JPS5925686A - 固定化酵素及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定化酵素及びその製造方法に関する。

酵素反応は医薬品、食品等の！１ｉｌＪ造の過程で−ｇ
Ｂ工業的にも実施されているが、（）Ｌ来は酵素を基質
の水溶液にγ容解さ−Ｕて、この水溶液中で反応を行な
わ、ｌしている。しかし、このような方法によれば反応
茶色を一定にに住持しつつ、新島Ｙな酵素を？ｄｉ給し
たり、また、反応後に酵素を失活さｌることなり、４ユ
成物と酵素を分δ１［することが非席に困難であり、酵
素が不経済に消費される。そのうえ、反応が回分式であ
るから生産性に劣る。

この、１、うな問題を解決するために、既に水不溶１；
ト′の［０＋−に酵素を固定化し、この固定化酵素に基
質を反晩、さけることが提案されていく）。このよ・う
な固定化酵素の一つとして、ｔＵ体に多孔性のシートを
用いたものが幾つが提案されている。例えば、特開昭５
３−４１４８７号には、紙、布等の多孔＋Ｉ＋シーＩを
酵累水溶液に含浸さ−Ｕてシーｌ−中に酵素を物理吸着
さけた後、この表面１：二：’１′ｉ力性豚を！Ｆ！Ｊ
脱した固コｉテ化酵素が提案され−（いるが、この固定
ｆ口１ｖ素においては、酵素の（’＋、　（ｉｉ７Ｍが
小さく、十記゛１り透（＋＋股を製１１り！する処理に
際してｒ＋’ｌ　’：＋−が失活ず４おそれが、１．る
のめならず、特に紫り目１１　ｔ１２合に、１、すＩｊ
ｉ月１ψ′・１゛る等の場合には酵素の失活顔向がｌｌ
ｒ！著であり、１゛′い作ノ）煩瑣である。１１：た、
１１．冒１ｊ１昭ｔ＋　５　４　Ｊ５３７′弓にし、！
、ｊヂン琵透ｊ１栄に酵素層く？容ンｌ婉をＩ−１玉入
ｊｍｊ渇して、ｆＩＹ素を膜の緻１・１ζな所８１′ｌ
スキン１−に（呆１，１さ−Ｕた固定化ｆＩｖ素がＩＭ
案されＣいる。この固定化酵素において番１１、酵素の
＋＋　ｌ：ｉｊ　ＩＩＲ４，１大きいが、ｔ１ｖ素が月
９からｊ３１目１１シないよ・うに酵素を架橋Ｌ−’／
、ｒ　Ｃ１扛ばなら・１′、この処理に際してやはり酵
素が失活・Ｊ乙おそれがＣらる。また、用いる股が１０
ＩｌｌＩＩｌな崩れず：透脱に限＞ｉニされ、’Ｊ’４
１　＋’＋＋＋＋　１１１１目８が消夏くなる。

本発明は上記した問題を）リテ決するためになされたも
のであ′つて、酵素のＩ’Ｊ　ＩＷｊ　Ｍが大きく、１
１つ、酵素の固定化に際して酵素の失’／＋”＋がない
うえに、製造１Ｍ作の節ｔ１１な固定化酵素及びその！
）Ｊｉｉ７方法を提供することを目的とする。

