JPS59213392A - リポソ−ムで媒介される真核細胞の形質転換 - Google Patents
リポソ−ムで媒介される真核細胞の形質転換Info
- Publication number
- JPS59213392A JPS59213392A JP59093086A JP9308684A JPS59213392A JP S59213392 A JPS59213392 A JP S59213392A JP 59093086 A JP59093086 A JP 59093086A JP 9308684 A JP9308684 A JP 9308684A JP S59213392 A JPS59213392 A JP S59213392A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- dna
- solvent
- lipid
- liposomes
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
- A61K9/1277—Processes for preparing; Proliposomes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、生物活性分子例えばデオキシリボ核酸（ＤＮ
Ａ）を脂質小胞又はリポソーム中に封入させる方法、及
び細胞特に植物の細胞を形質転換させるのにこの脂質に
封入されたＤＮＡを利用する方法に関する。
Ａ）を脂質小胞又はリポソーム中に封入させる方法、及
び細胞特に植物の細胞を形質転換させるのにこの脂質に
封入されたＤＮＡを利用する方法に関する。
形質転換とは、１つの細胞中で発生するＤＮＡが取シ出
されて、もう１つの細胞により安定に維持されるような
遺伝情報に関する一方向の転移の一般的な過程として定
義される。このＤＮＡの転移はいくつかの形をとる。バ
クテリア間においては、プラスミドに対して自然に発生
する情報の転移は接合である。ウィルスＤＮＡは、非溶
原性感染においてのみバクテリア染色体の中に比較的安
定に組込まれ、後で抑制的な刺激に感応して解放される
ことになる。
されて、もう１つの細胞により安定に維持されるような
遺伝情報に関する一方向の転移の一般的な過程として定
義される。このＤＮＡの転移はいくつかの形をとる。バ
クテリア間においては、プラスミドに対して自然に発生
する情報の転移は接合である。ウィルスＤＮＡは、非溶
原性感染においてのみバクテリア染色体の中に比較的安
定に組込まれ、後で抑制的な刺激に感応して解放される
ことになる。
発生源から原核細胞又は真核細胞に対する自然発生的な
又は人工的に構成されたＤＮＡの形態による情報の転換
は遺伝子工学の核心をなすものである。このような転換
は多くの方法により達成される。最も一般的な方法では
、細胞特にバクテリア細胞は選択性のマーカーを含有す
る形質転換ＤＮＡの緩衝水溶液に一定の時間さらされる
。細胞はマーカーによシ与えられた特性に応じて選択さ
れる。抗生物質耐性は一般的に用いられる選択性マーカ
ーである。もう１つの転換方法では、約５０％の濃度の
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含有する緩衝溶液
と形質転換ＤＮＡの緩衝水溶液中で転換されるべき細胞
を培養することが必要である。生存する細胞は、形質転
換ＤＮＡにより与えられる特性に応じて選択される。
又は人工的に構成されたＤＮＡの形態による情報の転換
は遺伝子工学の核心をなすものである。このような転換
は多くの方法により達成される。最も一般的な方法では
、細胞特にバクテリア細胞は選択性のマーカーを含有す
る形質転換ＤＮＡの緩衝水溶液に一定の時間さらされる
。細胞はマーカーによシ与えられた特性に応じて選択さ
れる。抗生物質耐性は一般的に用いられる選択性マーカ
ーである。もう１つの転換方法では、約５０％の濃度の
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含有する緩衝溶液
と形質転換ＤＮＡの緩衝水溶液中で転換されるべき細胞
を培養することが必要である。生存する細胞は、形質転
換ＤＮＡにより与えられる特性に応じて選択される。
一般に細胞は、形質転換される前に、転換が可能となる
ようにするために予備処理される。
ようにするために予備処理される。
このような予備処理によシ、細胞膜への接近が可能とな
シ、その結果形質転換ＤＮＡが細胞膜を横切って移動す
ることになる。いくつかのバクテリア細胞は、前記した
方法により転換される前に、バクテリア細胞壁を消化し
たシ、又はその形成を阻止したりするような酵素や抗生
物質で処理される。その結果、細胞膜はむき出しにされ
、細胞は浸透的に脆いものとなる。他のバクテリア細胞
の場合には、塩化カルシウムを含有する緩衝液にさらす
ことにより形質転換可能となる。
シ、その結果形質転換ＤＮＡが細胞膜を横切って移動す
ることになる。いくつかのバクテリア細胞は、前記した
方法により転換される前に、バクテリア細胞壁を消化し
たシ、又はその形成を阻止したりするような酵素や抗生
物質で処理される。その結果、細胞膜はむき出しにされ
、細胞は浸透的に脆いものとなる。他のバクテリア細胞
の場合には、塩化カルシウムを含有する緩衝液にさらす
ことにより形質転換可能となる。
真核細胞の形質転換は、同様な方法を利用して達成され
る。一般に動物細胞は、細胞壁をもっておらず、その結
果、酵素や抗生物質による予備処理を行わなくても浸透
的に脆いものである。また一般に酵母細胞は、酵累チモ
リーゼ（Ｚｙｍｏｌｙｓｅ Ｉを用いた予備消化によシ
浸透的に脆いものにされる。その結果得られるスフェロ
プラストは、細胞壁をもたない酵母細胞であシ、ＰＥＧ
含有又は非含有の形質転換ＤＮＡを用いて培養される。
る。一般に動物細胞は、細胞壁をもっておらず、その結
果、酵素や抗生物質による予備処理を行わなくても浸透
的に脆いものである。また一般に酵母細胞は、酵累チモ
リーゼ（Ｚｙｍｏｌｙｓｅ Ｉを用いた予備消化によシ
浸透的に脆いものにされる。その結果得られるスフェロ
プラストは、細胞壁をもたない酵母細胞であシ、ＰＥＧ
含有又は非含有の形質転換ＤＮＡを用いて培養される。
筐た一般に植物細胞は、前記したいずれかの方法による
転換の前に、植物細胞壁を酵素で消化させることにより
浸透的に脆いものにされる。このような浸透的に脆い植
ａ＋細胞は、一般には植物細胞原形質体と呼ばれる。
転換の前に、植物細胞壁を酵素で消化させることにより
浸透的に脆いものにされる。このような浸透的に脆い植
ａ＋細胞は、一般には植物細胞原形質体と呼ばれる。
細胞、特に原核細胞であれ真核細胞であれ浸透的に脆い
細胞、そのうち特に植物原形質体を形質転換させようと
する試み（は、転換を高頻度で達成するに際して２つの
大きな相互に関連する問題に直面した。第１には、細胞
は一般に非常に少ない頻度で細胞膜？ｆ：：通ったＤＮ
Ａ′ｆ：取り上げる。この現象は、細胞膜のより一般的
な特性に関する１つの表示である。そして細胞膜は一般
に選択的に浸透性であｐ１小さな分子に対しては通過さ
せるが、大きな分子、例えばペプチド又は蛋白質、糖類
、及びＤＮＡやリボ核酸Ｉ ＲＮＡ ）のようなポリヌ
クレオチドに対してはその通過を阻止する。第２には、
低頻度のＤＮＡ吸収に加えて、分解酵素、特に核酸ＤＮ
ＡとＲＮＡｆ、分解する酵素であるヌクレアーゼは、植
物原形質体を含む浸透的に鋭敏な細胞の調合物中に存在
し、それが細胞により取り上げられる前に、核酸を消化
し、その核酸中に含まれる情報を崩壊式せる。
細胞、そのうち特に植物原形質体を形質転換させようと
する試み（は、転換を高頻度で達成するに際して２つの
大きな相互に関連する問題に直面した。第１には、細胞
は一般に非常に少ない頻度で細胞膜？ｆ：：通ったＤＮ
Ａ′ｆ：取り上げる。この現象は、細胞膜のより一般的
な特性に関する１つの表示である。そして細胞膜は一般
に選択的に浸透性であｐ１小さな分子に対しては通過さ
せるが、大きな分子、例えばペプチド又は蛋白質、糖類
、及びＤＮＡやリボ核酸Ｉ ＲＮＡ ）のようなポリヌ
クレオチドに対してはその通過を阻止する。第２には、
低頻度のＤＮＡ吸収に加えて、分解酵素、特に核酸ＤＮ
ＡとＲＮＡｆ、分解する酵素であるヌクレアーゼは、植
物原形質体を含む浸透的に鋭敏な細胞の調合物中に存在
し、それが細胞により取り上げられる前に、核酸を消化
し、その核酸中に含まれる情報を崩壊式せる。
細胞によるＤＮＡの吸収効率を増加させるためには、一
般に数多くの方法が利用可能である。
般に数多くの方法が利用可能である。
これらの方法のうち、細胞によ、！７取シ上けられる物
質の水溶液を脂質小胞中に封入させる方法がある。この
脂質小胞は水性空間を、取シ囲む連続膜を形成する２層
の脂質からなる被覆物である。次いで脂質小胞又はリポ
ソームは、リポソームの脂質膜が転換させられる細胞の
細胞膜と融合する−り、、、 Ｋなると信じられている
条件下で、浸透的に脆い細胞と一諸に培養される。リポ
ソームの脂質膜が細胞膜と融合したのち、リポソームの
水性成分は細胞の内部の水性相を構成する水性細胞質ゾ
ル中に放出されると信じられてｂる。
質の水溶液を脂質小胞中に封入させる方法がある。この
脂質小胞は水性空間を、取シ囲む連続膜を形成する２層
の脂質からなる被覆物である。次いで脂質小胞又はリポ
ソームは、リポソームの脂質膜が転換させられる細胞の
細胞膜と融合する−り、、、 Ｋなると信じられている
条件下で、浸透的に脆い細胞と一諸に培養される。リポ
ソームの脂質膜が細胞膜と融合したのち、リポソームの
水性成分は細胞の内部の水性相を構成する水性細胞質ゾ
ル中に放出されると信じられてｂる。
種々の要素がリポソームで媒介される水性物質の細胞内
部への伝達効率に影響を与える。％にポリ核酸例えばＤ
ＮＡとＲＮＡ、蛋白質、多糖類等のような巨大分子に対
するリポソーム媒介伝達に関しては、水性物質がリポソ
ーム中に封入させられる効率、リポソームを生成する間
における封入物質の安定性及び異なる細胞にょるリポソ
ームの吸収における多様性は、すべて水性物質の細胞中
への伝達速度に影響を与える。
部への伝達効率に影響を与える。％にポリ核酸例えばＤ
ＮＡとＲＮＡ、蛋白質、多糖類等のような巨大分子に対
するリポソーム媒介伝達に関しては、水性物質がリポソ
ーム中に封入させられる効率、リポソームを生成する間
における封入物質の安定性及び異なる細胞にょるリポソ
ームの吸収における多様性は、すべて水性物質の細胞中
への伝達速度に影響を与える。
封入に影響を与える要素と一般的なリポソーム分野につ
いての優れた参考書は、ｒＬｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ｆｒｏ
ｍ Ｐｈｙｓｉｃａｌ ５ｔｒｕｃｔｕｒｅ ｔｏ Ｔ
ｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＪ （
Ｅ１ｓｅ１ｅｒ／Ｎｏｒｔｈ ＨｏｌｌａｎｄＢｉｏｍ
ｅｄｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ （１９８１）、 Ｋｎｉｇ
