JPS59109182A - コレステロ−ル低下活性画分の製造方法及び当該活性画分含有抗動脈硬化剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な抗動脈硬化剤及びその製造方法に関する
。今日、所謂典型的成人病の１種である動脈硬化性疾患
乃半島脂血症等の治療・予防系としてはクロフィブレー
ト関連製剤を始めとして幾つかが提案さｊているが、薬
理効果及び副作用等の点でこねらば必らずしも充分満足
し得るものとは云い錐くより効果的な桑畑への希求が一
段と高１っている。

本発明者らは新規抗動脈硬化剤につき８意研究の結果、
ストレプトコツカス属に属する各＞ｔａ微微生物鉢体ら
の特定抽出画分が血中コレステロール値を極ぬて効果的
に低下せしめ得るものであり旧つその起源が所謂腸内細
菌であるこねら菌体の抽出画分は経口では実質的無毒性
であること、更にはより高度の精製のための出発材料と
して好適であることを知見し、本発明に到達したもので
ある。

以下、本発明に於いて使用され得る微生物の種類等、活
性画分の製法、薬理作用等につき詳細に分説する。

微生物 ストレプトコツカス属に属する各種微生物が使用され得
、就中、ストレプトコッカスφフェシウム、ストレプト
コッカス番フエカーリス、ストレプトコッカス・ボービ
ス、ストレプトコッカス・エビラム、ストレプトコッカ
ス・デユランス、ストレプトコッカス・サリヴアリウス
、ストレプトコッカス・ミテイス、ストレプトコッカス
・イクィヌス等を好適なものとして例示し得る。

更に９本発明に於いて最も有用な具体的菌株例を微工研
受託番号と共に表示すれば下肥の１１五〇である。

第１表 ５ｔｒｅｐｔ、ｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃｉｕｍ　ＡＤ
Ｖ］００９１ｉ’ＥＲＭ　Ｐ−６６２４ｐ　　ａ　　ｆ
ａｅｃａＨｓ　ＡＤＶ９００］　　＃　　＃−６６２５
＃　　＃　　ａｖｊｕｍ　　ＡＤ２００３　　＃　　ｌ
−６６２６１１５ａｌｉｖａｒｊｕｓＡＩ）Ｖ］０ｆＪ
Ｏ１ｙ　　ｐ−６６２７ｙ　　ｌ　　ｄｕｒａｎｓ　　
ＡＤＶ３００］　　１　　＃−６６２８＃　　ｙ　ｍ１
ｔｔｓ　　ＡＤＶ７０ｔＪ］　　＃　　＃−６６２９１
　　　　＃　　　ｅｑｕｉｎｕｓ　　　ＡＤＶ８００］
　　　　　ｔｔ　　　　５−６６３０菌学的性質 菌学的性質の点では、本発明で使用の微生物は同−分類
菌につき公知各文献の示すものと同一の諸性質を有する
。

すなわち、不発明徴生物の菌学的性質及び培養条件等に
関しては丁記諸文献が参照される。

］　）　Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅ
ｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　ＢａｃｔｅｒｉｎｌｏｇＬ８
　ｔｈ　ｅｄ、　４９０−５０９　（１９７４）２　）
　Ｉｎｔ、　Ｊ、　５ｙａｔ、　Ｂａｃｔ、±６−１１
４　（１９６６）３　）　Ｍｊｃｒｏｂｊｏｌ　、　Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ　、−色！２（３１，２５７−２６９（１
９８］　）４　）　　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｐａｔｈｏｌ
、　　３３　５３−５７　（１９８０）５　）　　Ｊ、
　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　　１２８
　７］　３−７２０　（１９８２）６　）　Ａｐｐｌｉ
ｅｄ　ＭｉｃｒｏＭｏｌ、、　２３ｆ６１　１１３１−
１１３９（１９７２）ここで、前出各種菌株につきその
主な菌学的性状を要約して表示すれば次の通りである。

