JPS5933230A - 抗腫瘍活性物質ｅｄ−０１とその製法およびその製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は大腸菌エスケリキア属に槙する細菌の函体から
得られる抗腫瘍活性物質ＥＤ−０１およびその製法およ
び活性物質を有効成分とする製剤に関する。

腸内細菌科のダラム陰性桿菌の代表菌である大１腸菌エ
スケリキア属に属する細菌から得られる抗腫瘍活性物質
については他のダラム陰性菌類と同様に菌体の外膜に存
在するリボ多糖体（内毒素）や細胞壁の構築成分由来の
水溶性アジュバト等が知られている。

しかし、犬ｊ腸菌を含めたダラム陰性桿菌が産生ずるリ
ボ多糖体は宿主介在性の抗腫瘍作用を示す以外に、それ
自体が生体に対して発熱原性を示すばかりでなく、重篤
な致死毒性あるいはショックを誘発することが知られて
おり　（蛋白質核酸酵素別刷「細菌毒素研究の最近のあ
ゆみ」１９９頁、１９７６、同２６９頁、１９７６、Ａ
ｄｖａｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、嬰、２９３．１９７９’）
　、安全性の面で医薬として実用に供するには問題が多
い。

近年、リボ多糖体に化学的処理を施して毒性および発熱
性を軽減させた無毒化リピドＡが分離されているが、こ
の無毒化リピドＡが抗腫瘍活性を発揮するためには、単
独投与ではほとんど無効で結核菌由来の糖脂質（コード
ファクター）吉の併用を要することが明らかになってい
る（ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅ
ｒ　、　　７　、４３．１４．１７９）。

また、細胞壁構築成分を水性溶媒に可溶化した水溶性ア
ジュバントも研究されているが、その製造方法が煩雑で
あるばかりでなく、安定した強力な抗腫瘍活性が得られ
ないため未だ抗腫瘍剤として実用に供するまでに至って
いない。

先に本発明者らは、結核菌から得られる抗腫瘍物質につ
いて種々検討した結果、結核菌の変性デオキシリボ核酸
が宿主介在性の強力な抗腫瘍活性を有し、かつ毒性およ
び抗原性が極めて低いことを初めて見い出し特許（％願
昭５６−２３６６９）を出願した。

さらに、本発明者らはエスケリキア属に属する細菌の菌
体抽出物についても新規な抗腫瘍活性物質を見い出すべ
く、結核菌の経験に基づいて活性物質の検索を行なった
結果、培養が容易で安全性の扁いエスケリキア属の細菌
から調製した変性デオキシリボ核酸も高い抗腫瘍活性を
示し、かつ毒曲が億めて低いことを確認し、本発明物質
を加熱変性デオキソリボ核ｆｉＥＤ−０１と命名し本発
明を完成するに至った。

以下、本発明物質を単に加熱変性デオキシリボ核酸、変
性デオキシリボ核酸、デオキシリボ核酸あるいは、本物
質と称することが多い。

本発明によって得られるデオキシリボ核酸は結核菌由来
の該物質と同様に強い抗腫瘍活性を有し、これまでに報
告された動物細胞由来のデオキシリボ核酸等の抗腫瘍作
用（Ｓｃｉｅｎｃｅ　１／１９．９９７゜１９６５）に
比べ強力であり明らかにすぐれている。

また、本物質の抗腫瘍活性は腫瘍細胞に直接的に傷害作
用を示す動物細胞由来のデオキシリボ核酸等（Ｃａｎｃ
ｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　２７．２３４２．１９６７　
。

Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎ
ａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆＳｃｉｅｎｃｅ　６１．２
０７１９６８）と異彦り、担癌宿主の免疫反応を介して
抗腫瘍作用を示すという特徴がみもれる。

この特徴は本発明物質を試験管内で腫瘍細胞と培養して
も細胞増殖抑制作用がほとんどみられないこと、また本
物質は宿主の動物においてキラーＴ細胞増強効果および
マクロファージ活性化作用の他に尚水準のナチュラルキ
ラー細胞活性増強作用を示すという実験事実に基づいて
いる。

本発明物質とその製造法およびその宿主介在性の強力な
抗１腫瘍活性は本発明者らによって初めて見い出された
ものである。

すなわち本発明は、加熱変性によって抗）１（１瘍活性
を有せしめてなる加熱変性デオキシリボ核酸ＥＤ−０１
及びその塩に関し、更に詳細には、エスケリキア属細菌
より得られる抗ｊ匣瘍活性を有する加熱変性デオキシリ
ボ核酸ＥＤ−０１に関し、そして、その製法及び抗腫編
剤に関するものである。

さらに本発明はエスケリキア属細菌破砕物を遠心分離し
て得られる核酸画分を加熱することを特徴とする抗ｊ腫
瘍活性を有する加熱変性チオキシリボ核酸ＥＤ−０１の
製造法に関するものである。

さらに本発明は核酸画分の分離法として無細胞抽出液に
核１疲凝果剤を加え、得られる沈澱の可溶画分から分離
することを特徴とする抗腫瘍活性を有する加熱変性デオ
キシリボ核酸ＥＤ−０１の製造法に関するものである。

さらに本発明は核酸画分の分離法として無細胞抽出液に
核酸凝集剤を加え、得られる沈澱を水または塩類溶液に
対して透析した稜加熱し、その上清から分離することを
特徴とする抗腫瘍活性を有する加熱変性デオキシリボ核
酸ＥＤ−０１の製造法に関するものである。