本発明による固定化酵素は、多孔（１１股表白に形成さ
れた第１の１ｆ１１う）半重合体ゲルｌｉｄと、このゲ
ル層の」−に形成された酵素層と、この＾ゲ素屓の一ロ
、二形成された第２のｉｌ’ｌｉ分子重合体ゲル層とを
有し、少なくとも第１のゲル層が架橋されていることを
特徴とし、かかる固定化酵素は、本発明に（）ｔつで、
第１の水溶性１）１１分Ｊ’−１１７合体の水溶’／Ｐ
ｊ、　ニ多ｒｌ、（’Ｌ　ＩＩＱ　、Ｑ強制ｊＪ１過さ
−Ｕて、１１ｑ表面に第１の１）］Ｉ分子分目１口合体
ゲル形成する工程、酵素水溶１１ｋに上記第１のゲル１
耐を形成した膜を強制１耐過さ−Ｕて、第１のゲル層の
」二に酵素層を形成する工程、及び第２の水溶１！ｔ’
、　１ＴＩｉ分子重合体の水溶液に−１−記酵素Ｊ−を
形成した膜を強制１耐過さ・Ｕて、酵素層の」二に第２
の１ｆ１１分子１ｎ合体ゲル屓を形成する」二稈とをイ
ｉし、更に少なくとも第１の商分子車台体ゲル屓を架１
ｇさｌる１−稈を有する方法によって製ｉ＋’ｉされる
。

本発明において、多孔性膜としてはｆ＆　’ｈＡ’、す
る１扛１分子ｊ１【合体ゲル層を表面に形成することが
できれば、膜構造や膜形状、膜素４，１等に関係なく、
種々のｌＩ’Ｗを用いることができる。例えば、膜構ｊ
ｖｉ的には、等力性の所謂梢け・；ｊ１η過膜は（ｊ！
、廉で、珪つ、強度等の物理的）ｌＬ質にもすぐれるの
で々Ｔましく用いることができる。しかし、異方性の限
外ｊｌｌ過Ｉテやｊ更’／１Ｌｉｌ　ＩＩＡも勿論用い
ることができる。ｌｉ：た、膜形状としてム、１、股素
利のｉｎｉ分子重合体の溶液を適宜の支持体１・、に流
延塗布して製膜した１ｆｆｌ常のシート法の膜のほか、
繊維状チップを相ｔｉ１に絡ま・Ｕてシー１−にした所
１１１°ｌデゾス膜、ホ１，１−ファーイハーのよ・う
スＩ：繊維状の換ｔ）用いられる。また、膜素（Ａも１
．＋＋に制限されず、例えば、アセチルヒルに１−ス、
ブに１ピオン酸セルＣ１−）１、酪酸セル１−１−ス、
エチルセルロース、二ｌ・ロセルし！−ス等の・ヒルＩ
」−ス誘導体、ポリアミ１′、ポリイミド、アクリしに
トリルリフッ化ビニリデン、ボリテトラフルオし１エチ
レン、ポリエチレン、ボリプｌ，１ピレン、ポリビニル
アルコール、ポリ塩化ビニル等が用いられる。

本発明の固定化酵素において番、シ、」、記のような膜
表面に第１の水溶１ｚ１の商う）了ｔ１合体からなるゲ
ル層が形成されている。尚、模表面には、膜のｒｉする
微細な孔の壁表面をも含む。

−１−記ゲル！皆は水溶１！１′＋ｌ“１１分４ｉ口合
体の水／８１１ｋに股を強制ｊ１１過さする、二とＧこ
より形成される。本発明の固定化酵素を酵素反応に使用
する乙こは、」１η常、基質水溶液を膜に加圧透過さＵ
るが、ゲル層を水溶１！ｌ：　ｆｉｔ合体により形成す
ることにより、）１史の水♀ＩＬ和性を高めて反応水溶
液の■栄透過を容易ならし２めるためである。〜・方、
商分子ｉ（１合体としてアＩ：　’Ｊールセルロースの
よ・）な水不溶性１１支合体を用い、このｒｒ　ｌｔｌ
ｌ溶液に模を強制１耐過さ一Ｕると、形成されるゲル開
力＋２負Ｕ（にすぎて、酵素）反応を行なわＵる際に反
応生成物の透過が１．ｔ４　Ｓｌｌ＋となるので好まし
く／，１い。

