ES2285271T3 - Tratamiento de levaduras. - Google Patents

Abstract

Un liposoma para fusionarse con una célula de levadura, el liposoma está caracterizado porque el 40-50% molar de la bicapa de lípido del liposoma es fosfatidil-colina (PC), el 10-20% molar de la bicapa de lípido del liposoma es un anfífilo catiónico, aproximadamente un 10% molar de la bicapa de lípido del liposoma es un esterol y aproximadamente un 30% molar de la bicapa de lípido del liposoma es fosfatidil-etanolamina (PE) y/o dioleilfosfatidil-etanolamina (DOPE).

Description

Tratamiento de levaduras.

Ámbito de la invención

La invención se refiere a liposomas para la introducción de una molécula dentro de una célula de levadura y a un proceso para obtener células de levadura, que consiste en introducir una molécula exógena.

Antecedentes de la invención

Las especies de levadura, como las de los géneros Kluyveromyces y Saccharomyces, tienen un gran número de utilidades en las industrias alimentaria y cervecera, por ejemplo para proporcionar productos de fermentación y para proporcionar intensificadores de sabor.

Existe demanda de cepas de levadura nuevas y mejoradas en estas industria y actualmente estas cepas se obtienen ya sea por cultivo y selección de una cepa de un fenotipo particular, ya sea utilizando la tecnología de DNA recombinante para introducir uno o más genes en una célula con el fin de obtener un fenotipo particular. Aunque tales procesos sean útiles para generar cepas de levadura, hay ciertas limitaciones que afectan a la idoneidad de estos procesos para este fin. Por ejemplo, el cultivo y la selección de una cepa con arreglo a un fenotipo particular es una labor que requiere dedicación de tiempo, es cara y no permite crear el fenotipo deseado. La tecnología del DNA recombinante permite crear un fenotipo, pero las células de levadura producidas por estas tecnología se reconocen típicamente como organismos modificados genéticamente y esto conlleva a menudo consecuencias perjudiciales para los productos que se obtienen a partir de tales organismos.

A menudo, el factor crítico para obtener la función efectora deseada y, con ello, el fenotipo útil en una nueva cepa de levadura es la acción de una o más macromoléculas, por ejemplo proteínas. Por consiguiente sería ventajoso que se pudieran transfectar, en otras palabras introducir macromoléculas del tipo proteínas en una célula de levadura para obtener el fenotipo deseado, porque esto permitiría evitar las limitaciones de las técnicas de cultivo y selección y también las técnicas basadas en la tecnología del DNA recombinante.

Una manera de transfectar macromoléculas, por ejemplo proteínas, en células consiste en el uso de liposomas. Un liposoma es una estructura que contiene una o más esferas concéntricas de una bicapa de lípido, que incluye un compartimento acuoso. Hasta el momento no ha sido posible generar un liposoma que sea capaz de transfectar una macromolécula, por ejemplo una enzima activa, en una célula de levadura.

Los agentes o intensificadores de sabor, en especial los ribonucleótidos y el glutamato monosódico se producen de modo típico a partir de células de levadura según el procedimiento siguiente. En primer lugar se lisan las células de levadura para liberar una o más fracciones que contengan el RNA. En segundo lugar se ponen en contacto las fracciones que contienen el RNA con la 5'-fosfodiesterasa para producir ribonucleótidos. Finalmente se calienta las fracciones para evitar la posterior degradación de los ribonucleótidos. Estos procesos suelen ser caros, requieren mucha dedicación de tiempo y habilidad técnica y es notorio que dan lugar a productos que tienen un valor bajo en el mercado.

Además, los ribonucleótidos se utilizan de modo conveniente como intensificadores de sabor por adición de nucleótidos como ingrediente a una mezcla destinada a la fabricación de un alimento o de un producto alimentario. Un inconveniente de ello es que en algunas circunstancias, el ribonucleótido tiene que declararse con una etiqueta de aditivo para el producto alimentario. Esto tiene consecuencias en el valor de mercado del producto alimentario.

En vista de lo anterior, existe la necesidad de mejorar las células de levadura, incluidas las células de levadura destinadas a proporcionar intensificadores de sabor.

Resumen de la invención

La invención busca por lo menos minimizar uno o más de los problemas o limitaciones recién descritos para obtener mejoras en las células de levadura, en especial células de levadura destinadas a intensificadores de sabor.

En un aspecto, la invención proporciona un liposoma para fusionarlo con una célula de levadura. Este liposoma se caracteriza porque un 40-50% molar de la bicapa de lípido del liposoma es fosfatidil-colina (PC), un 10-20% molar de la bicapa de lípido del liposoma es un anfífilo catiónico, aprox. un 10% molar de la bicapa de lípido del liposoma es un esterol y aprox. un 30% molar de la bicapa de lípido del liposoma es la fosfatidil-etanolamina (PE) y/o la dioleilfosfatidil-etanolamina (DOPE).

Aquí se describe un proceso para la obtención de una célula de levadura para su fusión con un liposoma. El proceso consiste en tratar la célula de levadura para formar un esferoplasto o protoplasto de célula de levadura.

Se describe aquí un proceso para introducir una molécula exógena dentro de una célula de levadura. El proceso consiste en poner en contacto un esferoplasto o un protoplasto de célula de levadura con un liposoma que contiene una molécula exógena en condiciones que permitan al esferoplasto o al protoplasto la recepción del liposoma. El liposoma empleado en este proceso es el que se ha descrito antes.

En otro aspecto, la invención proporciona un proceso para producir una célula de levadura que contenga una molécula exógena. El proceso consiste en poner en contacto un esferoplasto o protoplasto de célula de levadura con la molécula exógena en condiciones que permitan que el esferoplasto o el protoplasto reciban al liposoma. El liposoma utilizado en este proceso es el que se ha descrito antes.

Aquí se describe una célula de levadura producida por el proceso recién descrito, así como el uso de una célula de levadura, recién descrita, para producir un alimento, un producto alimentario, un aditivo o un ingrediente para fabricar un alimento o un producto alimentario.

En otro aspecto, la invención proporciona un liposoma capaz de fusionarse con una célula de levadura. El liposoma se caracteriza porque un 40-50% molar de la bicapa de lípido del liposoma es PC, un 10-20% molar de la bicapa de lípido del liposoma es el 1,2-dioleil-sn-glicero-3-trimetilamonio-propano (DOTAP), aprox. un 10% molar de la bicapa de lípido del liposoma es ergosterol y aprox. un 30% molar de la bicapa de lípido del liposoma es PE y/o DOPE. El liposoma contiene además una 5'-fosfodiesterasa para hidrolizar la molécula de RNA y formar un ribonucleótido en la célula de levadura.

En otro aspecto, la invención proporciona un liposoma capaz de fusionarse con una célula de levadura. El liposoma se caracteriza porque un 40-50% molar de la bicapa de lípido del liposoma es PC, un 10-20% molar de la bicapa de lípido del liposoma es el (DOTAP), aprox. un 10% molar de la bicapa de lípido del liposoma es ergosterol y aprox. un 30% molar de la bicapa de lípido del liposoma es PE y/o DOPE. El liposoma contiene además una 5'-adenildesaminasa para desaminar el adenilato y formar un nucleótido de 5'-inosina-fosfato.

Se describe aquí un proceso para producir un liposoma que contenga una enzima, ya descrita antes. El proceso consiste en obtener una dispersión de PC, de DOPE y/o de PE, de ergosterol y de DOTAP en un disolvente orgánico, secar la dispersión para formar lípidos secos y redispersar los lípidos secos en un medio que contenga la enzima para formar un liposoma.

En otro aspecto, la invención proporciona un proceso para producir una célula de levadura que contenga una 5'-fosfodiesterasa para hidrolizar una molécula de RNA y formar un ribonucleótido. El proceso consiste en poner en contacto un esferoplasto o protoplasto de célula de levadura con un liposoma que contenga una enzima, ya descrita antes, que permita que el esferoplasto o el protoplasto reciban al liposoma.

Aquí se describe una célula de levadura que contiene una 5'-fosfodiesterasa que hidroliza a una molécula de RNA para formar un ribonucleótido. La célula de levadura es un producto del proceso recién descrito.

En otro aspecto, la invención proporciona un proceso para producir una célula de levadura que contiene una 5'-adenildesaminasa para desaminar el adenilato y formar un nucleótido de 5'-inosina-fosfato. El proceso consiste en poner en contacto esferoplasto protoplasto de célula de levadura con un liposoma que contiene una enzima, ya descrita antes, para permitir que el esferoplasto o el protoplasto reciban al liposoma.

Aquí se describe una célula de levadura que contiene la 5'-adenildesaminasa para desaminar el adenilato y formar un nucleótido de 5'-inosina-fosfato.

