、勤会に（（肢体中
に存召三する・浸ン・１英体の嗣°が多けｔｌ、は多い
程、公ｔイ来としての１）；ｉ：果体の数は大きくなる
。（’７．．ｔ、−＞で問題の粒子は、２つ又はそれ以
上或いＵ」：３つ又ｉｔ；ｆ：′ｎ以上の私ｌ子の［有
］を果である粒子として退択してよい。更に刺当な′ｌ
ｔ：気）１’Ｊ手設ｒＣより、粒子のある截以上のルタ
宋の全数ｆ数えるはかりでなく、谷分布の叔全数えるこ
とによって醒果の寸法を決定してよい。縦果の寸法が増
加するにつれて、■Ｅ果か４子の螢光も。

餅東中の粒子の数の増加と直線関係にはないが増大する
。

不均一な分布ケ冶するためのＩ氾２の方法１１部分的（
Ｃはすてに堝えられていたものであり、クエンチャ−の
ｉ＆光核粒子の粕汁が７１１５分的に螢光を減するとい
う方法である。他に、・ζ光分子が媒体中の阪侠体の−
に比例して或いは１）′４子上の結合点の数に比かｌし
てオ）ン子に結合するようになるという無蛍光粒子？？
ｍ”していてよい。例えば〉ζ光分子を抗配置曾″体に
結合させてよい。配位体ｉｔ無帝プＣ粒子に結合させる
ことができる。螢光体に共役する抗配位体は板検体？含
む試料と併せると、被検体は抗配置〜１体の結合点を７
両すことができ、桟りの結仕点は試料中の被恢体の址と
関連うけられよう。配イＡＬ体共役粒子を・原体に冷加
した時、残りの螢光共役体は粒子に結合し、変化する・
イ？光の粒子分布を提供する。螢光強度のしきい値は有
効試Ｈ容吊・に対して正の値を示すように烟択される。

次いで予じめ決めた時間ｌｉ、ｉ１隔において、平１電
において、父は２つの異なる時間において、しきいｆ＋
ｏ−よりも大きい螢光を有する有効試料答恒のパーセン
トを決定しよう。実際は、統計的な１１ｒ（、即ち年−
の値或いは禾が平面値から吋りれている月１合１／ｌｉ
変化の割合を火水してよい。

無螢光粒子は細胞表面上に複数の’ＰＩ’Ｌ原を有し、
但しある数の各抗原が存在する細１ｆ己を含む。螢光体
を標瞳した抗体を表面の抗）京に対して用いることによ
り、無償光イ：１１胞に螢光体になるであろう。

降通にる程度の螢光の分布が存在するでＪ・ろうが。

いくつかの状態においてｔま凡そ２つにすぎない分布、
即ち無螢光面ｊ胞及び笑質的に均一な蛍光の細側に関し
て、細側表四十に存在する帽付点ケ実質的に嗣オロする
ことがＩｊＪ’ｆ止であろう。

１＝Ａ　３の技法も１・ぜ來を用いることによって圀示
しうる。この挟術にふ・いては、無蛍光粒子がｌすｆ用
されるが、理吹相は蛍光１午としうる。このポにおいて
、（（を果は有効試料谷νのかなりの割付で汗げｉｌは
ηら々い。即ち一果が有効試料谷ｍ中に存在する場合、
幌祭される螢光が美質的に減少しよう。

これらの粒子は無蛍光であるけ１１ども、蛍光に対して
実Ｊｍｌ的に不透明であるべきである。即ち粒子は笑負
的な影を生じ、訣果の谷し°よりも央・ｉ的に大きい容
拓に２いて螢光が光♀↑シく維に到煙するのを４７Ｉ＝
、する。

上述の技法は被恢体を決定するためｖｃ　（′−＋仕す
る多くの検知の分析法のいくつか全・丙ボしたにすぎｈ
い。これらの分析法は多くの刊何吻及びセｆ許に晃ｔハ
すこ２ができる。特許のいくつかは米国特許鋼３．８２
６．６１３号、第３．８５３．９８７号％第３゜９２５
．５４１号、第４．０６１．４６６−号、第４，０６４
９３５号、単４．１４１．９６５号、第４，１６４，５
５８号、単４．２５６．８３４岩、第４．２７５．１４
９号及び第４．３１８．７０７号が圀である。種々の方
法の６ピ述は本明細督に参考文ｔｈ！；にとして引用さ
れる。こすしらの記述は完全なものでなく、むしろ本発
明の必用しつるいろいろ左方法のｉ夕ｏ示である。

