JPS59501229A - 寄生虫症及びアレルギ−症の新規診断試薬、その製造法並びに該試薬を用いる寄生虫症及びアレルギ−症の診断方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 寄生虫症及びアレルギー症の新規診断試薬、その製造法並びに該試薬を用いる寄 生虫症及びアレルギー症の診断方法 技　術　分　野 本発明は、仏国特許第７９／１６７７２号の主題である寄生虫症及びアレルギー 症の診断試薬の製造法についてなされた改良に関し、特に上記試薬を構成する好 塩基性細胞を集めるために用いる分離媒体についてなされた改良に関公知の通り く仏国特許第７９／１６７７２号参照）、アレルギー症又は寄生虫症にかかつて いると思われるヒト又は動物の患者から採取した血液試料の遠心分離は、白血球 層と上清の血漿との分離を起こす。血漿を捨てた後、白血球層を、好塩基性細胞 を破壊しない緩衝液、有利にはへ一ペス（Ｈｅｐｅｓ）　Ｍ　Ｃ又はパイブス（ Ｐ　１ｐｅｓ）緩衝液からなる緩衝液により、取り出す。次いで、好塩基性細胞 を分離し最終的に好塩基性細胞に冨んだ懸濁液からなる診断試薬を得るのを可能 にするために、得られた懸濁液の下に密度１．０７９〜１’、０８５の液体が注 入される。上記特許においては、白血球層を取り出すのに使用される緩衝液の組 成の例として下記組成が示されている。

ヘーペス、モル溶液　２５瞠 ＫＣＱ、１０％　０．９３２ｍ１２ Ｃａ　ＣＱ２．１０％　０．５５０ｍＱＭｇ　ＣＱ２．１０％　０．５１０噌 ＮａＣ９，９％　（７，６ＣＩ　）　８４４．　１　１ｎ１２Ｈ２０、蒸留水充 分量　１０００ｍ１００Ｏ７，４〜７．６ 好塩基性細胞を分離するために使用される密度１．０７９〜１．０８５（］ｅ２ 体は、２８０〜３２０ミリオスモルの重量オスモル濃度（ｏｓｍｏｌａｒｉｔｙ ）を有するものとして定義できる。そして、該液体は、有利にはソデイウムメト リゾエーｈ　（ｍｅｔｒｉｚｏａｔｅ）と゛フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ　）　” 　（シュークロースとエビクロロヒドリンの重合体）又は゛パーコール（Ｐｅｒ ｃＯｌｌ）　”　（ポリビニルピロリドンで被覆されたシリカのコロイド溶液） とからなり、好ましくは下記組成を有する。

ソデイウム　メトリシェード　１５Ｑ ゛フイコール″　１２．８６７（］ 水水分分量　１６５．８成 仏国特許出願第８０／１１６８９号は、前記緩衝液を若干修正した組成を提案し ており、その−例は下記組成である。

ヘーペス、モル溶液　４〜２５或 ＫＣＱ、１０％　０．９３２戒 Ｃａ　ＣＱ２．１０％　０．５５０ｍ１２Ｍｇ　ＣＱ２．１０％　０．５１０戒 Ｎａ　ＣＱ　、９％　８５０〜９０〇−水元分量　１０００購 ｐＨ７゜４〜７．６ 好塩基性細胞の分離に用いる濃い液体の組成は、主特許と比べて修正されていな い。

更に、特許出願第８０／１１６８９号は、特許第７９／１６７７２号による寄生 虫症及びアレルギー症の診断試薬の製造法についての改良を提案している。特許 第７９／１６７７２号によれば、全面を遠心分離して分離した白血球層を、血漿 を捨てた後、前記した様な緩衝液で取り出し、白血球懸濁緩衝液の下に密度１． ０７９〜１．０８５の液体を注入する手段により好塩基性細胞を分離しているの に対し、特許出願第８０／１１６８９号によれば、予め全血を遠心分離すること なく好塩基性細胞を分離することが可能である。事実、下層の濃い液体に基づく 手段による好塩基性細胞の分離は、全面と適切な組成でヘパリンを含有するヘー ペス緩衝液との等量混合物を用いて行なわれる。全面は、有利にはカリウム　エ チレンジアミンテトラアセテート（Ｋ３　ＥＤＴＡ）中に採取される。この様な 場合に使用される緩衝液は、有利には下記組成を持っている。