Aquí se describe un proceso para producir un intensificador de sabor en una célula de levadura. El proceso consiste en tratar una célula de levadura para formar un esferoplasto o un protoplasto, poner en contacto el esferoplasto o protoplasto con un liposoma que contenga una enzima para hidrolizar una molécula de RNA y formar un nucleótido, en condiciones que permitan que el esferoplasto o protoplasto reciban al liposoma y proporcionar condiciones que permitan la hidrólisis de una molécula de RNA en una célula de levadura por acción de la enzima del liposoma, para obtener un intensificador de sabor.

Aquí se describe un proceso para producir un intensificador de sabor en una célula de levadura. El proceso consiste en tratar una célula de levadura para formar un esferoplasto o protoplasto, poner en contacto el esferoplasto o protoplasto con un liposoma que contenga una enzima para la desaminación del adenilato y para formar un nucleótido de 5'-inosina-fosfato, en condiciones que permitan al esferoplasto o protoplasto recibir al liposoma y generar las condiciones que permitan la desaminación de un adenilato en una célula de levadura por acción de la enzima del liposoma para formar el intensificador de sabor.

Descripción detallada de las formas de ejecución

Tal como se describe aquí, el inventor ha producido un liposoma que es capaz de fusionarse con una célula de levadura y, lo que es importante, es capaz de transferir una molécula contenida en el liposoma al citoplasma de la célula de levadura para permitir que la célula realice una función deseada en la célula de levadura. La invención proporciona, pues, un liposoma caracterizado porque:

- un 40-50% molar de la bicapa de lípido del liposoma es PC,

- un 10-20% molar de la bicapa de lípido del liposoma es anfífilo catiónico,

- aprox. un 10% molar de la bicapa de lípido del liposoma es esterol y

- aprox. un 30% molar de la bicapa de lípido del liposoma es PE y/o DOPE.

En una forma de ejecución, un 50% molar de la bicapa de lípido del liposoma es PC. En otra forma de ejecución un 20% molar de la bicapa de lípido del liposoma es anfífilo. En otra forma de ejecución, aprox. un 30% molar de la bicapa de lípido del liposoma es DOPE. En otra forma de ejecución, aprox. un 30% molar de la bicapa de lípido del liposoma es PE.

Típicamente, el esterol es el ergosterol o una molécula que tenga una estructura similar, por ejemplo el colesterol.

La esterilamina o la DOTAP son especialmente útiles en el liposoma de la invención como anfífilos catiónicos.

La bicapa de lípido del liposoma puede contener también ácido oleico. En una forma de ejecución, aprox. un 5% molar de la bicapa de lípido del liposoma es ácido oleico. Es típico que, cuando la bicapa de lípido del liposoma contiene también ácido oleico, entonces menos del 30% molar de la bicapa de lípido del liposoma sea PE y/o DOPE.

Los siguientes liposomas son especialmente útiles para la fusión con y la transferencia e una macromolécula contenida en el liposoma a una célula de levadura.

(a) un liposoma caracterizado porque:

- un 50% molar de la bicapa de lípido del liposoma es PC;

- aprox. 30% molar de la bicapa de lípido del liposoma es DOPE;

- un 10% molar de la bicapa de lípido del liposoma es DOTAP; y

- aprox. un 10% molar de la bicapa de lípido del liposoma es ergosterol.

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(b) un liposoma caracterizado porque:

- un 40% molar de la bicapa de lípido del liposoma es PC;

- aprox. 30% molar de la bicapa de lípido del liposoma es DOPE;

- un 20% molar de la bicapa de lípido del liposoma es DOTAP; y

- aprox. un 10% molar de la bicapa de lípido del liposoma es ergosterol.

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(c) un liposoma caracterizado porque:

- un 50% molar de la bicapa de lípido del liposoma es PC;

- aprox. 30% molar de la bicapa de lípido del liposoma es PE;

- un 10% molar de la bicapa de lípido del liposoma es DOTAP; y

- aprox. un 10% molar de la bicapa de lípido del liposoma es ergosterol.

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(d) un liposoma caracterizado porque:

- un 40% molar de la bicapa de lípido del liposoma es PC;

- aprox. 30% molar de la bicapa de lípido del liposoma es PE;

- un 20% molar de la bicapa de lípido del liposoma es DOTAP; y

- aprox. un 10% molar de la bicapa de lípido del liposoma es ergosterol.

De forma típica, el liposoma de la invención contiene además una molécula que se tiene que introducir en una célula de levadura. La molécula está contenida en el liposoma, en el sentido de que puede estar encapsulada en el liposoma; es decir, puede estar confinada dentro de un compartimento acuoso que está definido por la bicapa de lípido del liposoma. Como alternativa, la molécula puede estar ocluida o insertada dentro de la bicapa de lípido y/o puede haber penetrado (protrusionado) dentro del compartimento acuoso definido por la bicapa y/o protrusionado desde la superficie de la bicapa de lípido del liposoma para establecer contacto con la célula de levadura.

Además, la molécula contenida en el liposoma es una "molécula exógena", en el sentido de que es una que no se ha producido, ni se ha derivado ni se ha obtenido de la célula de levadura, a la que dicha molécula va a transferirse. Por consiguiente son moléculas exógenas las moléculas producidas por métodos sintéticos o artificiales, incluidas las que no son de origen natural y las moléculas producidas por células que no sean células de levadura.

Sin embargo, se entenderá que una molécula exógena puede ser idéntica a una molécula producida por una célula de levadura. Por ejemplo, una 5'-fosfodiesterasa que se obtiene de una célula de levadura es una molécula exógena para una célula de levadura, a la que se pretende transferir la enzima, en el caso en el que la enzima no se haya producido por ni obtenido de la célula de levadura.

Se entenderá que la molécula contenga en el liposoma pueda ser cualquier molécula que sea capaz de ser contenida en un liposoma y que pueda impartir un efecto deseable una célula de levadura. Son ejemplos de tales moléculas aquellas que son útiles para producir productos de fermentación, tales como proteínas, en especial enzimas, aminoácidos, ácidos nucleicos, azúcares, compuestos orgánicos y glutamato monosódico.

Se entenderá además que en circunstancias particulares, el liposoma antes descrito puede no contener la molécula que se quiere introducir en la célula de levadura. Más en concreto, en algunas circunstancias se reconoce que el liposoma tiene una utilidad particular como superficie para la reacción de uno o más sustratos. En tales circunstancias, el liposoma de la invención no está dotado de otra molécula a introducir dentro de una célula de levadura.

Tal como se describe aquí, se cree que el liposoma de la invención transfiere o, en otras palabras, introduce una molécula contenida en el liposoma en una célula de levadura por endocitosis. Por consiguiente, el liposoma tiene de modo típico un diámetro que permita la endocitosis del liposoma en la célula de levadura. Un diámetro apropiado para el liposoma se sitúa entre 100 y 400 nm y un liposoma particularmente útil es el que tiene un diámetro entre 200 y 400 nm.

Se cree que la desestabilización de la bicapa de lípido del liposoma es un paso importante en el proceso de fusión del liposoma con la bicapa endosómica de la célula de levadura, que conduce a la transferencia de una molécula que puede estar contenida en el liposoma a la célula de levadura. Una estrategia para provocar la desestabilización de la bicapa de lípido del liposoma consiste en adaptar el liposoma de manera que la bicapa de lípido sea sensible a las fluctuaciones del pH. Por ejemplo, el liposoma de la invención se adapta a la desestabilización de las bicapas de lípidos de liposoma en el pH del endosoma de la levadura. Es particularmente útil un liposoma que contenga bicapas de lípido adaptadas a la desestabilización a un pH entre 5,0 y 6,0.

En los ensayos que han conducido a la invención, el inventor ha reconocido que ciertas manipulaciones de una célula de levadura pueden ser especialmente útiles para permitir la fusión del liposoma con la célula de levadura, por ejemplo para transferir una molécula contenida en el liposoma a la célula de levadura. Más en concreto, el inventor reconoce que sería necesario quitar por lo menos en parte ciertas moléculas, incluidos los complejos de \alpha-(1-6)- y -(1-3)-manano (goma de levadura)/proteína y el complejo de \beta-(1-6)- y -(1-3)-glucano (celulosa de levadura)/proteína con un armazón de quitina, de la célula de levadura para formar un esferoplasto de célula de levadura o quitarlas de forma más sustancial para formar un protoplasto de célula de levadura. Tal como se describe aquí, la membrana exterior de lípido de un protoplasto de célula de levadura, también conocida como plasmalema o membrana plasmática, contiene fundamentalmente proteínas, esteroles, esfingolípidos y fosfolípidos. La plasmalema es suficiente para proporcionar una barrera que regula el transporte de especies moleculares hacia dentro y hacia fuera de la célula de levadura. El inventor ha encontrado de modo sorprendente que el tratamiento aquí descrito es suficiente para quitar por lo menos parcialmente la goma de levadura y la celulosa de levadura y todavía es suficientemente sensible para proporcionar esferoplastos o protoplastos de células de levadura viables que son capaces de endocitosis del liposoma de la invención.