ここに、水溶性重合体としては、ポリビールアルニ１−
ル、ポリエチレンイミン、ポリ　（メタ）アクリル酸及
びその塩、ポリアクリルアミ１′、ポリビニルビｔｌリ
ドン、ポリビニルピリジン、ポリアクリル等の合成ｉ１
Ｔ＋重量計合体、アルブミン、カラー１グーナン、コラ
ーゲン、−１ルギン酸ソーダ、ジアル−３”　ｌ＝　Ｆ
　−３’　ニー′−）’　７　等０）　人、’；’！ｉ
　Ｉｌ’ｌ＋分子１１１合体を好マし５く用いる、二と
がＣきるが、これらに１１１！定されるものではない。

水〆容１ＩＣＩｌ’ｌ＋う）　Ｉ’　ｆｌｉ合体のゲル
層を形成′ｌるにあたり、その南瓜ｔ；Ｉ：　ｉｌ鴇、
二制限されるものどはないが、１！１１；’！’＋、０
．０　ｉｌ　１〜３０　ｊｒｒ　ｌ；Ｉ　９６、Ｏｒマ
シ＜　Ｌ；Ｉ：　（１，０５へ５屯１．９６の範囲であ
る。余りに１１１．い濃度の水溶ｌＩ’ｔを用い乙と、
ゲル層が厚くなって）、（質や反応η二放物の透過１（
Ｉがｉｕ（くなるので好まし２くない。逆に調度が余り
に小さいときは、均一なゲル層を形成しゲ１１いと共に
、ゲル層の形成に不・ｉｌ・ｉｌｌ！に長時間を要する
こととなるので６ｒましくない。

本発明においては、第１のゲルＩＭ　ｃ、ｔ：　、酵素
反応の１１なわれる水系において熔出−Ｕず、安定に膜
上に存’ＩＦ　シて後ｊボする酵素層を１呆持するため
に架橋されていることを自する。水溶性重合体の架橋方
法は既によく知られており、例えば、ポリビニルアル：
１−ルの場合、ホウ酸や電Ｔ−線により架橋さ４るごと
かでき、また、ｉｕ　ｌｉ］ｌｆ　？ミノ基を有するボ
リエヂレンイミンやアルブミン等の場合し１、ジアルテ
′ヒト′により架１１雷さするごとができる。ｆメこ、
アル゛）′ン酸ソーダの１Ｊ７１合は、ＩＩｉ＋’酸カ
ルノウノ、の、１、うなカルシウム塩に、１、り架１□
ｔさ−Ｕるごとができ【〕。

尚、水溶性凸分Ｊ′４０合体のう）子早し、１涌′畠、
ｖノ十乃至数百万程度であり、肱表ｒｒｉｉ十に水溶性
、［（１分子ｍ合体のゲル層を形成する〕こめには、膜
は用いる「Ｅ合体のう）子曙よりも小さい分画分Ｙ−量
をｒｔすることがＩｒシ・要でｔ６る。しかし、肱が用
いる水溶Ｉノ１山合体の分子♀よりも人きい分画分子♀
を白−、ｔｚ＋ｔＵ合でも、例えば、予め水溶性ｔ］’
Ｈ合体の水濱／ｐＪ、仁二架１喬卯ト茫ンおｌ川し゛で
才９き、これにｉｌ朶を弓巾１１．旧ｍｉ崗さロン〕と
共に架橋さ・することにより、股十に有りＪなデフ１屓
を形成する、二とができ、或いは１漠表面に７１り熔１
゛１重合体を少♀（＝Ｊ着さ−ｌ、架橋処理した１（６
二水溶＋１重合体の水溶液を強制ｉｌ１過さＵるごとに
よっても、膜裏面にイｊ効にゲルＩＮを形成°Ｊること
ができて１゜架橋処理は々ｒ〕Ｉ　Ｌ　＜は、架橋剤の
水溶液に■ζ！を強制Ｊｍ過さ−ｌることにより行なわ
れるが、場合υ二よってはゲル層をｌｉに架橋剤水溶液
に塗布、？ｉ’　Ｌ　＜は含浸さ−Ｕるこよによっても
行なうことができる。