ヘーペス、モル溶液　４〜２５ｍＱ ＫＣ（１，１０％　０．９３２戒 Ｎａ　ＣＱｌ　９％　８５０〜９００ｍ１２ヘパリン　５〜２０　ｕｎｉｔｓ　 ／ｍＱ好ましくは１０ｕｎｉｔｓ　／ＩＴＩＧ 水充分量　１０００軛 ｐＨ７，４〜７．６ ヘパリンを含有するヘーペス緩衝液の使用は、好塩基性細胞を分離する様に白血 球層を濃い液体で処理するための、血漿から白血球層を分離する最初の段階であ る遠心分離を不要にし得る。従って、全血とヘパリン含有ヘーペス緩衝液の混合 物を濃い液体で直接処理することにより、好塩基性細胞の分離方法を簡易にし得 る。

発明の概要 本発明の目的は、特許第７９／１６７７２号及び特許出願第８０’／１１６８９ 号による好塩基性細胞の分離方法を、同時に以下の利点を保持しつつ、更に簡易 にすることにある。更に詳しくは、その利点は、試薬中の好塩基性顆粒球の濃度 が高いこと、及びその試薬を用いて行なわれるアレルギー症及び寄生虫症の診断 テストで観察される顆粒減少率が高いことである。

本発明によれば、寄生虫症及びアレルギー症の診断薬の製造法は、寄生虫症又は アレルギー症にかかつていると思われるヒト又は動物の患者から、好ましくはエ チレンジアミン四酢酸又はその塩の一種の媒体中に採取した全面試料と上述のヘ パリン含有ヘーペス緩衝液とを等量で混合し、該混合物を主にヘーペス緩衝液、 ポリビニルピロリドン及びヨード芳香族酸の水溶性塩を含有し、密度が１．０７ ７〜１．０８５である好塩基性細胞分離媒体上に置き、次いでこの組成物を適当 な時間適当な速度で遠心分離して好塩基性細胞とリンパ球とを含む環を得た後、 それを取り出し、適当な組成のヘーペス緩衝液で注意深く洗浄して後者を取除い て該細胞の沈澱のみを残し、それを再懸濁して、予めいくつかの穴には緩衝液が 導入され残りの穴には寄生虫の抗原又はアレルゲンが導入された、診断の評価の ためのスライド又は皿の穴に入れるべく準備される。

本発明で用いる好塩基性細胞分離媒体の有利な実施態様によれば、媒体は好まし くはヘパリンを、好ましくはそのアルカリ金属塩の一種特にナトリウム塩の形で 含有する。

本発明で用いる好塩基性細胞分離媒体の他の有利な実施態様によれば、それが含 有するヨード芳香族酸の水溶性塩は、トリヨード芳香族又はヘキサヨード芳香族 の酸の水溶性塩、特にナトリウム及び／又はメグルミン（ｍｅｇｌｕｍｉｎ）の イオキシタラメート（ｉｏｘｉｔａｌａｍａｔｅ）　、メグルミン及びモノエタ ノールアミンのイオキシタラメート、ナトリウム及び／又はメグルミンのイオキ ザグレート（ｉｏｘａｇｌａｔｅ　）等よりなる群から有利に選ばれる。

本発明で用いる好塩基性細胞分離媒体の更に他の有利な実施態様によれば、媒体 は主に３．５〜５．５ｒｒｌＱ／Ｑのヘーペス緩衝液、５〜３０（Ｊ／Ｑのポリ ビニルピロリドン及び２２０〜２５０ｍＱ／（！の水溶性ヨード芳香族酸塩を含 有する水溶液からなる。

本発明による好塩基性細胞分離媒体は、有利には、下記の組成を有する。

ヘーペス、モル溶液　３．５〜５．５鵬ＫＣＱ、１０％　０．４９鵬 ＮａＣＱ、９％　４５〜４８ｍＱ アルカリ金属塩の一 種の形態のヘパリン　２５００〜７５００ｕｎｉｔｓポリビニルピロリドン　５ 〜３０゜ 水溶性ヨード芳香族酸塩　２２０〜２５０　ｒｎＱ水充水量分量　１Ｑ 密度　１．０７９〜１．０８５ ｐＨ３７℃で７．３５〜７．５０゜ 本発明による寄生虫症及びアレルギー症の診断テストをするための簡易キットは 、下記のものを含む。