以下余白 第２表 （＊２，３．５−）リフェニルテトラゾリウムクロリド
）これらの微生物の培養は−に紀の通り常法によるもの
であるが、例えばロゴサ（Ｒｏｇｏｓａ）液体培地（訂
）にて好気的に静置培養１−７、得られ、Ｔこ培養液な
遠心分離してその菌体が採集される。

（註） ロゴサ液体倍力ＩＬの組成 蒸留水１１中に トリブチケース　　　　　　　１０ｆ 酵母エキス　　　　　　　　　　５７ ト　　リ　フ゛　ト　−　ス　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　３２に２　ＨＰ　０４　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３　　ノＫ
Ｈ２ＰＯ４３？ クエン酸三アンモニウム２１ ツイーン８ｆ）　　　　　　　　　　ｌｒグルコース　
　　　　　　　　２０７ システイン塩酸塩　　　　　　０．２ｉ／※塩力４浴７
俸　　　　　　　　　　　５　ｍ１（１）［７，１２１
℃　］５分間加熱滅醒）※塩類溶液蒸留水］　００　ｖ
＋ｉに 活性画分の製法 本発明活性画分のＪｌｌｌｌｌｌ法的製法を各工程ごと
に示せば次の通りである１、 １　菌体採集−「程 前記各微生物等の菌株を前述のロゴサ液体培地５ｅに接
種し７．３７　’Ｃにて５時間好気的に静置培養１〜て
生菌数６　Ｘ　Ｉ　０８７ｍ１の培養液をつくり、得ら
ねゴー培養液を１２，００　Ｏｒｐｍの連続遠心分離に
伺し菌体を集め、生理食塩水で２〜３回洗浄（〜て採集
菌体とする。

２、　暗体破壊処理に程 ａ）　　ｉ’ｉｉｌ記採集菌体を生理食塩水　（０８５
％ＮａＣ１水溶１）１５ｍｅに懸濁し７てイｎらねる菌
液（２Ｘ　］　Ｏ′。／ｍｅ）をＪＩＦｉ℃で１ｏ分間
加熱（オートクＩ／−プ）（〜、破壊菌体懸濁液と１−
る。

ｂ）前項ａ）に示ｆ菌液を超音波破壊処理（１５Ｋｃ、
６０分）し、破壊菌体懸濁液とする。

３、　蛋白分解酵素処理−Ｔ二相 前記破壊菌体懸濁液を常法によ０プロナーゼ、トリプシ
ン、ペプシン等の蛋白分解酵素処理する。ここにおいて
各種蛋白分解酵素中プロナーゼが特に有用であり、その
処理条件等は次の文献に推する： Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ
、■、ｐ２６（１９６６）。

４、活性画分分取工程 前記被処理液を分子量３．５０　（ｌ以下透過性透析膜
（商品名″セロチューブ；半井化学薬品社製）等で３昼
夜、蒸留水で透析処理し、透析内液として目的活性画分
が 得られる。

薬理作用 ■、楽即効果 後記各実験例例示”−ｉ’　：：ｔｆｊ、　ｒ１本発明
活性画分より成る抗動脈硬化剤は、血中コレステＬ■−
ル佃を極めて効果的に低下せしめるものであり、したが
って、この指標と密接な関連を有する動脈硬化症ヤ始め
と］−１高脂血症、高リボ蛋白血症、黄色肺症、胆石症
、旨血圧症、糖尿病等の疾患に交・１しその治療乃至予
防薬として有用なものと云い得ろ。　　　一 本発明削は父、経１］、静注等の手段で適用されイ！子
、その用畦は通常０．０１η〜数１０ｖ／に、９体重、
より好−チしくは経口投与で０．１　ＩＦ／〜数１／に
７体重程度であｒ）、その剤型としては生理食塩水等へ
の旭ミ濁液渭、凍結乾燥等による粉末剤、顆粒剤、錠剤
、カプセル剤等々、通常の剤型を適肖なギヤリヤ、増耽
剤、希釈ハ１１等と共に適宜選択使）１１シ得る。