装置を史に理解するために図囲ｆｆ参照する。図凹は分
析に使用できる本発明の具体例を例示する。

粒子２をＪｌ＠ｉ濁液で官有する液体試料１が試料受器
手段３　ＶＣ含捷れている。試料受器手段は試料を保持
し且つ諭体六■下に光学７ｉ（４ｖＪ１１’　５の先端
が押入しうるいすノ１の容器であってもよい。小さい寸
法の’ｊ＋　Ｉ’ｍ、・汐１１えはミクロか量器Ｃｍ１
ｃｒｏｔｉｔｅｒ　ｗｇＬｌ）がここでは有用である。

一ヒ記装置は、物質が人手によって試料容器中に２４人
されるパッチ式の系［対して示される。連続式又はパッ
チ式操作に対してはいろいろｈ　１１ｊ４の装置ｉｊ部
部品出出ることができる。抄１ｊえば試料及び試楽を予
じめ決めた谷前で口内ｊ１的に移すためには。

ビペツターー布釈４・残″Ｊｔ便用することができる。

試枦１及び試梨を自Ｉ助的に混合し１次いでブ℃字峨朋
りが反しである′肖中′（ｒ−荊過埒せる馴７合、流管
を用いることができる。この場合手動又は自動装置に通
常の神々の形体を用いることができる。

光学繊維５は、一般的な意味で上述されており。

図面にＶｉＹ字型カプラー６の単一（又は試験）繊卸と
して示されている。２つの分岐したｍＲｆｉ＋−はイン
プット棉針［ニアと検知繊維８であり、すべての３つは
接合点９で一緒になっている。光源１１からの励起光１
０はインプット繊維の先端を通ってカプラーに入る。励
起光源は分析に用いる螢光体の吸収スペクトル内の電磁
照射￥ｉ−発するいずれかの光ｎチｔであってよい。好
適々光源はｗ色光を発する約４００　ｎｖル以上のもの
である。Ｈｇ　−Ｃｄ及びＡτレーザーはこの点に関し
て慣−に有用である。

広い波長の光源を用いる」↓′Ｊ会ｒＣは、フィルター
を用いて励起光の波長ｒ：１［見回がｊ方望の１；甲囲
内にあるようにする。

祭合点９はインプット橙久ぜ７からの実）・’Ｊ的にす
べての光を試験ホ４（利１５に向わせ、ここから光は試
験祿維の先喘４を通って液体試料１に入り、有効試料谷
屓１２ケ照射する。すでに述べたように、試料を励起光
により狭い光線として或い（ｄ全試料を光糾内に皓いて
照射するために、他の平段も使用できる。光学繊維ケ用
いる賜金、有効試料谷批に試料の内鑵ブレ部分であり、
そのｔ１１１面（開面）の境界は光学幀泊ｔの構造で決
められ、その輔の長さは光源の強さ及び先ｇｒｊから試
料中への距離の増加と共に低下する強１更の開会によっ
て決矩畑れる。

有効試料谷恨１２内に示ちれる単一の粒子からの螢光の
１部分だけは適当な方向に放射されて試験イ、ｄ、維の
先端に再び入る。次いでこの部分は試験繊維５を通り、
カプラーの接合点９に戻り、そこで等しく或いはル）る
−星比でインプット徴維７及び検知・１と純量８に分か
れ、信号１３が映知器１４で抗みとられ且つバックグラ
ウンドのノイズと区別される十分なＩｔ虫ＩＷで検知：
ａｊｆＫ４＋　８を出る。険チ１］器は光電子を受は且
つそれを異なる強度の・１汀云間の差としての形に変換
することのできるいずれかの装置（＋で々）る◎ 光′１ｉ：子増１］實により１つの光・ぞルスで放射さ
れる′１子に、信号ケｊ４巾し、光串４子壇巾管にｔｌ
」米するノイズｆ　１ｌＩＬ・ζ少させ、そしてデ゛ジ
タル・カウンターで数えらｔｌ、る十分な′由、圧のパ
ルスＴｈｅら生するプレ壇巾命ｌ／Ｃ向けらノ１、る。