予め定められた量の本発明による好塩基性細胞分離媒体を各々に含有するアンプ ル又は試験管の様な多数の適当な容器、及び分離媒体により分離されたリンパ球 の環を洗浄するための好塩基性細胞を破壊しないヘーペス緩衝液の予め定められ た量を各々に含有するアンプル又は試験管の様な多数の適当な容器の構成のセッ ト、並びにいくつかの穴を有し、コントロール用の穴を除いて、大多数の穴が、 診断又は検出すべき１若しくはそれ以上のアレルギー症又は１若しくはそれ以上 の寄生虫症に特異的な予め定められた変え得る量の１又はそれ以上の抗原を受け 入れる様にした診断の評価のための多数のスライド又は皿、仏国特許出願第８２ ／１１６８９号に定義されている溶液と同じタイプの固定と染色を迅速に且つ同 時にするだめの予め定められた量の溶液を含有する多数のアンプル又は試験管、 診断のために準備された顕微鏡用スライドの間に置かれる光学封入剤の試験管と カバープレート、及び多数のカバープレートからなる診断テストを行なうための 構成のセット。

適切に調製された媒体の発展によって、血液試料（有利にはエチレンジアミン四 酢酸のカリウム塩中に採取される）は、予めヘーペス緩衝液と混合され、引き続 く遠心分離で分離効果のある濃い媒体上に、予め遠心分離することなく直接置か れる。この簡易化された方法は、好塩基性細胞とリンパ球を含む環の分離を助け るヨード化合物が濃い媒体中に存在していることにより可能になる。

ここまでの記載の他に、本発明は以下の記載から明らかになる他の態様をも含む 。

本発明は、以下の付加的記載によってより明確に理解されるであろう。以下の記 載は、本発明の主題を形成する方法の実施態様の例に関する。

しかしながら、それは本発明をどの様にも制限するものではないと明確に理解さ れなければならない。

実　施　例 ■−寄生虫症及びアレルギー症の診断試薬の製造１．１又はそれ以上の寄生虫症 又はアレルギー症にかかつていると思われる絶食した患者の静脈から５誰の血液 を採取する。試料は、Ｋ３Ｅ、ＤＴＡの最終濃度が血液１■Ω当り１．５ｍｑと なる様にに３　ＥＤＴＡ中に採取する。それを５　ｍＱのヘパリン含有ヘーペス 緩衝液と混合する。

２、下記組成の好塩基性細胞分離媒体５ＩＩＩＩ２を丸底の遠心分離管（１）に 入れる。

ヘーペス、モル溶液　０．３６９ｍ１２ＫＣ１１０％　０．０４９鵬 ＮａＣＱ、９％　４．６３ｍ１ｌｌ ヘパリンナトリウム塩　２６３ｕｎｉｔｓ　（１，６５ｍ（］）ポリビニルピロ リドン　２ｇ ナトリウム及びメグルミンのイオキ サグレート（市販品、商品名［ヘキサ ７１Ｊ”／り、１．（ＨＥＸＡＢＲＩＸ）Ｊ、ラボラトリーズ　グエルベット （Ｇ　ｉｔＪ　Ｅ　ＲＢ　Ｅ　Ｔ　）製＞　２：３−７戚Ｈ２ｏ充分量　１９５ 減−＋−密ｉを１−０８１ＯＯ／ｖＫｌに調節するため（約５（転） ｐＨ，３７℃で７．４２ ３、上記１で調製した血液試料とヘパリン含有ヘーペス緩衝液との等量混合物を 、パスツールピペットを用いて、この管（１）中の分離媒体の表面上に静かに置 く。

４、この管を４００Ｇで３０分間遠心分離する。ＫＣＱ及びＮａＣＱを含むヘー ペス緩衝液が、ヘーペス緩衝液中の「ヘキサブリックス」及びポリビニルピロリ ドンの混合物よりなる実際の分離媒体から分離する。二層の境界の白い環の形の もの全部く１〜３１１１１２）を、注射筒又はバルブ（ｂｕｌｂ）を接続したパ スツールピペットを用いて取る。