この、１、・）にして架橋されたゲルＩ＄−１１，１う
）向うｉｒ−Ｒがｉ！Ｉ］常１　（１０（１＋１１９〕
下であイ〕ので、このゲル層の上に１１ゲ素水溶＞ｒＸ
を強制１二過さ−Ｕると、酵素がゲル層をｊ１ｎ過−Ｕ
ず、（ｒす１に酵素層を形成する。１）鹸フ゛Ｃ１本発
明によれば、用いる１漠の１＾１造やそのｉ：＋’Ｌ孔
孔瞳孔径係なく、酵素を膜に／Ｍｌ持さｌることができ
る。

勿論、酵素反応においては、酵素反応の括質又（Ｊ生成
物の分子里が、例えば、グルコース、尿酸、尿素、コレ
ステ１：Ｉ−ル、ペニシリンアシラーゼ等の場合で数十
乃至数千程度であるので、これらがゲル層を透過するの
は何ら妨げられない。

本発明によれば、」−記第１のゲル層の上に酵素Ｊ−が
形成されている。この酵素層は、ＰＩＹ素の水溶ン１シ
乙こＩＩ史をづ巾制幻Ｙｌｊ鵡さ・Ｕるごとに、１；す
、−に記したよ・）に、ｆ１ｖ素がゲル１ｍ′４に：透
過する、二となく、ゲル層１：　Ｌ：”、　ｈｌｉ　ｌ
Ｊｊされ゛ｃ影形成Ｉｒ、ｚ＋。

本発明Ｃ１二おいて用いる？ｉ？素は特に開眼されるも
のではないが、例えば、グル：１−ス・イソメターＵ１
グルー１−スオキシダービ、ウレ゛ｒ−ゼ、ウリカーＭ
、Ｔｌレスｙ−ｒ、ｔ　−ル；ｔ　キシターｔ　１１．
−　７　’−／　Ｎ酸化／ｉ？　Ｎ＋ｊ、ペニンリーノ
”−ゼ、カクラーセ゛等を用いることができる。／ｉ？
素はト１的とす【１反１，１−１に’ｂＬ、して１種又
は２種以上の１１へ合物が用いられ、ｅｌだ、酵素層は
１１ＨののならＪ゛、多層に形成されても、１、い。

更に、必ルｊに１．みして、ｈゲ３−と水溶１！ｌ　ｉ
ｌ’ｌ＋分子市合体との混合物εこ第１のゲル層を形成
した腺を強制御１ｎ過さ・Ｕ、混合物として屓を形成さ
１．必要に応してｉｆ￥合体を後述する。１、うに架１
８さ−Ｕてもよい。また、これらの酵素の水溶液はアル
ブミン、グリセリン等の適宜の安定剤を含有してい“（
も、；；い。

本発明の固定化酵素は、上記酵素層の十に第ンの１０１
分７−　Ｄｉ合体ゲル層を有する。このゲルＩＨも前記
と同じ理由により水溶１：１」１合体からなり、前記と
同様に、１１ｙ素屓を形成した股に酵素層側からｉ口合
体水Ｉ′８液を強制ｉｌｌ過さ・ｌるごとにより形成さ
れる。上記ダＳ２のゲル１Ｆ４も第１のゲルＪＨ人同し
く架橋されていてもよい。この場合、第１のゲルＩＮを
形！戊した１多、これを架橋さ−１、次に酵素Ｊｄを形
Ｊ戊し、第２のゲル層を形成して、このゲル層を架Ｊｆ
ｆｉさυ、かくして１１Ｍ別的にゲル層をダｌ橋さ−０
てもらいが　また、？１′日と第２のリール層を形成し
た後、架Ｊ２剤水熔１１νを１漢に強制御ｎ過して、同
時に架橋しても、１、い。