ｈｔ ｍ集）の第３章に掲載されている“Ｌｉｐｏｍｏ
ｍｅｓ ：Ｐｒ、ａｐａｒａｔｊｏｎ ａｎｄ Ｃｈａ
ｒａｃｔａｒｆｚａｔｌｏｎ“（Ｓ ｚ ｏ ｋｔｉ巨
ｓ、及びＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ 、Ｄ、著）
である。
いての優れた参考書は、ｒＬｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ｆｒｏ
ｍ Ｐｈｙｓｉｃａｌ ５ｔｒｕｃｔｕｒｅ ｔｏ Ｔ
ｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＪ （
Ｅ１ｓｅ１ｅｒ／Ｎｏｒｔｈ ＨｏｌｌａｎｄＢｉｏｍ
ｅｄｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ （１９８１）、 Ｋｎｉｇ
ｈｔ ｍ集）の第３章に掲載されている“Ｌｉｐｏｍｏ
ｍｅｓ ：Ｐｒ、ａｐａｒａｔｊｏｎ ａｎｄ Ｃｈａ
ｒａｃｔａｒｆｚａｔｌｏｎ“（Ｓ ｚ ｏ ｋｔｉ巨
ｓ、及びＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ 、Ｄ、著）
である。
簡単に要約すると、現在用いられている方法は次の通り
である。最も簡単に形成されるリポソームは多重層小胞
（ＭＬＶ）である。ＭＬＶは、フラスコや試鋏管の壁土
に薄い脂質膜を析出させ・水性相を加え、次いで容器を
静かに攪拌することによ多形成される。このようにして
つくられたＭＬＶは、多重の脂大層をもつ。
である。最も簡単に形成されるリポソームは多重層小胞
（ＭＬＶ）である。ＭＬＶは、フラスコや試鋏管の壁土
に薄い脂質膜を析出させ・水性相を加え、次いで容器を
静かに攪拌することによ多形成される。このようにして
つくられたＭＬＶは、多重の脂大層をもつ。
ＭＬＶの大きな欠点は、多重の脂質層を形成することに
よる水性物質封入度の低下である。
よる水性物質封入度の低下である。
（Ｂａｎｇｌｌａｍ他（１９６５） 、 Ｊ、Ｍｏ１．
Ｂｉｏｌ、 、 １３：２３８−２５２ １ ＭＬＶが窒素のような不活性雰囲気下で超音波処理にか
けられた場合には、直径１００ ’ｎｍ以下の小さな単
一層小胞（ＳＵＶ）の均一な集団が形成される。８ＵＶ
のサイズが小さいために、脂質１モル幽たシの水性空間
の封入量および封入されるべき巨大分子の大きさが制限
され、後者は一般に約４０，０００ダルトン（ｄ）より
も小さくなる。Ｉ Ｐａｐｈｉｄｊｏｐｏｕｌｏｓ 、
Ｄ及びＭｉｌｌｅｒ 、Ｎ、 （１９６７） 、 Ｂ
ｉｏｃｈｉｍ、Ｂｌｏｐｈｙｓ。
Ｂｉｏｌ、 、 １３：２３８−２５２ １ ＭＬＶが窒素のような不活性雰囲気下で超音波処理にか
けられた場合には、直径１００ ’ｎｍ以下の小さな単
一層小胞（ＳＵＶ）の均一な集団が形成される。８ＵＶ
のサイズが小さいために、脂質１モル幽たシの水性空間
の封入量および封入されるべき巨大分子の大きさが制限
され、後者は一般に約４０，０００ダルトン（ｄ）より
も小さくなる。Ｉ Ｐａｐｈｉｄｊｏｐｏｕｌｏｓ 、
Ｄ及びＭｉｌｌｅｒ 、Ｎ、 （１９６７） 、 Ｂ
ｉｏｃｈｉｍ、Ｂｌｏｐｈｙｓ。
Ａｃｔａ、 、 １３５ ： ６２４−６３８ 、 Ａ
ｄｒｆａｎ 。
ｄｒｆａｎ 。
Ｇ及びＨｕａｎｇ 、Ｌ−（１９７９） ＋ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ 。
ｈｅｍｉｓｔｒｙ 。
１８：５６１０−５６１４）
直径が１００ ｎｍ 以上の脂質小胞である大きな単一
層小胞（ＬＵＶｌをつくるために、いくつかの方法が開
発された。比較的に大きな体積の水性相中にリン脂質含
有の有機溶媒介注入することにより／ト胞の形成をもた
らす溶媒注入法は、よく利用されてきたが、プラスミド
ｐＢＲ３２２ＤＮＡの封入効率はわずか約３％に過ない
（Ｄｅａｍｅｒ 、 ［）、Ｗ、及びＩｌａｎｇｈａｒ
ｎ 、 Ａ、Ｄ。
層小胞（ＬＵＶｌをつくるために、いくつかの方法が開
発された。比較的に大きな体積の水性相中にリン脂質含
有の有機溶媒介注入することにより／ト胞の形成をもた
らす溶媒注入法は、よく利用されてきたが、プラスミド
ｐＢＲ３２２ＤＮＡの封入効率はわずか約３％に過ない
（Ｄｅａｍｅｒ 、 ［）、Ｗ、及びＩｌａｎｇｈａｒ
ｎ 、 Ａ、Ｄ。
（１９７６）、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａ
ｃｔａ、 ４４３ ：６２９−６３４ 、 Ｆｒａｌｅ
ｙ、Ｒ，Ｔ’、他＋１９７９） 。
ｃｔａ、 ４４３ ：６２９−６３４ 、 Ｆｒａｌｅ
ｙ、Ｒ，Ｔ’、他＋１９７９） 。
Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、７６：：う ３４８−３３５２）
。
。
その上、この方法は、大部分の生物学的分子が完全性を
維持するためには比較的に高温である約６０℃で行われ
る。
維持するためには比較的に高温である約６０℃で行われ
る。
洗浄剤／リン脂質混合物から種々な方法で洗浄剤を除去
することからなるもう１つの方法も用いられたが、封入
効率がわずかに約６−１２襲に過ぎない（Ｅｎｏｃｈ
、ＨｏＧ、及びＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ 。
することからなるもう１つの方法も用いられたが、封入
効率がわずかに約６−１２襲に過ぎない（Ｅｎｏｃｈ
、ＨｏＧ、及びＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ 。
Ｐ、 （１９７９１、Ｐ、Ｎ、Ａ、８．７６ ： １４
５−１４９）。その上、この方法でつくられたリポソー
ムが水性空間の中味を細胞内部に伝達するのに用いられ
た場合には、リポソームと結合した残留の洗浄剤が細胞
の生存に影響を与える。
５−１４９）。その上、この方法でつくられたリポソー
ムが水性空間の中味を細胞内部に伝達するのに用いられ
た場合には、リポソームと結合した残留の洗浄剤が細胞
の生存に影響を与える。
またＬＵＶをつくるためには、カルシウムにより誘発さ
れる融合法も用いられた （ Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ他（１９７５）
、 Ｂｉｏｃｈｅｍ。
れる融合法も用いられた （ Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ他（１９７５）
、 Ｂｉｏｃｈｅｍ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ 、 ３９４ ： ４８３−
４９１ ）。
４９１ ）。
この方法では、酸性リン脂質からなる予備成形されたＳ
ＵＶは、誓封さ・れた大きな単一層小胞をつくるために
、カルシウム及びエチレンジアミ／テ）・う酢酸（ＥＤ
ＴＡ）で処理される。この方法を用いた場合、ウィルス
やＲＮＡ、ＤＮＡ等の巨大分子のような粒子に対する封
入効率はわずか約１０％であり、蔗糖のような比較的小
さい分子に対する封入効率は約１５％である。
ＵＶは、誓封さ・れた大きな単一層小胞をつくるために
、カルシウム及びエチレンジアミ／テ）・う酢酸（ＥＤ
ＴＡ）で処理される。この方法を用いた場合、ウィルス
やＲＮＡ、ＤＮＡ等の巨大分子のような粒子に対する封
入効率はわずか約１０％であり、蔗糖のような比較的小
さい分子に対する封入効率は約１５％である。
その上、この方法は、この方法で用いられるＳＵＶ中に
最初に封入される分子の大きさにより限定される。
最初に封入される分子の大きさにより限定される。
もう１つの方法である逆相蒸発法は、水性相中に溶解し
た物質を封入させるのに用いられた。
た物質を封入させるのに用いられた。
この方法を用いた場合、水性緩衝液のイオン強度による
が、約２０−６０％の水性相が封入されうる（ ５ｚｏ
ｋａ 、 Ｓ、及びＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ
、 Ｄ−（１９７８） 、 Ａｎｎ、Ｒｅｖ、 Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ、Ｂｉｏｅｎｇ、、 ９ ：４６７−５０８
、 Ｆｒａｌｅｙ他（１９８０）、Ｊ。
が、約２０−６０％の水性相が封入されうる（ ５ｚｏ
ｋａ 、 Ｓ、及びＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ
、 Ｄ−（１９７８） 、 Ａｎｎ、Ｒｅｖ、 Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ、Ｂｉｏｅｎｇ、、 ９ ：４６７−５０８
、 Ｆｒａｌｅｙ他（１９８０）、Ｊ。
Ｂｉｏ、ｃｈｅｍ、 、 ２５５ ： １０４３１−１
０４’３８）。
０４’３８）。
この方法では、脂質は有機溶媒又は低沸点フッ化層素中
に溶解される。水性物質は脂質／溶媒混合物に直接添加
され、次いで均質なエマルジョン分つくるよう、に、そ
の調合物は超音波処理される。その超音波処理工程は、
高い封入割合を得る上で決定的である。溶媒は、その後
リポソームが形成する工程の間に蒸発により除去される
。
に溶解される。水性物質は脂質／溶媒混合物に直接添加
され、次いで均質なエマルジョン分つくるよう、に、そ
の調合物は超音波処理される。その超音波処理工程は、
高い封入割合を得る上で決定的である。溶媒は、その後
リポソームが形成する工程の間に蒸発により除去される
。
植物原形質体や他の浸透的に脆い細胞を形質転換させる
／也めに逆相蒸発法を用いてＤＮＡ含有のリポソームを
つくろうとする際に、本発明者は、短時間の間でざえも
超音波処理の従来工程がリポソーム中に含゛まｔしかつ
最終的には転換される細胞中Ｖこ転移されるＤＮＡを実
質的に崩壊させ、分解するということケ見い出した。そ
の結果、逆相蒸発法を用いた場せ、封入効率は高いが、
転換頻度は低い。
／也めに逆相蒸発法を用いてＤＮＡ含有のリポソームを
つくろうとする際に、本発明者は、短時間の間でざえも
超音波処理の従来工程がリポソーム中に含゛まｔしかつ
最終的には転換される細胞中Ｖこ転移されるＤＮＡを実
質的に崩壊させ、分解するということケ見い出した。そ
の結果、逆相蒸発法を用いた場せ、封入効率は高いが、
転換頻度は低い。
本発明者は、更に脂質／溶媒／水性調合物を激しく攪拌
した場合に、リポソームの水性望間内に含まれる巨大分
子特にＤＮＡが崩壊又は分解されることなく、高い封入
効率でもってリポソームがつくられるということを見い
出した。
した場合に、リポソームの水性望間内に含まれる巨大分
子特にＤＮＡが崩壊又は分解されることなく、高い封入
効率でもってリポソームがつくられるということを見い
出した。
更に詳しくは、超音波処理工程が省略されその代シに種
々なプラスミドを含有する脂質／溶媒／水性調合物を乳
化させるための渦動工程が採用されているような逆相蒸
発法によｐつくられたリポソームは、高頻度で植物細胞
を転換させるのに用いることができるということが見い