Aquí se describe un proceso para la obtención de una célula de levadura para la fusión con un liposoma que consiste en el paso de tratar una célula de levadura para formar un esferoplasto de célula de levadura o un protoplasto de célula de levadura.

La célula de levadura se trata por ejemplo para formar un esferoplasto o un protoplasto de célula de levadura poniendo en contacto la célula de levadura con una o más enzimas para la digestión por lo menos parcial de la goma de levadura y de la celulosa de levadura. Para este fin son enzimas especialmente indicadas la liticasa y la \beta-glucuronidasa. El proceso puede consistir en el paso adicional de aislamiento del esferoplasto o del protoplasto. Para este fin es particularmente indicado un gradiente de densidad. Por ejemplo, las células de levadura para el tratamiento en el proceso para producir esferoplastos o protoplastos de célula de levadura son células que existen en fase de crecimiento exponencial. Antes del tratamiento de las células de levadura para formar un esferoplasto o un protoplasto de célula de levadura, las células de levadura pueden lavarse para eliminar el medio de cultivo de dichas células de levadura.

Aquí se describe un proceso para introducir una molécula exógena dentro de un esferoplasto o protoplasto de célula de levadura. El proceso consiste en poner en contacto un esferoplasto o protoplasto de célula de levadura con un liposoma que contenga la molécula en condiciones que permitan que el esferoplasto o protoplasto reciban al liposoma. El liposoma empleado para este proceso es por ejemplo el que se ha descrito antes.

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Tal como se describe aquí, el inventor ha observado que el liposoma de la invención es recibido por un esferoplasto o un protoplasto de célula de levadura por endocitosis. El esferoplasto o protoplasto de célula de levadura se ponen en contacto con el liposoma por ejemplo para que permitan al esferoplasto o protoplasto recibir al liposoma o, en otras palabras, la endocitosis del liposoma, a una temperatura en torno a 37ºC. Tal como se describe aquí, el esferoplasto o protoplasto y el liposoma pueden ponerse en contacto por endocitosis en un tampón que tenga una osmolaridad compatible con una célula de levadura.

La invención proporciona un proceso para producir un esferoplasto o protoplasto de célula de levadura que contenga una molécula exógena. El proceso consiste en poner en contacto un esferoplasto o protoplasto de célula de levadura con un liposoma que contenga una molécula para permitir que el esferoplasto o protoplasto reciban al liposoma. El liposoma empleado en este proceso es el que se ha descrito antes.

El esferoplasto o protoplasto de célula de levadura pueden ponerse en contacto para permitir al esferoplasto o protoplasto recibir al liposoma según las condiciones descritas antes. El proceso puede consistir en el paso adicional de cultivar un esferoplasto o protoplasto de célula de levadura provistos de una molécula exógena para proporcionar una célula de levadura.

Aquí se describe una célula de levadura, un esferoplasto o un protoplasto producidos por el proceso recién descrito. Son células, esferoplastos y protoplastos especialmente idóneos para el uso en el proceso recién descrito los pertenecientes a los géneros Kluyveriomyces y Saccharomyces.

Aquí se describe el uso de una célula de levadura, descrita antes, para producir un alimento, un producto alimentario, un aditivo o un ingrediente para producir un alimento o un producto alimentario. El uso de la célula de levadura puede ser un proceso que consiste en el paso de poner en contacto la célula de levadura con una composición para producir un alimento, un producto alimentario, un aditivo o un ingrediente para la producción de un alimento o de un producto alimentario.

Aquí se describe además un alimento, un producto alimentario, un aditivo o un ingrediente para la producción de un alimento o de un producto alimentario, producido por una célula de levadura aquí descrita. El alimento, el producto alimentario, el aditivo o el ingrediente para la producción de un alimento o de un producto alimentario es por ejemplo un producto producido por fermentación o por reacción de Maillard. Los ejemplos incluyen a los productos que contienen proteínas vegetales hidrolizadas.

Un liposoma especialmente útil para la invención contiene la 5'-fosfodiesterasa que hidroliza moléculas de RNA de una célula de levadura para producir 5'-ribonucleótidos. Por consiguiente, la invención proporciona un liposoma caracterizado porque:

- un 40-50% molar de la bicapa de lípido del liposoma es PC,

- un 10-20% molar de la bicapa de lípido del liposoma es DOTAP,

- aprox. un 10% molar de la bicapa de lípido del liposoma es ergosterol y

- aprox. un 30% molar de la bicapa de lípido del liposoma es PE y/o DOPE; dicho liposoma contiene 5'-fosfodiesterasa.

Este liposoma es particularmente útil porque, tal como se ha descrito antes, tal liposoma puede transfectar una 5'-fosfodiesterasa a una célula de levadura que permita a la 5'-fosfodiesterasa hidrolizar moléculas de RNA del citoplasma para producir ribonucleótidos. Por consiguiente, una ventaja especial de tal liposoma es que pueden proporcionarse ribonucleótidos para el uso como intensificadores de sabor sin los pasos previos de purificación del RNA de un lisado de células de levadura, digiriendo el RNA con la enzima y aislando los productos ribonucleótidos. Otras enzimas o compuestos capaces de formar un compuesto para proporcionar sabor a un alimento o producto alimentario o para proporcionar sabor a ingredientes para fabricar un alimento o producto alimentario pueden incluirse en el liposoma. Un ejemplo de tal enzima es la 5'-adenil-desaminasa.

Otro liposoma especialmente útil de la invención contiene la 5'-adenil-desaminasa para desaminar el adenilato y producir un nucleótido de 5'-inosina-fosfato. La invención proporciona, pues, un liposoma caracterizado porque:

- un 40-50% molar de la bicapa de lípido del liposoma es PC,

- un 10-20% molar de la bicapa de lípido del liposoma es DOTAP,

- aprox. un 10% molar de la bicapa de lípido del liposoma es ergosterol y

- aprox. un 30% molar de la bicapa de lípido del liposoma es PE y/o DOPE; dicho liposoma contiene 5'-adenil-desaminasa.

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Aquí se describe un proceso para producir un liposoma que contiene una enzima, ya descrita antes. El proceso consiste en formar una dispersión de PC, DOE y/o PE, ergosterol y DOTAP, en un disolvente orgánico, secar la dispersión para obtener los lípidos secos y redispersar los lípidos secos en un medio acuoso que contenga la enzima en forma de liposoma. Tal como se describe aquí, es particularmente útil una solución 2:1 de cloroformo-metanol como disolvente orgánico para formar una dispersión de los lípidos. De forma típica, el proceso consiste en un paso adicional de aislamiento de liposomas que tengan un diámetro de unos 400 nanómetros.

La invención proporciona además un proceso para producir un esferoplasto o un protoplasto de célula de levadura que contenga una enzima recién descrita. El proceso consiste en poner en contacto un protoplasto de célula de levadura con un liposoma que contenga la enzima para permitir al esferoplasto o protoplasto recibir al liposoma. Tal como se describe aquí, el inventor ha observado que el liposoma de la invención es recibido por un esferoplasto o protoplasto de célula de levadura por endocitosis. De modo típico, el esferoplasto o protoplasto de célula de levadura se ponen en contacto para permitir que el esferoplasto o protoplasto reciban al liposoma o, en otras palabras, para efectuar la endocitosis del liposoma a unos 37ºC. Tal como se describe aquí, el esferoplasto o protoplasto y el liposoma se ponen en contacto para efectuar la endocitosis en un tampón que tenga una osmolaridad que sea compatible con una célula de levadura.

Aquí se describe una célula de levadura que contiene una enzima para hidrolizar una molécula de RNA y formar un ribonucleótido. La célula de levadura es la producida por el proceso descrito antes.

Se describe también aquí una célula de levadura que contiene una enzima para la desaminación del adenilato y la formación de un nucleótido 5'-inosina-fosfato. La célula de levadura es la producida por el procedimiento descrito antes.

Aquí se describe un proceso para producir un intensificador de sabor en una célula de levadura. El proceso consiste en tratar una célula de levadura para formar un esferoplasto o protoplasto, poner en contacto el esferoplasto o protoplasto con un liposoma que tenga una enzima tal como se ha descrito antes para permitir al esferoplasto o protoplasto recibir al liposoma y proporcionar condiciones para que la enzima del liposoma pueda realizar funciones de enzima de una célula de levadura y producir el intensificador de sabor.

Aquí se describe además un intensificador de sabor producido por el proceso antes descrito. El intensificador de sabor producido por el proceso de la invención es por ejemplo un ribonucleótido, tal como el 5'-guanosina-monofosfato, el 5'-citosina-monofosfato, el 5'-adenosina-monofosfato o el 5'-uracil-monofosfato. El ribonucleótido es con preferencia el 5'-guanosina-monofosfato o el 5'-inosina-monofosfato. El intensificador de sabor puede ser también un compuesto del tipo glutamato monosódico.