本発明においては、重合体水溶液及び架橋剤水溶〆１ｋ
に膜を強制通過さ−Ｕるにあたって、加圧、減圧いＪ゛
れのＰＪ川用を用いてもよいが、加圧して水溶１１ｋ、
を股１ｆｆｌ過さ−Ｕる場合、その月二力は例えば０．
１〜１　（ｌ　ｋｇ　／　（ニーが）酌当である。圧力
が０．１　ｋｇ　／　ｃｎｔよりも小さいときは、水溶
液の透過量が少ないので、ゲルｒ−の形成や架橋処理に
長時間を要して実用的でなく、−力、ｌ　Ｏｋｇ　／　
ｃＪを越えるときは、多孔（！ｌ　ＩＩＡの破（ｌが起
こるおそれがあるほか、ゲル層やＦｉＶ素Ｉ−〇）ｌ！
Ｅ（を化が起こり、１文Ｌｉ、、、水溶液の透過性がｉ
？（＋　くなるのでＩ）Ｔましくない。

尚、ゲル層や酵素ｌ皆を形成する場合、更に（、ｌ架橋
剤水溶液に股を強制ｉ１Ｔ］過さＵるＪＪｊ合、３何常
、各水ン容液１！　ｔｂ’ｉ圃してＩＩ史をｉｌＴ］過
さＵる。例えば、当初には股を透過した重合体もゲル１
何が形成されるにつれて、膜を透過しなくなり、白油に
ゲル層の形成に関ｌｊするからである。

本発明の固定化酵素の（・ｌ！ＪＩＢこ（ｂたって（Ｊ
、膜に基質水溶液を強制１何過さ・Ｕる。この際の圧力
も１ｊ；［記と間し理１１１から１〜５　ｋｇ　／　ｃ
ｎｌ稈ｊＷがよい。

本発明による固５１ど化ｎ’ｌ素シ、！、ｊ以−１−の
よ）に、４′７几性１１央表面に、水溶性面分−Ｊ７−
１ト合体からなり、１１つ１．Ｗ！横された第１のゲル
層が形成され、この−１−に酵素層と水溶性１ｒｌｉ分
子−ｍ合１（：からなる第２のゲル層が順次形成されて
１′５句、ｌＩｉ？素を１１９内に（５＋ｌＩ、＋Ｙさ
・けるのではないので、Ｆｉ？素の負（１；ｊ量を大き
くすることができ、そのｊ只すＪｉ’ｊにあ］こつ−こ
Ｇ、１、ｌＥ４勿１１１マ〕月シｊ本（質を１ｑ（定さ
れず、しかも、＄！Ｊｉ告操作が非；賓に簡ｄｉであり
、１１つ、酵素は重合体のゲルＩｔｉＬこて扶ｉ１；れ
ζいるので、酵素！、！ニ応系にＪ−７いて熔出′１″
ることがなく、長期にわたつｊｊｏｌｌい！’＋Ｖ素活
１１１をｉイ１（、デすることができる。更に、ｆ１ゲ
素自体￥架橋処狸する・シ、要がないので、Ｉ＋’ｆ素
の架橋に件・）酵５硲−の失を占もない。

以下に本発明の実施例を挙げるが、本発明ｋ１．Ｌれら
実施ｉｔ’ｌｌにより（１１５ら限）Ｖされるものでｔ
ｉｔない。

実施例１ 名イ１、ヤ（顆として分画分子県約５（１００（ｌのホ
１１−ファイバー状梢けζ通過＋１Ｑ（ｌ］東電気上業
（１句製Ｎ　Ｔ　＋１−１１（１５（ｌへ〇（１、）漢
４４質ポリーｙ′ミ１′、外径１．　（ｌ　ｍｓ、内径
（１，６ｍｍ、自りＪ膜面積１．８６　Ｉ＋（）を用い
、水溶性ｉ１１＋う１ｒ１１（合体としてポリエチレン
・イミン（１１本Ｉ＠１媒化学上業（Ｉｌｌ　！ｌｕＪ
ボリコニチレンイミン水ハ寵（ｉ　ｒ−１［１（ｌ［ｌ
　）を、ｉｌ：ノこ、ｒｉｂ　暑畳、ニー　ｃ、＋グ／
レニＪ−ス４　ソ）　ソーｔ’　（ＪｉｍｉＲＩ’１ｌ
ｌｓ″ｉ”、’、Ｉ業（ＩＩｌＩＪ　ス４　’；’　−
セ）　ヲ用イｋ。