２、急性毒性 後記実験例に示′ｆ１市り、本発明削のＬ　Ｄ　ｓ。

値は４．２　ｍ７　／マウス（腹腔内股１ｊ）以十−Ｃ
あ０、幻＝口投Ｌｊの場合は実質的に無毒性であ４）３
、実施例 その生菌数が２　Ｘ　１　＋１　　個／　ｍｌの菌沿（
牛３Ｊ１１食塩水懸濁）を用い、前記活性画分の製法に
準シテヌトレフ゛トコノカス・フェシウムＡＤＶ］　（
１０９から超音波処理（前記２．ｂ）項）により破壊菌
体懸濁液を得た。

−ゼ（シグマ社製プロテアーゼ・タイプＸＩＶ）２０■
に、Ｊ：０４７℃、２４時間処理し、その後火にプロナ
ーゼ１（）■を添加し４７℃、２４時間酵素処理しｔこ
。得られた被処理液を前項４．に記載の通り透析処理に
付し、低分子量（約３．５　（１０以下）成分を除去し
、活性画分を得た。

ここに於いて、菌液］　００　ｍｅ　Ｃ生菌数２Ｘ１０
１２個）当りの菌体乾燥重量は２．０２であり、これよ
り得られる活性画分の夫は３４５■であった。

次（で、このｊ二うにして得らｎ定活性画分を１０ｍ１
生食水に１＠濁しそのＱ、　５　ｍｌ及びこれに相尚量
の各両分及びオートクレーブ処理しｆこのみの死菌体菌
液を通常ラット（雄６週令、平均体重２２　Ｏｒ、各群
５匹）に２週間、経口的に連日投与した。

次いでこれらラットの工大動脈より動脈血を採集、遠心
分離して血清標品を得、コレスキット（商品名；関東化
学社製、Ｚｕｒｋｏｗｓｋｉ法）により血清標品中コレ
ステロール値を測定しｆこ。

結果を第３表に要約して示す。

尚、表中、対照は試料無投与ラット群であり、各数値は
対照群を１００％としたときの低下率（係）であり、父
、比活性は死菌体の夫を１としたときの単位重量当りの
相対活性を示す。

父、ダイエツトすなわち飼料の組成（重量％）は下記第
４表の通りでありこねを自由摂取とした（以下、同様）
。

第３表 両　分　　　　　低下率（％）比活性 透析外液　　　〜〇− 活性画分　　　３５．（，１７，３ 死菌体菌液　　　　２７７　１ 第４表 カゼイン　　　　　　　　　２０ 大豆油　　　　　　　　　］　０ 小麦でんぷん　　　　　　　６Ｊ ミネラル　　　　　　　　　　４ ビタミン混合物　　　　　　　２ ろ紙粉末　　　　　　　　　　３ 以下余白 実施例 央＠例Ｊと同様にしてストレグトコノカス属各種微生物
の加熱処理菌体及び活性画分を得、こねをＩ＋１１常ラ
ット（雄１８週令、平均体重２４０２；各群５匹）、通
常及び無菌マウス（雄１８週令、平均体ｉｆｆ　２　（
１？　；各群１０匹）に４週１０１、菌数にし７て１０
”個／日相尚量を経口的に連日投与し、前記と同様にし
て血清中コレスプロールの各低下率を測定しｒこ。結果
を第５表に示１−６尚、表中、パコレステロール負荷”
又は”果糖負荷”は、前記飼料に更に１係コレスプロー
ルを添加したもの或いは小麦でんふんケ果糖にて全型置
換した飼料を使用した場合を示すものであり、数値は無
投与群な対照としに加熱処理菌体の低下率及び活性画分
の比活性（括弧同数１１１）である。