さらに本発明は、デオキシリボ核酸含有物を約８０〜１
２０℃に加熱して、抗腫瘍性を有せしめることを特徴と
する抗腫瘍活性を有する加熱変性デオキシリポ核１１Ｅ
Ｄ−０１の製造法である。

さらに本発明は、加熱変性によって抗腫瘍活性を有せし
めてなる加熱変性デオキシリポ核ＷＥＤ−０１を有効成
分とする抗腫瘍剤である。

本発明に用いられる微生物は、エスケリキア属微生物の
培養方法や菌体の破砕方法は、通常の方法に従ってよい
。たとえばエスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ　ｃｏｌｉ　）の場合はＢＧＬＢ培地などを用いて３
０℃程度の温度で４０時間培養することにより良好な培
養物が得られ、これを雌心分シ１１゜まだは濾過して菌
体を得ることが出来る。得ら扛た菌体を水、好ましくは
適当な緩衝液と充分混合し、氷冷しながらダイノミル（
Ｄｙｎｏ　　Ｍｉｌｌ）　　するいはフレンチ（Ｆｒｅ
ｎｃｈ　）プレスなどにより菌体を破砕して破砕菌体ｊ
ケ濁液を得る。この懸濁液を遠心して無細胞抽出液を得
るが、このときの遠心分離の条件は、未破砕菌体１部分
的に破砕された菌体、ａ胞壁画分等を沈渣として除去出
来る通常の遠心力で良く、たとえば５，０００ｘｇ、　
　１０分間以上遠心してその上清を取得する。

本発明における無細胞抽出液とは、破砕菌体懸濁液から
遠心分離によシ、未破砕菌体、部分的に破砕された菌体
、細胞壁画分等を出来るだけ除いた両分のことである。

無、細胞抽出液から核酸画分を得るには、無料１１改抽
出液を直接有機溶剤処理して核酸画分を得る方法（例え
ばマーマー（Ｍａｒｍｕｒ　）法やフェノール法等、以
下的接崩機溶剤法と称する）と無細胞抽出液に核酸凝集
剤を加えて核酸画分を含む沈澱をイ４Ｉる方法が適用可
能である。

直接有機溶剤法は小量規模（通常１７以下）の本発明物
質を得るのに適した方法であり、得られる核酸画分（以
下ＥＤ核酸画分と称する）は、通常抗原性を有する多糖
や蛋白等の不純物を含有するので密度勾配遠心法等によ
り不純物を出来るだけ除去した後書られる精製デオキシ
リボ核酸画分を加熱処理して本発明物質を得るか、ある
いはＥＤ核酸画分をまず加熱処理した後遠心法や沈澱法
等によって不純物を除去して本発明物質を得る。

ＥＤ核酸画分や精製デオキシリボ核酸画分の加熱処理条
件は、稜述の調製法と共通するので、後に詳しく述べる
。

本発明における加熱の目的は本発明物質の分子世分布を
調節し、２本鎖構造を１本鎖構造にかえるとともに不純
物の除去効率を高め、製剤化を容易にし、片時の躊解性
を高め、抗腫瘍活性が高く、かつ、毒性、副作用の低い
本発明物質を得ることである。

無細胞抽出液に核ｒ駿凝集剤を加えて核１投画分を沈澱
させる方法は、核酸画分を濃縮出来るので大量規模の本
発明物質を得るのに適した方法である。

この方法において用いられる核酸凝集剤は通常の核酸凝
集剤のいずれも使用可能であるが、後の工程で用いた凝
集剤を簡便に除去出来るという意味で、低分子凝集剤が
好ましい。その好適な例としては、塩化カルシウム、塩
化マンガン、塩化マグネシウム、硫酸アルミニウム等の
多価金属陽イオンあるいはストレプトマイシン、カナマ
イシン等の水溶性塩基性抗生物質まだはその塩等が挙け
られる。核酸凝集剤の使用量はその種類により適宜選択
出来るが、たとえば多価金属陽イオンでは０．１〜１０
％、好丑しくけｏ、ｉ〜３％、抗生物質では０．０１〜
１０％、好ま１〜くけ０．１〜１％を抽出液に対して使
用するのが適当である。

操作としては無細胞抽出液に核酸凝集剤を加え、生成し
た沈澱を遠心あるいは濾過等の方法により分離して核酸
画分を含む懸濁液を得る。この懸濁液より核酸凝集剤を
除くには透析が適当である。

その際に使用する水性溶媒は、核酸凝集剤の除去効率を
高めるために適当なイオン強度を有する、ｐＨが中性附
近のｔ、ｌ衝液が好ましい。たとえば好適なものとして
ｉｃｉ：　Ｑ、　１〜１ＭＮａ（４含有リン酸緩衝液、
０．１〜ＩＭＫＣρクエン酸緩衝液、０．１〜１ＭＮａ
Ｃｆ１含有炭１１タナトリウム緩衝液、０．１〜ＩＭＮ
ａＣｆｉ含有トリス塩酸緩衝液等が挙げられる。