カウンターのケ゛−トＩＪｊ間当すノ光パルスのグ（は
ケ゛−ト時間に区って平均すｆｌ−た光の辿曳に比νり
する。これらの光）パルスの数値は数値の変化ｊｆ検知
するプログラムを１１１ｔんだコンピュータに入り１問
題の粒子の有効試料按用°中の通過に相当する螢光の鋭
い変動を示す。これは光検知器からの信号がどのように
デジタＪし式で計昇される刀１の１つのｉ夕１＋　ｖｃ
すぎない。他に、検知器からのアナログ信号を用い、鋭
い変化をノ１イーノクス・フィルター（）ｔｉｇｈ−ｐ
ａｓｓ　ｆｉｒ　ｔｅｒ）で検知することもできる。或
いはアナログとデジタルの組合せ法も積用できる。いず
れの場合にも、しきい瞭を越える信号の変動の頻度は１
間ｊ用の粒子が有効試利答卸中で検知される頻度に相当
すると解釈できる。

次いで正であると児斤される　ｉ、！ｉ４ち予じめ決め
たしきい匝レベル１り上の・撃光を与える有効試料存知
−の・ぐ−セントを決定することができる。甘た公知の
石゛の被検体を有する試料を用いて分子′Ｔを行ない、
正の有効試料各９の・呪祭されたパーセント全被検体の
俵ＩＷに対してグラフにすることもできる。

この１１１−コンピュータは正の有効試料谷１の決定に
九づいて試料中の伝１灸体の改題を自動的に計）ネする
であろう。この計ｎは、平１財Ｇｉ＋０１回のル１間に
対して或いは半筒付近又は平衡時の１回の期ＩＨｊ　Ｋ
対して予じめ決められた期間における正の有効試料容置
の・ぞ−セント間の差に基づいてもよい。

実施例１ 本実施例は、螢光及び無螢光粒子の双方ｆ含有するθｉ
ｆ、体ｈ゛ｉ濁液中に存在する・ｆ元粒子を飲えること
に本発明を１更用するＶｌｌを示す。

クマリンで予備染色した直径０．９ミクロンのポリスチ
レンビーズを、　ＰｏｌｙｓＣｉｅｎｃｇｓ、　Ｉｎｃ
。

（Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、　Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉａ
）からイ（すた。このビーズｆｒ、　ｌ’＃Ｉ４＞Ｎで
あるが染色されてないビーズと。

ビーズを蒋／恥状態に且つ分離して保つのに十分な牛の
皿ｆｇアルブミンｆ：苫む水性緩価浴赦中におい”で−
緒にした。ビーズの全量が３．５　Ｘ　１０−７個／ｍ
ｌであるが染色と非染色ビーズの割合の異なるいくつか
のそのような聰濁液を２ｍｌのプラスチック・カップ中
に入ｆ］、た。次（ハで谷（にミ′／＠液ケ次のように
分析した。

Ｋａｐｔｏｎ、　Ｉｎｃ、　（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ、　
Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ’）から入手したＹ字型鍼維光学
カプラー（Ｓｐｌｉｔｔｓｒ−Ｍｏｎｉｔｏｒ、　Ｉ’
０ＭＳ−８５０−Ｐ型）の１つの繊維端をｍｌ濁液中に
没入した。ｆ・、ＨＡａｌは５０ミクロンの置部を有し
、１２°の半角を有する励起円・羅と１×１０７ｍ１の
有効試料谷旬を与えた。Ｈｅ　−Ｃｄレーザーからの励
起光を２つの分岐横紐の１つに供帽した。染色された粒
子が試料谷釦中を拡散するにつれて、螢光の部分が粒子
がら放射された。これは没入され、た繊維に丙び入り−
ｔｋ　＃ｉｌ；　ｊν合都で分岐し、２つの分岐ＭＶ維
に沿って♀ｒしい半分の螢光が返汚さ名た。次いで第２
の分岐ハく雑巾を通ったｉｈ５分を、５０〜５００秒の
期間１回０．１秒毎の割合で２００ミリ秒のｒ−ト時団
内において干渉をフィルターで除いた鎌篩ｒインのＥＭ
Ｉ光電子増巾（倦で絖みとった６次いでゲート時間尚り
の螢光Ａルスの平均数をコンピューターで決定した。測
定の精度を高めるために、染色された粒子の割合が試少
するにつれて長い全サンプリング時間を用いた。朱色さ
れたビーズを１す・用しない空実験を行なってパックグ
ラウンドレベルを決定した。

