JPS5939290A - 酵素および微生物の固定化法 - Google Patents
酵素および微生物の固定化法Info
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- JPS5939290A JPS5939290A JP14990382A JP14990382A JPS5939290A JP S5939290 A JPS5939290 A JP S5939290A JP 14990382 A JP14990382 A JP 14990382A JP 14990382 A JP14990382 A JP 14990382A JP S5939290 A JPS5939290 A JP S5939290A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は疎水性ゲルを用いた酵素および微生物の固定化
法に関するものである。
法に関するものである。
酵素および微生物を固定化させる方法として、本発明者
らは以前、ポリ−６−カプラミド（ナイロン−６）の構
造単位のα位の水素をジアルキルアミノ基で置換したも
のを、ノ・ロゲン化アルキル、ノ・ロゲン化アルコール
などで四級化して得られるポリマーを固定化用の担体と
して用いる方法を開発した（特願昭５６−１８３０７８
）。特に水酸基を有する四級化試薬を用いた場合には親
水性のゲルが得られ、これを固定化酵素の担体として用
いた場合、酵素活性が増し、基質との親和性が増すこと
が判明した。
らは以前、ポリ−６−カプラミド（ナイロン−６）の構
造単位のα位の水素をジアルキルアミノ基で置換したも
のを、ノ・ロゲン化アルキル、ノ・ロゲン化アルコール
などで四級化して得られるポリマーを固定化用の担体と
して用いる方法を開発した（特願昭５６−１８３０７８
）。特に水酸基を有する四級化試薬を用いた場合には親
水性のゲルが得られ、これを固定化酵素の担体として用
いた場合、酵素活性が増し、基質との親和性が増すこと
が判明した。
しかしながらこの方法では、ゲル化にかな少時間を要す
るため効率が悪いという欠点がある。本発明者らはかか
る欠点に鑑み、短時間で強固なゲルを得ることができ、
しかも酵素および微生物を簡単にかつ安定に固定化でき
る方法を確立すべく検討した結果、本発明に到達した。
るため効率が悪いという欠点がある。本発明者らはかか
る欠点に鑑み、短時間で強固なゲルを得ることができ、
しかも酵素および微生物を簡単にかつ安定に固定化でき
る方法を確立すべく検討した結果、本発明に到達した。
すなわち本発明は、三級ポリアミン化合物と該ポリアミ
ン化合物よりも過剰当量のキシレンジクロライドとの反
応生成物によジ三級アミン結合を有するポリアミドを架
橋させ、得られる疎水性ゲルを固定化用担体として用い
ることを特徴とする酵素および微生物の固定化法を提供
するものである。
ン化合物よりも過剰当量のキシレンジクロライドとの反
応生成物によジ三級アミン結合を有するポリアミドを架
橋させ、得られる疎水性ゲルを固定化用担体として用い
ることを特徴とする酵素および微生物の固定化法を提供
するものである。
本発明の三級ポリアミン化合物としては、少なくとも両
末端に三級アミンを持つ化合物が好ましく、具体的には
式％式％（ （ は低級アルキレン基）〕で示される三級ジアミン化合物
、三級トリアミン化合物または環状三級ジアミン化合物
が好ましい。特に上記三級ジアミン化合物のｎが２，６
および１１であるテトラメチルエチレンジアミン、テト
ラメチルへキサメチレンジアミンＣＴＭＨＤ）およびテ
トラメチルウンデカメチレンジアミンが好ましく、この
中でもＴＭＨＤはナイロン−６，６の主原料であるヘキ
サメチレンジアミンのジメチル置換物であり最も入手し
やすいという利点を有する。
末端に三級アミンを持つ化合物が好ましく、具体的には
式％式％（ （ は低級アルキレン基）〕で示される三級ジアミン化合物
、三級トリアミン化合物または環状三級ジアミン化合物
が好ましい。特に上記三級ジアミン化合物のｎが２，６
および１１であるテトラメチルエチレンジアミン、テト
ラメチルへキサメチレンジアミンＣＴＭＨＤ）およびテ
トラメチルウンデカメチレンジアミンが好ましく、この
中でもＴＭＨＤはナイロン−６，６の主原料であるヘキ