出された。その上、この方法でつくられたりボッ７ムを
用いた場合には、プラスミドが実質的に無傷のままで植
物原形質体中に伝達されうるということも見い出された
。特に、リポソームに封入されたプラスミドｐＢＲ３２
７は、予想外に安定に維持されかつ再生された場合に高
頻度で植物細胞の原形質体中に転移されるということが
わかった。更にｐ ＢＨ３２７は植物細胞中で安定に維
持されかつ再生するということもわかった。
々なプラスミドを含有する脂質／溶媒／水性調合物を乳
化させるための渦動工程が採用されているような逆相蒸
発法によｐつくられたリポソームは、高頻度で植物細胞
を転換させるのに用いることができるということが見い
出された。その上、この方法でつくられたりボッ７ムを
用いた場合には、プラスミドが実質的に無傷のままで植
物原形質体中に伝達されうるということも見い出された
。特に、リポソームに封入されたプラスミドｐＢＲ３２
７は、予想外に安定に維持されかつ再生された場合に高
頻度で植物細胞の原形質体中に転移されるということが
わかった。更にｐ ＢＨ３２７は植物細胞中で安定に維
持されかつ再生するということもわかった。
本方法では、リポソームをつくるために適当な脂質の混
合物が用いられる。このような脂質としては、例えばホ
ス７アチジルセリン（ＰＳＩ、ホスファチジルコリン（
ＰＣ）、ジノくノトミチジルホスファチジルコリン、コ
レステロール（ＣＨ］、ステアリルアミン（ＳΔ）及び
ジセチルホスフエー）（ＤＣＰ）が含まれる。α−トコ
フェロールもまたその混合物に加えられる。
合物が用いられる。このような脂質としては、例えばホ
ス７アチジルセリン（ＰＳＩ、ホスファチジルコリン（
ＰＣ）、ジノくノトミチジルホスファチジルコリン、コ
レステロール（ＣＨ］、ステアリルアミン（ＳΔ）及び
ジセチルホスフエー）（ＤＣＰ）が含まれる。α−トコ
フェロールもまたその混合物に加えられる。
種々な脂質の割合は、変わシうるが、一般に０−１０Ｐ
Ｓ：０−９ＰＣ：０−５ＣＨ：０−ＩＳＡ：０−ｌＤＣ
Ｐのモル比の範囲内である。
Ｓ：０−９ＰＣ：０−５ＣＨ：０−ＩＳＡ：０−ｌＤＣ
Ｐのモル比の範囲内である。
ＰＳのみから又はＰＣのみからリポソームをつくること
は可能ではあるが、通常は脂質の混合物が用いられる。
は可能ではあるが、通常は脂質の混合物が用いられる。
一般に種々の脂質の割合は、つくられるリポソームが正
電荷、中性電荷又は負電荷のいずれをもつかによシ変わ
シうる。例えば、ＩＰＳ：４ＰＣ：５ＣＨのモル比では
、正味の負電荷をもつリポソームが得られる。ＩＰＣ：
ＩＣＨのモル比では、リポソームは正味の中性電荷をも
つ。ＩＳＡ：４ＰＣ：５ＣＨのモル比では、リポソーム
は正味の正電荷をもつ。正味の負電荷をもつリポソーム
が好ましい。
電荷、中性電荷又は負電荷のいずれをもつかによシ変わ
シうる。例えば、ＩＰＳ：４ＰＣ：５ＣＨのモル比では
、正味の負電荷をもつリポソームが得られる。ＩＰＣ：
ＩＣＨのモル比では、リポソームは正味の中性電荷をも
つ。ＩＳＡ：４ＰＣ：５ＣＨのモル比では、リポソーム
は正味の正電荷をもつ。正味の負電荷をもつリポソーム
が好ましい。
種々な脂質が例えはクロロホルムのような溶媒中に供給
される場合には、溶媒中の脂質は所望の割合で容器中で
混合される。そして溶媒は蒸発させられ、容器中には脂
質の混合物が残る。
される場合には、溶媒中の脂質は所望の割合で容器中で
混合される。そして溶媒は蒸発させられ、容器中には脂
質の混合物が残る。
ジエチルエーテルやジイソプロピルエーテルのような有
機溶媒、又は例えばジイソプロピルエーテルとクロロホ
ルム又は低沸点フン化炭素のような有機溶媒の混合物が
脂質混合物に加えられる。好ましくは、ジエチルエーテ
ルが用いられる。
機溶媒、又は例えばジイソプロピルエーテルとクロロホ
ルム又は低沸点フン化炭素のような有機溶媒の混合物が
脂質混合物に加えられる。好ましくは、ジエチルエーテ
ルが用いられる。
リポソーム中に封入される物質を含有する水溶液が調製
される。一般に、その水溶液は、適当な緩衝液中にある
封入される物質、例えばＤＮＡＸＲＮＡ、蛋白質、多糖
類、糖蛋白質等のような巨大分子又はプラスミドからな
る。例えば、ＤＮＡが封入される場合には、１０ミリモ
ル（ｍＦｉｉ）のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン（Ｔｒｉｍ ）とｐＨ８，０にある０、 １−１．
０ｍＭのＥＤＴＡ又は同じｐＨの０．４モル（Ｍ ）の
マンニント緩衝液が用いられる。その水溶液は、脂質／
溶媒／水性調合物をつくるために脂質／溶媒混合物に加
えられる。
される。一般に、その水溶液は、適当な緩衝液中にある
封入される物質、例えばＤＮＡＸＲＮＡ、蛋白質、多糖
類、糖蛋白質等のような巨大分子又はプラスミドからな
る。例えば、ＤＮＡが封入される場合には、１０ミリモ
ル（ｍＦｉｉ）のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン（Ｔｒｉｍ ）とｐＨ８，０にある０、 １−１．
０ｍＭのＥＤＴＡ又は同じｐＨの０．４モル（Ｍ ）の
マンニント緩衝液が用いられる。その水溶液は、脂質／
溶媒／水性調合物をつくるために脂質／溶媒混合物に加
えられる。
次いでその脂質／溶媒／水性調合物は、封入される物質
の完全性に対して実質的に非崩壊的かつ非破壊的な手段
によシ激しく攪拌される。
の完全性に対して実質的に非崩壊的かつ非破壊的な手段
によシ激しく攪拌される。
この手段には、一般に脂質／溶媒と調合物の水性相とを
実質的に乳化させるのに十分な時間の間、調合物を急激
に回転させ゛、同時に振とうさせることが含まれている
。この目的のためには、急激な強い振とうのみ、又は急
激な強い回転のみでも十分である。必要とする強い攪拌
のために適した１つの装置は、渦動型のミキサーである
。約３０秒−１０分間の間、渦動させると、脂質／浴媒
／水性調合物の適当な乳化が行われる。普通の場合、３
分間の渦動が行われる。超音波処理は、多くの巨大分子
、特にＤＮＡやＲＮＡ（１）ようなポリヌクレオチド及
び蛋白質のようなポリペプチドの構造の分解を起こすた
め、望丑しくない。
実質的に乳化させるのに十分な時間の間、調合物を急激
に回転させ゛、同時に振とうさせることが含まれている
。この目的のためには、急激な強い振とうのみ、又は急
激な強い回転のみでも十分である。必要とする強い攪拌
のために適した１つの装置は、渦動型のミキサーである
。約３０秒−１０分間の間、渦動させると、脂質／浴媒
／水性調合物の適当な乳化が行われる。普通の場合、３
分間の渦動が行われる。超音波処理は、多くの巨大分子
、特にＤＮＡやＲＮＡ（１）ようなポリヌクレオチド及
び蛋白質のようなポリペプチドの構造の分解を起こすた
め、望丑しくない。
調合物を乳化させるために十分な攪拌を行ったのち、溶
媒は好ましくは３７℃以下の生理学的温度で調合物から
除去される。Ｄ Ｎ Ａ、 ＲＮＡ。
媒は好ましくは３７℃以下の生理学的温度で調合物から
除去される。Ｄ Ｎ Ａ、 ＲＮＡ。
多糖類及びポリペプチドのような大部分の生物学的な分
子は３７℃では実質的な分解奮起さないため、この温度
が好ましいが、封入きれる分子の耐熱性によｐ、又は比
較的に影響が小さいが、脂質混合物の粘性、用いられる
脂質に対する最適な相移行条件及び細胞のリポソーム吸
収のための最適な温度により、その温度は上昇させるこ
とができる。最適な場合、溶媒は窒素のような不活性ガ
スキャリアの下で負の圧力好ましくは約−１２インチ水
銀（３０４ｍＨｇ）で除去される。
子は３７℃では実質的な分解奮起さないため、この温度
が好ましいが、封入きれる分子の耐熱性によｐ、又は比
較的に影響が小さいが、脂質混合物の粘性、用いられる
脂質に対する最適な相移行条件及び細胞のリポソーム吸
収のための最適な温度により、その温度は上昇させるこ
とができる。最適な場合、溶媒は窒素のような不活性ガ
スキャリアの下で負の圧力好ましくは約−１２インチ水
銀（３０４ｍＨｇ）で除去される。
上記に概述したようにして得られたリポソームは、植物
原形質体のような浸透的に脆い細胞を転換させるために
直接に用いられるか、又は精製工程にかけられる。一般
に精製は、分析用の遠心分離、クロマトグラフィ又は透
析法によシ行われる。またリポソームは電気泳動法によ
り荷電に応じて選択されうる。精製は、例えば遠心分離
機の試験管中で蔗糖又は蔗糖／オスモチカムの上にリポ
ソーム調合物を積層し、リポソーム調合物を遠心分＃機
中で適当な速度で適当な時間回転させて所望のリポソー
ム成分を選択させることにより、行われる。かなシう壕
くい〈１つの方法では、リポソームは遠心分離機の試験
管の底部で約０．４−０．８Ｍの濃度をもつ蔗糖溶液中
に再懸濁させられた。約０．２−０．４Ｍの濃度をもつ
蔗糖とオスモチカム好箇しくは約ｏ、ｘ−ｏ、４Ｍの濃
度ケもつマンニットとの層がその再懸濁されたリポソー
ムの上に設けられる。好′ましくば、蔗糖／オスモチカ
ム溶液は０．３Ｍの蔗糖と０．１Ｍのマンニットとから
なる。
原形質体のような浸透的に脆い細胞を転換させるために
直接に用いられるか、又は精製工程にかけられる。一般
に精製は、分析用の遠心分離、クロマトグラフィ又は透
析法によシ行われる。またリポソームは電気泳動法によ
り荷電に応じて選択されうる。精製は、例えば遠心分離
機の試験管中で蔗糖又は蔗糖／オスモチカムの上にリポ
ソーム調合物を積層し、リポソーム調合物を遠心分＃機
中で適当な速度で適当な時間回転させて所望のリポソー
ム成分を選択させることにより、行われる。かなシう壕
くい〈１つの方法では、リポソームは遠心分離機の試験
管の底部で約０．４−０．８Ｍの濃度をもつ蔗糖溶液中
に再懸濁させられた。約０．２−０．４Ｍの濃度をもつ
蔗糖とオスモチカム好箇しくは約ｏ、ｘ−ｏ、４Ｍの濃
度ケもつマンニットとの層がその再懸濁されたリポソー
ムの上に設けられる。好′ましくば、蔗糖／オスモチカ
ム溶液は０．３Ｍの蔗糖と０．１Ｍのマンニットとから
なる。
試験管は、約４０分間約１００．ＯＯＱ回（ｘｇ ］の
割合で遠心分離され、その結果、試験管の上部に浮遊し
たリポソームが集められる。
割合で遠心分離され、その結果、試験管の上部に浮遊し
たリポソームが集められる。
特別な特性をもつリポソームを同定し、その同定された
リポソームを単離するために他の方法も利用されうる。
リポソームを単離するために他の方法も利用されうる。
例えば、大きな孔のゲルを用いた排除クロマトグラフィ
やアガロースビーズ全開いた薄層クロマトグラフィは、
リポソーム調合物の大きさの分布全測定するための周知
の方法である。（Ｖａｎ Ｒｅｎ５ｖｏｕｄｅ他（］、
９８０１ 。
やアガロースビーズ全開いた薄層クロマトグラフィは、
リポソーム調合物の大きさの分布全測定するための周知
の方法である。（Ｖａｎ Ｒｅｎ５ｖｏｕｄｅ他（］、
９８０１ 。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｂｙａ、 Ａｃｔａ、 ５９
５ ： １５０−リポソーム調合物は、精製されていて
も又は未精製のま＼でも、次いで転換される細胞と接Ｍ