核酸画分を含む懸濁液を含塩緩衝液に対して透析した後
要すれｌばさらに水に対して透析して塩類を除く。透析
済みの核酸画分を含む懸濁液を以下ＥＮ−１画分と称す
る。ＥＮ−１画分を得る操作は、全て冷却下で行ない、
核酸画分の不必要な分解、変性を防止する。冷却温度は
０ないし１０℃が好ましい。

ＥＮ−１画分から本発明物質を得るには２つの方法が可
能である。１つの方法は、ＥＮ−１画分から核酸画分を
分離した後、得られた核酸画分を加熱して本発明物質を
得る方法であシ、もう一つの方法はＥＮ−１画分を加熱
処理ｊ−た後本発明物質を分離する方法である。

前者の方法においては、まずＥＮ−１画分の含有物濃度
と水性溶媒のｐＨや塩濃度等を調節した後、遠心分離ま
たは、濾過等の方法によりＥＮ−１画分からデオキシリ
ボ核酸を含む可溶両分を分離する。

この可溶画分から沈澱法あるいはカラムクロマト法ある
いは電気泳動法さらに要すればリボヌクレアーゼ処理法
等の方法によりデオキシリボ核酸画分を分離して、加熱
処理すれば本発明物質が得られる。ＥＮ−１画分から可
溶画分を分離する際の好適なＥＮ−１画分の濃度は１〜
１５　ｍ１ｉｌ／ｍＮ　である。水性溶媒のｐＨは中性
附近が好ましく、通常酸あるいは塩基、あるいは緩衝液
でｐＨから８の範囲に調節する。水性溶Ｉのイオン強度
は、遠心分離等の際の沈澱の除去効率に影響を与え、通
常０．１以上が好ましく、要すれば食塩あるいは塩化カ
リウム等を加えてイオン強度を調節しても良い。

このように調節したＥＮ−１１曲分を通常２０，０００
Ｘ７で５分間以上遠心分離すると、核酸画分を含／Ｊ−
清澄な可溶山号がその上清として得られる。とθ片ヒ清
からストレプトマイシンあるいは塩化マンガンあるいは
セチルトリメチルアンモニウムプロミド等を用いる沈澱
法あるいはセファローズ等を用いるカラムクロマト法あ
るいは塩化ビニル−酢酸ビニル共重合体等を用いる電気
泳動法等によジデオキシリボ核酸画分を分離することが
出来る。

以上の操作は全て０〜１０℃で行うのが好ましい。

このようにして得られたデオキシリボ核酸画分をさらに
リボヌクレアーゼ処理後加熱処理するかあるいは加熱処
理後リボヌクレアーゼ処理すれば精製された本発明物質
が得られるが、加熱条件は後者の方法と共通するので後
に詳述する。

後者の方法では、まずＥＮ−１画分を加熱するが、この
加熱操作は核酸画分の適切な変性を行なうことおよび不
純物を変性させ以後の本発明物質の分離操作を容易にす
ることを目的とする。加熱条件は後に示すように本発明
物質の抗腫瘍活性にも密接に関連しており、適切な条件
範囲が存在する。

加熱の要因としては、加熱時の溶質の濃度、水性溶媒の
種類とｐＨ，イオン強度、加熱温度、加熱時間が挙げら
れ、適切な条件範囲は次のとおりである。

溶質の濃度は１〜１５ｍグ／ｍｆｌが適切である、。

水性溶媒が水あるいは食塩等の含塩水（イオンリ］（度
が０．１〜０．５）の場合は８０′Ｃないし７１２０℃
で５分間ないし１２０分間、水性溶媒が、緩衝液のｌ烏
合は緩衝液のｐＨによって大きく影響され、＋１３性附
近のｐＨでは加熱温度は高く、加熱時間も長くし、酸性
あるいはアルカリ性では、加熱温度は低く、加熱時間も
短くするのが好ましい。

例えば水性溶媒が強酸性あるいは強アルカリ性の場合は
、加熱温度を８０〜１２０℃に限定するものではなく、
室温付近でも充分である。まだ、水性溶媒がアルカ１１
生の場合はｐＨ，加熱温度および時間を適宜選択すれば
本発明物質からリボ核酸を除去しうる点で有利な場合も
ある。

以上のごとく、適切な加熱条件を選ぶことによシ後に示
すように本発明の目的とする抗腫瘍活性が高く、かつ抗
原性の低い加熱変性デオキシリボ核酸を含む）け濁液を
得ることが出来る。

ここに示した加熱条件は本発明物質調製法の重要な要因
であり、本明細書で示したいずれの調製法にも適用可能
である。

このようにしてＥＮ−１画分を加熱した後冷却し、遠心
捷たはｐ過等の方法により沈渣を除けば、本発明物質を
含む清澄な溶液を得る。この溶液から本発明物質を分離
するのは容易であり、通常の方法によって可能である。

その適切な例としては、核酸凝集剤による沈澱法、有機
溶媒による分画法。

カラムクロマト法あるいは電気泳動法等とりボヌクレア
ーゼ処理法との組み合わせが挙げられる。

これらの方法によって得られた本発明物ノａｔは、その
まま製剤の原体として使用するか、あるいは凍結乾燥し
て乾燥粉末にすることも可能である。

本発明物質はその理化学的性質から明らかなように加熱
によって変性したデオキシリボ核酸であるが、その含量
は、本発明物質凍結乾燥物中の６０〜１００％を占める
。この含量は調製法１分析法によって変化するが本明細
書に示したいずれの調製法によって得られる本発明物′
Ｋにおいても加熱変性デオキシリボ核酸が主成分である
ことは変わらない。本発明物質中のデオキシリボ核酸の
分子量は約３万から１００万の間に分布し、グアニン。