結果を７：Ａ’　１表に示す、試料中に存在するビーズ
の、コンピューターで決定されるような平均数は。

蛍元凶倣鏡で夾際に数えることによってσ（１４定され
る↓うな染巴特れたビーズの娘度Ｋ　ＸＨＬ、て示され
ている。データは滑らかな関係を７１くしている。

第　　Ｉ　　表 試験昭果富染色対非染色ビーズ 全ビーズ濃度：ビーズ３．５　Ｘ　１０〕個／成有効試
料！１４：＝　１ｘ　１ｏ°丁１ｎｌケ・−ト時間１２
０ミリ秒 ０（Ｌきい値）　　　２００　　２．５Ｘ１０’±２５
×１伊４１．７Ｘ１０’　　　　　５００　　　８．０
Ｘ１（ｒ’　±２．８　Ｘ　１０’６．９Ｘ１０’　　
　　１００　　５．２Ｘ１０−３±１．６　Ｘ　１０−
”２．８Ｘ１０’　　　　　１００　　　１．７Ｘ１σ
２±０．３　Ｘ　１０−２１、ｌＸ１０’　　　　　　
？５　　　９．３Ｘ１０−”±〇、８Ｘ１０４４．４Ｘ
１０’　　　　　　　５０　　　２．６Ｘ１０−’　　
±０．２　Ｘ　１　（ｒｌｌ、８Ｘ１０’　　　　　　
５０　　　４．６Ｘ１０−’　±０．２　Ｘ　１０−１
実施例２ 本実施例ｊｄ、本く６明全月１いることによるビーズの
接合の供出法を示す。

実ｈＩｌＩ例１で６１−１述した染色ビーズを抗免投グ
ロブリンＡ′（抗１ｇ１ｌ）で破覆し、同様の方法で緩
衝Ｒ１竹中に：メ纂濁させた。次いでいくつかのそのよ
うな歴濁渣Ｖｃ秤々の餉のＩｇＥを除却し、実施例１に
６１．述した什維光学カプラー及び方法を用いて分析を
行なった。

ｉｔｒ果を小■衣ｒＣ示す。ＩｇＥのｈ；の増加と共に
。

明るいビーズｅ２と果物の商影響を反映して粒子のカウ
ントの１￥／犬が見られた。

第　ＩＩ　　衣 全ピース°糸度ｔビーｘ”３．５ｘｉｏフイ向／　ｍｌ
有５！；ＩＩ試料各被＋　０．５　Ｘ　１０−’　ｍＩ
Ｖケ゛−ト時Ｉ１．ｉｊ　＋２０　ミリ秒１（ＩＥ濃度 ０、０　　　　　　７．６　Ｘ　１０−”　　＋０．９
　Ｘ　１０−”０、１　　　　　　７．９　Ｘ　１０−
２　　＋１．　：（Ｘ　１０−”１、０　　　　　　９
．８　Ｘ　１　０”　　＋１．　ＯＸ　Ｉ　　Ｆ２１０
、０　　　　　　１３　Ｘ　１　０−”　　＋２．　Ｏ
Ｘ　１０−２１０００　　　　　　　　３７　Ｘ　１０
−２　　±３．０Ｘ１０′！上述の結果からは、本発明
の方法が低砲度のいろいろな配位体を決定するための闇
単で正確な方法ｆ提供することは明白である。本方法Ｖ
！螢光標扉を用いる多ｆ市類の分析に容易に適用するこ
とができる。史に、本方法は、すべてが実切削に１ｉｑ
ｉ　−の螢光を有する或いは広く変化する・、ｆ、−光
を１イすることのできる螢光体を数えることｆ言む新規
な工ｙ３−手順に１画用できる。裳飽けｔｉＪｉ単であ
り、容易に目！唾ｆＩＪ化でき１神祭された信号に基づ
いて試料中の被４矢体の餡−を直接続４、とることがで
きる。

以上不発明について、例示の目的及び明示と理）伜のた
めに央か１１秒１１を用いていくらか詳１ＦＩＩｆに６
己述してきたけれど、７１♀許ｍｌ求の卸、凹円である
変化及び改変を行ないうろことに明らかである。

【図面の簡単な説明】

１ツｊ面は、螢光ｆ発する〜子の存在を検知するのに用
いるための庫゛健明の長姉゛の１つの具体例を示す藺屯
な全体図である。 府ｆ＋　出ｌｒｕ　人　　シバ・カンノぞ二−手　続　
補　正　書（カニ噌 昭和５８年１１月２４日 特許庁１９′１目　　ハ　４＊　第１１　　夫　　　殿
１、事件の表示 ＋ｌ’ｌ願昭！ｉ　）（−］　２４　Ｈ＋’　２　刊゛
２、発明の名称 （）ｌ子の旨５ｒ、ｖ、を匂１白− ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 ４代　理　人〒１０７ １ツ１　面 ７、補正の内容