）させられる。一般にこの工程では、浸透的に脆い任意
の細胞又は転換可能なように処理された圧し俗の細胞が
用いられるが、実際的には、転換される細胞は特別な目
的と特性の組合せに応じて選択される。すなわち、例え
ば動物＃ｌ胞が選択される。例えば転換された酵母細胞
が最終的に発酵、醸造又はクローニング工程に用いられ
る予定である場合には、スフェロプラストをつくるよう
に酵素的又は耐生物的に変性された酵母細胞が接触させ
られる。塩化カルシウム溶液を用いたり、又はバクテリ
ア細胞を転換可能にする他の方法を用いたシして予備処
理されたバクテリア原形質体やバクテリア細胞は、例え
ばアミノ酸製造、ホルモン製造、クローニング等のよう
な種々な目的のために用いられる。
５ ： １５０−リポソーム調合物は、精製されていて
も又は未精製のま＼でも、次いで転換される細胞と接Ｍ
）させられる。一般にこの工程では、浸透的に脆い任意
の細胞又は転換可能なように処理された圧し俗の細胞が
用いられるが、実際的には、転換される細胞は特別な目
的と特性の組合せに応じて選択される。すなわち、例え
ば動物＃ｌ胞が選択される。例えば転換された酵母細胞
が最終的に発酵、醸造又はクローニング工程に用いられ
る予定である場合には、スフェロプラストをつくるよう
に酵素的又は耐生物的に変性された酵母細胞が接触させ
られる。塩化カルシウム溶液を用いたり、又はバクテリ
ア細胞を転換可能にする他の方法を用いたシして予備処
理されたバクテリア原形質体やバクテリア細胞は、例え
ばアミノ酸製造、ホルモン製造、クローニング等のよう
な種々な目的のために用いられる。
当該分野における当業者にとって周知である種々の方法
によシつくらｉ′した植物細胞の原形質体は、前記した
方法でつくられた外因性ＤＮＡを含有するリボンーノ・
を用いて縁シ返し転換された。植物細胞の原形質体を転
換するための条件は変わるが、一般に植物細胞の原形質
体は、その浸透平衡全維持するように用いられる適当な
緩衝液中で維持される。このような緩衝液は、植物細胞
の培養分野においては周知のものである。その緩衝液の
１つの例は、０．４−−０．８Ｍのオスモチカム（例え
ばマンニット）と約５０−８０のｐＨで約１５０ｍＭの
塩化カルシウムを含有する５ｍＭのＴｒｉｓである。ｐ
Ｈは転換のためには約６．５であることが好廿しい。
によシつくらｉ′した植物細胞の原形質体は、前記した
方法でつくられた外因性ＤＮＡを含有するリボンーノ・
を用いて縁シ返し転換された。植物細胞の原形質体を転
換するための条件は変わるが、一般に植物細胞の原形質
体は、その浸透平衡全維持するように用いられる適当な
緩衝液中で維持される。このような緩衝液は、植物細胞
の培養分野においては周知のものである。その緩衝液の
１つの例は、０．４−−０．８Ｍのオスモチカム（例え
ばマンニット）と約５０−８０のｐＨで約１５０ｍＭの
塩化カルシウムを含有する５ｍＭのＴｒｉｓである。ｐ
Ｈは転換のためには約６．５であることが好廿しい。
リポソームを用いた転換は、緩衝液のサンプルと植物細
胞の原形質体に、分子量が約１０００−２００００ダル
トンで、濃度が全ヤンプルに対して約１０−４０％体積
／体積（Ｖ／Ｖ ）のＰＥＧを添加することによシ、容
易に行われる。
胞の原形質体に、分子量が約１０００−２００００ダル
トンで、濃度が全ヤンプルに対して約１０−４０％体積
／体積（Ｖ／Ｖ ）のＰＥＧを添加することによシ、容
易に行われる。
約１０００−６０００ダルトンの分子量をもっＰＥＧが
特に好適である。また分子量が約４０００ダルトンで濃
度が全サンゾルに対して約２０％Ｖ／ＶのＰＥＧが最適
であるということがわがつた。こね、まで述べられたリ
ポソーム転換システムを用いた場合、植物の原形体中に
原核細胞又は真核細胞又はそれらの混合物に出来する種
々なプラスミドを伝達することかり能であった。
特に好適である。また分子量が約４０００ダルトンで濃
度が全サンゾルに対して約２０％Ｖ／ＶのＰＥＧが最適
であるということがわがつた。こね、まで述べられたリ
ポソーム転換システムを用いた場合、植物の原形体中に
原核細胞又は真核細胞又はそれらの混合物に出来する種
々なプラスミドを伝達することかり能であった。
この方法を・用いた場合、植物の原形質体中に伝達され
るプラスミドには、Ｙｅｐ−１３ＬＴ５、大腸菌ｐ Ｂ
Ｒ３２２とｐＢＲ３’ ２７ 、及びＳＶ４０ゲノム
の一部分が含まれる。しかしなｉ・：らこれらのシラス
ミドの必ずし７も全ては安定に維持されない。
るプラスミドには、Ｙｅｐ−１３ＬＴ５、大腸菌ｐ Ｂ
Ｒ３２２とｐＢＲ３’ ２７ 、及びＳＶ４０ゲノム
の一部分が含まれる。しかしなｉ・：らこれらのシラス
ミドの必ずし７も全ては安定に維持されない。
驚くべきことには、ｐＴ３Ｒ３２７が植物細胞中で安定
に維持され、その中で安定に再生されるということがわ
かった。
に維持され、その中で安定に再生されるということがわ
かった。
本発明は、次の実施例を参照することによシ当業者にと
ってより明らかなものとなる。そして実施例は、単に典
型的なものであるように、本発明者により考えられてい
る。本発明の範囲から逸脱しないで、正確な化学濃度、
温度、処理時間、細胞の種類等を変えることが期待され
るということは、容易に明らかである。
ってより明らかなものとなる。そして実施例は、単に典
型的なものであるように、本発明者により考えられてい
る。本発明の範囲から逸脱しないで、正確な化学濃度、
温度、処理時間、細胞の種類等を変えることが期待され
るということは、容易に明らかである。
実施例１
〔負に荷電されたリポソームを用いた場合にＤＮＡの封
入効率に対する超音波処理又は機械的渦動の影響〕 １マイクロモル（μＭ）のホスファチ・ツルセリン、４
μＭ（７）コリン及び５μＭのコレステロールを含有し
た脂質混合物が、脂質／溶媒混合物をつくるために０．
５−のエーテル中に溶解させられた。３２ｐで標識され
たＤＮ’Ａを含有する緩衝水溶液が、１０ｍＭの塩化カ
リウム、１０ ｍＭのリン酸カリウム及びｐＨ６，５で
ｏ、 ｉｍＭのＥＤＴＡ中で、■−当たシ１０マイクロ
グラム（μＶ）の濃度をもつｐＢＲ３２２中に挿入され
たプラスミドＢＡＭＨ／２９から調製された。０．１５
−のこの溶液が、脂質／溶媒／水性調合物をつくるため
に脂質／溶媒混合物に加えられた。この脂質／溶媒／水
性調合物は、浴タイプの超音波処理器中で５，２０又は
１２０秒間超音波処理することによシ、又は３０゜１２
０又は６００秒間機械的に渦動することにより乳化され
た。乳化処理の後、リポソームは不活性な９素雰囲気中
で約−１２インチＨ１の減圧下にエーテルを除去するこ
とにより形成された。このようにして得られたリポソー
ムは、次に遠心分離により精製された。すなわち約０、
１．５ ｍｌのリポソームが約０．８５−の０．４Ｍ庶
蔗糖混合された。０．３Ｍの蔗糖と０．１Ｍのマンニッ
トからなる２、 ８５ ｍｌの蔗糖／オスモチカム溶液
が０．４Ｍの蔗糖／リポソーム層の上に積層さノ１．た
。次いで試験管を約４０分間、約１００，０００Ｘ？で
回転させた。精製されたリポソームは試験管の上部に浮
遊したので、それらは集められた。
入効率に対する超音波処理又は機械的渦動の影響〕 １マイクロモル（μＭ）のホスファチ・ツルセリン、４
μＭ（７）コリン及び５μＭのコレステロールを含有し
た脂質混合物が、脂質／溶媒混合物をつくるために０．
５−のエーテル中に溶解させられた。３２ｐで標識され
たＤＮ’Ａを含有する緩衝水溶液が、１０ｍＭの塩化カ
リウム、１０ ｍＭのリン酸カリウム及びｐＨ６，５で
ｏ、 ｉｍＭのＥＤＴＡ中で、■−当たシ１０マイクロ
グラム（μＶ）の濃度をもつｐＢＲ３２２中に挿入され
たプラスミドＢＡＭＨ／２９から調製された。０．１５
−のこの溶液が、脂質／溶媒／水性調合物をつくるため
に脂質／溶媒混合物に加えられた。この脂質／溶媒／水
性調合物は、浴タイプの超音波処理器中で５，２０又は
１２０秒間超音波処理することによシ、又は３０゜１２
０又は６００秒間機械的に渦動することにより乳化され
た。乳化処理の後、リポソームは不活性な９素雰囲気中
で約−１２インチＨ１の減圧下にエーテルを除去するこ
とにより形成された。このようにして得られたリポソー
ムは、次に遠心分離により精製された。すなわち約０、
１．５ ｍｌのリポソームが約０．８５−の０．４Ｍ庶
蔗糖混合された。０．３Ｍの蔗糖と０．１Ｍのマンニッ
トからなる２、 ８５ ｍｌの蔗糖／オスモチカム溶液
が０．４Ｍの蔗糖／リポソーム層の上に積層さノ１．た
。次いで試験管を約４０分間、約１００，０００Ｘ？で
回転させた。精製されたリポソームは試験管の上部に浮
遊したので、それらは集められた。
ｆ） Ｎ Ａの封入パーセントは、３２ｐを読み取るた
めにセットされた液体シンチレーション計数管中におい
て３２ｐ標識ＤＮＡを測定することにより推定された。
めにセットされた液体シンチレーション計数管中におい
て３２ｐ標識ＤＮＡを測定することにより推定された。
種々な処理の場合における封入効率が第１表に示されて
いる。渦動を行った場合の封入効率は、同じ時間（１２
０秒間）の間超音波処理を行った場合の封入効率の約６
５チであった。渦動時間を６００秒にまで増加さぜると
、超音波処理を行った場合に観測される最大割合の約７
１φに相当１−るＤＮＡ封入割合が得られた。
いる。渦動を行った場合の封入効率は、同じ時間（１２
０秒間）の間超音波処理を行った場合の封入効率の約６
５チであった。渦動時間を６００秒にまで増加さぜると
、超音波処理を行った場合に観測される最大割合の約７
１φに相当１−るＤＮＡ封入割合が得られた。
第１表
３０秒 １９ ３１ ５秒
１２０＃ ２４ ３８ ２０１６００＃
２７ ３７ １２０〃実施例 〔リポソームに封入されたＤＮＡの完全性に対する渦動
又は超音波処理の影響〕 リポソームが実施例１に記載された通シに調製された。
２７ ３７ １２０〃実施例 〔リポソームに封入されたＤＮＡの完全性に対する渦動
又は超音波処理の影響〕 リポソームが実施例１に記載された通シに調製された。
リポソームが調製されたのち、精製されたリポンーム調
合物を各々約３０μを含む杼品が０．２５−人のマイク
ロ試験管中に入れられた。０．１−のフェノールが加え
られ、完全にリポソーム標品と混合されたのち、３０秒
間遠心分離された。フェノール抽出の後に残った水性懸
濁液２０ ｔｔＬが、１０ｍＭのＴＲｌ５゜ｐＨ１３で
１ｍＭのＥＤＴＡ緩衝液中においで１．４％アガローズ
ダルに対するダル電気泳動のために取シ出された。この
サンプルは約２．５時間１５０？ルトで処理された。サ
ンプルの前端は、そのゲルの各サンプル槽に加えられた
青色トレーサ染料の５０％グリセリン溶液でもって決定
された。ＤＮＡ成分は紫外線光（ＵＶ）の下において臭
化エチジウムで処理することにょシ目に見えるようにさ
れた。未処理ＤＮＡとＤＮＡサイズ標準は、同じ時間の
間グルの上で処理された。渦動されたサンプルと未処理
のプラスミドＤＮＡとの間では、目立った差異が観察さ
れなかった。超音波処理された全てのサンプルのＤＮＡ
が不規則な長さの断片になるまで広範囲にわたって開裂