シトシン（ＧＣ）合計は約４７．３％である。本発明物
質の転移温度Ｔｍは、明確な値を示さずさらに、ヒドロ
キシアパタイトのカラムクロマトグラフィーにより分析
すると本発明物質が変性された１本鎖デオキシリボ核酸
であることを意味する。

本明細書に示した方法によって得られる物′へのなかに
は、加熱変性デオキシリボ核酸以外に、産量のリボ核酸
、蛋白、糖等を含むもの・もめるが、いずれも混入物と
耳える程度であり、要すればこれらはさらに精製して除
くことが出来る。

次に実施例１において精製して得られたＥＤ−ＡＩにつ
いて理化学的性質を調べ、その結果を示す。なお、実施
例２で得られたＥＤ−Ａ２０′：ＩＮ製品についても同
様の理化学的性質を示している。

本物質、加熱変性デオキシリボ核酸Ｅ　Ｄ−Ａ　Ｉの理
化学的性質（Ｎａ塩による）： （１）元素分析（％）：Ｃ：２６．２〜３３．３２　　
Ｈ：４．２３〜５．６３Ｎ：１１．２３〜１３．５２　
　　　Ｐ　：　６．３３〜７．５４　　　Ｎａ：３．５
５〜４．８０（２）分子量：３万〜１００万 分子量分布図は第１図に示す通り。

（３）融　点：明確な融点を示さない。

（４）紫外線吸収スペクトル：第２図に示す通り。

（５）赤外線吸収スペクトル：第３図に示す通り。

（６）溶剤に対する溶解性：水に可溶、エタノール。

メタノール、エーテル、アセトンに不溶。

（７）呈色反応 Ａ）オルシノール反応Ｓ　ＳＴＳ法により分画したＲＮ
Ａ画分に対して陰性。

Ｂ）　ジフェニルアミン反応：　ＳＴＳ法により分画し
たＤＮＡ画分に対して陽性。

Ｃ）ニンヒドリン反応二本物質１０μｔ１ｍρの濃度で
陰性。

Ｄ）アンスロン反応二本物質１０μｔ１ｍρの濃度で陰
性。

（８）塩基性、酸性、中性の区別二本物質の水溶液のｐ
Ｈは６．５〜７．５である。

（９）物質の色：白色粉末 （１０）特　性：加熱処理によって可溶性を付与すると
ともに、高い抗腫瘍活性を有せしめ、かつ８ｆ性は極め
て低くなり又発熱性物Ｊホは除去されている。

０１）　　塩基組成（％）ニゲアニン：２４．２　　ア
デニ／：　２５，１シトシン：２３．Ｉ　　チミ　ン：
２７．：う（方法は化学分析による） （１＠　　酵素処理：本物質をデオキシリボヌクレアー
ゼ［（ＤＮａｓｅＩ）で処理すると抗腫瘍性がなくなる
が、リボヌクレアーゼＴ、　（ＲＮａｓｅ　Ｔｍ　）　
　の処理では抗腫瘍性は変化しない。

（１３）　　ヒドロキシアパタイトのカラムクロマトグ
ラフィーにより分析すると１本鎖構造である。

０４）転移温度（Ｔｍ）　　：測定された融解曲線から
は明確な転移温度Ｔｍは求められない。

本発明物質が示す抗腫瘍活性の本体が、加熱変性デオキ
シリボ核酸であることは、本発明物′Ｋをデオキシリボ
核酸分解酵素（ＤＮａｓｅ　Ｉ　）で処理すると抗腫瘍
活性がなくなること、本発明物質をリボ核酸分解酵素（
ＲＮ　ａｓｅ　Ｔｔ　）　　で処理しても抗腫瘍活性が
変化しないことから明らかである。

本発明物質を抗腫瘍剤として用いる場合は、注射剤の型
で用いるのが好ましい。本発明物質は、Ｌｉｉ独である
いは通常用いられる添加剤、賦型剤を加えて液剤、ある
いは同時溶解型の凍結乾燥製剤として適用可能である。

ま゛た本発明物質は水中油滴型あるいは油中水滴型のエ
マルジョンとしても適用可能である。

本発明物質の使用量、投与経路は適宜選択されるが使用
蓋は体重喀あたシ０，０１ないし１００ｍ＠が好ましく
、投与経路は皮肉、皮下、静脈内、腹腔内投与や腫瘍内
投与が行なわれる。さらに本物質は経口投与も可能であ
る。

本発明物質はモルモットやマウスの種々の腫瘍系に対し
て高い抗腫瘍作用を示す。例えばマウスの同系腫瘍であ
るＩＭｃ力ルチノーマに対して本発明物質は生理食塩液
に溶解した型で腫瘍細胞と接触させた後、動物体内に移
植することによる腫瘍の生着抑制（サプレッション活性
）あるいは動物体内に生着した腫瘍組織内に投与するこ
とによる抗腫瘍活性（サプレッション活性）において原
料である菌体と同等か、あるいはそれよりも高い抗腫瘍
活性を示した。また、モルモットの同系腫瘍であるライ
ン１０に対しては、油中水滴型の本発明物質の腫瘍内投
与により、本発明物質は、原発腫瘍の増殖抑制だけでな
く、所属リンパ節への腫瘍の転移も抑制した。