サメチレンジアミンのジメチル置換物であり最も入手し
やすいという利点を有する。
一方、キシレンジクロライドは、オルト、メタ、バラ体
のどれでも用いうるが、クロロメチル基の結合方向が対
角線上にあるバラキシレンジクロライドが特に好ましく
用いられる。
のどれでも用いうるが、クロロメチル基の結合方向が対
角線上にあるバラキシレンジクロライドが特に好ましく
用いられる。
上記の三級ポリアミン化合物とキシレンジクロライドは
、溶媒中で四級化反応させるとオリゴマーが形成される
。反応溶媒としてはエタノール等のアルコールが好まし
い。該反応生成オリゴマーは、架橋剤として使用するた
め両末端にクロロメチル基が結合していることが好まし
く、かがるオリゴマーは三級ポリアミン化合物に対して
、過剰当量のキシレンジクロライドを使用することによ
り得られる。該オリゴマーは、三級ポリアミン化合物と
キシレンジクロライドを、たとえば、前者ｍ当量に対し
後者を？＋＄＋１の当量比で秤量し、溶媒にキシレンジ
クロライドを溶解させた後、加熱下に、三級ジアミン化
合物を徐々に流加してゆき、流加終了後、更に加熱して
生成物を熟成させ、その後、溶媒を除去すること等にょ
シ好ましく製造される。
、溶媒中で四級化反応させるとオリゴマーが形成される
。反応溶媒としてはエタノール等のアルコールが好まし
い。該反応生成オリゴマーは、架橋剤として使用するた
め両末端にクロロメチル基が結合していることが好まし
く、かがるオリゴマーは三級ポリアミン化合物に対して
、過剰当量のキシレンジクロライドを使用することによ
り得られる。該オリゴマーは、三級ポリアミン化合物と
キシレンジクロライドを、たとえば、前者ｍ当量に対し
後者を？＋＄＋１の当量比で秤量し、溶媒にキシレンジ
クロライドを溶解させた後、加熱下に、三級ジアミン化
合物を徐々に流加してゆき、流加終了後、更に加熱して
生成物を熟成させ、その後、溶媒を除去すること等にょ
シ好ましく製造される。
このようにして得られるオリゴマーの中で、三級ポリア
ミン化合物としてＴＭＨＤを用いたものは次のような化
合構造式を有し特に好ましく用いられる。
ミン化合物としてＴＭＨＤを用いたものは次のような化
合構造式を有し特に好ましく用いられる。
本発明の三級アミン結合を有するポリアミドとしては、
ポリ−６−カプラミドの構造単位のα位の水素をジアル
キルアミノ基で置換したポリアミドが好ましく、ジアル
キルアミン基の置換率は、５０％以上、特に７５％以上
が好ましい。
ポリ−６−カプラミドの構造単位のα位の水素をジアル
キルアミノ基で置換したポリアミドが好ましく、ジアル
キルアミン基の置換率は、５０％以上、特に７５％以上
が好ましい。
ここで置換率とはポリ−６−カプラミドの構造単位のα
位の水素をジアルキルアミノ基で置換した平均的な割合
を百分率で表わした値である。
位の水素をジアルキルアミノ基で置換した平均的な割合
を百分率で表わした値である。
またポリアミドの種類としては、ポリ−６−カプラミド
（ナイロン−６）またはその共重合体が好ましく、具体
的には、特にポリ−α−（＃、＃−ジメチルアミノ）−
８−カプラミドが好ましい。
（ナイロン−６）またはその共重合体が好ましく、具体
的には、特にポリ−α−（＃、＃−ジメチルアミノ）−
８−カプラミドが好ましい。
本発明に使用しうる酵素および微生物は、特に限定され
ないが、ウレアーゼ、インベルターゼなどの酵素、およ
び、デスルホビプリオブルゴリスミャザキ菌ＣＤＶＭ）
の様な微生物が好ましい。
ないが、ウレアーゼ、インベルターゼなどの酵素、およ
び、デスルホビプリオブルゴリスミャザキ菌ＣＤＶＭ）
の様な微生物が好ましい。
これらの酵素および微生物を固定化するには、三級ポリ
アミン化合物とキシレンジクロライドとの反応生成物で
ある架橋剤と、三級アミン結合を有するポリアミドの各
々を所定濃度水溶液とし、目的に応じた形状の容器中に
前記三水溶液と、酵素又は微生物の水溶液を加え、均一
に混合した後に、５℃前後に保ちながら静置することが
好ましい。かくして、疎水性ゲルによる酵素又は微生物
の固定化物が得られる。
アミン化合物とキシレンジクロライドとの反応生成物で
ある架橋剤と、三級アミン結合を有するポリアミドの各
々を所定濃度水溶液とし、目的に応じた形状の容器中に