したことは、識別しうる移行ピークを少しももたない長
いＤＮＡ塗抹によって明らかとなった。
合物を各々約３０μを含む杼品が０．２５−人のマイク
ロ試験管中に入れられた。０．１−のフェノールが加え
られ、完全にリポソーム標品と混合されたのち、３０秒
間遠心分離された。フェノール抽出の後に残った水性懸
濁液２０ ｔｔＬが、１０ｍＭのＴＲｌ５゜ｐＨ１３で
１ｍＭのＥＤＴＡ緩衝液中においで１．４％アガローズ
ダルに対するダル電気泳動のために取シ出された。この
サンプルは約２．５時間１５０？ルトで処理された。サ
ンプルの前端は、そのゲルの各サンプル槽に加えられた
青色トレーサ染料の５０％グリセリン溶液でもって決定
された。ＤＮＡ成分は紫外線光（ＵＶ）の下において臭
化エチジウムで処理することにょシ目に見えるようにさ
れた。未処理ＤＮＡとＤＮＡサイズ標準は、同じ時間の
間グルの上で処理された。渦動されたサンプルと未処理
のプラスミドＤＮＡとの間では、目立った差異が観察さ
れなかった。超音波処理された全てのサンプルのＤＮＡ
が不規則な長さの断片になるまで広範囲にわたって開裂
したことは、識別しうる移行ピークを少しももたない長
いＤＮＡ塗抹によって明らかとなった。
実施例３
〔リポソームで媒介されるグラスミドｐＢＲ３２７のト
ウモロコシ原形質体への伝達〕トウモロコシの原形質体
が次のようにして準備された。すなわちトウモロコン懸
濁細胞が、７０回／分で回転する回転式培養器上のフラ
スコ中において、０．２Ｍのマンニラ）、０．０８Ｍの
ＣａＯ右、５％（Ｖ／Ｖ）のセルリシン（ｃａｚ式会社
）中、１６℃で４−６時間培養された・。−１臨床用の
遠心分離機中で２分ＩＨＩ低速で遠心分離することによ
シ、トウモロコシの原形質体が集められた。トウモロコ
シの原形質体は、０．４Ｍノマンニット、］、ＯｍＭ
のＫＣｌ 及びｐＨ６，５で１０ｍＭの２−（Ｎ−モル
ホリノ）エタンスルホン酸（Ｍ Ｅ Ｓ ） ／ Ｔ
ｒ ｉ ａ中で２回洗浄されたのち、０．４Ｍのマンニ
ット緩衝液中で１−当たシｌＸｌ０’個の原形質体を含
む状態で再び懸濁された。
ウモロコシ原形質体への伝達〕トウモロコシの原形質体
が次のようにして準備された。すなわちトウモロコン懸
濁細胞が、７０回／分で回転する回転式培養器上のフラ
スコ中において、０．２Ｍのマンニラ）、０．０８Ｍの
ＣａＯ右、５％（Ｖ／Ｖ）のセルリシン（ｃａｚ式会社
）中、１６℃で４−６時間培養された・。−１臨床用の
遠心分離機中で２分ＩＨＩ低速で遠心分離することによ
シ、トウモロコシの原形質体が集められた。トウモロコ
シの原形質体は、０．４Ｍノマンニット、］、ＯｍＭ
のＫＣｌ 及びｐＨ６，５で１０ｍＭの２−（Ｎ−モル
ホリノ）エタンスルホン酸（Ｍ Ｅ Ｓ ） ／ Ｔ
ｒ ｉ ａ中で２回洗浄されたのち、０．４Ｍのマンニ
ット緩衝液中で１−当たシｌＸｌ０’個の原形質体を含
む状態で再び懸濁された。
リポソームは次のようにしてつくられた。すなわち、０
．８！ｍｆのＰＳ、３．１ＲＩのｐｃ。
．８！ｍｆのＰＳ、３．１ＲＩのｐｃ。
１．９■のＣＨ及び２５μｍのα−トコフェロールがク
ロロホルム中で混合させられたのち、減圧蒸発によ）ク
ロロホルムが除去きれた。最終体積が約０．５ ｄにな
るように、０．５ＲＩのエーテルがその脂質に加えられ
た。プラスミドｐＢＲ３２７からのＤＮＡは、３２ｐで
標識された状態又は標識されないま＼で、’１０ｍＭの
Ｔｒｉｓ、ｐＨ８，０で１．ｍＭのＥＤＴＡを含有する
緩衝水溶液中で１〜／ゴの濃度になるように懸濁させら
れた。２５μｔのＤＮＡ含有の緩衝水溶液が脂質／−Ｉ
ニーチル混合物に加えられた。最終のソルビットの濃度
が０，４Ｍに、脂質／溶媒／水性調合物を形成する最終
の水性成分体積が０１５ｍ１になるように、水とソルビ
ットとがこの混合物に加えられた。この脂質／溶媒／水
性調合物ｄ、約３分間渦動された。渦動の後に、エーテ
ルが窒素界囲気下、３７℃、−１２インチＨ２（３０４
，８ｍｍＨｆ ）で回転式蒸発器中で蒸発させられた。
ロロホルム中で混合させられたのち、減圧蒸発によ）ク
ロロホルムが除去きれた。最終体積が約０．５ ｄにな
るように、０．５ＲＩのエーテルがその脂質に加えられ
た。プラスミドｐＢＲ３２７からのＤＮＡは、３２ｐで
標識された状態又は標識されないま＼で、’１０ｍＭの
Ｔｒｉｓ、ｐＨ８，０で１．ｍＭのＥＤＴＡを含有する
緩衝水溶液中で１〜／ゴの濃度になるように懸濁させら
れた。２５μｔのＤＮＡ含有の緩衝水溶液が脂質／−Ｉ
ニーチル混合物に加えられた。最終のソルビットの濃度
が０，４Ｍに、脂質／溶媒／水性調合物を形成する最終
の水性成分体積が０１５ｍ１になるように、水とソルビ
ットとがこの混合物に加えられた。この脂質／溶媒／水
性調合物ｄ、約３分間渦動された。渦動の後に、エーテ
ルが窒素界囲気下、３７℃、−１２インチＨ２（３０４
，８ｍｍＨｆ ）で回転式蒸発器中で蒸発させられた。
このエーテル蒸発工程の間に、リポソームが形成し７た
。最終体積が１−になるように、０．１５ｍｊ！の粗製
リポソームが遠心分離様の試験管中で０．８５ｒｎｌの
０．４ Ｍ蔗糖中に懸濁させることによシ精製された。
。最終体積が１−になるように、０．１５ｍｊ！の粗製
リポソームが遠心分離様の試験管中で０．８５ｒｎｌの
０．４ Ｍ蔗糖中に懸濁させることによシ精製された。
す２」？ノー蔗糖庶糖混合ｑ勿は２．８５ ｙｍの０．
３ Ｍ蔗糖／ ０．１ Ｍ ？ ン＝ ットでもって積
層された。試験管は、２０℃で４０分間、約１００，０
ＯＯｘｆ／で回転させられ７辷。上部に浮遊したリポソ
ームが精製すれ７”ｔＣ’）ポソーム調合物であり、そ
れはトウモロコシ原形質体との培養のために取り出され
た。
３ Ｍ蔗糖／ ０．１ Ｍ ？ ン＝ ットでもって積
層された。試験管は、２０℃で４０分間、約１００，０
ＯＯｘｆ／で回転させられ７辷。上部に浮遊したリポソ
ームが精製すれ７”ｔＣ’）ポソーム調合物であり、そ
れはトウモロコシ原形質体との培養のために取り出され
た。
１ｍ１１当り９１ Ｘ １０“個のトウモロコシＬａ
形質体を含有する約１７のトウモロコシ原形質体１０．
４Ｍマンニット緩衝液が、１ゴ当たシ約０゜９５ ｒａ
ｙの脂Ｘを含有する０、 １−の精製されたリポソーム
調合物でもって培養された。最終の濃度が約２０チにな
るように、ＰＥＧ４０００がこの混合物に加えらＪ′Ｌ
７’Ｃ，ｌ） ＞ｊｅソーム／原形質体／ＰＥＧ混合物
は約１５分間２５℃で培養された。
形質体を含有する約１７のトウモロコシ原形質体１０．
４Ｍマンニット緩衝液が、１ゴ当たシ約０゜９５ ｒａ
ｙの脂Ｘを含有する０、 １−の精製されたリポソーム
調合物でもって培養された。最終の濃度が約２０チにな
るように、ＰＥＧ４０００がこの混合物に加えらＪ′Ｌ
７’Ｃ，ｌ） ＞ｊｅソーム／原形質体／ＰＥＧ混合物
は約１５分間２５℃で培養された。
リポソーム／原形質体／ Ｐ Ｅ Ｇ混合物は、最終の
体積が約１０−になるまで、徐々に段階的に０．４Ｍの
マンニット緩衝液でもって稀釈されれ。稀釈された調合
物は、低速の臨土用遠心分離機の上で２分間、約１００
ｘｙで遠心分流された。上澄み液１ｃＬ除去され、次
いでトウモロコシ原形質体は８ゴの０．４ Ｍマンニッ
ト緩衝液中で再び懸濁させられ、前記した通り再び遠心
分離にかけられ、成長培養基中で再び懸濁させられた。
体積が約１０−になるまで、徐々に段階的に０．４Ｍの
マンニット緩衝液でもって稀釈されれ。稀釈された調合
物は、低速の臨土用遠心分離機の上で２分間、約１００
ｘｙで遠心分流された。上澄み液１ｃＬ除去され、次
いでトウモロコシ原形質体は８ゴの０．４ Ｍマンニッ
ト緩衝液中で再び懸濁させられ、前記した通り再び遠心
分離にかけられ、成長培養基中で再び懸濁させられた。
１ｔの成長培養基には、１７０ｒｑの１塩基性リン酸カ
リウム、１６００７ｎｇの硝酸アンモニウム、１９００
７ｆｌｐの硝酸カリウム、４４０■の塩化カルシウム２
水和物、３７０〜の％１ｆｆｌｆｆマグネシウム７水和
物、１６．９ｑ＋の硫酸マンガン１水和物、１０．３グ
の硫酸亜＠１水和物、６．２■のホウ酸、３．８３℃グ
のヨウ化カリウム、０．２５ ｍｇのモリブデン酸ナト
リウム、０．０２５ｍ９の硫酸第２銅、０．０２５１ｎ
ｙの塩化コバルト、５■のニコチン酸、１０ｍＶのチア
ミン塩酸塩、１０■のピリドキシン塩酸塩、１００ηの
ｌ−イノジット、２．ＯＦ２の２．４−ジクロロフェノ
キシ酢酸、２０２の蔗糖、２５０■のダルコース、６４
１のマンニット及び０．１％の寒天が含まれている。そ
の培養基のｐＨは、５．０に調節された。上記した媒質
からなるコンディショニングされた培養基は、その中で
トウモロコシ原形質体が最初２−４日間成長させられ、
取り出されたのち、最終の濃度が約２０％になるまで、
成長培養基に加えられた。トウモロコシ原形質体は、上
記の培養基を含有するプレート中、成長が行われるのに
十分な時間の間、暗所で、２８−３０℃の温度で成長さ
せられた。
リウム、１６００７ｎｇの硝酸アンモニウム、１９００
７ｆｌｐの硝酸カリウム、４４０■の塩化カルシウム２
水和物、３７０〜の％１ｆｆｌｆｆマグネシウム７水和
物、１６．９ｑ＋の硫酸マンガン１水和物、１０．３グ
の硫酸亜＠１水和物、６．２■のホウ酸、３．８３℃グ
のヨウ化カリウム、０．２５ ｍｇのモリブデン酸ナト
リウム、０．０２５ｍ９の硫酸第２銅、０．０２５１ｎ
ｙの塩化コバルト、５■のニコチン酸、１０ｍＶのチア
ミン塩酸塩、１０■のピリドキシン塩酸塩、１００ηの
ｌ−イノジット、２．ＯＦ２の２．４−ジクロロフェノ
キシ酢酸、２０２の蔗糖、２５０■のダルコース、６４
１のマンニット及び０．１％の寒天が含まれている。そ
の培養基のｐＨは、５．０に調節された。上記した媒質
からなるコンディショニングされた培養基は、その中で
トウモロコシ原形質体が最初２−４日間成長させられ、
取り出されたのち、最終の濃度が約２０％になるまで、
成長培養基に加えられた。トウモロコシ原形質体は、上
記の培養基を含有するプレート中、成長が行われるのに
十分な時間の間、暗所で、２８−３０℃の温度で成長さ
せられた。
グラスミドＤＮＡは、２６日の成長期間の間、種々の時
に細胞から単離された。細胞は遠心分離によシ集められ
、上澄みの成長媒質は捨てられた。１０’−１０’個の
細胞が、１％のデルコシル、２０ｍＭのＥＤＴＡ、５０
ｍＭのＮａＣ４２５０ｍＭの蔗糖、５０ｍＭのＴｒｉｇ
を含有する０、２−の抽出用緩衝液（ｐＨｓ、ｏ）中に
、室温で約４時間、再び懸濁させられた。抽出用緩衝液
は、５０ｍＭのＴｒｉ８．５０ ｍＭの塩化ナトリウム
、２ｍｌのＥＤＴＡ及び１ ｍＭのβ−メルカゾトエタ
ノールで飽和されＡ ０．５−のフェノール（ｐＨ７，
５）で２回洗浄された。ＤＮＡはエタノールで沈澱化さ
れ、−日夜−２０℃で保存された。ＤＮＡペレットは洗
浄され、９５条のエタノール中に再び懸濁させられ、空
気で乾燥させられたのち、最後に塩化ナトリウム／クエ
ン酸ナトリウム緩衝液中に再び溶解させられた。
に細胞から単離された。細胞は遠心分離によシ集められ
、上澄みの成長媒質は捨てられた。１０’−１０’個の
細胞が、１％のデルコシル、２０ｍＭのＥＤＴＡ、５０
ｍＭのＮａＣ４２５０ｍＭの蔗糖、５０ｍＭのＴｒｉｇ