５、かくして得た細胞媒体を、下記組成のヘパリン含有ヘーペス緩衝液の入った 遠心分離管（２）に入れる。

へ−ペス、モル溶液　４〜２５魅 ＫＣＱ、１０％　０．９３２脱 ＮａＣ（！、９％　８５〜９０噌 ペハリンナトリウム塩　５０００〜１００００ｕｎｉｔｓ水充分量　１０００ｍ Ｑ ｐｉ−１３７℃で７．４〜７４６ １５０Ｇで１０分間遠心分離する間、後者で洗浄する。

上澄を管のスロープが変わるところまで除去する（残量士０．５ｍＱ）、或いは 同等の効果の他の変法でも良い。上澄みの除去は、管を３秒間反転させることで も可能である。

細胞の沈澱を約０．５鵬の同じヘーペス緩衝液で取り出す。

いずれの場合においても、細胞の沈澱は、［ポルテックス（ＶＯＲＴＥＸ）Ｊ　 （登録商標）を用いて手動で３０〜５０秒間震動させて、全体を均一化する。

■−診断テスト １、懸濁された細胞の沈澱は、診断の評価のためのスライド中の各々の穴に２０ μＱ入れる。この穴は、任意にＣａＣＱ２及びＭｇｃ（１２を含むことができる 。次に、スライドを、水を含んだ綿を含むカバーされた皿（ペトリ皿型）の中に 入れる。穴は、２０分間、３７℃のオーブン中に置かれる。

皿のカバーと綿を取り去る。スライドは、オーブン中にあるまま、約１５〜３０ 分乾燥される。スライドは、ヘアードライヤーを用いて乾燥することもできる。

固定／染色は、従来技術で述べた染色及び固定を迅速且つ同時にできる一溶液で 、各々の穴を覆うことで達成される。

この状態でスライドを１５分間作業台上に放置し、次に水浴ですすぎ（３０秒） 、無水アルコール浴で脱水しく２０〜３０秒）、封入を容易にするためにキシレ ン浴に数秒間浸漬する。

封入剤を１滴、カバープレート上に置く。次に、これをスライドに適用する。穴 の乾燥に１０〜１５分ｂｏｏ要である（乾燥は、スライドをオーブン中又（よヘ アードライヤーの下に置くことにより促進できる）。

２、テストの評価 これは、通常の光学顕微鏡を用１７Ｘで行なわれる。視野全体に完全に焦点を合 わせるために充分な品質の「広？！野（ｗｉｄｅ−ｆｉｅｌｄ　）　Ｊの対物レ ンズ及び接眼レンズを用（Ｘるのが好ましい。評価は、有利に（ま顕微鏡に固定 され、［オプトマックス（ＯＰＴＯＭＡＸ）Ｊ　（登録商標）なる［コンピュー ターｊに接続された白黒のテレビカメラを用ｔＩＸで行ない得る。このテスト評 価技術（よ、「アレルギー」、１９８１．３６．２３９〜２４４、 Ｆ　、　Ｌ　Ｅ　Ｙ　！’４　Ａ　Ｄ　！　Ｅ　ＲＮ　Ｈ、Ｌ　ＵＣＥ、Ａ、Ａ ＢＲＥＧＯ及びＪ、ＤＲＹ、ｆヒト好塩基性顆粒減少の自動−測定」に記載され て（Ｘる。

使用倍率は、好塩基性細胞の数により変イヒさせ１尋る。それは一般的には４０ ０倍であり、もしも試料カー好塩基性細胞に非常に富んでいるならば１０００倍 （液浸）にまで増加することができ、或いは逆にもしも観察者力（このことに慣 れているならば２５０倍にまで減少すること力＼できる。

好塩基性細胞は、他の細胞（本質的に１ノンノ＼球及び単球）に比べて黒っぽい 色をして（Ｘると（Ｘう特徴、特に伯の細胞の青色（明るい又は暗い）と異なり 紫時に【ま赤色であるという特徴に□より、認識される。