０、４５ｉ１ｉ　ｐ　９６のボリコＪ−レン・イミ二／
氷ン容１１シ１０ｐを−１，記Ｊ、目−フリ゛イハー状
打昌・ｈ’　１ｉｌｌ　ｊか））１骨の夕１１冊力・ら
流ｌ；１５ｐ／分、圧力（１，：ｔ　ｋｇ／　ｃｏｄに
゛ζ室温トに４時間ｆＡ’ｉ　１ムＩＵ７（流ｊ；ｎさ
・１！て、第１のゲル層を形成した（玲、？（！ｊ　ｌ
８剤Ｃ；ｆ＋るグルタル゛Ｊ゛ルデＩニド水溶ｌｔＶの
２５％水６音ｔＵ、を１−１記ポリエチし・ン・イミン
水ｉ′８液にｔお加Ｕ７、ｂ；？、甲１０ρ／分、圧力
１ｋｇ／＋・れ室〆晶にζ史にζ３時間１盾Ｉ、！；ｉ
　Ｌ７て流ｊ１ηさ・ｌ、１記ゲル屓を架橋さｌた。こ
のよ・）にし７て、第１の架橋ゲル層をＨヴ１表面、１
−に形成した後、水を流１；Ｉ８　ｅ　／　’ｙン、用
刀（１，５ｋｇ　／　（・１に、室１品にてｐ　Ｉｔ力
ｌす′１となるまで（盾Ｉ臂流ｊ１ηさ・１！てＩ史を
洗滌し７た。

次（、−１水５ｅにグルニ１−スイソメラー１ｉ水溶液
１５０ｍ１を熔解したちのを疏甲１（１／！／分、圧力
１、５　ｋＨＨ／　ａＡ、Ｓ５．１！、’＋、　ＬＣで
２時間循環流＋ｌＴＩ　サ、ｄ、酵ヌ一層を形成した。

酵素水／？ｆ液の当初の２１１Ｏｎ＋ｎａこ　、おりる
吸光）Ｕよ１．３１２であ・つたところ、膜処理後には
Ｏ，（１７９となったので、約９４％のグツト＝１−ス
イソメラーゼカ（膜に１呆１）された。

この（糸、リン酸二水素す１リウＪ８にてｐＨ７，（ｌ
　Ｌ、二メＩＭ整したポリエチレンイミン氷と６液をｄ
：！；）、　１１１　Ｐ／分、圧力１．５ｋｇ／＋・献
室温にて１時間ｆＡ’ｉ　Ｉζ１しζ流ｊｍさ師こ。次
に、（１，Ｉ　Ｍ硫酸マグネン１シＪいを含有する０、
　Ｉ　Ｍ酢１’ｌ’（１２Ｊ南〆＋’ｒｉ、　＋　ｏ　
ｐにグルタノトアノトデヒ１′を０．０１　ｉｒｔ屋９
石となる、ｌ、゛）に加え、Ｉ）１１を７，５に調整し
た架橋剤水溶液１　＋１７！をを’１ＡＦｌ；ｌＩ　２
１７分、圧力０．５　ｋｇ　／　ｃｏｔ　、　室７Ｑ　
ニ’Ｃ２時間循Ｉｑ流ｉｍさ・ｌ！た（＆、５　［１ｍ
　Ｍ　（ｔＥＩＩｉグマグネー／ウドを含白づ−る水Ｉ
５７！を（盾Ｉ贋流１ｆｆｌさくｊ−テＩＪ５４を？、
ｌｌｉ　＋ＩＮし、史に、２　Ｍ食塩水溶液１０／！、
０．３Ｍ食塩水水溶＋）、　Ｉ　（ｌ　ｐ、水５　ＲＯ
）　ｌｒｌ　テ／ｌＩＥ　Ｊさ−Ｕ、力・＜シテ、グ）
Ｉｙ　１１−スイ’／メラーゼ固定化膜を（１１た。