を含有する０、２−の抽出用緩衝液（ｐＨｓ、ｏ）中に
、室温で約４時間、再び懸濁させられた。抽出用緩衝液
は、５０ｍＭのＴｒｉ８．５０ ｍＭの塩化ナトリウム
、２ｍｌのＥＤＴＡ及び１ ｍＭのβ−メルカゾトエタ
ノールで飽和されＡ ０．５−のフェノール（ｐＨ７，
５）で２回洗浄された。ＤＮＡはエタノールで沈澱化さ
れ、−日夜−２０℃で保存された。ＤＮＡペレットは洗
浄され、９５条のエタノール中に再び懸濁させられ、空
気で乾燥させられたのち、最後に塩化ナトリウム／クエ
ン酸ナトリウム緩衝液中に再び溶解させられた。
この精製されたＤＮＡ調合物の標品は、当該分野におけ
る当業者にとって周知である方法を用いて、大腸菌を転
換させるのに用いられた。
る当業者にとって周知である方法を用いて、大腸菌を転
換させるのに用いられた。
大腸菌細胞、の転換および転換細胞のその後の成長の後
に、そのプラスミドは培養された大腸菌細胞から再び単
離された。再び単離されたプラスミドＤＮＡは限定酵素
で消化され、比較のために植物細胞から既に単離された
プラスミドＤＮ Ａと並べて電気泳動された。
に、そのプラスミドは培養された大腸菌細胞から再び単
離された。再び単離されたプラスミドＤＮＡは限定酵素
で消化され、比較のために植物細胞から既に単離された
プラスミドＤＮ Ａと並べて電気泳動された。
ｆＩｒＥ物細胞小細胞離されたＤＮＡは１．４チのアガ
ローズｒルの上で電気泳動により溶解された。
ローズｒルの上で電気泳動により溶解された。
ＤＮＡはサザーンプロット法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｔ
ｏｔｒｎ ｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ） ヲ用いてニトロセ
ルロースの上にプロットさｔ”Ｌ−ｚ ｐ Ｂ Ｒ３
２７ノ３２ ｐ標識Ｄ Ｎ Ａプローグとハイグリッド
を形成させた。その結果得られたフィルターはコダック
Ｘ−オマットフイルム′上で放射線像撮影を行なった。
ｏｔｒｎ ｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ） ヲ用いてニトロセ
ルロースの上にプロットさｔ”Ｌ−ｚ ｐ Ｂ Ｒ３
２７ノ３２ ｐ標識Ｄ Ｎ Ａプローグとハイグリッド
を形成させた。その結果得られたフィルターはコダック
Ｘ−オマットフイルム′上で放射線像撮影を行なった。
植物原形質体又は大腸菌から単離されたｐＢＲ３２７Ｄ
ＮＡとｐＢＲ３２７標準との間には、少しの差異もみら
れなかった。薄いたことＫは、トウモロコシ原形質体の
培養時間全増加させるにつれて、ｐＢＲ３２７ＤＮＡの
バンドの強度が増加した。これは、ｐＢＲ３２７プラス
ミドカトウモロコシ細胞の培養内で再生したということ
を示している。
ＮＡとｐＢＲ３２７標準との間には、少しの差異もみら
れなかった。薄いたことＫは、トウモロコシ原形質体の
培養時間全増加させるにつれて、ｐＢＲ３２７ＤＮＡの
バンドの強度が増加した。これは、ｐＢＲ３２７プラス
ミドカトウモロコシ細胞の培養内で再生したということ
を示している。
代理人 弁理士桑原英【麩
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、細胞の細胞膜全通過して物質を伝達する方法であっ
て、（ａＪ適描な脂質混合物を供給し、（ｂ）この脂質
混合物を水と混和性の溶媒中に溶解させ、（ｃｌこの溶
解された脂質／溶媒混合物に上記物質の水溶液を添加す
ることにより、脂質／溶媒／水溶液の調合物を形成させ
、（ｄ）この形成された脂質／溶媒／水溶液の調合物を
上記物質に対して非破壊的な手段によシ直ちに混合させ
、（ｅ） リポソームを形成するように上記溶媒を除去
し、最後に（ｇｌ適当な緩衝液中で細胞をこの得られた
リポソームと接触させることからなることを特徴とする
方法。 ２、 上記の溶媒が物質に対して非破壊的な条件下で蒸
発しつる極性の有機溶媒であることを特徴とする特許請
求の範囲第１項に記載の方法。 ３、 上記の溶媒がエチルエーテルであることを特徴と
する特許請求の範囲第２項に記載の方法。 ４、上記の溶媒を除去する工程（ｅ）が適当なガスキャ
リアーの存在下、約り７℃／１２インチ（３０４，９ｍ
ｌ Ｈｇ で蒸留することにより行われることを特
徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ５、上記の混合工程（ｄ）が超音波処理以外の混合であ
ること・を特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方
法。 ６、上記の混合工程（ｄＪが渦動であることを特徴とす
る特許請求の範囲第５項に記載の方法。 ７、 上記の適当な脂質混合物がホスファチジルセリン
、ホスファチジルコリン、シバルミチルホス７アチジル
コリン、コレステロール、ステアリルアミン及びジセチ
ルホスンエートからなる脂質の群から選ばれることを特
徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ８、上記の脂質が更にα−トコフェロールを含有するこ
とを特徴とする特許請求の範囲第７項に記載の方法。 ９、上記の脂質のモル比がホスファチジルセリン、ホス
ファチジルコリン：コレステロール：ステアリルアミン
：ジセチルホスフェートに対して各々０−１０：Ｏ−９
：０−５：０−１の範囲内であることを特徴とする特許
請求の範囲第７項に記載の方法。 １０、上記のモル比がホスファチジルセリン、ホスファ
チジルコリン：コレステロールに対して各々１：４：５
であることを特徴とする特許請求の範囲第９項に記載の
方法。 １１、上記のモル比がホスファチジルコリン：コレステ
ロールに対して各々１：１であることを特徴とする特許
請求の範囲第９項に記載の方法。 １２８上記のモル比がステアリルアミン：ホスファチジ
ルコリン：コレステロールに対して各々１：４：５であ
ることを特徴とする特許請求の範囲第９項に記載の方法
。 １３、上記のリポソームが正味の負電荷をもつことを特
徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。 １４、上記のリポソームが正味の中性電荷をもつことを
特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。 １５、上記のリポソームが正味の正電荷をもつことを特
徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。 １６、上記の伝達される物質が糖類であることを特徴と
する特許請求の範囲第１項に記載の方法。 １７、上記の伝達される物質がペプチドであることを特
徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。 １８ 上記の伝達される物質が核酸であることを特徴
とする特許請求の範囲第１項に記載の方法０ １９、上記の伝達される物質が巨大分子であることを特
徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ２０、上記の巨大分子が多糖類であることを特徴とする
特許請求の範囲第１９項に記載の方法。 ２１、上記の巨大分子がポリペプチドであることを特徴
とする特許請求の範囲第１９項に記載の方法。 ２２、上記の巨大分子がポリ核酸であることを特徴とす
る特許請求の範囲第１９項に記載の方法。 ２３、上記のポリ核酸がＲＮＡであることを特徴とする
特許請求の範囲第２２項に記載の方法。 ２４、上記のポリ核酸がＤＮＡであることを特徴とする
、％ｆｆ請求の範囲第２２項に記載の方法。 ２５、上記のポリ核酸がプラスミドであることを特徴と
する特許請求の範囲第２２項に記載の方法。 ２６、上記のプラスミドがｙＥＰ１３ＬＴ５であること
を特徴とする特許請求の範囲第２５項に記載の方法。 ２７、上記のプラスミドがｐＢＲ３２２であることを特
徴とする特許請求の範囲第２５項に記載の方法。 ２８、上記のプラスミドがｐ ＢＲ３２７であることを
特徴とする特許請求の範囲第２５項に記載の方法。 ２９、上記のプラスミドが細胞中で複製することを特徴
とする特許請求の範囲第２８項に記載の方法。 ３０、上記の核酸が媒介体であることを特徴とする特許
請求の範囲第２２項に記載の方法。 ３１、上記の媒介体がｙＥＰ１３ＬＴ５であることを特
徴とする特許請求の範囲第２２項に記載の方法。 ３２、上記の媒介体がｐＢＲ３２２であることを特徴と
する特許請求の範囲第２２項に記載の方法。 北上記の媒介体がｐＢＲ３２７であることを特徴とする
特許請求の範囲第２２項に記載の方法。 ３４、上記の媒介体が形質転換される細胞中で複製する
ことを特徴とする特許請求の範囲第３３項に記載の方法
。 ３５、上記の接触させられる細胞が原核細胞であること
を特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３６、上記の接触させられる細胞が浸透的に脆い、受容
能力のある原核細胞であることを特徴とする特許請求の
範囲第３５項に記載の方法。 ３７、上記の接触させられる細胞が浸透的に脆い真核細
胞であることｌｚｃ％徴とする、特許請求の範囲第１項
に記載の方法。 ３８、上記の接触させられる細胞が植物の原形質体であ
ることを特徴とする特許請求の範囲第３７項に記載の方
法。 ３９、上記の接触させられる細胞が酵母スフェロプラス
トであることを特徴とする特許請求の範囲第３７項に記
載の方法。 ４０ 上記の接触させられる細胞が動物の細胞である
こと全特徴とする、特許請求の範囲第３７項に記載の方
法。 ４１、上記の接触工程（ｇ）が更にｍ接触させられる細
胞を適当な緩衝液中に懸濁させ、（１１）この懸濁させ
られた細胞にリポソームを添加し、１ｌｉ）この懸濁さ
せられた細胞とリポソームを一諸に適当な温度で培養し
、０φこの培養中の懸濁させられた細胞とリポソームに
ポリエチレングリコールを添加し、（■）このリポソー
ムと細胞とを融合させるのに十分な時間、リポソームと
１８濁させられた細胞とを培養するという工程からなる
ことｋｔｒｊ徴とする、特許請求の範囲第１項に記載の
方法。 ４２、上記の接触させられる細胞が原核細胞であること
を特徴とする特許請求の範囲第４１項に記載の方法。 ４３、上記の接触させられる細胞が浸透的に脆い、受容
能力のある原核細胞であることを特徴とする特許請求の
範囲第４１項に記載の方法。 ４４、上記の接触させられる細胞が浸透的に脆い真核細
胞であることｆ：％徴とする、特許請求の範囲第４１項
に記載の方法。 ４５、上記の接触させられる細胞が植物の原形質体であ
ることを特徴とする特許請求の範囲第４４項に記載の方
法。 ４６、上記の接触させられる細胞が酵母スフエロプロス
トであることを特徴とする特許請求の範囲第４４項に記
載の方法。 ４７、上記の接触させられる細胞が動物の細胞であるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第４４項に記載の方法。 ４８、上記の培養工程が約１６〜２８℃で約５〜６０分
