JPS5980610A - コレステロ−ル低下活性画分の製造方法及び当該活性画分含有抗動脈硬化剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な抗動脈硬化剤及びその製造方法に関する
。今日、所謂典型的成人病の１種である動脈硬化性疾患
乃至高脂廂症等の治療・予防薬としてはクロフィブレー
ト関連製剤を始めとして幾つかが提案されているが、薬
ｊ１（１効果及び副作用等の点でこれらは必らずしも光
分満足し得るものとは云い難くより効果的な薬剤への希
求が一段と高４っている。

本発明者らは新規抗動脈硬化剤につき鋭意研究の結果、
ストレプトコツカス属に屈する各ｆ１１徽生物菌体から
の特定抽出画分が面中コレステロール値を極めて効果的
に低下せしめ得るものであり且つその起源が所謂腸内細
菌であるこれら菌体の抽出画分は経口では実質的無毒性
であること、更にはより高度の精製のための出発材料と
して好適であることを知見し、本発明に到達したもので
ある。

以下、本発明に於すて使用され得る微生物の種類等、活
性画分の製法、薬１！１１作用等につき詳細に分脱する
。

微生物 ストレプトコツカス属に屈する各種微生物が使用さね得
、就中、ストレプトコッカス・フェシウム、ストレプト
コッカス・フェカーリス、ストレプトコッカス・ボービ
ス、ストレフトコツカス・エビラム、ストレプトコッカ
ス−デユランス、ストレプトコッカスｅサリヴアリウス
、ストレプトコッカスｅミテイス、ストレプトコッカス
・イクイヌス等を好適なものとして例示し得る。

更に、本発明に於いて最も有用な具体的菌株例を微工研
受託番号と共に表示すれば下記の通りである。

第　１　　表 ５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃｉｕｍ　　　Ａ
ＤＶ］００９　　　　ＦＥＲＭ　Ｐ−６６２４ｒ　　　
ｆａｅｃａｌｉｓ　　　ＡＤＶ９００］　　　　　　　
ｔ　　　ｚ−６６２５＃　　　　＃　　　ａｖｉｕｍ　
　　　ＡＤ２００３　　　　　　　＃　　　＃−６６２
６Ｉ　　　５ａｌｉｖａｒｉｕｓＡＩＷ］０００］　　
　　　ｐ　　　ｚ−６６２７＃　　　ｄｕｒａｎｓ　　
　　ＡＤＶ３００１　　　　　　＃　　　＃−６６２８
＃　　　ｍ１ｔｉｓ　　　　ＡＤＶ７００１　　　　　
　ｒ　　　ｔ−６６２９ｙ　　　ｅｑｕｉｎｕｓ　　　
ＡＤＶ８００１　　　　　　ｐ　　　ｒ・−６６３０菌
学的性質 菌学的性質の点では、本発明で使用の微生物は同−分類
菌につき公知各文献の示すものと同一の諸性ｆｔ１Ｊン
有する。

すなわち、本発明微生物の菌学的性質及び培養条件等に
関しては下記諸文献が参照される。

］　）　Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅ
ｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂｐｃｔｅｒｊｏｌｏｇｙ　
＊８　ｔｂ　ｅｄ、、　４９０−５０９　（１９７４）
２）　Ｉｎｔ、　Ｊ、５ｙｓｔ、　Ｂ、ａｅｔ、　１６
　１１４　（１９６６）３）　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　
Ｉｍｎｕｎｏｌ、　２５（３）、　２５７−２６９　（
１９８］）４）　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、　Ｐａｔｈｏｌ、ＪＡ
５３−５７　（１９８０）５）　Ｊ、　Ｇｅｎｅｒａｌ
　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　１２８７　］　］３−７２
０（１９８２）６）　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ、、　２３１６）　１１３　］−１１３９（１９７
２）ここで、前出各種菌株につきその１三な菌学自勺性
状を要約して表示すれば次の通りである。