好塩基性細胞を各穴について数える。殆んど大多数の場合には、２０の顕微鏡視 野で充分である（垂直の直径に沿った任意の１０視野及び水平の直径に沿った任 意の１０視野）。勿論、重要な点は、各穴につ（蔦で同じ数の視野を調べるべき ことである。

同じ穴Ａ及びＢで見つけられた好塩基性細胞の数を加えると次の様になる。

Ｃ＝抗原のない好塩基性細胞の数又（ま好塩基性細胞の全体の数、 ＡＣ＋（１，２，３又は４）−希釈１．２．３又【ま４の抗原のある好塩基性細 胞の数、 顆粒減少率（ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ　１ｎｄｅｘ　）　（Ｄ、Ｉ　、　） 　４ま、抗原の各希釈について次の関係により決定される。

即ち、ある希釈で脱顆粒した好塩基性細胞の数カへ、コントロールＣに存在する 好塩基性細胞の全体の数と関係付（ｆられる（この値は、パーセントとして表わ される）。

下記表は、従来方法による試薬の製造法を用（１てアレルギー症の患者から分離 した好塩基性細胞力＼らなる試薬及び本発明の方法により得られる試薬を用０て ８１１１定したときに、顆粒減少のパーセントが実質的に同じオーダーであるこ とＣ−顕微鏡の１０視野で数えた抗原がない好塩基性細胞の数（コントロール） 。

本発明の要件による診断試薬は、寄生虫症及びアレルギー症の診断又は検出の試 験をするのに使用できるのみでなく、循環づる特異的イムノグロブリン特にＩｇ Ｅの増加を起こす他の病気特に細菌性の、免疫病の、ビールス性の及び真菌性の 病気の診断にも使用できる。

以上から明らかな様に、本発明は、その実施方法、実施態様及びここにより明快 に記述された応用方法について何ら限定されるものではなく、逆に、本発明の枠 又は範囲を越えるものを除いて、当業者が行なうすべての変化を包含するもので ある。