第５表 （，６，９） Ｓ、エビラムＡＤ２００３　　　　２５．０　３３．１
　２４．４（６，１） Ｓ、サリヴアリウスＡＤＶ１０００１　　２９．６　４
４．４（７，２） Ｓ、デユランスＡＤＶ３００１　　　３６．２　３９．
９　２１．１（４，９） Ｓ、　ミテイスＡＤＶ７００１　　　　　　３３．４　
　　　　　　　２２．２（６，６） Ｓ、イクイヌスＡＤＶ８００１　　　　２１．５　２８
．０（５，１１ リコレステロール負荷ダイエツト ＊＊）果糖負荷ダイエツト 実施例 Ｓ、エビラムＡＤ　２００３菌株を用い、実験９１．１
１と同様にして（但し、破壊工程しま８０°Ｃの熱水に
よる：前３．ａ）項）、活性画分を得た。

これを前記実験例】と同様に通常ラットに投与した結↓
Ｐ１比活性は７．５であった。

実施例 Ｉ　ＣＲ系マウス（雄６週令、平均体重３０，０十０．
７Ｆ）を使用し、前記活性画分の製法に従って得ら才１
に活性画分をマウス当り９×１０　、　　　□９　Ｘ　
１０８．９　Ｘ　１０７個の３段階の出発菌数（各群１
０匹）に相肖楡でその生理食塩水Ｑ、５　ｍｌ！懸濁液
を腹腔内投与し、１４日間マウスの生死を観察しｆこ。

Ｂｅｈｒｅｎｓ　−ＫＭｒｂｅｒ法に従って算出したＬ
Ｄｓｏ値（■／マウス）を第６表に示す。

尚、連日経口投与では、（八ずれの場合でも実質的ｌＬ
無毒性であった。

第６表 Ｓ、フェシウムＡＤＶＩ　００９　　　　　　　４．７
Ｓ、フエカーリスＡＤＶ９　（，１０１４，２Ｓ、エピ
ラムＡＤ２００３　　　　　　　　　４．２Ｓ、サリヴ
アリウスＡＤＶ１００ＯＩ　　　　　５．５Ｓ、デユラ
ンスＡＤＶ３００］　　　　　　　　６．１Ｓ、ミテ（
スＡＤＶ７００１　　　　　　　　　４．３Ｓ、イクイ
ヌスＡＤＶ８０ｆ月　　　　　　　５．５製剤例 １、前記実験例１に従って得らハたＳ、フェシウムＡＤ
Ｖ１００９活性両分の凍結乾燥物５０１ｎｇ（死菌体数
１．５Ｘ］０１１個に相当）を精製でんぷん末９５０■
と均一に混合、打錠して経口投与用錠剤どした。この錠
剤は体重５０に９の成人における死菌体数用［３Ｘ１０
’個／にり体重に相当する。

２、　上記凍結乾燥物４３０■を精製でんぷん末５０（
ｌりと混合、打錠したものは、同様に用量３Ｘ］０１０
個／　Ｋｒに相当する。

このように、本発明剤は前記標準用曖等に基づいて、活
性画分と薬学的にＫ「容され得る担体とを混合して所定
の活性を有する所望の剤型とすることができる。

特許出願人　　株式会社アドバンス開発研究所手続補正
書（自発） 昭和５８年７　月２７日 特許庁長官若杉和犬　殿 １、事件の表示 昭和５７年特許願第２１９２８４号 ２、発明の名称 コレステロール低下活性画分の製造方法及び当該活性画
分含有抗動脈硬化剤 ３６補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 住所　　〒１０３　　東京都中央区日本橋小舟町５番７
号（置　　０３−６６７−１５５１） ４、補正の対象 明細書の［発明の詳細な説明］の欄 −ゝ＼ ５、補正の内容 明細書第４頁第１行目から９行目第１表を下記の通りに
訂正する。