さらに本発明物質は、生理食塩液に溶解して腫瘍組織と
は異る場所に投与することによってもＩＭＣ力ルチノー
マに対して抗１１１９作用を４＜シだ。

本発明物ノ綴の急性毒性はマウスに対する静脈内投与に
よる体重ｋｇあたりの５０％致死量Ｌ　Ｄ　５０１１１
！４が５００　ｍｓ’以上であることから、極めて低い
。

また本発明物質の抗原性についても、モルモットを用い
たアナフィラキシ−試験、遅延型アレルギー試験によっ
て、本発明物質が極めて安全であることが判明した。

その信奉発明物置の発熱性、疼痛性、起炎性。

肉芽形成性等も原料菌体に比較し、極めて低く、通常の
医薬としての適用には問題にならない程度であることが
、神々の試験により判明した。

各棟のハ１（瘍細胞に対する本発明物質の細胞増殖抑制
作用を調べだところ、本発明物質は、はとんど細胞増殖
抑制作用を示さなかった。このことから本発明物質は宿
主の免疫反応を介して抗腫瘍作用を示すと考えられるの
で本発明物質の免疫学的活性を種々検討した。その結果
、本発明物質はマウスのキラーＴ　１ｎ（ＩＩ胞増強効
果、およびマクロファージ活性化作用の他にナチーラル
阜う−細胞活性増強作用を示した。

以上の種々の知見から本発明物質は抗腫瘍剤として極め
て有用なものと考えられる。

以下に本発明物質の製造法を実施例により、また、本発
明物質の抗腫瘍剤としての有用性を試験例により示す。

実施例１　ストレプトマイシンを用いて得られる懸濁液
の可溶画分から本発明物質の製造：牛胆汁末　　　　　
２０１ 乳　　糖　　　　　　　１０タ ペプトン　　　　　１０ｆ！ ブリリアンドグリン　０．０＋３３　ｉＰ水を加えて１
氾にし、ｐＨ６，８〜７．４に調節する。

Ｅｓｃｈｅｒｊｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ−１２株を上記
組成のＢＧＬＢ培地で３０℃、４０時間培養し、培養液
を遠心分離処理して得た湿菌体＋　００　ｆ！をＨ，１
０ｍ（！の１、０　ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に
懸濁した後、水冷下ダイノミルで破砕し、２０，０００
　ｘｓ’で２０分間遠心分離して」１清の無細胞抽出液
を得だ。この抽出液にストレプトマイシン硫酸塩を終濃
度が０．３％になるように添加し、充分攪拌した後、４
℃で一晩静置し、生成した沈澱を遠心分離により集め、
０．５　Ｍ　ＮａＣ，Ｃ含有１．０　ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）にｊ羅濁した。この懸濁液をセロハンチ
ューブに詰めて同じ緩衝液に対して透析し、続いて０．
４−　Ｍ　ＮａＣＱに対して透析して核酸画分を含む懸
濁液１５０ｍρ　（以下この懸濁液をＥＮ−１と称する
）を得た。ＥＮ−１を２０，０００ｘｆで３０分間遠心
分離して上清を得、この上清にセチルトリメチルアンモ
ニウノ・、プロミド（以下このものをＣＴＡＢと称す。

東京化成金社製）を最終濃度が０．２％（Ｗ／Ｖ）にな
るように加えて充分攪拌し、室温に３０分間静置した。

生成した沈澱を遠心分離により集め、Ｉ　Ｍ　Ｎａ（４
液２００ｍρに溶解した後、等量のクロロホルム−イン
アミルアルコール（２４：］）の混液を加えて振盪、遠
心分離して水層部分を得た。

この操作をさらに２回くり返した後、得られた水層に３
倍量の９９．５％エタノールを加えて攪拌し、４℃で一
晩静置した。生成した沈澱を遠心分離により集め、蒸留
水１００ｍＱに溶解した後、　０．９％食塩液に対して
透析し、精製核酸溶液を得た。この溶液を湯浴にて１０
０℃、６０分加熱後水冷した後、蒸留水に対して透析し
た。この溶液をｌＮＮａ　ＯＨで中和後、凍結乾燥して
乾燥標品２６５ｍｆを得だ。氷晶９０ｍ１ｉ’を０．０
５　Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）１０ｍρに溶解した後
、同緩衝液２ｍＱに溶ｊ１ＨしたりボヌクレアーゼＴ２
（三共会社ｆｆ）２ｏｏｔｒを添加し、３７℃で２２時
間反応させた。反応液に等量のクロロホルム−インアミ
ルアルコール（２４：１）の混液を加えて振盪後、遠心
外（ξ（［シて水層部分を得た。この操作をさらにくり
返し、水層の全量を、あらかじめ０．５Ｍ炭酸水素アン
モニウム液で洗浄した径２．５ｃｍ、長さ９０ｃｍのセ
ファデックスＧ−１００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎ
ｅ　Ｃｈｅｍｉ　−ｃａｌｓ社製）カラムに負荷し、四
肢で溶出した後、最初に溶出する両分としてデオキシリ
ボ核酸を含む両分を得た。この画分を蒸留水に対して透
析した後、ＮａＯＨで中和後、凍結乾燥して本発明物質
７２ｍ１を得た。以下このものをＥＤ−ＡＩと称す。