Aquí se describe un alimento o producto alimentario o un ingrediente para producir un alimento o producto alimentario que contiene un agente o intensificador de sabor producido por el proceso antes descrito. El alimento o producto alimentario o el ingrediente o el aditivo para producir el alimento o producto alimentario por el proceso descrito antes es típicamente un producto fermentado o un producto de sabor o una bebida producida por fermentación o por reacción de Maillard o que contenga un producto de una de estas reacciones.

Aquí se describe una composición que contiene un liposoma ya descrito antes.

Ejemplos Ejemplo 1 Materiales y equipo

Se adquieren a la empresa Sigma Aldrich (Castle Hill, Australia) la fosfatidil-colina de soja (PC), la dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE), la fosfatidil-etanolamina de soja (PE), el 1,2-dioleil-sn-glicero-3-trimetilamonio-propano (DOTAP), el ergosterol (ERGO), la calceína, fluoresceína-isotiocianato-dextrano (FITC-FD 250S), dextrosa, base trisma, Ficoll tipo 70, FC-77 fluorado, aceite de baño de punto de fusión, I-sucrosa-ul-14C, aceite de silicona AR 200, liticasa y \beta-glucuronidasa - tipo H2. La Sepharose CL-4B se adquiere a la empresa Amersham Biosciences (Castle Hill, NSW). La sorbita se adquiere a la empresa Med-Chem (Kew, Vic). El extracto de levadura y la peptona bacteriana se adquieren a la empresa Oxoid Chemicals (Heidelberg, Vic). El Saccharomyces cerevisiae y el K. marxianus (FRR 1337) se obtienen por cesión gentil de la empresa Food Science Australia (North Ryde, NSW). Los productos químicos y disolventes restantes son de calidad HPLC.

Se utilizan un evaporador rotatorio Büchi y un liofilizador Heto FD-3 para secar inicialmente y después eliminar todas las trazas de disolventes orgánicos de las películas de fosfolípidos obtenidas por re-hidratación realizada en un baño de agua de temperatura controlada Braun Certomat WT. La formación de vesículas multilamelares (MLV) se realiza inicialmente en un baño de ultrasonidos Braun 1200 con la adición de esferillas de vidrio de 2 mm para facilitar la eliminación del lípido seco de las paredes del matraz. La reducción de tamaño de los liposomas de las MLV para obtener vesículas unilamelares grandes (LUV) se realiza en una extrusora Avestin Lipo-fast basic con estabilizador que incorpora filtros de membrana de policarbonato de 400 nm después de una serie de ciclos de pasos de congelación y descongelación en un intervalo de -80ºC y 40ºC utilizando un congelador de laboratorio y un baño de agua caliente. Este paso tiende a incrementar el volumen de captura con el liposoma formado. Las LUV se separan de cualquier material no encapsulado por filtración a través de gel empleando un sistema completo de FPLC de proceso de gradiente Amersham Pharmacia AKAT con un monitor modelo 900, lámpara y detector (ajustado a 280 nm), una bomba modelo 920 e incorporando un colector de fracciones Frac 950 conectado a un ordenador del tipo Compaq Desk Pro Pentium III, que soporta programas informáticos analíticos Unicorn. La columna empleada en el cromatógrafo es una columna K9-30 con relleno de esferillas de Sepharose CL 4B (de 45 \mum a 165 \mum) y provista de dos filtros soportes de 25 \mum. Se monta la columna en una depósito de envasado RK16/26 y se lleva empleando una bomba peristáltica de velocidad variable. El tamaño de partícula de los liposomas de LUV formados se estima con un analizador de partículas de lecho largo del tipo Malvern Mastersizer-S conectado a un ordenador del ACO Pentium II, que soporta programas informáticos analíticos del tipo Mastersizer, versión 2.18. Para incubar la levadura se emplea un agitador orbital Bioline, realizando el lavado, formación de culotes y separaciones de densidad de las células y protoplastos en una centrífuga Beckman J2-H2 utilizando un rotor JA 20 de cabezal fijo así como un rotor de cabezal de cangilón oscilante JS-13 específicamente para la separación del protoplasto. La confirmación de la viabilidad del protoplasto se realiza por absorción de sucrosa C14 y se mide en un analizador de centelleo de líquidos del tipo Packard 1600 TR, después de centrifugar los protoplastos en un aparato del tipo Beckman 152 Microfuge con un gradiente de silicona y aceite.

La confirmación de la endocitosis fluorescente se realiza con un microscopio del tipo Leica TCS-4D Confocal equipado con un láser de mezcla de gases criptón y argón y una longitud de onda de excitación de 488 nm, que está conectado a un ordenador Dell Pentium 2 que soporta programas informáticos de análisis por la imagen del tipo Leica Scan-ware. El análisis por la imagen detallado de las células para identificar la posición de los liposomas dentro del citoplasma y la membrana plasmática se realiza con un microscopio de transmisión electrónica del tipo Philips CM 100 y las imágenes se captura con una cámara digital del tipo Gatan Dual Vision.

Ejemplo 2 Creación de liposomas Material de vidrio

Antes de utilizarse en los ensayos, todos los objetos de vidrio se lavan con un detergente exento de fosfato y después se sumergen en ácido nítrico 5M y se enjuagan en agua tratada con Milli Q para eliminar cualquier traza de material proteináceo, lípido o sal residuales en un intento de evitar cualquier oxidación inesperada de los fosfolípidos y cualquier posible inserción de materiales extraños a las bicapas de lípidos formadas, que pudieran cambiar la carga o la densidad de empaquetamiento de los liposomas creados.

Preparación de soluciones estándar de fosfolípidos

Se preparan soluciones patrón de 20 mg/ml de PC, PE, DOPE, DOTAP y ERGO. Se preparan disolviendo 20 mg de cada lípido en 1 ml de una solución 2:1 (v/v) de cloroformo y metanol, que se filtra a través de un filtro Millipore de 0,45 \mum y se almacena a 4ºC hasta el momento del uso.

Se utilizan exclusivamente matraces, probetas, jeringuillas de vidrio y agujas de acero inoxidable para preparar estas mezclas y evitar la posible migración de monómeros de plástico desde las puntas de la pipeta o desde los filtros que pudieran contaminar y alterar la configuración de empaquetamiento de las micelas de fosfolípidos, que podría traducirse en un vertido prematuro de los materiales ocluidos durante el almacenaje de la suspensión de liposoma.

Preparación de la película de lípido seca

En un matraz de fondo redondo Quick fit de 100 ml, que se ha lavado, se introducen 5 ml de la solución 2:1 de cloroformo-metanol para asegurar la dispersión adecuada de los fosfolípidos. Después se añade un total de 250 \mul de la mezcla de lípidos de soluciones patrón de 20 mg/ml y se agita suavemente durante 1 hora. Se forran los matraces con lámina de aluminio para proteger los lípidos contra la oxidación causada por la luz UV y se hace un barrido con nitrógeno de la cavidad superior vacía durante 5 minutos para eliminar el oxígeno de dicha cavidad antes de conectar el matraz al evaporador rotatorio Büchi. Se evaporan los disolventes con vacío a 60 rpm durante 90 minutos en un baño de agua mantenido a 37ºC, que es superior a la temperatura de transición de fases (TmºC) para el componente fosfatidilcolina, con lo cual se asegura que todos los lípidos están en la fase cristalina líquida, permitiendo una dispersión uniforme. Se cubre el evaporador con una lámina de plástico negro para asegurar que el paso de luz sea mínimo. Para asegurar la eliminación de todos los disolventes de los lípidos secados, se congelan finalmente los matraces a -52ºC con una presión de 0,001 mbar durante 2 horas y después se lavan de nuevo con nitrógeno, se sellan y se almacenan a -80ºC hasta el momento de la rehidratación.