間行われること全特徴とする、特許請求の範囲第４１項
に記載の方法。 ４９、上記の培養工程が約２５℃で約２０分間行われる
ことを特徴とする特許請求の範囲第４１項に記載の方法
。 ５０、上記のポリエチレングリコールは約１０００−２
ｏ、ｏｏｏダルトンの分子量をもち、その濃度は全溶液
に対して約１０−４０％であることを特徴とする特許請
求の範囲第４１項に記載の方法。 ５１、上記のポリエチレングリコールは約１０００−６
０００ダルトンの分子量をもち、その最終濃度は全浴液
に対して約２０％であることを特徴とする特許ＷＲ求の
範囲第４１項に記載の方法。 ５２、上記のポリエチレングリコールは約４０００の分
子量をもつことを特徴とする特許請求の範囲第４１項に
記載の方法。 ５３、上記の適当な緩衝液が約１−５０ｍＭ の濃度を
もつ塩化カルシウム、約０．４−０．８Ｍの濃度をもつ
オスモチカム、約５ｍＭ の濃度をもつトリスＨα、及
び約５．０−８．０のｐｎからなること（ｉ−特徴とす
る、特許請求の範囲第４１項に記載の方法。 ５４、上記の適当な緩衝液が約１０ ｍＭ の塩化カル
シウム、約０．４Ｍのマンニット、約５ｒＩＩＭのトリ
スＨα及び約６．５のｐｎからなることを特徴とする特
許請求の範囲第４１１項に記載の方法。 ５５、上記の溶媒が上記物質に対して非破壊的な条件下
で蒸発しうる極性の有機溶媒であることを特徴とする特
許６１１求の範囲第１項に記載の方法。 ５６、 Ｊ１記の精製工程が更に（１）リポソームを一
定体積の蔗糖溶液中で躬懸濁させ、（１１）この蔗糖溶
液を一定体積の蔗糖／オスモチカム溶液で被覆し、（ｉ
ｌｌ） ＩＪポソームの内部に含まれない物質を分離す
るのに十分な時間、この再懸濁させられたリポソームを
遠心分離し、０ｖ）リポソームが上記の蔗糖／オスモチ
カムの表面に浮遊したのち、このリポソーム全集め、最
後にＭこのリポソームを緩衝液中に再懸濁させる。とい
う工程からなることを特徴とする特許請求の範囲第５５
項に記載の方法。 ５７、上記の蔗糖溶液が約０．４−０．８Ｍの濃度をも
ち、また上記の庶Ｎ／′オスモナカム溶液が約０．２−
０．４Ｍの蔗糖と約０．１−０．４Ｍのマンニットから
なることを特徴とする特許請求の範囲第５６駒に記載の
方法。 ５８、上記の蔗糖溶液が約０．４Ｍの濃度をもち、゛ま
た上記の蔗糖／マンニット溶液が０．３Ｍの蔗糖と０．
１Ｍのマンニットからなることに％徴とする、特許請求
の範囲第５６項に記載の方法。 ５９、上記の蔗糖溶液と蔗糖／マンニット溶液との体積
比が約１＝３であること７１苛徴とする特許請求の範囲
第、）６項に記載の方法。 ６０、上記の精製されたリポソームが接触させられる細
胞１０６個に対して約２ミクロモルのリポソーム様の脂
質を含有することを特徴とする特許請求の範囲第５６項
に記載の方法。 ６１、 （ａ）植物の細胞原形質体を成形し、（ｂ）こ
の植物の細胞原形質体をＤＮＡで形質転換させることか
らなる、植物の細胞全形質転換させる方法。 ６２、上記のＤＮＡがプラスミドであることを特徴とす
る特許請求の範囲第６１項に記載の方法。 ６３、上記のプラスミドがｐ ＢＨ３２７であることを
特徴とする特許請求の範囲第６２項に記載の方法。 ６４、上記のＤＮＡが封入されたリポソームであること
を特徴とする特許請求の範囲第６１項に記載の方法。 ６５、上記のＤＮＡは、（ａ）適凸な脂質混合物を供給
し、（ｂ）この脂質混合物を水と混和性の溶媒中で溶解
させ、ｔｅｌこの溶解された脂質／溶媒混合物にＤＮＡ
水溶液を添加することによシ、脂質′ ／溶媒／水溶液
の調合物を形成させ、（ｄｌこの形成された脂質／溶媒
／水溶液の調合物を上記のＤＮＡに対して非破壊的な手
段によシ直ちに混合させ、最後ＶＣ（ｅ）リポソームを
形成するように上記溶媒を除去する工程により、封入さ
れることを特徴とする特許請求の範囲第６４項に記載の
方法。 ６６、上記のＤＮＡがプラスミドであることを特徴とす
る特許請求の範囲第６５項に記載の方法。 ６７、上記のプラスミドがｐＢＲ３２７であることを特
徴とする特許請求の範囲第６６項に記載の方法。 ６８、 ｉ許請求の範囲第６１項に記載の方法によシ形
質転換させられた植物の細胞。 ６９、ＤＮＡがプラスミドであることを特徴とする特許
請求の範囲第６８項に記載の植物の細胞。 ７０、プラスミドがｐＢＲ３２７であることを特徴とす
る特許請求の範囲第６９項に記載の植物の細胞。 ７１、ＤＮＡが封入されたリポソームであることを特徴
とする特許請求の範囲第６８項に記載の植物の細胞。 ７２、ＤＮＡは、（、）適当な脂質混合物を供給し、（
ｂｌこの脂質混合物を水と混和性の溶媒中で溶解させ、
（Ｃ）この溶解された脂質／溶媒混合物にＤＮＡ水溶液
を添加することにより脂質／溶媒／水溶液の調合物を形
成させ、（ｄ）この形成された脂質／溶媒／水溶液の調
合物を上記のＤＮＡに対して非破壊的な手段により直ち
に混合させ、最後に（ｅ） ！Ｊポソームを形成するよ
うに上記溶媒を除去する工程によシ、封入されることを
特徴とする特許請求の範囲第７１項に記載の植物の細胞
。 ７３、ＤＮＡがプラスミドであることを特徴とする特許
請求の範囲第７２項に記載の方法。 ７４、プラスミドがｐＢＲ３２７であることを特徴とす
る特許請求の範囲第７３項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US49383583A | 1983-05-12 | 1983-05-12 | |
| US493835 | 1983-05-12 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59213392A true JPS59213392A (ja) | 1984-12-03 |
Family
ID=23961888
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59093086A Pending JPS59213392A (ja) | 1983-05-12 | 1984-05-11 | リポソ−ムで媒介される真核細胞の形質転換 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59213392A (ja) |
| KR (1) | KR840008816A (ja) |
| AU (1) | AU2793884A (ja) |
| DE (1) | DE3416978A1 (ja) |
| FR (1) | FR2545837A1 (ja) |
| GB (1) | GB2140822A (ja) |
| IL (1) | IL71797A0 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03147793A (ja) * | 1989-11-02 | 1991-06-24 | Tetsuyuki Akao | 合成２分子膜を用いた核酸の細胞内導入の方法 |
| US5552157A (en) * | 1990-08-27 | 1996-09-03 | Kabushiki Kaisha Vitamin Kenkyusya | Liposome for entrapping gene, liposomal preparation and process for the manufacture of the preparation |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3588230D1 (de) * | 1984-05-11 | 2001-09-13 | Syngenta Participations Ag | Transformation von Pflanzenerbgut |
| US5231019A (en) | 1984-05-11 | 1993-07-27 | Ciba-Geigy Corporation | Transformation of hereditary material of plants |
| FI864720A (fi) * | 1985-11-22 | 1987-05-23 | Ciba Geigy Ag | Direkt gentransmission i plasticider och mitokondrier. |
| DE3784860D1 (de) * | 1986-12-05 | 1993-04-22 | Ciba Geigy Ag | Verbessertes verfahren zur transformation von pflanzlichen protoplasten. |
| US5350689A (en) * | 1987-05-20 | 1994-09-27 | Ciba-Geigy Corporation | Zea mays plants and transgenic Zea mays plants regenerated from protoplasts or protoplast-derived cells |
| DE3936328A1 (de) * | 1989-10-27 | 1991-05-02 | Schering Ag | Pharmazeutische praeparate |
| DE4013580A1 (de) * | 1990-04-24 | 1991-10-31 | Schering Ag | Verfahren zur herstellung von wirkstoffhaltigen waessrigen liposomensuspensionen |
| US6403865B1 (en) | 1990-08-24 | 2002-06-11 | Syngenta Investment Corp. | Method of producing transgenic maize using direct transformation of commercially important genotypes |
| UA48104C2 (uk) | 1991-10-04 | 2002-08-15 | Новартіс Аг | Фрагмент днк, який містить послідовність,що кодує інсектицидний протеїн, оптимізовану для кукурудзи,фрагмент днк, який забезпечує направлену бажану для серцевини стебла експресію зв'язаного з нею структурного гена в рослині, фрагмент днк, який забезпечує специфічну для пилку експресію зв`язаного з нею структурного гена в рослині, рекомбінантна молекула днк, спосіб одержання оптимізованої для кукурудзи кодуючої послідовності інсектицидного протеїну, спосіб захисту рослин кукурудзи щонайменше від однієї комахи-шкідника |