ＥＤ−ＡＩのデオキシリボ核酸の金線（純度）は５％過
壇素酸で加７に分解した後、ジフェニルアミ／法（Ｂｉ
ｏｃｂｅｍｉｃａｌ　　Ｊｏｕｒｎａｌ　　６２．３１
５．１９５６）により定量しだ時９８．０％であった。

実施例２　マーマー法による本発明物質の製造：Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、　ＫＩ２．　ＡＴＣＣｌ
０７９８を実施例１のＢＧＬＢ培地で同様の培養条件に
よって得だ湿菌体２５５グを７倍量の１０　ｍＭ　ＩＪ
ン酸緩衝液に懸濁した後水冷下ダイノミルで破砕し、２
０，０００ｘｆで２０分間遠心して％細胞抽出液を得た
。この抽出液からマーマー　（Ｍａｒｍｕｒ、　　Ｊｏ
ｕｒｎａｌ　ｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ
　３．２０８．１９６１　）　　法により粗デオキシリ
ボ核酸画分を得だ。この両分を０．９％食塩液に対して
透析した後、１００℃、　６０分加熱した。冷却後蒸留
水に対して透析、中和後凍結乾燥して得た標品６３ｍグ
に対し、実施例１と同様のスケールでリボヌクレアーゼ
Ｔ２処理ヲ行ない、精製し、本発明物質４１ｍグを得た
。以下このものをＥＤ−Ａ２と称す。ＥＤ−Ａ２のデオ
キシリボ核酸含量は実施例１と同様の方法で分析すると
９８．４％であった。

実施例３　液剤 ＥＤ−ＡＩ、ＩＯｍｆＰをＩＯｍＮのＰＢＳマイナス液
（栄研化学社製）に溶解し、ニュクリポアーＮｏ　２０
　（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ社製）を用いて無菌濾過しだ。

得られたＦ液を１．５ｍｌずつバイアル瓶に無菌的に分
注して本発明物質の液剤を得た。

実施例４　凍結乾燥製剤 ＥＤ−ＡＩ、１０ｍ７をＩＯｍＮの注射用蒸留水に溶解
し、次に５００ｍｆのマニトールを加えて溶解した後、
ニュクリポアーＮｏ２０を用いて無菌濾過しだ。得られ
たＦ液を１．５　ｍｆＪずつ無菌的にバイアル瓶に分注
した後、凍結乾燥して本発明物質の凍結乾燥製剤を得た
。

実施例５　エマルジョン剤 ＥＤ−ＡＩ、４ｍｊｉ’を０．５　ｍｆｌの生理４１ｉ
液に溶ｊ・Ｊイし、次にドラケオー／Ｌ＝　６−　ＶＲ
（Ｄｒａｋｅｏｌ　６−ＶＲ。

Ｐｅｎ５ｉｌｖａｎｉａ　Ｒｅｔｉｎｉｎｇ　Ｃｏｍｐ
ａｎｙ製）とアラシールＡ　（ＡｒｌａｃｅｌＡ、　Ａ
ｔ１ａｓ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ製
）の８．５：１．５の混液０．５ｍｆｉを加えて連結注
射針を用いて油中水型のエマルジョンを得だ。

試験例１　マウスＩＭＣ力ルチノーマに対する抗腫瘍作
用 本発明物質のマウスＩＭＣ力ルチノーマに対する抗腫瘍
性を調べた。

試験系は次のとおりである。

ＣＤＦ　１雌性マウスの皮肉に５×１０　個のＩＭＣカ
ルチノーマーマを移植し、移植後１日目から隔日に計６
回、実施例３の方法で調製した製剤を１回あたり０．１
ｍυずつ、腫瘍内に投与した。移植後３５５日目腫瘍を
摘出し、その重量を測定した結果は第１表のとおりであ
った。

第１表　マウスＴＭＣカルチノーマに対する抗腫瘍作用 ＊　：　ｐ（０，０５＊＊　：　ｐ（０，０１後述の検
定を含めて平均腫瘍重量および治癒例数の出現頻度の有
意差検定にはスチーーデントのｔ検定法とフィッシャー
の検定法をそれぞれ用いた。Ｔ／Ｃは対照群の平均腫瘍
重量に対する投与群〕平均腫瘍重量のパーセント比であ
る。ＢＣＧはＢＣＧワクチン（日本ピーシ−ジー会社製
）を用いた。対照としては生理食塩液を用いた。

試験例２　ストレイン２モルモットのライン１０ヘパト
ーマに対する抗腫瘍作用二 本発明物質のストレイン２モルモットのライン１０ヘパ
トーマに対する抗腫瘍作用を調べた。

１×１０６個のライン（１ｉｎｅ）　１０ヘパ］・−マ
胛瘍細胞をストレイン（５ｔｒａｉｎ　）　　２モルモ
ットの皮肉に移植し、移植後７日目に実施例：３に示し
た方法で調製した製剤ｏ、１ｍｆｌを腫瘍内に膜力した
。移植後８００日目生存例数、治癒例数、所属９７７４
節への転移の有無を調べだ。対照としては生理食塩液を
用いて同様に調製したものを用いた。