Hidratación de la película de lípido seca y encapsulamiento de un colorante fluorescente

Se hidratan las películas secas de fosfolípido en un proceso de dos pasos para evitar la precipitación o floculación del lípido de carga catiónica DOTAP, que se sensible a la concentración milimolar de polianiones tales como la calceína, el fosfato o el EDTA, así como la presencia de cationes monovalentes o divalentes en concentraciones superiores a cinco milimolar. Se observa el fenómeno de separación de los lípidos catiónicos durante nuestro trabajo y se investiga y se corrige el proceso durante nuestros ensayos por hidratación de la película inicialmente en agua tratada con Milli Q a 37ºC durante 30 minutos para iniciar la formación de un complejo micelar. Después se realiza una hidratación de 30 minutos a 1 hora con el encapsulante deseado en una solución debidamente tamponada a pH 7,2 para inducir una sensibilidad catiónica en el liposoma. En nuestros ensayos iniciales se utiliza una solución 20 mM de calceína en Trisma 10 mM ajustada a pH 7,2 y después se continúa con una solución de 10 mg/ml de isotiocianato de fluoresceína-dextrano FD 250S para asegurar que se evita el movimiento pasivo de una molécula más pequeña a través de la membrana de plasma de nuestros protoplastos, que se hayan formado. En ensayos tempranos se ha identificado que cuando se incuba sola la calceína de peso molecular más bajo con los protoplastos formados existe un poco de migración pasiva de esta molécula a través de la membrana del plasma o bien nuestras células, produciendo un resultado positivo falso. La sustitución de la calceína por el dextrano FITC 250 kDa permite eliminar esta situación y proporciona datos cuidadosos de la endocitosis liposómica inducida. Después se someten los lípidos hidratados a ciclos de congelación y descongelación 3 veces a -80ºC y 37ºC en un intento de aumentar la captura de volumen del colorante fluorescente dentro de las bicapas de lípidos al tiempo que se evita el colapso del dextrano conjugado con FITC. Se realiza un breve tratamiento de 10 minutos en un baño de ultrasonidos para finalizar el desarrollo de las MLV y a mismo tiempo reducir cualquier agregación excesiva entre las micelas. Después se extruye cada una de las soluciones en una extrusora Avestin Lipofast basic con estabilizador.

Extrusión y aislamiento de vesículas lamelares grandes por filtración a través de gel

La extrusora Avestin Lipofast basic es un aparato de extrusión manual que tiene una capacidad de 1 mililitro y utilizado 2 jeringuillas Hamilton herméticas al gas incorporadas al efecto, ajustadas a un par de soportes de membrana de cuatro agujeros, que incluyen un filtro de policarbonato prisionero de una carcasa de acero inoxidable. Antes de cada uso se lavan los componentes de la extrusora con agua y después con una solución 2:1 de cloroformo:metanol para eliminar cualquier lípido residual y se lavan de nuevo con agua tratada con Milli Q y se dejan secar antes de volver a montarlos. En nuestros ensayos se emplean filtros de policarbonato desechables de 400 nm, que se encaja en los soportes de la membrana con tenazas para evitar la contaminación con lípidos accesorios. El trabajo posterior permite identificar que los filtros de 200 nm son más apropiados para una mayor entrada endocitótica de nuestros liposomas a través de la pared celular basada en las micrografías electrónicas de transmisión de liposomas grandes que se adhieren a la pared de la membrana exterior y liposomas pequeños que pasan al citoplasma de los protoplastos. El inconveniente de este supuesto es que también se reduce el volumen de captura del liposoma. Después del montaje de la extrusora se llenan individualmente las jeringuillas con tampón Trisma 10 mM de pH 7,2 y se extruyen a través del filtro de policarbonato en la jeringuilla opuesta y se descartan los contenidos. Se repite esta operación con la otra jeringuilla, pero realiza en dirección opuesta con la intención de prehumectar el lecho de relleno para un paso más fácil de la solución de lípido a través de la membrana así como eliminar cualquier colorante o lípido residuales que se hayan podido adherir a la carcasa de la extrusora.

Se sumergen en un baño de agua a 37ºC la extrusora y los matraces que contienen las MLV para precalentar el aparato y asegurar que los lípidos se hallan en estado cristalino, lo cual permite un paso más fácil a través de la extrusora. Se pasan las soluciones a través de la extrusora en un sentido de avance y de retroceso 23 veces para lograr una dispersión homogénea de las LUV. Es importante para cada extrusión finalizar el procedimiento en la jeringuilla opuesta para evitar la resuspensión de cualquier material atrapado que pudiera estar presente en el filtro durante el primer paso. Se envasan las soluciones, que se vuelven transparentes después de extrusiones repetidas, en tubos Eppendorf preesterilizados de 2 ml, que se cubren con una lámina de aluminio y se almacenan a 4ºC antes de la filtración a través de gel.

El tampón para la filtración a través de gel consiste en sorbita 1 M, cloruro potásico 100 mM, Trisma base 25 mM y cloruro magnésico 100 \muM, ajustado a pH = 7,2. Antes de su utilización se filtra el tampón y se desgasifica con vacío durante 10 minutos y se prepara con agua Milli Q. Después de la filtración el tampón se hierve para eliminar cualquier aire remanente y se mantiene en un baño encapsulado a 37ºC para asegurar que los lípidos se hallan en la fase líquida durante la filtración. Los requisitos para eliminar el aire ocluido del tampón antes de su utilización son aumentar el grado de separación entre los liposomas y el colorante libre evitando la compresión de las esferillas blandas de relleno de Sepharose. Antes del uso se equilibra la columna con tres volúmenes de tampón para eliminar cualquier etanol o azida sódica residuales, que se emplean como conservantes dentro de las tuberías de FPLC y la columna con relleno de Sepharose, mientras que las columnas que no están en uso se almacenan en un frigorífico a 4ºC. En el método de separación se emplea un caudal de 0,5 ml/min y se inyectan dos mililitros de suspensión de liposoma en la columna, con una efica-
cia de elución del 95%. El volumen de proceso que se emplea es de 79 ml y el tiempo de proceso es de 197 minutos.

Ejemplo 3 Creación y confirmación de protoplastos de levadura competentes Preparación de medios de cultivo e incubación de células de levadura

Para la producción de protoplastos de levadura se descongela un cultivo liofilizado de Saccharomyces cerevisiae (YNN 281) y después se propaga a 30ºC durante 20 horas en un agitador de 120 rpm a temperatura controlada y se cultiva en medio YEPD esterilizado que contiene un 1,5% (p/v) de extracto de levadura, un 2% (p/v) de peptona bacteriana y un 2,0% (p/v) de dextrosa, ajustado a pH = 6,5. Después de la incubación se lavan dos veces las células con una solución estabilizada osmóticamente de cloruro potásico 0,65M, Trisma base 25 mM y cloruro magnésico 100 \muM, ajustada a pH = 6,5. El requisito de concentración para el protocolo de suspensión se basa en la comprensión de la presión osmótica intracelular y la concentración de la levadura en reposo de Saccharomyces cerevisiae, definida empleando los datos del punto de depresión por congelación. Se realiza la centrifugación de las células recolectadas a 4ºC en una centrífuga Beckman J2 H2 a 10.000 rpm durante 15 minutos.

Se ha identificado que la porosidad y el contenido de lípidos de la membrana plasmática de la levadura puede alterarse para un transporte endocitótico facilitado de compuestos de peso molecular más elevado si se manipulan las condiciones de tiempo, temperatura y pH, o se modifican los solutos en los medios soportadores para intensificar el crecimiento de la membrana de lípidos.

Preparación de una solución enzimática y gradientes de densidad para el aislamiento de protoplastos de levadura

Para la digestión de las paredes de nuestra célula de levadura se prepara un digesto de enzima que contiene 2 mg/ml de liticasa y 1 mg/ml de jugo intestinal de serpiente (\beta-glucuronidasa de Helix pomatia) en una solución de cloruro potásico 0,65M, Trisma base 25 mM y cloruro magnésico 100 \muM ajustada a pH 6,5. Esta solución es la misma que se emplea para el lavado y la resuspensión de células de levadura recolectadas. Se preparan los protoplastos de una suspensión de 4 ml de células lavadas y se añade 1 ml de preparación de enzima. Se efectúa la incubación en frascos cónicos sellados y se ha reaccionar a 37ºC durante 3 en un agitador rotatorio a 120 rpm de temperatura controlada para producir nuestros protoplastos viables.

Después se construye un gradiente de densidad de cinco hileras en tubos Falcon para aislar los protoplastos a partir de células intactas y remanentes de pared celular en el intervalo comprendido entre 1,04 g/l y 1,10 g/l. Cada solución contiene sorbita en una concentración de 0,65 M a 1 M, 25 mM de Trisma base, 100 \muM de cloruro magnésico y un 5% o un 10% de Ficoll en las fracciones más densas. Se estabiliza cada solución a pH 7,2 y se deposita un total de 5 ml de cada solución en los tubos Falcon empezando por la fracción más densa y acabando con el digesto de enzima de levadura. Se cierran los tubos, se colocan en una centrífuga Beckman y se centrifugan durante 15 minutos a 1000 rpm y a 4ºC para aislar los protoplastos.