以下余白 （１１２，３，５−）リフェニルテトラゾリウムクロリ
ド）これらの微生物の培養は上記の通り常法によるもの
であるが、例えばロゴサ（Ｒｏｇｏｓａ　）液体培地（
註）にて好気的に静置培養し、得られた培養液を遠心分
靜してその菌体が採蛯さねる。

（註） 蒸留水１１中に トリブチケース　　　　　　　１０１ 酵母エキス　　　　　　　　　　５２ トリグトース　　　　　　　　　　　３２に２ＨＰＯ４
３ｆ ＫＨｚＰＯｔ　　　　　　　　　　　　　　　　３　Ｓ
’クエン酸三アンモニウム　　　　２ｖ ツイーン８０　　　　　　　　　１？ グルコース　　　　　　　　　　２０Ｆシステイン塩酸
塩　　　　　　０．２２※塩類溶液　　　　　　　　　
　　５Ｍ（ｐｉ（７，１２１”Ｃ１５分間加熱滅菌）※
塩類溶液蒸留水１００ｍ１に 活性画分の製法 本発明活性画分の典型的製法の１例を各工程ごとに示せ
ば次の通りである。

１、　菌体採集工程 前記名微生物等の菌株を前述のロゴサ液体培地５６に接
種し、３７“Ｃにて５時間好気的に静置培養して生菌数
６　Ｘ　ｊ　（ｌｓ／ｍｔの培養液をつくり、得らねた
培養液を１２，０００　ｒｌ）ｍの連続遠心分離に付し
菌体を集め、生理食塩水で２〜３回洗浄して採集菌体と
−ス４）。

２、菌体破壊処理工程 ａ）前記採集菌体を生Ｊｊ１食塩水　（０，８５％Ｎ、
ａＣ１水溶液）　１５　ｍｌに懸濁して得られる菌液（
２ＸＩＯ”／献）を１１５°Ｃで１０分間加熱（オート
クレーブ）し、破壊菌体懸濁液とする。

ｂ）前項ａ）に示す菌液を超音波破壊処理（１５ＫＣ，
６０分）し、破壊菌体懸濁液とする。

３、蛋白分解酵素処理工程 前記破壊菌体懸濁液を常法によりプロナーゼ、トリプシ
ン、ペプシン等の蛋白分解酵素処理する。ここにおいて
各種蛋白分解酵素中プロナーゼが特に有用であり、その
処理条件等は次の文献に準する： Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ
、■、ｐ２６（１９６６）。

４、活性画分分取工程 透析膜（商品名”セロチューブ”；牛丼化学薬品社製）
等で３昼夜；蒸留水で透析処理し、透析内液として目的
活性画分が得られる。

薬理作用 １、薬理効果 後記各実験例に示す通り本発明活性画分より成る抗動脈
硬化剤は、血中コレステロール値を極めて効果的に低下
せしめるものであり、したがって、この指標と密接な関
連を有する動脈硬化症を始めとし、高脂血症Ｈ＋ｔ％　
’）ボ蛋白血症、黄色腫症、胆石症、高面圧症、糖尿病
等の疾患に対しその治療乃至予防薬として有用なものと
云い得る。

本発明剤は父、経口、静注等の手段で適用され得、その
用量は通常数〃り〜数１０５’／Ｋｆ体重、より好１し
くは軽口投与で数］０ｆｆ９〜数Ｖ　／　Ｋｙ体重程度
であり、その剤型としては生理食塩水等への懸濁液剤、
凍結乾燥等による粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等
々、通常の剤型を適当なキャリヤ、増敏剤、希釈剤等と
共に適宜選択使用し得る。

２、急性前件 後記実験例に示す通り、本発明剤のＬＤｓ。

値は４．２〜／マウス（腹腔内投与）以上であり、経口
投与の場合は実質的に無毒性である。

実施例 その生菌数が２Ｘ１０１０個／　ｍｅの菌液（生理食塩
水懸濁）を用い、前記活性画分の製法に準シテストレブ
トコノカス・フェシウムＡＤＶ１００９から超音波処理
（前記２．ｂ）項）により破壊菌体懸濁液を得た。