ＩＭのグル′Ｊ　−ス（０，１Ｍｇ１ｒ（Ｊ、マク、＊
　’Ｊ　ラム、２　ｍ　Ｍ　ｊ４ｉ化″Ｊパル１及びｐ
ｌ＋７．５の０．１　Ｍ　＋リスマレート緩１Φｉ　ｌ
ｔＫを含イｊする。）水ン容ン１νｌ　０７！を流量！
１．５　ｐ　７分、圧力（１，６ｋｇ／　ｃｒＡ　、温
度Ｇ　Ｏ’Ｃで−にでｉ！ｌだ酵素固定化膜に循ｓＭ流
通さ・Ｕたとこ７）、透過速度的１１　（ｌ　ｍｌ／分
であって、約１０時間後に全グル、：１−スの約（１０
％がフラクトースに変換された。

尚、フラクトースへの変換率はＷｌ［酸−カルバゾール
法により、５　Ｇ　ｆｌ　ＩｕＴｌの吸光度を測定する
ことにより行なった。

ま）こ、膜透過液からはタンパク質は全く検出されず、
股からのグ刀−：１−スイソメラーじの漏出は認められ
なかった。

実施例 実施例Ｉの酵素固定化膜をモジ、ゴー−ル化し、実ｈｆ
ｔｉ例１と同じ多Ｍのグ月ｄＩ−ス水溶１１ｋを流’、
　＠　（ｉ　７！ｌ分、圧力０．２　ｋｇ　／　ｃしｒ
ｎＫ度５５℃で膜モジュールに循環して供給しつつ、膜
透過液を２２ｍ。１！分の割合で取り出したところ、第
１１Ｗ＋に示すよ・）に６０時間にわた゛ってほぼ一定
のフラクト−スへの変換率を示した。

比較例 実施例１において、グルタルアルデヒドによる第１及び
第２のゲル層の架橋処理を１１なわなかった以外は、実
施例１と全く同様にして、グルコースイソメラ＝＋ｉ固
定化膜を１！ｌた。この膜を実施例２と同じくモジ、−
１−−ル化し、間し条（）１下で酵素反応を連続して１
ｊなわ−Ｕたところ、第１図に示Ｊ−１１、・）に、変
換率は５時間経過後に！；Ｉ　ｔ！！：　’Ｆ　Ｌ始め
、２０時間ｉ＆には約２　（１！１’ｏにまで低下した
。また、膜透過液にε、ｌタンパク質が検出され、＾ゲ
素が膜から一ロＩ；漏出していることが認められた。