Confirmación de la viabilidad de las células de levadura por adsorción sobre sucrosa C14

Para asegurar la naturaleza competente del protoplasto formado para realizar la endocitosis se cultivan células de levadura en medio YEPD modificado, en el que se sustituye un 2% (p/v) de dextrosa por un 4% (p/v) de sucrosa como fuente de carbono para facilitar el mecanismo de absorción y de transporte de la sucrosa C14 a cargo de las células de levadura. Se forman los protoplastos del modo antes descrito y se aíslan de nuevo utilizando un gradiente de densidad basado en la sorbita. El aislamiento en aceite de silicona de los protoplastos es un método conveniente para separar células radiomarcadas de una solución de gradiente de azúcar. En este procedimiento se incuban las células en una solución radiactiva durante un período especificado de hasta 1 hora, tal como se ha visto en nuestros ensayos, y se centrifugan a través de aceite de silicona en una densidad específica para separarlas para el recuento de centelleo. Se preparan siete microtubos (400 \mul) para obtener culotes de protoplastos, cada uno de ellos contiene 10 \mul de FC 77 fluorado como solución de captura y 100 \mul de aceite de silicona AR 200 (densidad de 1,05 g/l) como media a utilizar para la separación de protoplastos en sucrosa C14. En el ensayo se emplean 40 \mul de sucrosa 1M (preparada en un matraz volumétrico de 50 ml), a los que se añaden 2 \mul del patrón de sucrosa C14. Después se colocan 1,2 ml de la suspensión de protoplastos en un tubo Eppendorf de 1,5 ml y en el tapón se sitúan 12 \mul de la solución 1M de sucrosa C14. El período de incubación se inicia cuando el tapón se sella sobre el tubo Eppendorf. A continuación se sacan partes alícuotas de 100 \mul de protoplastos cada 10 minutos y se colocan sucesivamente en una serie de tubos de 400 \mul preparados con gradientes de aceite de silicona y se centrifugan a 7000 rpm durante 10 segundos. Se sacan tubos en cada intervalo de tiempo y se vierten a través de la fracción superior de aceite de silicona para capturar el culote de protoplastos formados y se resuspende en 100 \mul de agua tratada con Milli Q en un tubo de centelleo que contiene 3 ml de líquido de centelleo. Como patrón se toman 100 \mul de volúmenes de sucrosa 1M que contiene C14 para el recuento, pero no se centrifuga a través del aceite de silicona como los protoplastos sin isótopo, sino que estos se centrifugan a través del aceite de silicona y se cuentan para evitar la corrección de atenuación del extracto de protoplastos.

Se traza una gráfica de las cuentas, registrada en forma de nmoles de sucrosa absorbida, frente al tiempo para confirmar la absorción de nuestro isótopo de sucrosa en los protoplastos competentes.

Ejemplo 4 Estudios de endocitosis Incubación de los protoplastos formados con los liposomas unidos al colorante

Se dispensa una parte alícuota de 0,8 ml de una suspensión de protoplasto a través de una punta de pipeta de orificio grande (para asegurar que será minímo el trastorno que sufra el frágil protoplasto) a un tubo Eppendorf esterilizado, en el que se han introducido 0,8 ml de la suspensión de liposoma obtenida por filtración a través de gel. Ambas soluciones son de densidades equivalentes para asegurar la estabilidad del protoplasto y se mezclan suavemente antes de iniciar la incubación. Se forran los tubos individualmente con una lámina y se forran lateralmente con una lámina de espuma Styrofoam, que a su vez está forrada con una lámina para asegurar que los tubos permanecerán en su sitio y después se sumergen en un baño de agua a 37ºC durante un período de incubación de 90 minutos.

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Estudios de microscopio confocal para identificar la fusión del liposoma y la endocitosis fluorescente

Se aplica una muestra de 20 \mul de la suspensión incubada sobre un portaobjetos del microscopio, con los bordes del vidrio deslizante superior sellados con una resina acrílica para impedir el secado de la muestra. Una vez realizada la aplicación se almacenan los cristales en la oscuridad para reducir el riesgo de pérdida de fluorescencia del conjugado de FITC y se examinan inmediatamente en contraste de fases y fluorescencia empleando un microscopio confocal.

Estudios en microscopio electrónico de transmisión que confirman la coalescencia liposómica y la endocitosis celular

La técnica utilizada para preparar células montadas en bloques para el análisis por la imagen requieren 0,5 ml de la suspensión de protoplasto-liposoma fijados con 50 \mul de glutaraldehído del 1,25% (p/v) y paraformaldehído del 1,0% (p/v) en tampón cacodilato 0,2M de pH = 7,2 durante 1 hora. Después se mezcla la suspensión fijada con un volumen similar de agarosa del 5,0% y se deja sedimentar a 4ºC durante 20 minutos. Se cortan pequeños cubos de la mezcla (aproximadamente 2 mm^{3}) y se fijan a 4ºC durante 14 horas más. Después se fijan las muestras con tetróxido de osmio del 1,0% (p/v), se tiñen en bloque con acetato de uranilo del 2,0% (p/v), se deshidratan a través de una serie gradual de etanol y se sumergen en resina Epon/Araldit.

Se cortan secciones ultrafinas con un ultramicrotomo Leica y se recogen en rejillas de cobre/paladio. Se tiñen las secciones con acetato de uranilo del 4,0% (p/v) y acetato de plomo Reynolds y se examinan con un microscopio electrónico de transmisión Philips CM 100 y las imágenes se captan con una cámara digital Gatan Dual Vision.

Ejemplo 5 Producción y uso de un liposoma que contiene la 5'-fosfodiesterasa

Se maceran raicillas de cebada en un mezclador Waring. Después se filtra la solución resultante a través de una tela de queso y se centrifugan a 4ºC y a 10.000 rpm durante 20 minutos para eliminar los restos de raicillas. Se separa el líquido sobrenadante y se calienta a 60ºC durante 1 hora. Se centrifuga de nuevo la solución a 4ºC y 10.000 rpm durante 20 minutos, se recoge el líquido sobrenadante y se desaliniza en una columna Hitrap 26/10 en un aparato FPLC. Se pasa la solución desalinizada a través de un aparato de intercambio aniónico empleando una columna High Prep 16/10 y se recogen las fracciones activas, se desalinizan y se pasan a través de una columna Mono Q. Después se concentra la enzima purificada individual en una membrana de ultrafiltración por centrifugación a través de una membrana Amicon Ultra 4 con corte a 30.000 wt a 4ºC y 7.500 rpm durante 8 minutos.

Después se forman los liposomas por un proceso de evaporación de disolvente y se liofilizan para producir una película fina de fosfolípidos de la concentración deseada de PC = 50%, DOPE = 30%, DOTAP = 10% y ergosterol = 10%. Se hidratan las películas en primer lugar en agua tratada con Milli Q y después con solución de enzima desalinizada que contiene un tampón estabilizado osmóticamente de sorbita 0,65M para asegurar que la 5'-fosfodiesterasa no se volverá inactiva después de congelar y descongelar. Se someten a tratamiento de ultrasonidos por breve tiempo, durante 2 minutos, las vesículas multilamelares formadas en un baño de ultrasonidos para reducir la agregación y continuar la formación de liposomas grandes y después se congelan y descongelan 3 veces para aumentar el potencial de captura de los liposomas. A continuación se extruye la solución descongelada de los liposomas a través de una extrusora Avestin con un filtro de tamaño de poro 400 nm, las vesículas unilamelares grandes contienen las enzimas aisladas por filtración a través de gel en un aparato FPLC empleando una columna de 30 cm por 1 cm con relleno de Sepharose CL 4B. Después se concentran de nuevo los liposomas que tiene fijada la enzima en un tubo de centrífuga Amicon Ultra 4 y se almacenan a 4ºC hasta el momento necesario.

Los protoplastos y los esferoplastos se obtienen del modo indicado antes. Después se concentran los protoplastos por centrifugación en un tubo de membrana de 5 \mum Millipore Ultra Free CL a temperatura ambiente y 900 rpm durante 50 minutos después de haber realizado una dilución 1:4 en el tampón de gradiente 1,03 g/l para facilitar la centrifugación. Después se combinan 50:50 los protoplastos concentrados con el liposoma concentrado que contiene fijada a la enzima en un tubo Eppendorf y se incuban con agitación en baño de agua a 37ºC durante 90 para efectuar la transfección de los liposomas y facilitar la liberación de la enzima fijada. Después se lisa la mezcla de las células en una prensa francesa y se centrifuga el material celular a 4ºC y 10.000 rpm durante 20 minutos, se recoge el líquido sobrenadante y se congela para retardar cualquier reacción posterior de la enzima liberada. Seguidamente se miden los 5'-ribonucleótidos en solución por RPHPLC frente a una suspensión de protoplasto de levadura incubado sin la adición de los liposomas con la enzima fijada y se comparan los valores obtenidos.

