JPS59501361A

JPS59501361A - ポリペプチド↓−毒素混成タンパク質

Info

Publication number: JPS59501361A
Application number: JP58502665A
Authority: JP
Inventors: バチヤ・パトリシア; ライクリン・シ−モ−; マ−フイ・ジヨン・ア−ル
Original assignee: プレジデント　アンド　フエロウズ　オブ　ハ−バ−ド　カレツジ; ニユ−・イングランド・メデイカル・センタ−・インコ−ポレイテツド
Priority date: 1982-07-15
Filing date: 1983-07-14
Publication date: 1984-08-02
Also published as: EP0113374A1; NO840981L; US4468382A; AU554929B2; AU1880583A; EP0113374A4; WO1984000299A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ゲリペプチドー毒素混成タンパク質本発明は線状二二一マペプチドを井有ジスルフィド含有結合によって毒素涌片にカップルさせて成る選択された１乳動物の細胞を治療処置するのに有用な１群の混成タンパク質（ｈｙｂｒｉｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　）　に関し、より詳細には、下垂体１瘍におけるような下垂体細胞を治療処置するのに有用、かつ高血圧症及び対ｌＩ痺患者の筋肉けいれんを臨床処置するのに有用なホルモン−毒素混成タンパク質に関する。より詳細には、本発明はネーチャー（二二一パイオマジー）、２３３巻、８−１１（１９７１）にウチダ等が記載するような突然変異体Ｃ，ジフテリア鳳菌株Ｃｖ　（β　ｔｏｘ　−４５）　の早期終了ｔｏｘ遺伝子生成物（自生毒素の分子量６２，０００に対して分子量４５，０００’）である交さ反応物質４５　（ＣＲＭ　４５　）として知られる毒素にカップルさせた甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）から成るキメラに関する。

生体内の特異の選択Ｋａ胞（標的細胞）を他のａ胞に影響を与えることなくそこなったり或は破壊することのできる治療剤を提供することが長い間の目標であった。選択された群の細胞に特異的に結合することのできるリガンドにカップルさせた毒素から成る混成タンパク質は従来提案されてきたが、これらの混成タンパク質は種々の理由から治療剤としての役に立たなかった。ジフテリア毒素Ａ鎖をヒト胎盤性催乳ホルモンにジスルフィド結合を通して橋かけすることによってカップルさせて成る混成タンパク質を合成することが提案された。しかし、Ｊ。

Ｂｔｏｌ　、　Ｃｈ＠ｗ、、２５２巻、１５１５−１５２２（１９７７）チャン等に報告されているように、キメラは填乳ルセプターを含有する細胞に結合したが、それらの４鹿におけるタンパク質の合成を抑制しなかった０リチンＡ毒素をジスルフィド結合を通して同様に僑かけすることによってヒト絨毛膜ゴナトド冒ビンホルモン蹟にカップルさせて成るキメラが報告された；特異性を有すると言われているが、その結合能力は報告されなかったし、かつラットライジツヒ踵瘍Ｓ胞におけるタンノぐり質合成を顕著に抑制するのに極めて高い濃度が必要とされ、エンドシト−シスによる非特異的入り込みと標的細胞の一胞質漢を横切るキメラの毒性部分の移送による特異的入り込みとを区別するのを極めて木蝋にさせた。オエルトマン等Ｊ　、　Ｂ１６１　、　Ｃｈ＠ｎ、、２５４巻、１０２８− １０３２（１９７９）瀾じ欠点がシスタミンを橋かけ剤として用いてインシュリンにカップルさせたジフテリア人から成る混成物に見出された。ミスキミンズ等、Ｂｉｏｅｈ＠ｍ。

Ｂｌｏｐｈｙｓ　、　Ｒ＠ｌ　、　Ｃｏｍｍｕｎ　、、　９１巻、１４３−１５１（１９７９）ｏｉｌ素二官能性（ｈｓｔ＠ｒｏｂｌｆｕｎｃｔｌｏｎａｌ　）橋かけ剤によって表皮成長因子（ｇＧＦ　）にカップルさせたりチン人から成る混成物が作られたが、ＥＧＦによって付与される待合特性は選択された特異細胞に制約されずに広範囲の細胞刑を包含する。フーリー等、セル、２２巻、５６３ −５７０（１’９８０）。