前記三水溶液と、酵素又は微生物の水溶液を加え、均一
に混合した後に、５℃前後に保ちながら静置することが
好ましい。かくして、疎水性ゲルによる酵素又は微生物
の固定化物が得られる。
本発明で用いられる架橋剤は疎水的な性質を有するので
、疎水性で６Ｄ、したがって得られるゲルも疎水性であ
る。疎水性ゲルを用いて酵素および微生物を包括固定化
する本発明方法は、有機溶媒を用いる必要はなく、水溶
液中で固定化出来るので、酵素や微生物の失活を防ぐこ
とが出来、低温で疎水性の固定化ゲルが得られる。
、疎水性で６Ｄ、したがって得られるゲルも疎水性であ
る。疎水性ゲルを用いて酵素および微生物を包括固定化
する本発明方法は、有機溶媒を用いる必要はなく、水溶
液中で固定化出来るので、酵素や微生物の失活を防ぐこ
とが出来、低温で疎水性の固定化ゲルが得られる。
又、本発明の疎水性ゲルは、親水性ゲルと比ベゲル化所
要時間が２〜２４時間と比較的短く、シかも、非常に強
固なゲルになるのが特徴である。ゲル化時間やゲル強度
は、三級アミン結合を有するポリアミドと架橋剤の仕込
み比や、架橋剤における三級ポリアミン化合物の−Ｒ−
の長さを変えることにより容易に調節できる。
要時間が２〜２４時間と比較的短く、シかも、非常に強
固なゲルになるのが特徴である。ゲル化時間やゲル強度
は、三級アミン結合を有するポリアミドと架橋剤の仕込
み比や、架橋剤における三級ポリアミン化合物の−Ｒ−
の長さを変えることにより容易に調節できる。
又、三級アミン結合を有するポリアミドの置換率を変え
ることによっても調節できる。従って本発明方法では、
容易に短時間で強固なゲルを製造することができる。
ることによっても調節できる。従って本発明方法では、
容易に短時間で強固なゲルを製造することができる。
さらに、本発明方法で得られた固定化された酵素、微生
物は活性が低下せず、かつ熱安定性、ｐＨ安定性、およ
び耐有機溶媒性等の安定性にも優れていることが特徴で
ある。
物は活性が低下せず、かつ熱安定性、ｐＨ安定性、およ
び耐有機溶媒性等の安定性にも優れていることが特徴で
ある。
以下実施例を挙げて本発明の詳細な説明する。
なお、以下の実施例において、固定化された酵素および
微生物の性質を常法で評価した。ウレアーゼの場合の酵
素活性は、基質尿素がウレアーゼにより加水分解されて
発生するアンモニアの量を、インドフェノール法により
比色定量した結果から求めた。インベルターゼの場合は
、基質のＤ−サッカ四−スの減少量をトリフェニルテト
ラゾリウム法により比色定量した結果から求め友。又、
デスルホビプリオプルゴリスミャザキの場合は、基質の
硫酸が菌体によル還元されて発生するＨ２Ｓ量をガスク
ロマトグラフィーで分析した結果から求めた。
微生物の性質を常法で評価した。ウレアーゼの場合の酵
素活性は、基質尿素がウレアーゼにより加水分解されて
発生するアンモニアの量を、インドフェノール法により
比色定量した結果から求めた。インベルターゼの場合は
、基質のＤ−サッカ四−スの減少量をトリフェニルテト
ラゾリウム法により比色定量した結果から求め友。又、
デスルホビプリオプルゴリスミャザキの場合は、基質の
硫酸が菌体によル還元されて発生するＨ２Ｓ量をガスク
ロマトグラフィーで分析した結果から求めた。
実施例 １゜
バラキシレンジクロライド（ＰＸ−Ｃ１２） ０．０６
モルを１００２のエタノール中に溶解し、７０〜７５℃
に昇温後、テトラメチルへキサメチレンジアミン（７′
ＡＩＨＤ）０．０５モルを３０分かけて流加し、流加終
了後、更に１時間熟成反応を行なう。
モルを１００２のエタノール中に溶解し、７０〜７５℃
に昇温後、テトラメチルへキサメチレンジアミン（７′
ＡＩＨＤ）０．０５モルを３０分かけて流加し、流加終
了後、更に１時間熟成反応を行なう。
しかる後に、ロータリーエバポレーターで減圧乾燥し、
更に６０℃で真空乾燥を行ない架橋剤を得た１、、この
様にして得られた架橋剤の、仕込み当量比から求めた重
合度は１１である。
更に６０℃で真空乾燥を行ない架橋剤を得た１、、この
様にして得られた架橋剤の、仕込み当量比から求めた重
合度は１１である。
次に、架橋剤の１０ ％ （”Ｖｗ ）水溶液２０９と
、置換率１００チのジメチルアミノ置換ナイロン−６の
１０ ％ （ｗ／、ｗ ）水溶液２０１を混合し、直ち