Ejemplo 6 Resultados y discusión

Hemos incorporado fosfolípidos, PE y PC a la matriz primaria de un liposoma. La inclusión de un anfífilo cargado, el DOTAP, se realiza para incitar la fusión inicial a las proteínas de superficie que se hallan en la membrana plasmática de la levadura y el agente estabilizador. Se emplea el ergosterol para facilitar un intercambio más fluido de lípidos entre la pared celular de levadura y el liposoma. Los compuestos adicionales se incorporan a la estructura del liposoma para facilitar una liberación controlada del material encapsulado y se basan en la PE y su derivado la DOPE, que contiene un grado elevado único de ácidos grados insaturados.

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La PE se utiliza con la DOPE en el mecanismo de liberación de nuestros liposomas, tiene un grupo de cabeza menor que la PC, tiene por naturaleza forma cónica y es propensa a formar micelas invertidas hexagonales en solución, sobre todo a un pH bajo. La presencia de la PE y en particular de la DOPE con grupos oleicos insaturados proporciona una mayor curvatura de membrana dentro del liposoma, lo cual conduce a una liberación más rápida del material encapsulado y como tal se incorpora para actuar como compuesto de liberación desencadenada dentro de la fórmula.

Los ensayos realizados contienen las siguientes combinaciones de fosfolípidos: 1

1

Todos los ensayos se realizan por duplicado empleando como control negativo el dextrano conjugado con FITC sin encapsular para confirmar el transporte no endocitótico del conjugado sin encapsular.

Hay tres categorías principales de liposomas: las vesículas multilamelares que contienen 2 o más lamelas concéntricas dispuestas en la configuración de la corteza de una cebolla y pueden tener un tamaño comprendido entre 1 \mum y <100 \mum; las vesículas unilamelares grandes, que tienen una bicapa única y una distribución de tamaños entre 200 nm y 1 \mum; y las vesículas unilamelares pequeñas, que tienen un tamaño inferior a 200 nm. Para nuestro trabajo se han escogido las vesículas unilamelares grandes (LUV), porque las vesículas multilamelares son demasiado grandes para atravesar la membrana plasmática de la levadura y las vesículas unilamelares pequeñas son demasiado pequeñas e incapaces de acumular cantidades significativas de nuestro dextrano-FITC o de 5'-fosfodiesterasa.

Las vesículas unilamelares grandes pueden obtenerse por un gran número de métodos después de la hidratación inicial de la película lípida para formar las MLV. La exposición a una sonda o un baño de ultrasonidos es un proceso que requiere mucha dedicación de tiempo, los liposomas que se producen tienen tamaños desiguales y potenciales de captura desiguales y en el caso de exposición a la sonda de ultrasonidos se produce solamente un pequeño volumen de suspensión que necesita enfriarse con agua-hielo para disipar el calor generado por la punta de la sonda. Este proceso no es ampliable ni adaptable al encapsulado de enzimas, ya que el calor generado y el requisito de separar los fragmentos de titanio de la suspensión de liposomas llevarían a la inactivación de las enzimas que se pretende encapsular.

Puede adoptarse también un procedimiento de deshidratación-rehidratación y es ampliable hasta una escala de 100 volúmenes, pero también es variable en cuanto al potencial de captura. La inyección de etanol con evaporación de disolvente en fase inversa y la diálisis en detergente pueden aplicarse también, pero el inconveniente de cada uno de estos métodos, a pesar de que lo vienen utilizando muchos investigadores, es que expone a nuestra enzima a disolventes orgánicos o a detergentes, lo cual reduce significativamente su actividad. El procedimiento de eliminación del detergente requiere en particular una diálisis exhaustiva para eliminar los tensioactivos y tendría un coste prohibitivo para la industria alimentaria.

Se ha empleado también la microfluidización para preparar vesículas como se hace con la prensa francesa, pero de nuevo la desnaturalización de las enzimas, debida a las fuerzas de cizallamiento, convertiría en inaceptables a estos procedimientos.

Hemos utilizado la evaporación de disolvente para los lípidos y un método de congelación-descongelación suave y de extrusión para la producción de las LUV, porque permite un alto volumen de captura del colorante fluorescente y 5'-fosfodiesterasa y permite una incorporación más fácil de un lípido catiónico.

La inclusión de un paso previo de congelación-descongelación antes de la extrusión proporciona un aumento del volumen de captura dentro del núcleo de las LUV formadas, como se confirma también por nuestras observaciones TEM. El principio de congelación y descongelación provoca la ruptura y refusión del liposoma, durante este tiempo el soluto encapsulado se equilibra en las cavidades más profundas del núcleo del liposoma. Después de la congelación y descongelación, los liposomas pueden agregarse, pero se ha constatado que un breve paso de exposición a ultrasonidos antes de la extrusión podría disgregar el aglomerado y facilitar la formación de las LUV.

En los ensayos con calceína se realizan hasta 6 ciclos de congelación-descongelación para aumentar el volumen de captura, pero en el caso del dextrano conjugado con FITC solamente se realizan 3 ciclos en un intento de evitar la rotura del compuesto fluoresceína, que, si está libre, puede dar lugar a un falso positivo, tal como se ha comprobado en los estudios de endocitosis con la calceína.

El tamaño de los liposomas formados se corta a medida a <400 nm con la acción de la extrusora que reduce el riesgo de desnaturalización de las enzimas o conjugados así como el ensuciamiento de las membranas. Los filtros empleados son filtros de 400 nm, aunque después se ha evaluado el filtro de 200 nm para aumentar el porcentaje de LUV pequeñas para una migración más fácil a través de la membrana lípida de la célula. Las membranas de policarbonato empleadas para la extrusión se fabrican con un proceso de combinación de láser y mordentado químico, destinada a producir cavidades de poros de paredes rectas y diámetro exacto.

Se ha encontrado también que durante nuestros ensayos es necesario hidratar y extruir nuestros lípidos por encima de la temperatura de transición de fases del lípido de temperatura para evitar el rajado de los filtros de policarbonato durante la extrusión.

El procedimiento de extrusión produce LUV de un tamaño uniforme y definido, según se determina con un Malvern Mastersizer S y se confirma con las micrografías electrónicas de transmisión. El tamaño medio es de 0,36 micras.

El proceso de filtración a través de gel se emplea para fraccionar los liposomas formados con la solución que contiene el colorante sin encapsular. Para tener éxito en la separación de los liposomas catiónicos requiere conocer los principios de separación basados en el tamaño diferencial de los materiales y la capacidad de empaquetar una columna de filtración eficaz a través de gel. El material de relleno empleado para la separación es la Sepharose CL 4B, que es una agarosa en forma de esferillas que se deriva del agar y se reticula por reacción con el 2,3-dibromopropanol en condiciones alcalinas. Al igual que en el caso de los almidones reticulados, el efecto de reticulación de este material proporciona un gel de agarosa con mayor estabilidad térmica y química en un amplio intervalo de pH.

Se elige la Sepharose CL 4B porque está en el centro del intervalo de separación de las Sepharose y tiene un tamaño de esferillas menor dentro del intervalo inferior, lo cual facilita un movimiento más rápido de componentes de peso molecular grande. Su intervalo óptimo de separación se sitúa entre 70 x 10^{2}-20 x 10^{2} y el tamaño de las esferillas se sitúa entre 45 y 165 \mum.

Los filtros de la columna se eligen específicamente de 25 \mum para asegurar que las esferillas de tamaño menor van a permanecer dentro de la columna y los liposomas van a separarse y no se alojarán en la parte alta del filtro de la columna, porque de hacerlo restringirían el flujo e impedirían la separación, como hemos comprobado en las primeras columnas que utilizamos en nuestros ensayos. Los filtros convencionales se identifican por un tamaño de 2 \mum, lo cual provoca el ensuciamiento y la entrada restringida de los liposomas grandes en la columna, haciendo imposible su aislamiento.

El tampón de separación que se utiliza en los ensayos se elige de modo que pueda soportar osmóticamente a los protoplastos formados cuando se combina con los últimos liposomas para los estudios de endocitosis y se identifica durante las separaciones de gradiente de los protoplastos formados. La separación de los liposomas por filtración a través de gel se identifica en dos picos de eluyente del cromatógrafo, entre los que la suspensión lechosa que contiene los liposomas sale de la columna en primer lugar como función de su tamaño molecular y se confirma por las imágenes TEM, tiñiendo negativamente las rejillas recubiertas de carbón con soluciones del 2,0% (p/v) de fosfotungstato sódico ajustadas a pH = 7,0.

Los protoplastos se preparan con arreglo a técnicas estándar. Se realiza una incubación de tres horas con una centrifugación posterior a 4ºC y 1000 rpm durante 15 minutos para aislar los protoplastos. Los protoplastos se encuentran primariamente en la tercera capa del tubo Falcon, cuya solución tiene una densidad de 1,07 g/l. Después se utiliza una concentración del tampón como solución de separación para todos los ensayos de filtración a través de gel. Se identifican los protoplastos por contraste de fases y microscopía TEM con los remanentes de las paredes celulares que están presentes o se han captura. Se observa durante la microscopía confocal y TEM que los remanentes de la pared celular que contienen proteínas cargadas negativamente forman aglomerados con los liposomas de DOTAP, en particular en una concentración del 20% molar.