線状二二一マペプチドを共有ジスルフィド含有結合によってＣＲＭ　４５にカップルさせて成る混成タンパク質又はキメラが、尊素活注（′４胞タンパク質合成を抑制する）及び０１Ｍ４５の高い治窄比をも保搏しながら線状ニューペプチドの＠合特異憔を高文に保持することを今見出した。その上、遊１のＣＲＭは′Ｓ素膜レセプターに結合する能力が欠けており全ての＠乳動物細胞に対し毒性がほとんど頌い１従って、カップ１Ｊングした後のＣＲＭ　４５は選択された線状ニューロペプチドが待合するそれらの細胞に対してのみ毒性がある。ＣＲＭ　４５分子の自生構造体は疎水性アミノ巻シーケンスを含有し、該アミノ酸シーケンスはそれが結合する細胞の脂質膜を混成分子が通り抜けるのを容易にさせるものと考えられる。本発明の混成タンパク質の一部を形成することができる線状ニューロペプチドの中には、甲状Ｗ＃激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）　、ソマトスタチン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、５ｅｌｌ−エンケファリン、ｍｅｅｔ〜エンケファリン、二二一マテンシン、Ｐ物質、オキシトシン、ガストリン、コルチコトロピン放出因子、コレシストキニン、モチリン、ボンベシンがある。これらの中でＴＲＨが好ましい、というのはＴＲＨレセプターを運ぶセル型の数は少いから、混成ＴＲＨ−ＣＲＭ　４５についての標的細胞の範囲は極めて限られ、下垂体のそれら（甲状礫刺激ホルモン及びプ豐ラクチンを作るそれら）の内のある傭、かつ一層低い程度まで視床下部の神経単位のある種及び畢丸のある橿の細胞にほとんど独占的に限られるからである。混成ＴＲＨ＋　ＣＲＭ　４５はその他の近い関係の細厄、例えば黄体形成ホルモンを作る下垂体１＠泡に結合しない。従って、この混成物は下垂庫ｉ！ｌ唱、特にプロラクチノマス、チマトロピノマス、ソマトトマピノマスの治療に有用であり癖かつ混成づが３′Ｊｉ勘性機能及び自律神経系活性であって、共にＴＲＨレセプターを運ぶものを制御するそれらの二ニーロンに特異的に結合することができることから高血圧症及び対ＡＳ４Ｓ２Ｏ筋肉けいれんの処置に有用である。不発明のその他の混成タンパク質は、キネマの選択されたニュープペプチドが待合するそれらの細胞をそこなったり或は破壊する必要のある治療に有用である。

従って、不発明は線状ニューロペプチドをジスルフィドを通してＣＲＭ　４５に共有待合させて成り、線状二二一ロペプチドレセプターをゼする細胞に対し毒性の混成タンパク質から成る。特に好適な生成物は、ＴＲＨをジスルフィド−合を通してＣＲＭ　４５に共有請合させて成０１ＴＲＨレセプターを有する細胞に対し毒性の混成タンパク質から成る。好適な実ｆ！態様では、共有結合はＴＲｆｌのヒスチジルイミダゾール基とＣＲＭ　４５の任意の反応性基との間にあり１尚一層好ましくは、結合はＴＲＥＩのヒスチジルイミダゾール基とＣＲＭ　４５のアミノ又はアミド基との間にある。加えて、本発明は混成タンパク質を生理学的に容認し得る毒性の無いキャリヤー、例えば塩類と一部にして成る、線状二ニー四ペプチドレセプター、特にＴＲＩ’ｌし七ブタ−を達ぶ細胞に対してのみ毒性の治療組成物、並びに該レセプターを運ぶ細２宛におけるタンパク質合成の抑制方法であって、線状二二一ロペプチドから反る混成タンパク質、例えばＣＲＭ　４５に共有待合させたＴＲＴ（を、例えば治療組成物を非経口注入によって細胞に接触させることから成る前記方法とから成る。

線状二二一ロペプチドのＣ″Ｒｙｉ４５への共有結合は、各分子の選択された官能基を共有反応によってジスルフィド結合を含む従来の橋かけ剤を通して互いにカップリングさせる従来の任意の手順によって行うことができる。

一方では（ＣＲＭ　４５のンアミ７基と反応し、他方では（ＴＲＨの）ヒスチジルイミダゾール基と何段碧かで反応する二官能性橋かけ剤を通しての間接カップリングが特に重要である。