次に０．００１５　Ｍ　ＣａＣ１ｚ伺加０．２　Ｍリン
酸緩衝液に懸濁しく総容１ｉｏｏν）、これをプロナー
ゼ（シグマ社製プロテアーゼ・タイプＸＩＶ　）２０　
ｍｙにより４７℃、２４時間処理し、その後更にプロナ
ーゼ１０■を添加し４７℃、２４時間酵素処理した。得
られた被処理液を前項４．に記載の通り透析処理に付し
、低分子量（約３，５００以下）成分を除去し、活性画
分を得た。

ここに於いて、菌液１０　Ｑ＋ｎｊ’　（生菌数２　Ｘ
　Ｉ　Ｏ”個）当りの菌体乾燥重量は２．０１であり、
これより得られる活性画分の夫は３４５１Ｉｖであった
。

次に、このようにして得られた活性画分をＪＯｄ生食水
に懸濁しそのＱ、　５　ｍｌ及びこれに相当量の各両分
及びオートクレーブ処理したのみの死菌体菌液を通常ラ
ット（雄６週令、平均体重２２０り、各群５匹）Ｋ２週
間、経口的に連日投与し／こ。

次いでこね、らラットの工大動脈よ？）動脈血を採集、
遠心分離して血清標品を得、コレスキット（商品名：関
東化学社製、Ｚｕｒｋｏｗｓｋｉ法）によｒ）血清標品
中コレステロール値を測定した。

結果を第：３表に要約して示す。

尚、表中、対照は試料無投刀ラット群であり、各数値は
対照群を１００％としたときの低下率（鉤であり、又、
比活性は死菌体の夫を１としたときの単位重斌当りの相
対活性を示す。

又、ダイエンドすブよりち飼料の組成（％−ｆｒｔ係）
は下記第４表の通りでありこれを自由摂取とした（以下
、同様）。

第３表 透析外液　　　〜〇　　　　− 活性画分　　　３５．０　　　７．３ 死菌体菌液　　　　２７．７　　　　　１第４表 カゼイン　　　　　　　　２０ 大豆油　　　　　　　　１０ 小麦でんぷん　　　　　６１ ミネラル　　　　　　　　　４ ビタミン混合物　　　　　２ ろ紙粉末　　　　　　　　３ 以下余白 実施例 実験例】ど同様にしてストレプトコツカス属４５、１ｉ
ｇ微生物の加熱処理菌体及び活性画分な得。

これを通常ラッ］・（雄１８週令、平均体重２４０１；
各群５匹）、通常及び無菌マウス（雄１８週令、平均体
重２０　ｙ　；各群１０匹）に４週間、菌数にして１０
１１　個／日相当昂を経口的に連日投与し、前記と同様
にして血清中コレステロールの各低下率を測定した。結
果を第５表に示す。

尚１表中、“コレステロール負荷”又は”果糖負荷”は
、前記飼料に更に１％コレステロールを添加しまたもの
或いは小麦でんぷんを果糖にて全量置換した飼料を使用
した場合を示Ｊものであり、数値は無投与群を対照とし
た加熱処理菌体の低下率及び活性画分の比活性（括弧的
数値）である。

第５表 無菌　　　通　常 微　生　物　　　　マウス　マウス　ラット　ラフトリ
ラット０リコレヌテロール負荷タイエツト 重り果糖負荷ダイエツト 実施例 Ｓ、エビウムＡＤＶ２００３菌株を用い、実験例１と同
様にして（但し、破壊工程は８０℃の熱水による：前３
．ａ）項）、活性画分を得た。