La adición de un sistema enzimático de dos componentes, empleando la liticasa y el jugo intestinal de serpiente (\beta-glucuronidasa de Helix pomatia) está destinada a hidrolizar los \beta-(1-3)-glucanos y los enlaces cisteína de las proteínas de la pared celular para hidrolizar eficazmente tanto los hidratos de carbono como las proteínas y producir los protoplastos. Los ensayos de incubación se realizan a una temperatura constante de 37ºC y a un pH de 7,2 porque se ha comprobado que el pH no es un parámetro crítico y todos los pasos anteriores de hidratación y purificación se realizan a esta temperatura. La única variable que se ha revisado es el período de incubación, que puede variar entre 30 minutos y 90 minutos. Se decide que 90 minutos es el período más apropiado para lograr los niveles más altos de transfección de protoplastos.

Para asegurar la absorción de nuestros liposomas por endocitosis tienen que determinarse los protoplastos viables y se adopta el uso de un isótopo marcado radiactivamente de la sucrosa, registrándose la absorción de este metabolito durante un período de una hora. Se cultivan las células en un medio de sucrosa para facilitar el mecanismo de transporte celular deseado.

Se preparan patrones y se miden para el centelleo de base sin añadir el isótopo y se miden 100 \mul de un patrón de sucrosa 1M que contiene el isótopo para obtener el recuento de una solución 1 \mumolar de sucrosa. El centelleo pone de manifiesto que 1 \mumol de sucrosa proporciona aproximadamente 7000 cuentas, por lo tanto se calcula que 1 cuenta equivale a 1 x 10^{-6}/7000 ó 144 x 10^{-12} moles. Las cuentas de base de una solución de sucrosa no isotópica son 9 cuentas. El resultado de este ensayo pone de manifiesto una absorción lineal y progresiva del isótopo de sucrosa, como puede comprobarse en la siguiente tabla que recoge la naturaleza competente y viable de los protoplastos
formados.

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TABLA 1 Tiempo y cuentas de centelleo de la determinación de la absorción de sucrosa-I 14C en protoplastos de levadura

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El movimiento de solutos a través de la membrana puede realizarse por un gran número de métodos, en función del tamaño y de la carga de los solutos por el proceso de difusión o de adsorción. Con la fusión, transferencia entre membrana e intercambio de lípidos (entre liposomas y membranas celulares) se consigue una absorción facilitada de compuestos moleculares grandes en las células, con entrega en los anteriores endosomas. El proceso de absorción tiene lugar por acción de la fagocitosis, aunque es habitual la endocitosis, y requiere que los solutos estén encapsulados en una micela de carga superficial opuesta a la de la célula.

Durante la endocitosis tiene lugar una coalescencia inicial de los liposomas con una membrana plasmática celular, cuando las proteínas o las enzimas de la superficie celular, que están cargadas negativamente, se fijan sobre una carga positiva que se ha aplicado al liposoma con la posible adición ulterior de cationes estabilizadores, anticuerpos o propilenglicol, para asegurar la protección y la orientación correcta de las enzimas funcionalmente activas que se han fijado sobre la superficie de las células.

Una vez fijado sobre la superficie de la célula, el liposoma acabará envuelto por la membrana plasmática.

Una vez introducido dentro de la célula, el liposoma reside en el anterior endosoma. La acción de un entorno de pH reducido dentro de la célula, comprendido entre 5,6 y 5,9, combinado con una temperatura elevada de incubación de 37ºC facilita el intercambio de lípidos entre las 2 membranas, lo cual se traduce en un debilitamiento del liposoma y de la estructura endosómica.

A una temperatura elevada, la fluidez de las LUV y la alteración de la densidad de empaquetamiento provocada por el ergosterol facilitan la liberación del dextrano conjugado e el citoplasma celular. El principal mecanismo de liberación que se ha identificado en nuestro trabajo se debe a los componentes PE y DOPE que contienen ácido oleico, como se ha constatado por fluorescencia registrada dentro de las células con el uso de las fórmulas 4, 5, 11 y 12.

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TABLA 2 Resumen de los ensayos de endocitosis con varias fórmulas liposómicas que contienen dextrano-FITC

Todos los ensayos se realizan por duplicado y con un control negativo para evaluar la endocitosis del dextrano no encapsulado.

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Determinaciones de microscopía confocal y electrónica de la fusión celular y de la endocitosis

Se utilizan las imágenes confocales para identificar aquellos liposomas que sufren endocitosis activa con una liberación controlada de colorante fluorescente encapsulado en los protoplastos de levadura. La endocitosis se confirma por microscopía electrónica de transmisión, que proporciona imágenes de fusión protoplasto-liposoma y liposomas tanto grandes como pequeños fijados a la pared celular y liposomas pequeños hallados dentro del anterior endosoma de un citoplasma de célula de levadura.

Conclusión

Parece que la acción del DOTAP de facilitar la coalescencia entre los liposomas y el protoplasto de levadura es esencia para facilitar la fusión celular, mientras que la adición de la DOPE proporciona en particular una mayor liberación del dextrano conjugado fijado a los liposomas que contienen la fosfatidiletanolamina, pero los dos actúan en grados diversos.

Se puede concluir que los liposomas catiónicos que se forman a un pH más elevado que el pH del citoplasma de las células diana son capaces de fusionarse y de penetrar en el citoplasma de las células.

La acción de un mecanismo de liberación desencadenada que incorpora a la fosfatidiletanolamina es importante para liberar los componentes fijados dentro del liposoma, sin embargo la PE sola puede todavía proporcionar una liberación controlada de los contenidos liposómicos, si se aumentan la temperatura y el tiempo de incubación.

Claims (18)

1. Un liposoma para fusionarse con una célula de levadura, el liposoma está caracterizado porque el 40-50% molar de la bicapa de lípido del liposoma es fosfatidil-colina (PC), el 10-20% molar de la bicapa de lípido del liposoma es un anfífilo catiónico, aproximadamente un 10% molar de la bicapa de lípido del liposoma es un esterol y aproximadamente un 30% molar de la bicapa de lípido del liposoma es fosfatidil-etanolamina (PE) y/o dioleilfosfatidil-etanolamina (DOPE).

2. Un liposoma según la reivindicación 1, en el que el 50% molar de la bicapa de lípido del liposoma es PC.

3. Un liposoma según la reivindicación 1, en el que el 20% molar de la bicapa de lípido del liposoma es un anfífilo catiónico.

4. Un liposoma según la reivindicación 1, en el que el aproximadamente un 30% molar de la bicapa de lípido del liposoma es PE.

5. Un liposoma según la reivindicación 1, en el que el aproximadamente un 30% molar de la bicapa de lípido del liposoma es DOPE.

6. Un liposoma según la reivindicación 1, en el que el esterol es el ergosterol.

7. Un liposoma según la reivindicación 1, en el que el esterol es el colesterol.

8. Un liposoma según la reivindicación 1, en el que el anfífilo catiónico es el 1,2-dioleil-sn-glicero-3-trimetilamonio-propano (DOTAP).

9. Un liposoma según la reivindicación 1, en el que la bicapa de lípido del liposoma contiene además ácido oleico.

10. Un liposoma según la reivindicación 9, en el que aproximadamente un 5% molar de la bicapa de lípido del liposoma es ácido oleico.

11. Un liposoma según la reivindicación 1, en el que el liposoma tiene un diámetro entre 100 y 400 nm.

12. Un liposoma según la reivindicación 1, en el que las bicapas de lípido del liposoma se desestabilizan a un pH entre 5,0 y 6,0.

13. Un liposoma según la reivindicación 1, en el que el liposoma contiene además una molécula exógena, dicha molécula exógena es una molécula elegida entre el grupo formado por una proteína, enzima, aminoácido, ácido nucleico, azúcar y glutamato monosódico.

14. Un liposoma según la reivindicación 13, en el que la enzima es una 5'-fosfodiesterasa.

15. Un liposoma según la reivindicación 14, en el que la 5'-fosfodiesterasa es la fosfodiesterasa 1 (fosfohidrolasa de diéster de ácido ortofosfórico, EC 3.1.4.1).

16. Un liposoma según la reivindicación 13, en el que la enzima es la 5'-adenil-desaminasa.

17. Un proceso para producir un esferoplasto o protoplasto de una célula de levadura que contiene una molécula exógena y consiste en poner en contacto un esferoplasto o un protoplasto de célula de levadura con un liposoma ya definido en una cualquiera de las reivindicaciones de 13 a 16, que contiene la molécula exógena para permitir al esferoplasto o protoplasto la recepción del liposoma.

18. Un proceso según la reivindicación 17, en el que la molécula exógena es una enzima.