次の実施例は本発明による混成タンパク質又はキネマの調製について例示する役割を果すもので、本発明の蛇囲を制約するつもりのものではない。

実施例１ＴＲＨとＣＲＭ　４５とを二段階反応によって共有待合させた。第１段階で、ＴＲＨとＣＲＭとを各々独立に二官能性儒かけ剤に反応させて反応性の誘導体を形成し、第２段階で、反応性誘導体を互いに反応させて共有結合した混成タンパク質を形成した。

米国Ｐｒｏｃ　、　Ｎａｔｌ　、　Ａｅａｄ　、　Ｓｅｔ　、、　７５巻、５５１９−２３（１９７Ｂ）、ギリランド等によって説明されている方法に類似の方法で１−エチル−３（３−ジメチルアミツブ冒ピル）−カルボジイミドＭＣＩ　（ＥＤＡＣ）　を触媒としてヨード酢酸とシスタミンとを棒金反応させて次式に従って二官能性橋かけ剤を作った：１１ｃｅ（、−ＣＯＨ＋ＮＴ（ｔ−ＣＨ，−ＣＨ，−３−８−ＣＭ、−ＣＨ２−ＮＨ。

１ →ＩＣＦＩ、　−Ｃ−ＮＨ，−ＣＨ，−ＣＩ（、−８−Ｓ−ＣＨ，−ＣＨ，−ＮＨ，＋Ｈ，０反応体（蒸留Ｈｔ０５ｆｉｔ中ヨードａｏ２ｓダ、シスタミン５０ｒｎ９、ＥＤＡＣ２５ｉ、ｖ）を層がりでテ謳において屁合し、ｐＴ（を４．７に保った。

３０労後にｐＨ２５，６に上げ、市販の合成ＴＲＨ２：、ηを亦工た。ＴＲＨとのカルボキシメチル化反応をｑｔｔがりで、迩やかにふりまぜながら６時間次式に従って運行させた：ＲＨＴＲＨ完全に誘４化させた（　ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ　）アセチロシスタミニル−ＴＲＨをリンｍ　堰繰衝４で平衡にしたセファデックスＧ−１０カラムでｍ！した。ピーク留分を２４０　ｎｍにおける光学１度によってめた。

ＣＲＭ　４５は据置（ｄ＠ｆｅｒｒａｔｅｄ　）　ＣＹ培地で生育させた溶原甜Ｃｙ　（βｔｏｘ　−４５）の培養上澄み液から硫酸アンモニウム沈、投及びＪ　、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　−ｉ　５６巻、１１３５−１１４２（１９７Ｂ）、バハ等記載のＤＢＡＥ　イオン交遺クロマトグラフィーによって精製した。ＣＲＭ　４５　ｆｉ度は、Ｊ　、　Ｃｌ１ｎ　、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　、、　７巻、９１−９６（１９７Ｂ）、マーフィー等に記載されるようにマケット免疫に％泳動によってめた。

精製したＣＲＭ　４５の第−及び第ニアミ７基を市販の腹素二官能性橋かけ剤であるＮ−スフシミジル−３（２−ビリジルジチオ）−ブマビオネー）　（５ＰＤＰ　）　で誘導化させた：簡メには、αＩ　Ｍ　ＮａＣ１、α１Ｍリン酸ナトリウム援衝４（ｐＨ１ｓン中のＣＲＭ４５　（１ｍ９／ｍ）を、５ＰＤＰの２倍過剰量を少量の環水アルコールに溶解した溶液に室温で３０分間混合した。次に、混合物を（Ｌ　１５　Ｍ　ＮａＣｌ　。

［１０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐ　Ｈ７，５）　ＣＰＢＳ　）　ニ対して透析させたｏ　ｆｌｌ変度、Ｂｉｏｃｈｅｍ　、　Ｊ　、、　１５１巻、４１７−４３２（１９７５）、スタフベリー等によって先に説明されたように、２−ピリジルジスルフィド（ＦＤＰ　）結合を還元した後に３４５　ｎｍ　における吸光度の増大によってめた。平均では、ＣＲＭ　４５分子当りｐＤＰ　ｆｉ分が１〜２であった。該調剤は生体外で測定してＡＤＰＲ−）ランスフェラーゼ活性を保持していた。