結果は第２表に示した。

第２表　ストレイン２モルモットノラインＩＯヘパト−
マに対する抗腫瘍作用 ＊：ｐ（０，０１ 、試験例３　核酸分解酵素処理物の抗腫瘍作用：本発明
物質を核酸分解酵素で処理することにより本発明物質の
抗腫瘍活性の本体を調べた。

試験法は次のとおりである。

ＥＤ−ＡＩ’＆デオキシリボ核酸分解酵素ＤＮａｓｅＩ
（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　ＩＪ）　　で処理
した後得られた分解物をクロロホルム処理してＤＮａｓ
ｅ　Ｉを除き、次にセファデックスＧ　１０　　（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ　ＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ製）カラ
ムにより脱塩、凍結乾燥して、本発明物質の核酸分解酵
素処理物を得た。得られた処理物の抗腫瘍活性を試験例
１と同様に試験し、第３表に示す結果を得た。

第３表　マウスＩＭＣカルチマーマに対する核酸分解酵
素処理物の抗腫瘍作用 Ｔ／Ｃは対照群の平均腫瘍重量に対する投与群の平均腫
瘍重量のパーセント比である。

対照としては生理食塩液を用い、ＢＣＧはＢＣＧワクチ
ンを用いた。

試験例４　ナチュラルキラー（Ｎ　Ｋ　）　泊ＩＩ　１
１ｔａの活性増強作用： 本発明物質のＮ　Ｋ細胞に対する活性増強作用を調べた
。

試験法は次のとおりである。

生理爬塩液、ＥＤ−Ａｌ又はＥＤ−Ａ２の生理穴塩液溶
解液（１ｍグ／ｍｆｆ）を８週令のＣ５７ＢＬ、／６系
雌性マウスに一匹あたり□０．３　ｍＱ腹腔内投与して
その４８時間後に腹腔浸出細胞を採取した。採取液中の
ｒ１朋胞故を１０％牛脂児而清添加ＲＰＭ　１１６４０
培地で２ＸＩ０６個／ｍＱに調整した後プラスチックシ
ャーレに移して３７℃、５′ｙ；炭酸ガス大気下で９０
分間インキ−ベートし、シャーレに付着性細胞、非付着
性の細胞を得た。各々の細胞５×１０　個と　Ｃｒで標
識したマウス白血病細胞ＹＡＣ−１、ＩＸ］、０’個を
３７℃、　５％炭酸ガス大気下で１０％牛脂児而清添加
ＲＰＭＩ１６４０　培地を用いて４時間培養した。その
培養上清に遊離された５１Ｃｒの放射能をオートガンマ
−カウンター（Ｐ　ａｃｋ　ａ　ｒｄ　’ＪＪＪ　）で
測定し、腹腔浸出細胞のＹＡＣ−１細胞に対する細胞障
害作用、を調べた。

第４表　ＮＫ細胞の活性増強作用 試験例５　細胞増殖直接阻害作用 本発明物質のＹＡＣ−１マウス白血病細胞とＦＭ３Ａマ
ウス乳癌細胞の細胞増殖に対する直接阻害作用を調べた
。

試験系は次のとおりである。

８．４Ｘ１０’個のＹＡＣ−１細胞と１５．４Ｘ１０’
個のＦＭ３Ａ細胞をそれぞれ１０％牛脂児血清添加ＲＰ
Ｍ１１６４０培地に浮遊せしめ、３７℃、５％炭酸ガス
大気下で２４時間培養後ＥＤ−Ａｔを１ｒｒ＋ｙ／ｍＡ
の最終濃度に加え、同じ条件下でさらに培・養を継続し
た。培養開始後２４時間目毎にトリパンブルー染色によ
り生絹ｉ胞数を測定１〜だ。結果は第５表に示しだ。

試験例６　急性前件： １群１０匹の゛５週令ｄｄＹ系１１１１性マウス（甲−
均体重２４グ）にＥＤ−ＡＩを生理食塩に溶解１ッて体
重］、　ｋｇあたり５００ｍｆを静脈内投与した。本発
明′白質は投与後ｌａ１間の観察期間中、体重増加σ）
抑ｊｔｉｌｌを示さず、死亡例もなかった。この結果か
ら本発明物質の静脈内投与における５０％致死用袖Ｔ−
１）　５（１は５００ｍグ／ｋｇｌｕ上と考えられる。

試１験例７　抗原性： 生理食塩液に溶解１２だＥＤ−ＡＩを１群６匹のハート
レー系雌ｉ生モルモット　（平均体重３４９９）に１匹
あたりＩｍｆｉ’ずつ、週：３回合計６回皮内投与し２
て感作した。最終感作日から２週間経過ｙｐ＋）−ＡＩ
を生理食塩液に溶解して体重ｋｇあたり１０ｍｆあるい
は２ｍｆを静脈内投与した。チャレンジ前後のモルモッ
トの行動観察により本発明物質の抗原性を調べたところ
本発明物質は前記投与量では全くアナフィラキシーショ
ノ、りを誘発しなかっ、ｌこ。

試験例８　発熱性： 生物学的製剤基準の一般試験法に準じて、沫閑生理食塩
液に浴ｌＩｌイしたＥＩ）−Ａｌを１群３頭の在来独白
色ウサギに５００　／ｌｆ　／Ｊ＜ｇの投与量で耳静脈
内に投与し、投与量３時間にわたって直腸体部を測定１
−２だ。