これを前記実験例１と同様にＩＪｌｌ　？ｉ＋：ラット
に投与ｌまた結果、比活性は７．５であった。

実施例 Ｉ　ＣＲ系マウス（雄６週令、平均体’１１３０．０±
０．７’ｌを使用し、前記活性画分の製法に従＋　９ って得られた活性画分をマウス当り９×１０．９　Ｘ　
ｌ　Ｏ’、９Ｘ１０’個の３段階の出発菌数（各群１０
匹）に相当計でその生理食塩水Ｑ、　５　ｍｅ懸洞液を
腹腔内投与し、１４日間マウスの生死を観察した。

Ｂｅｈｒｅｎｓ−に’ａｒｂｅｒ法に従って＄−出した
Ｌ　Ｄａｏ値（ｍ１／マウス）を第６表に示１゜ 尚、連日経口投与では、いずれの場合でも実質的に無毒
性であった・ 第６表 Ｓ、フエシウＡＡＤＶＩ００９　　　　　　　４．７Ｓ
、７：ｘ、ｊ）−り、（ＡＤＶ９００１　　　　　　４
．２Ｓ、エビラムＡＤ２００３　　　　　　　４．２Ｓ
、　−９−ＩＪ　ウ７１ＪウスＡＤＶＩ０００１　　　
　５．５Ｓ、デユランスＡＤＶ３００］　　　　　　　
　６．ＩＳ、ミテ（スＡＤＶ７００１　　　　　　　４
．３Ｓ、イク（ヌスＡＤＶ８００１　　　　　　　５．
５製剤例 １、前記実験例１に従って得られたＳ、フェシウムＡＤ
Ｖ］００９活性画分の凍結乾燥物５０〜（死菌体数１．
５Ｘ］０”個に相当）を精製でんぷん末９５０■と均一
に混合、打錠して経口投ｊｊ用錠剤とした。この錠剤は
体重５０に９の成人における死菌体数用１ｉ３Ｘ］０”
個／Ｋｆ体庫、に相当する。

２、　−に記凍結乾燥物４３（１ｒｎｇを精製でんぷん
末５００〜と混合、打錠したものは、同様に用縫３　Ｘ
　］　０”個／胸に相当する。

このように、本発明剤は前記標準用液等に基づいて、活
性画分と薬学的にＷ［各式れ得る相体とを混合して所定
の活性を有する所望の剤型とすることができる。

特許出願人　　株式会社アドバンス開発佃究所手続補正
！（自発） 昭和５８年７　月２７日 特許庁長官若杉和夫　殿 １、事件の表示 昭和５７年特許順第１８９２５４号 ２、発明の名称 コレステロール低下活性画分の製造方法及び当該活性画
分含有抗動脈硬化剤 ３、補正をする省 事件との関係　　　特許出願人 住所　　〒１０３　　東京都中央区日本橋小月町５番７
号（置　　０３−６６７−１５５１） ４．１１１正の対象 明細書の１発明の詳細な説明］の欄 ５、七■二の内容 明細書第４頁第１行［ｊから９行目第１表を下記の通り
に訂正する。