ＴＲ）１とＣＲＭ　４５との　結合上述したように調部したアセチルシスタミニルーＴＲＨをジチオトレイット５× １０”Ｍで室温において３０ｔｆ間還元し、次にＰＢＳで平衡させたセファデックスＧ−１０カラムで迅速な脱壜を行った。氏５′−ジチオビス−（２−二）口安息香酸）で滴定してめるような遊浦のスルフヒドリル４で変性した次の構造を有するＴＲＨ分子：ＴＲＨを含有する留分をＣＲＭ　４５−　ＰＤＰにおよそ１０：１のモル比で直ちに混合した。ジスルフィド反応を室温で進行させて３４３　ｎｍ　における吸光度の増大を分光光度計によって追った。反応を完結させた後に（通常２０〜３０労）、混合物をリン眼堰ａ衝塩に対して大量に透析させて未反応ＴＲＨ’ｆｆ子を取り除いた。反応により次の構造の混成タンパク質が得られた：Ｒｄ氷上のＩ　Ｎ　ＭＣＩ　ｊ　ＯＯμノ中ｐ−アミノ安息香酸五６〜をＨｔ０５０ μノ甲のＮａＮ０ｔ　ｔ　８　ｍ９に１０分間反応させて新しいジアゾ化（ｄｉ凰ｚｏｔ’１＝ｅｄ　）　ｐ−アミノ安息香酸を−４した。アリ：ｆｆ　）　１５．ｕノヲＩＭＮａｃｌ　、　０．１Ｍホウｆｉ！緩衝−ｊｉ（ｐＨｙ、ｏ　）５００μ！甲のＴＲＨ３Ｏ０μＩに服えた。４　’Ｃで２４時間経過倹、シスタミン６ダ、１−エチル−３（３−ジメチルアミツブ冒ピル）−カルボジイミドＨＣｌ５η、蒸留Ｈ，０５００μｌを反応配合物に皿えた。次に、ｐＨを７４Ｍして４．７に３０分間保った。

完全に誘導化させたＴＲＨをリン酸″１４衝塩において平衡にした七ファデックスＧ−１０で楕裂し、次に実施例１で説明したア七チルシスタミニルーＴＲＨと同じ方法でジチオトレイットで還元し、脱壜し、ＣＲＭ　４５−　ＰＤＰに反応させた。債果は次の構造の混成タンパク質であった。

ＣＨ，ラット下垂体１瘍細胞（タシュジアン（Ｔａａｈｊｉａｎ　）等、１９６Ｂ）を、馬血清１５％、牛の冶児血清２．５ｋ、グルタミン２Ｘ１０　Ｍを補充したノ）ンのＦ１０培池ｒ：Ｌ５ｄ中のウェル当り５Ｘ１０　細胞１度で２４のウェルプレート（リンブマ）に接種した。７２時間培養した〜１０　Ｍ）を含有する新しい培地で更に２４時間再培養した。次に培地をｌ１２５μｃｔ　ｃ−ｏイシン（２８０ｍｃｉ／ｆｆ１ｄ　、ニューイングランドニュークリア）に直き換えた。１時間後に培地を取り去り、付着した細胞を５％トリクロル酢ぼでよく洗浄した。次に細胞をウルトラフルーオア（Ｕｌｔｒａｆｌｕｏｒ　）　（ナショナルダイアグノスチツクス）α５ｔＩＬｔＧＣ町溶化した０中毒した培１によって加入したワイシンの量を未処理の対照培橿によって万口大したものの％として地紋する投与量一応答カーブを作った。

特異的毒性は混成タンパク質のパッチからバッチへと変ったが、典型的には、実施例１の混成タンパク質約５Ｘ１０＝Ｍの濃度がこの系におけるタンパク質合成の５０％抑制、即ち起源（ｏｒｌｇｉｎａ　）の毒性のおよそ２００〜５００倍の毒性を引き起こした。実施例２の混成タンパク質は同じ系でｌＸ１０　Ｍの濃度においてタンパク合成を５０％抑制させた。