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 工、被恢体全含む疑いのある試料中の該被検体の存在を
   決定する方法において、但し該方法が該試ｆ＋を粒子含
   有の分析媒体と一緒にすることケ含み、なお該７βン子
   又は該媒体の少くとも１つが螢光体であり、ｈつ該方法
   が予じめ決められた有効試相谷酊から・、ｅ元ケ受けと
   るために元♀繊維を用いることを言み、なお該有効試料
   容量は螢光の半均１１１：（７ハらの変動が予じめ決め
   た螢光の強度直を越えるという１氏有蕉率を仝凹曲に及
   び一時的に有していると定性され、また該被検体の存在
   は該分析媒体の肩効試利往に１の代数から得られる螢光
   領の観宛される変動を変化はせ、また該変動は（ａ）粒
   子及び該被検体間の結合に由来する粒子の凝集成いは（
   ｂ）螢光体又はクエンチャ−の、特異的結合対の結合を
   介しての無螢光粒子又は螢光粒子への結合、の結果とし
   て存在する。という該被検体の存在を決定する該方法で
   あって、 該試料を該が７子含有の分析媒体と一緒にし；少くとも
   該有効試料谷址を励起光で照射し；代数の有〃１試料存
   ｈ１′からの螢光強度を決定し：そして 平均１ｕ−力４らの変動の数を、公知の↑（ｊの被検体
   を有する分析媒体における変動に関連つける。 ことを含んでなる該方法。 ２、該変動が粒子の涙巣の結果として存在する特許請求
   の範囲第１項記ｔＪ＋Ｖの方法。 ３１亥粒子が螢光性である狩許請λくの範囲第２瑣ｈｉ
   、載の方法。 ４、該変動が螢光体の無螢光粒子へのホ１１甘の結果と
   して存在する特許請求のｉ陀囲第１項記載の方法。 １　よ変動がクエンチャ−の螢光粒子への結合の結果と
   して存在する特許請求の＋１＋ｉ）門弟１項記載の方法
   。 ６、該有効試料容重を該光字４．奴維からの光で照射す
   る特許ａ〜求のｉｔ’ｌｌ囲第１．２，３，４又は５項
   の何れかに記載の方法。 ７、該試料が生」却字的流体である特許：’＃　Ｊ（の
   範囲第５狽記載の方法。 ＆　被検体全含有する疑いのある試料中の被検体の存在
   ケ決定する方法において、但し該被検体７５祐己位体及
   びその同族受体からなる特典的帖合対（５ｂｐ）の貝で
   あり、該方法が（１）該螢光本・γ子が媒体中の被検体
   の散に比例して縦来するように該ｓｂｐの１つの員の複
   数が結合した螢光粒子及び（２）予じめ決めた値よりも
   太きいしきい値からの。 螢光鎚の変動の確率が低いように１寸法及び時間に関し
   てず糀される有効試料容忙からの螢光を受ける光学繊維
   を１史用する。という方法であって。 該試料を分析媒体中において該螢光粒子と一緒にして、
   螢光粒子を分析媒体中の被検体の量に比ｉ夕１１シて凝
   集塾せ寡 該有効試料谷坩全該光学４．！維を用いての励起光で照
   射し； 螢光デト度を枚数の有効試料容量から決η！シ；そして 峨有効試料容量の強度の、該予じめ決定した領からの変
   化を、公知の１１１．の被検体を有する分析媒体中の変
   化に関連つける。 ことをぼんでなる該被検体の存在を決建する該方法。 ９、寸法及び時間に関して有効試料容量として定在され
   る小￥＋鎗からの蛍光ｆｔ測定する装置において。 朴器墨 該容器中［延びる試験誠紺、インプット帆座及び侠知神
   、靴を有する１字形のカプラー光字瀘維；該インプット
   、、伐紐とイセ１１合ぜた光照射手段；１１〆恢知セ・
   、ｊ糾と組合せた光検知手段；不一含んでなり、但し 督光瑛知手段が光検知手段及び予じめ決定した時：ｉ４
   １　ｒｆＪｉ　ｍに１すしきい（ｔｉｔ以上の、光偵知
   手段から受けた伯゛号の変動？数えるための手段ケ含む
   。 パ亥荀二光ｆｒ＋用定する装置。