第１表 一□１−−生一各一−−−−−−−受進香引一５ｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｆａｃｃｉｕｍ　　ＡＤＶ１０
０９　　　　　　ＦＥｆｌＭ　　ＩＩＰ−２９６ｔｉ　
　　　ｉｔ　　　ｆａｅｃａｌｉｓ　　ＡＤＶ９００１
　　　　　　ｔｔ　　　／／　−２９７／／　　　　　
　／／　　　　　ａＶ！ｕｌｌ　　　＾０２００３　　
　　　　　　　　　　　　ｉｉ　　　　／／　−２９８
ｔｔ　　　　／／　　　５ａｌｉｖａｒｉｕｓ　　ＡＩ
ＷＩＯＱＯＩ　　　　　／／　　　／／　−２９９／／
　　　　／／　　　ｄｕｒａｎｓ　　ＡＤＶ３０（１１
／／　　　／／　−３ＱＱ’／　　　　　　　／／　　
　　　ｍ１ｔｉｓ　　　ＡＤＶ７００１　　　　　　　
　　　　　　　ｕ　　　　　７／　−３０１’／　　　
　ｉｉ　　　ｅｑｕｉｎｕｓ　　ＡＩＩＶ８００１　　
　　　　　／／　　　ｕ　−３０２受託番号変更届 昭和５８年７月２７日 特許庁艮官若杉和夫　殿 １、事件の表示 昭和５７年特許願第２１９２８４号 ２、発明の名称 コレステロール低下活性画分の製造方法及び当該活性画
分含有抗動脈硬化剤 ３、手続をした者 事件との関係　　　特許用新人 住所　　〒１０３　　東京都中央区日本橋小舟町５番７
号（置　　０３−６６７−１５５１） ４、旧寄託機関の名称 通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所５、旧受託
番号 徽工研菌１ｔＡ６６２４号 （ＦＥＲＭ　　Ｐ−６６２４） 微工研菌寄第６６２５号 （Ｆ’ＥＲＭ））−６６２５） 微王研菌寄第６６２６号 （Ｆ’ＥＲＭＰ−６６２６） 微工廿菌寄第６６２７号 （ＦＥＲＭ　　Ｐ−６６２７） 微工研菌寄第６６２８号 （ＦＥＲＭ　　Ｐ　　６６２８） 微工研制「・＼６６２９号 （ＦＥＲＭ　　Ｐ−６６２９） 徽工研菌寄第６６３０９ （ＦＥＲＭ　　１）−６６３０） ６、新寄託蝦関の名称 通商産業省工業技術院微生物工業扶１ｌＦｉ研究所７、
新受託番号 徽工研条寄第２９６号 （ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２９６３ 微工研条寄第２９７婦 （ＦＥＲＭ　　Ｂｌ”−２９７） 微工研条寄第２９８号 （ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２９８） 微工研条寄第２９９号 （ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２９９） 徽丁研条Ｖ？ｆ第３０ｏす （Ｆ’ＥＲＭ　　　Ｂｌ）−３００） 徽丁研条寄第３０１号 （ＦＩＥＲＭ　　　ＢＰ−３０１） 徽］二研条寄第３０２号 （ＦＥＲＭ　　　ＢＰ−３０２） ８、添付書類の１”１録 （１）新受託番号を証明する誓面　　　　　　７通（受
託証の写）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　ストレプトコツカス属に属する微生物を培養
   し、培養物から菌体を採集し、前記菌体を破壊処理した
   後蛋白分解酵素処理し次いで得られる懸濁液から少なく
   とも分子量約３，５００以下の成分を除去することより
   成るコレステロール低下活性画分の製造方法。
2. （２）　　特許請求の範囲第（１）項に記載の方法で得
   られる前記活性画分を有効成分として含有することを特
   徴とする抗動脈硬化剤。
3. （３）　　前記微生物がストレプトコッカス・フェシウ
   ム、ストレプトコッカスφクエカーリス、ストレフ゛ト
   コツ力ヌーボービス、ストレプトコッカス・エヒウム、
   ストレプトコッカス書デユランス、ストレプトコッカス
   拳ｆｌＪつ７ＩＪ　＋７７、ストｌ／ブトコツカス・ミ
   テイヌ及びストレプトコッカス・イクイヌスより成る群
   から選択ざ才する］　ｆｉｌｉ又は２紳Ｊ’）上の微生
   物であることを史に特徴とする特許請求の範囲第（２）
   項に記載の指動脈硬化剤。