| EP0713387B1 (en) * | 1993-08-06 | 1998-03-04 | Opperbas Holding B.V. | A method for preparation of vesicles loaded with biological structures, biopolymers and/or oligomers |
| US5739118A (en) | 1994-04-01 | 1998-04-14 | Apollon, Inc. | Compositions and methods for delivery of genetic material |
| US5962428A (en) * | 1995-03-30 | 1999-10-05 | Apollon, Inc. | Compositions and methods for delivery of genetic material |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4235871A (en) * | 1978-02-24 | 1980-11-25 | Papahadjopoulos Demetrios P | Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles |
| DE2942780A1 (de) * | 1979-10-23 | 1981-05-21 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V., 3400 Göttingen | Eukaryotische zellen, eukaryotische protoplasten und vielzellige eukaryotische lebende organismen mit einem gehalt an durch lipidvesikel eingebrachter dna, verfahren zu ihrer herstellung von gen-produkten, zur immunisierung und zur behebung genetisch bedingter defekte |
| DE3023787A1 (de) * | 1980-06-25 | 1982-01-21 | Studiengesellschaft Kohle mbH, 4330 Mülheim | Verfahren zur erhoehung der inkorporation und der expression von genetischem material in die kerne von intakten zellen mit hilfe von liposomen |
| EP0061253A3 (en) * | 1981-03-18 | 1982-12-08 | Beecham Group Plc | Process for the transfer of genetic material into actinomycete cells, prepared cells and method of culturing these cells and isolating a metabolite |
| DE3269389D1 (en) * | 1981-08-10 | 1986-04-03 | Wellcome Found | Pharmaceutical formulations containing antimony |
-
1984
- 1984-05-08 DE DE19843416978 patent/DE3416978A1/de not_active Withdrawn
- 1984-05-09 GB GB08411838A patent/GB2140822A/en not_active Withdrawn
- 1984-05-10 IL IL71797A patent/IL71797A0/xx unknown
- 1984-05-11 AU AU27938/84A patent/AU2793884A/en not_active Abandoned
- 1984-05-11 KR KR1019840002535A patent/KR840008816A/ko not_active IP Right Cessation
- 1984-05-11 FR FR8407287A patent/FR2545837A1/fr active Pending
- 1984-05-11 JP JP59093086A patent/JPS59213392A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03147793A (ja) * | 1989-11-02 | 1991-06-24 | Tetsuyuki Akao | 合成２分子膜を用いた核酸の細胞内導入の方法 |
| US5552157A (en) * | 1990-08-27 | 1996-09-03 | Kabushiki Kaisha Vitamin Kenkyusya | Liposome for entrapping gene, liposomal preparation and process for the manufacture of the preparation |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL71797A0 (en) | 1984-09-30 |
| AU2793884A (en) | 1984-11-15 |
| GB8411838D0 (en) | 1984-06-13 |
| DE3416978A1 (de) | 1984-12-06 |
| GB2140822A (en) | 1984-12-05 |
| KR840008816A (ko) | 1984-12-19 |
| FR2545837A1 (fr) | 1984-11-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPS59213392A (ja) | リポソ−ムで媒介される真核細胞の形質転換 | |
| Nakae | Outer membrane of Salmonella typhimurium: reconstitution of sucrose-permeable membrane vesicles | |
| US4394448A (en) | Method of inserting DNA into living cells | |
| Raz et al. | Biochemical, morphological, and ultrastructural studies on the uptake of liposomes by murine macrophages | |
| US4515736A (en) | Method for encapsulating materials into liposomes | |
| JP3479535B2 (ja) | リポソームの粒径を制御する方法 | |
| Mayer et al. | Uptake of antineoplastic agents into large unilamellar vesicles in response to a membrane potential | |
| Grant et al. | Fusion of phospholipid vesicles with viable Acholeplasma laidlawii | |
| US6447800B2 (en) | Method of loading preformed liposomes using ethanol | |
| CA2561247C (en) | Serum-stable amphoteric liposomes | |
| US4814270A (en) | Production of loaded vesicles | |
| JP2627899B2 (ja) | 遺伝子封入リポソームの製法 | |
| AU587600B2 (en) | Method for preserving liposomes | |
| EP0036277B1 (en) | Covalently bonded liposome-protein-compositions and method of producing them | |
| JPS61501897A (ja) | 融合リポソ−ムおよびリポソ−ムの酸誘導融合方法 | |
| Fairclough et al. | Reconstitution into liposomes of glucose active transport from the rabbit renal proximal tubule. Characteristics of the system | |
| JPS61180713A (ja) | 脂質小胞の製法およびその使用法 | |
| Abeywardena et al. | Lipid-protein interactions of reconstituted membrane-associated adenosinetriphosphatases. Use of a gel-filtration procedure to examine phospholipid-activity relationships | |
| EP2034019B1 (en) | Composition for nucleic-acid introduction | |
| ES2285271T3 (es) | Tratamiento de levaduras. | |
| Sharom et al. | Reconstitution of membrane transporters | |
| Ostro et al. | Parameters affecting the liposome-mediated insertion of RNA into eucaryotic cells in vitro | |
| Bramhall | Conductance routes for protons across membrane barriers | |
| Unden et al. | Structural properties of the proteoliposomes catalyzing electron transport from formate to fumarate | |
| Lelkes et al. | Liposome-mediated transfer of macromolecules into flagellated cell envelopes from bacteria |