第　１　表 −Ｉ／’ｌ］　　　　　　　　〆託号 ５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　　ｆａｅｃｉｕ＋ｅ　
　ＡＤＶＬＯＯ９ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２９６ｈ　　　　
ｏ　　　ｆａｃｃａｌｉｓ　　ＡＤＶ９００１　　　　
　　ｈ　　　ｔｔ　−２９７ｔｔ　　　　ｔｉ　　　ａ
ｖｉｕａ＋　　＾０２００３　　　　　　　　ｕ　　　
ｔｔ　−２９８／／　　　　ｔｔ　　　５ａｌｉｖａｒ
ｉｕｓ　　ＡＤＶｌｏｏＯＩ　　　　　ｏ　　　〃−２
９９／ｌ　　　　／／　　　ｄｕｒａｎｑ　　ＡＤＶ３
００１　　　　　　　Ｉｔ　　　Ｉｔ　−３００／／　
　　　　　　ｔｔ　　　　　ｌｌ１Ｌｉｓ　　　ＡＤＶ
７００１　　　　　　　　　　　　　　／／　　　　　
ｔｔ　　　３０１／／　　　　ｏ　　　ｅｑｕｉｎｕｓ
　　ＡＤＶｌｏｏｌｔｔ　　　ｔｔ　−３０２受託番号
変更届 昭イ１１５８年７月２７０ 特許庁長官若杉和夫　殿 １、事件の表示 昭和５７年特許！ｉ１第１８９２５４号２、発明の名称 コレステロール低下活性画分の製造方法及び当該活性画
分含有抗動脈硬化ｎす ３６手続をした者 事件との関係　　　特許出願人 住所　　〒１０３　　東京都中央区Ｕ本的小舟町５番７
号（置　　０３　６６７−１５５．１） 氏名　　株式会社アドバンス開発研究所４、旧寄託ｎＩ
！ｌｌの名称 通商産業省工業技術院微生物工業技術耕究所５．１１Ｊ
受託番号 徽」ニイυＴ丁Ｖ！？＋１ｆｆＩＧ６２４号（ＦＥＲＭ
　　Ｐ−６６２４） 徽Ｊ−研菌寄第６６２５号 （ＦＥＲＭ　　Ｐ　　Ｇ　６２５） 徽工研菌寄第６６２６号 （Ｆ″ＥＲＭ　　１）−６＋３２（３）’ＸＣ１１’ｌ
ｆｆＭ？ｆＦ［’１６Ｇ２７９（ＦＥＲＭ　　Ｉ）−６
６２７） 徴工研菌寄第６６２８号 （ＦＥＲＭ　　Ｐ−６６２８） 徽工研菌寄ｍ６Ｇ２９号 （１”ＥＲＭ　　１）−６６２９） 徽土研菌１η第６６３０号 （１・”ＥＲＭ　　Ｐ−ＧＧ３０） ６、新寄託（茂Ｉｌｌの名称 ｉシ商産業省工業技術院微生物工業技術研究所７、新受
託番号 徽工研条寄第２９６号 （ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２９６） 徽工研条寄第２９７号 （ＦＥＲＭＵＰ−２９７） 徽工研条寄第２９８号 （ＦＥＲＭ　　ＩＩＰ−２９８） 徽工研条寄第２９９号 全上研条寄第３００号 （ＦＥＲＭ　　ＢＰ−３００） 徽上研条’＋ＫｆＫＳ　３　ｔ）　１号（Ｆｌ己ｌζＭ
　　ＢＰ−３０１＞ 微工石π条寄Ｈｓ３ｏｚ号 （ＦＥＲＭ　　１３Ｐ　　３０２） ８、　添イ’Ｉ’ａｉ　炙へのＩＪ録 （１）新受託番号をｌ１ｉｌ：ＩＵける書面　　　　　
　７通（受託１ｉｉＥの写）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｉｌ＋　　ストレプトコツカス属に属する微生物を培養
   し、培養物から菌体を採集し、前記菌体を破壊処理した
   後蛋白分解酵素処理し次いで得られる懸濁液から少なく
   とも分子量約３，５００以下の成分を除去することより
   成るコレステロール低下活性画分の製造方法。 （２）　　特許請求の範囲第（１）項に記載の方法で得
   られる前記活性画分を有効成分として含有することを特
   徴とする抗動脈硬化剤。 （３）　　前記微生物がストレプトコッカス・ノエシウ
   ム、ストレプトコッカスのフエカーリス、ストレプトコ
   ッカス・ボービス、ストレプトコッカス・エピラム、ス
   トレプトコッカス昏デユランス、ストレプトコッカス・
   サリヴアリウス、ストレプトコッカス・ミゾイス及びス
   トレプトコッカス・イクイヌスより成る群から選択され
   る１種又は２種以上の微生物であることを更に特徴とす
   る特許請求の範囲第（２）項に記載の抗動脈硬化剤。