実施例３ ＹｉすＪ模面閑２０　ｃｎｌのミリポアフィルタ−（ｉ
ｌＡ合セルＣＩ−〕、を素）、（とする畢均孔経（１，
２２／Ｉの？、’＋？　ｒｌ、模、ミリボア？ＩＩ）、
すＧＳ）に１％ポリコニチレンイミン水水溶１００＋ｎ
ｌを０．１　ｋｇ　／　ｃＡの圧力にて強制透過さ−ｌ
て第１のゲル層を形成した後、１００■のウリカーゼ（
和光純薬工業（ｌｉｌ製０．７５　Ｅｌ舅１ン／■）を
含むホウ酸！’Ａ　ｔｉｉ液（ρ１１９．０．０．０１
Ｍ）　　Ｉ　００ｍ１を１１力０．Ｉ　ｋｇ’／　ｃ＋
ｌＩで１ｉｌｌ　ｊ＃３さ−ｌて、上記ゲル層の１−に
ｆ’＋’ｆ　：＋’ｒ　ｌ＝ｌを形成さｌた。次いで、
ボウ酸でｐＨ９゜０にｌ！ｄ整しノこ１９石ポリエヂレ
ン・イミン水溶液１００ｍ１を酵２＋一層側から同様に
圧入１ｆｆｌ過さ−ｌて、第２のゲルｊ−を形成した後
、ホウ酸でｐＨ９，０に調整したｆｌ、　（１０５巾ｌ
；１％グルタルアルデ１：１′水熔液（１＋１ｌ（１，
０）をＩＬ力（１，３ｋｇ　／　ＣＩＪ　ニテｊｌｎ過
さ・ｌて、ゲル層をダｊ橋さ−ｌ、更に、ｐＨｆｉ、　
５、（１，（１１Ｍリン酸ルｉ暖１畢ｆン１にでｙｓ８
　＋ｌｉ榮し］こ。

この、１、・）Ｃ１二し’ｉｒｆ！７に／１ｌｌＩ素固
ｙｊ！化肱ｔこ温度の種々異なる尿酸水溶７ｔＶを月、
力０．　］　ｋｑ　／　ｃｎｌ、ｌ温度３０℃で通ｉＰ
ｒさｌたとごろ、透過速度は２ｍ１！分であっ′（、第
２図に示４−ように、尿１ＩｌＯ漏爪のλ１数に列して
ＨＨ膜透過液電極電位の対数は直ＪＪｉｆ的に増加Ｌ２
、酵素？ｌｉ極として有効に利用できること？＋’、’
　）Ｉ”　シている。

【図面の簡単な説明】

ｆｌ目しｌ　４；ｔ：　、４．：発明のグルコースイソ
メタービ固定化膜によるグツ］何−スへの変換率の経時
変化を比較例の一１ｙ素固）ｉ二化股の場合と１ノ「・
Ｕて示Ｊノ′ラフ、第２図は本発明の本発明のウレカー
Ｕ固定化膜を用いて、種ｈ　？ｉＡ度の異なる！１（質
濱１１ｋを反応さけた場合の−ｉＶ素反応の直線１ｊ１
を示すグラフである。 第１図 悄；す（ｈｒ） 第２図 −ｓ　　　−ｑ、夕　−４，０−３，５−３，０４Ｅ屈
峡（−Ａ’）Ｊ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１１多孔性膜表面に形成された第１のｉｎ１分子重合
   体ゲル屓と、このゲル層の」二に形成された酵素層と、
   この酵素層の−にに形成された第２の高分子重合体ゲル
   層−とを有し、少なくとも第１のゲル層が架橋されてい
   ることを特徴とする固定化酵素。 （２）第１の水溶性１１１１分子重合体の水溶液に多孔
   性腺を強制）］１１過さ・Ｕて、膜表面に第１のｉｌＬ
   分子重合体ゲル層を形成する工４〜１、酵素水溶液に−
   に記第１のゲル層を形成した膜を強制Ｊ過さ・ｌて、第
   １のゲル層の−にに酵素層を形成する工程、及び第２の
   水溶性高分子重合体の水溶液に」二記ＩＷ素屓を形成し
   た肱を強制通過さ・Ｕで、酵素層の」二に第２のＩｌｊ
   分子分子重合体ゲル形成する工程とを有し、更に少なく
   とも第１の１０１分子重合体ゲル層を架橋さ・ｌる工程
   を有することを特徴とする固定化酵素の製造方法。 （３）　　架橋剤水溶液にゲル層を強制通過さ−ｌて、
   ゲル層を架橋させることを特徴とする特許請求の範囲第
   ２項記載の固定化酵素の製造方法。