にウレアーゼの飽和水溶液（１，０２■／−）５−を加
えて均一に混合する。混合液を５℃に保ち静置しておく
と、約２時間で流動性を失ない、約６時間でウレアーゼ
固定化ゲルが得られた。この様にして得られたゲルの、
仕込み比から計算した架橋率は１６チである。
、置換率１００チのジメチルアミノ置換ナイロン−６の
１０ ％ （ｗ／、ｗ ）水溶液２０１を混合し、直ち
にウレアーゼの飽和水溶液（１，０２■／−）５−を加
えて均一に混合する。混合液を５℃に保ち静置しておく
と、約２時間で流動性を失ない、約６時間でウレアーゼ
固定化ゲルが得られた。この様にして得られたゲルの、
仕込み比から計算した架橋率は１６チである。
更に同様な方法で、架橋剤の成分をパラキシレンジクロ
ライドとテトラメチルウンデカメチレンジアミン（ＴＨ
ＵＤ’）に変え、架橋率１６％のウレアーゼ固定化ゲル
を得た。
ライドとテトラメチルウンデカメチレンジアミン（ＴＨ
ＵＤ’）に変え、架橋率１６％のウレアーゼ固定化ゲル
を得た。
以上の様にして得られた固定化ウレアーゼを、リン酸緩
衝溶液で膨潤処理を行ない、至適ｐＨおよび酵素活性を
測定した。第１図に、最大活性を示すｐＨを基準とした
相対活性のｐＨ依存曲線を示す。又、表１は、第１図か
ら求めた固定化ウレアーゼの至適ｐＨ１およびそのｐＨ
での単位ゲル質量（１ｆ）当シの酵素活性と固定化収率
を示す。ここで示した固定化収率は次式で表される。
衝溶液で膨潤処理を行ない、至適ｐＨおよび酵素活性を
測定した。第１図に、最大活性を示すｐＨを基準とした
相対活性のｐＨ依存曲線を示す。又、表１は、第１図か
ら求めた固定化ウレアーゼの至適ｐＨ１およびそのｐＨ
での単位ゲル質量（１ｆ）当シの酵素活性と固定化収率
を示す。ここで示した固定化収率は次式で表される。
表１
実施例 ２゜
実施例１と同様な実験を、ＴＭＨＤとＰＸ−Ｃ１２より
得た重合度１１の架橋剤と、ジメチルアミノ置換ナイロ
ン−６の仕込み比を変えることにょシ架橋率を変化した
ウレアーゼ固定住ゲルについて行なった。
得た重合度１１の架橋剤と、ジメチルアミノ置換ナイロ
ン−６の仕込み比を変えることにょシ架橋率を変化した
ウレアーゼ固定住ゲルについて行なった。
至適ｐＨは全て７．０であったが、酵素活性は架橋率の
増大に伴ない第２図に示す様に増加した。
増大に伴ない第２図に示す様に増加した。
更に、架橋率３２チの固定化ウレアーゼについての熱お
よび有機溶媒に対する安定性を調べた。前者は、第３図
に示すが、ここでは固定化ウレアーゼをｐ Ｈ７，０の
０．１ Ｍ りン酸緩衝溶液中で反応温度を変え、３０
℃の活性を基準とした相対的な酵素活性を調べたっ又、
後者は表２に示すが、ここではｐ Ｈ７，０の０．１Ｍ
！ｊン酸緩衝溶液中で２時間処理したものと、同じリン
酸緩衝溶液とエタノールの９：１の混合溶液中で同様な
処理をほどこしたもとの活性金比較した。
よび有機溶媒に対する安定性を調べた。前者は、第３図
に示すが、ここでは固定化ウレアーゼをｐ Ｈ７，０の
０．１ Ｍ りン酸緩衝溶液中で反応温度を変え、３０
℃の活性を基準とした相対的な酵素活性を調べたっ又、
後者は表２に示すが、ここではｐ Ｈ７，０の０．１Ｍ
！ｊン酸緩衝溶液中で２時間処理したものと、同じリン
酸緩衝溶液とエタノールの９：１の混合溶液中で同様な
処理をほどこしたもとの活性金比較した。
第３図から、本発明の固定化酵素は熱に対して安定であ
シ、又同様に表２から、エタノールによシはとんど失活
しないことがわかる。
シ、又同様に表２から、エタノールによシはとんど失活
しないことがわかる。
表２
実施例 ３゜
実施例１と同様な実験を、ＴＭＨＤとＰＸ−Ｃ１２より
得た重合度１１の架橋剤と、ジメチルアミノ置換ナイロ
ン−６を架橋率１６チになる様な割合で仕込み、インベ
ルターゼを固定化したゲルについて行なった。
得た重合度１１の架橋剤と、ジメチルアミノ置換ナイロ
ン−６を架橋率１６チになる様な割合で仕込み、インベ
ルターゼを固定化したゲルについて行なった。
ｐＨ５，０の０．１ Ｍ ！Ｊン酸緩衝溶液中で酵素反
応を行なった結果、単位ゲル質量（１Ｆ）の酵素活性は
２．６ Ｘ １０３ＣＵ／ｇ−ｗｅｔｇａｌ）固定化収
率は１３．３ｅｓであった。
応を行なった結果、単位ゲル質量（１Ｆ）の酵素活性は
２．６ Ｘ １０３ＣＵ／ｇ−ｗｅｔｇａｌ）固定化収