その結果、投与前・の対照体温に対する投与後測定体温
との差体温の最大値を発熱反応とすると３頭の発熱反応
の和は０９℃で、生物学的製剤基準の判定基準に従い発
熱反応陰性と判定された。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明物′はのセファローズＣ上−６Ｂカラム
クロマトによる溶出図を、第２図は同物質の紫外線吸収
スペクトルを、第；３図は同物質の赤外線吸収スペクト
ルを示す。 特許出ｊ狽人　三井東圧化学株式会社 Ｖ　　　　面 第　　１　　目 ０　　　　　　　　　１０　　　　　　　　　２０　　
　　　　　　　　Ｊθ試峡￥数（本） 第　２Ｉ２］ ｚｏｏ　　　ｚｚθ　　ｚ４ｏ　　　ｚＫｏ　　　２１
１７）　　　Ｊρθ　　Ｊｚθシ皮　　＆　　（ｃｍ力

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　加熱変性によって抗腫瘍活性を有せしめてなり、下
   記の理化学的性質（Ｎａ塩による）を示す加熱変性デオ
   キシリボ核酸ＥＤ−６ｘ及びその塩。 （１）元素分析（％）：Ｃ：２７．２０〜３３３２　　
   　Ｈ：４．２３〜５．６３　　　　Ｎ：１１．２３〜］
   、　３．５２Ｐ：６．３３−７．５４．　　Ｎａ：３．
   ５５〜４．８０（２）分子量＝３万〜１００万 分子量分布図は第１図に示す通り。 （３）融　点：明確な融点を示さない。 （４）紫外線吸収スペクトル：第２図に示す通り。 （５）赤外線吸収スペクトル：第３図に示す通り。 （６）溶剤に対する溶解性：水に可溶、エタノール。 メタノール、エーテル、アセトンに不溶。 （７）呈色反応 Ａ）オルシノール反応：　ＳＴＳ法により分画したＲＮ
   Ａ画分に対して１衾性。 Ｂ）ジフェニルアミン反応：　ＳＴＳ法により分画した
   ＤＮＡ画分に対して陽性。 Ｃ）ニンヒドリン反応：本物質１０μｆ／／ｍＱ　の濃
   度で陰性。 Ｄ）アンスロン反応：本物質１０ｆｉｆ／ｒｎｆ！の濃
   度で陰性。 （８）塩基性、酸性、中性の区別二本物質の水溶液のｐ
   Ｈは６．５〜７．５である。 （９）物質の色：白色粉末 （ＩＱ　　特性：加熱処理によって可溶性を付Ｊ６する
   とともに、高い抗腫瘍活性を有ぜしめ、かつ前件は極め
   て低くなり、又、発熱性物質は除去されている。 ０１）　　塩基組成（％）ニゲアニン：２４．２　　ア
   デニン：２５．４シトシン：２３．１　　チミン：２７
   ．３（方法は化学分析による） （１）　　酵素処理二本物質をデオキシリボヌクレアー
   ゼ（（ＤＮａｓｅ　［）で処理すると抗腫瘍性がなくな
   るが、リボヌクレアーゼＴ２（ＲＮａｓｅＴ２）の処理
   では抗腫瘍性は変化しない。 （１４ヒドロキシアパタイトのカラムクロマトグラフィ
   ーにより分析すると１本鎖構造である。 ０４）転移温度（Ｔｍ）　：　測定された融解曲線から
   は明確な転移温度Ｔｍは求められない。 ２、エスケリキア属菌より得られたものである特許請求
   の範囲第１項記載の加熱変性デオキシリボ核酸ＥＤ−０
   １゜ ：３．エスケリキア属細菌破砕物を遠心分離して得られ
   る無細胞抽出液から得られる核酸画分を加熱変性するこ
   とを特徴とする抗腫瘍活性を有する加熱変性デオキシリ
   ボ核酸ＥＤ−０１の製造法。 ４、核酸画分の分離法として無細胞抽出液を有機溶剤処
   理して分離することを特徴とする特許請求の範囲第３項
   記載の製造法。 ５、核酸画分の分離洗上して無細胞抽出液に核酸凝集剤
   を加え、得られる沈澱を水または塩類溶液に対して透析
   した後、その可溶画分から分離することを特徴とする特
   許請求の範囲第３項記載の製造法。 ６、エスケリキア属細菌破砕物を遠心分離して得られる
   無細胞抽出液に核酸凝集剤を加え、得られる沈澱を水壕
   九は塩類溶液に対して透析した後加熱してその上清から
   分離することを特徴とする抗腫瘍活性を有する加熱変性
   デオキシリボ核酸Ｅｌ）−０１の製造法。 ７、　デオキシリボ核酸含有物を約８０°〜１２０℃に
   加熱して、抗腫瘍性を有せしめることを特徴とする抗腫
   瘍活性を有する加熱変性デオキシリボ核酸ＥＤ−０１の
   製造法。 ８、加熱変性によって抗腫瘍活性を有せしめてなる加熱
   変性デオキシリボ核酸ＥＤ−０１を有効成分とする抗腫
   瘍剤。 ９、加熱変性デオキシリポ核（ＩＥＤ−０１がエスケリ
   キア属菌より得られたものである特許請求の範囲第８項
   記載の抗腫瘍剤。