対照実験では、ＴＲＨ−ＣＲＭ　４５　ｇＥ会合体増大した毒性が成分の生化学的斐具によるよりもむしろ配合体自体に固有であることを示した、というのはアセチルシスタミニルＴＲＨはこの系で毒性が無く、かつＣＲＭ　４５−　ＰＤＰがＣＲＭ　４５単独の場合に予想されるのと１同じ程度にのみタンパク亘合成を抑制したからである。１えて、配合体をジスルフィド橋かけを裟壊するだめのジチオトレイット（ＤＴＴ　）　５　Ｘ　１０　Ｍで或はジフテリア抗毒素で前処理してその毒性を４滅させた。また、ＴＲＴ（−ＣＲＭ　４５によるＧＨ５細胞の中毒を、細胞を過剰のＴＲＨで１時間前培養して防いだ。同悌に、ＴＲＨレセプターを含有しない３Ｔ３ムース）　（ｍｏｕｓｔ　）線維芽細胞系統で配合体の試験を行った場合には、’　ＣＲＭ　４５単独の毒性にすぎなかった。

配合体がａＨ３，Ｊｌｌａ上のレセプターについての”　Ｈ−ＴＲＨに対抗する能力を、Ｊ　、　Ｂｉｏｌ　、　Ｃｈ＠ｍ、、２４９　春、３０８６−３０９０（１９７４Ｌヒンクル等の技法を直接用いて測定した。実施１１の混成タンパク質（ＫＡ　＝＝３Ｘ１０　）は・親和力が一層小さいが、ＴＲＨし七ブタ一部位についての遊離のＴＲＨ（ＫＡ　＝　Ｉ　Ｘ　１０　）に対抗することが明らかであった、一方実施例２の混成タンパク質は親和力定数ＫＡ　：１０Ｍを示した。

ＣＲＭ　４５或は混成タンパク質のどちらかをゆるやかに放射線ヨウ素で処理し、クロマトグラフィー精製し、ラットの尾静脈中に注射し、１５分後に−ｆ！１頭して行った局在研究では、前方下垂体剤、視床下部・畢丸においてＣＲＭ　４５以上の混成物の増大した吸収を示したが、悩、肝、腎Ｉ、肺又は犀３においては示さなかった。過剰の非放射性ＣＲＭ　４５を襟識混成吻として同時に注射することにより、下垂体、視床下部、畢丸ｉｉ磁における吸収を低下した。

未処置対照に比べ、混成タンパク質で処置することによって培養中の正常ラット下垂体細胞によるＴＲＨ及びプロラクチンの基礎分泌を低下させた。加えて、ＴＲＨ又は高カリウムパルスによって放出されるこれら２つのホルモン量もまた処置細胞において顕著な程に一層少なかった。対照的に、ＴＲＨによって規制されないＬＨ分泌はこれらの培養において影ｉを受けなかった。

また、乳を分泌する母体ラットを混成タンパク質で処置してもプロラクチン生成を抑制し、ラットの子を死なせるか或は育たなかった。

＼国際調査報告１５１ｍ１１“ゝ１８０°ＰＣＴ／ＵＳ８３／Ｉ’ｌｌ’４ｇｌ第１頁の続きＭ　明　者　マーフィ・ジョン・アールアメリカ合衆国マサチューセッツ・ロス ■出　願　人　ニュー・イングランド・メディカル・センター・インコーホレイテッド

Claims

【特許請求の範囲】ｔ　線状ニューロペプチドレセプターを有する細胞に毒性のある、ジスルフィド結合を通してＣＲＭ　４５に共有請合させた該線状ニュー田ペプチドからなる混成タンパク質。２　前記線状ニューロペプチドがＴＲＨである請求の範囲第１項記載の混成タンパク質。五　前記結合が前記ＴＲＨのヒスチジルイミダゾール基と前記ｃＲＭ４５のアミノ基との間にある請求の＠囲第２項記載の混成タンパク質。ａ、１ＩＩＡ状ニユーロペプチドレセプターを運ぶ細胞におけるクンバク質合成の抑制方法であって、請求の範囲第１項記載の混酸タンパク質を該遥胞に接触させることから成る前記方法。＆　前記線状ニューマペプチドがＴＲＨである請求の範囲第４項記祇の方法。＆　請求の範囲第１項記載の混成タンパク質と生化学的に容認し得る毒性の無いキャリヤーとを一緒にして成り、選択された線状ニュー田ペプチドについてし七ブタ−を運ぶ細胞のみに毒性のある治療組成物。