率は１３．３ｅｓであった。
これらの結果から、本発明のゲルにょクィンベルターゼ
も包括固定化出来ることがわかる。
も包括固定化出来ることがわかる。
実施例 ４゜
実施例１に述べた方法で、ｐｘ−ｃｔ、とＴＭＨＤより
重合度１１の架橋剤を得、その８％（％）水溶液と置換
率１００チのジメチルアミノ置換ナイロン−６の１３
％ （１１Ｊ／ｗ）水溶液を各に２−混合し、１５分間
窒素でバブリングした後、デスルホビプリオプルゴリス
ミャザキ（ＤＶＭ）（３，７η／−）ｆ：２−加え、更
に１０分間窒素でバブリングした後に密封し、４℃で２
４時間保つことによシゲル固定化物を得た。
重合度１１の架橋剤を得、その８％（％）水溶液と置換
率１００チのジメチルアミノ置換ナイロン−６の１３
％ （１１Ｊ／ｗ）水溶液を各に２−混合し、１５分間
窒素でバブリングした後、デスルホビプリオプルゴリス
ミャザキ（ＤＶＭ）（３，７η／−）ｆ：２−加え、更
に１０分間窒素でバブリングした後に密封し、４℃で２
４時間保つことによシゲル固定化物を得た。
この様にして得られた固定化物の活性は、Ｎａｔｉτｅ
ＤＶＭと比べ９５．８％と高く、Ｎαｔｉｖεとほとん
ど変わりがなかった。
ＤＶＭと比べ９５．８％と高く、Ｎαｔｉｖεとほとん
ど変わりがなかった。
このことより、本発明のゲルにより微生物の固定化も出
来ることがわかる。
来ることがわかる。
第１図は実施例１の相対活性のｐＨ依存曲線を、第２図
は実施例２の酵素活性を、第３図は実施例２の熱安定性
を各々示す。 髪、 １．； ゛１１．２ 第１図 架橋↑（％） 温 度じＣ）
は実施例２の酵素活性を、第３図は実施例２の熱安定性
を各々示す。 髪、 １．； ゛１１．２ 第１図 架橋↑（％） 温 度じＣ）
Claims (1)
- 三級ポリアミン化合物と該ポリアミン化合物よりも過剰
当量のキシレンジクロライドとの反応生成物により三級
アミン結合を有するポリアミドを架橋させ、得られる疎
水性ゲルを固定化用担体として用いることを特徴とする
酵素および微生物の固定化法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14990382A JPS5939290A (ja) | 1982-08-31 | 1982-08-31 | 酵素および微生物の固定化法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14990382A JPS5939290A (ja) | 1982-08-31 | 1982-08-31 | 酵素および微生物の固定化法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5939290A true JPS5939290A (ja) | 1984-03-03 |
Family
ID=15485117
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14990382A Pending JPS5939290A (ja) | 1982-08-31 | 1982-08-31 | 酵素および微生物の固定化法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5939290A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007191065A (ja) * | 2006-01-20 | 2007-08-02 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 自転車用フレームおよび自転車 |
-
1982
- 1982-08-31 JP JP14990382A patent/JPS5939290A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007191065A (ja) * | 2006-01-20 | 2007-08-02 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 自転車用フレームおよび自転車 |
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