特表昭５９−５０１２２９（６） 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ■　第１段階において、１若しくはそれ以上の寄生虫症又は１若しくはそれ以上 のアレルギー症にががっていると思われるヒト又は動物の患者から、好ましくは 遊離のエチレンジアミン四酢酸又はその塩の一種の媒体中に採取した全血試料と ヘーペス緩衝液とをほぼ等量で混合し、該混合物を主にヘーペス緩衝液、ポリビ ニルピロリドン及びヨード芳香族酸の水溶性塩を含有し、密度が１．０７７〜１ ．０８５である好塩基性細胞分離媒体上に置−き、次いで第２段階において、こ の組成物を適当な時間適当な速度で遠心分離して好塩基性細胞とリンパ球とを含 む環を得た後、それを取り出し、適当な組成のへ一ペス緩衝液で注意深く洗浄し て後者を取り除いて該細胞の沈澱のみを残し、それを再懸濁して、予めいくつか の穴には緩衝液が導入され残りの穴には寄生虫の抗原又はアレルゲンが導入され た、診断の評価のためのスライド又は皿の穴に入れるべく準備される、循環する イムノグロブリン類の増加をもたらす寄生虫症及びアレルギー症の診断試薬の製 造法。 ■　第１段階で使用する好塩基性細胞分離媒体が好ましくはヘパリンを、好まし くはそのアルカリ金属塩の一種特にナトリウム塩の形で含有する請求の範囲第１ 項に記載の方法。 ■　上述の分離媒体中に含まれるヨード芳香族酸の水溶性塩が、トリヨード芳香 族又は−ヘキサヨード芳香族の酸の水溶性塩、特にナトリウム及び／又はメグル ミンのイオキシタラメート、メグルミン及びモノエタノールアミンのイオキシタ ラメート並びにナトリウム及び／又はメグルミンのイオキサグレートよりなる群 から有利に選ばれる請求の範囲第１項に記載の方法。 ■　好塩基性細胞分離媒体が主に３．５〜５．５ｍＱ’／Ｑのヘーペス緩衝液、 ５〜３０（１／Ｒのポリビニルピロリドン及び２２０〜２５０ｍＱ／Ｑの水溶性 ヨード芳香族酸塩を含有する溶液からなる請求の範囲第１項に記載の方法。 ■　好塩基性細胞分離媒体が有利には下記の組成を有する請求の範囲第１項に記 載の方法、 ヘーペス、モル溶液　３．５〜５．５−ＫＣ（！、１０％　０．４９ｍＱ ＮａＣ１９％　４５〜４８ｍＱ アルカリ金属塩の一 種の形態のヘパリン　２５００〜７５００ｕｎｉｔｓポリビニルピロリドン　５ 〜３０゜ 水溶性ヨード芳香族酸塩　２２０〜２５０ｍＧ水充分量　１Ｑ 密度　１．０７９〜１．０８５ １）Ｈ３’７℃で７．３５〜７．５０゜■　特異的ＩＱＦを運ぶ白血球（好塩基 性細胞）に富んだ懸濁液で、はぼ等量の血液試料と好ましくはヘパリンを含むヘ ーペス緩衝液との混合物を、ヘーペス緩衝液、ポリビニルピロリドン、及びヨー ド芳香族酸の水溶性塩を必須に含有し密度が１．０７７〜１．０８５の該白血球 を分離するだめの媒体の上に置いてなる組成物の遠心分離によって得られ、上記 遠心分離に由来する該細胞の沈澱が診断試薬を形成する特異的１ｑ　Ｅ　（好塩 基性細胞）を運ぶ白血球の懸濁液を含有しているものであって、診断テストをす べきヒト又は動物の患者から採取した血液試料から得られ、特異的［Ｅを運ぶ白 血球の懸濁液からなる、循環する特異的イムノグロブリン特にＩｇＥの増加を起 こす病気の診断試薬。 ■　主に、ヘーペス緩衝液、ポリビニルピロリドン及びヨード芳香族酸の水溶性 塩を含有し、その密度が１．０７７〜１．０８５である請求の範囲第５項に記載 の診断試薬の製造のための分離媒体。 ■　主に３，５〜５．５Ｗｌ／Ｑのヘーペス緩衝液、５〜３０（］／＋１のポリ ビニルピロリドン及び２２０〜２５０ＩＴＩＩ２／Ｑの１又はそれ以上の水溶性 ヨード芳香族酸塩を含有する溶液からなる請求の範囲第７項に記載の分、離媒体 。 ■　有利には下記の組成を有する請求♀範囲第８項に記載の分離媒体、 ヘーペス、モル溶液　３．５〜５．５或ＫＣ＋！、１０％　０．４９揺 ＮａＣＱ、９％　４５〜４８鵬 アルカリ金属塩の一 種の形態のヘパリン　２５００〜７５００ｕｎｉｔｓポリビニルピロリドン　５ 〜３０ｑ 水溶性ヨ一ド芳香族Ｍ塩　２２０〜２５０制水充分量　１Ｑ 密度　１．０７９〜１．０８５ ｐＨ３７℃で７．３５〜７．５００ ■　予め定められた量の請求の範囲第５項に記載の好塩基性細胞分離媒体を各々 に含有するアンプル又は試験管の様な多数の適当な容器、及び分離媒体により分 離されたリンパ球の環を洗浄するための請求の範囲第１０項に記載の最初の添加 としてのヘーペス緩衝液の予め定められた量を各々に含有するアンプル又は試験 管の様な多数の適当な容器の構成のセット、並びに いくつかの穴を有し、コントロール用の穴を除いて、大多数の穴が、診断又は検 出すべき１若しくはそれ以上のアレルギー症又は１若しくはそれ以上の寄生虫症 に特異的な予め定められた変え得る間の１又はそれ以上の抗原を受け入れ菖様に した診断の評価のための多数のスライド又は皿、固定と染色を迅速且つ同時にす るための予め定められた量の溶液を含有する多数のアンプル又は試験管、光学封 入剤の試験管、及び多数のカバープレートからなる診断テストを行なうための構 成のセットを含む寄生虫症及びアレルギー症の診断テストを行なうための簡易キ ット。 ■　いくらかの寄生虫症及び／又はアレルギー症の同時診断、並びに特に細菌性 の、免疫病の、ビールス性の及び真菌性の病気の様な循環する特異的イムノブプ リン特にＩｇ、Ｅの増加を起こす他の病気の診断をする、請求の範囲第５項に記 載の寄生虫症、各はアレルギー症を診断−する診断試薬の応用゛。