ES2285271T3 - Tratamiento de levaduras. - Google Patents
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Abstract
Un liposoma para fusionarse con una célula de levadura, el liposoma está caracterizado porque el 40-50% molar de la bicapa de lípido del liposoma es fosfatidil-colina (PC), el 10-20% molar de la bicapa de lípido del liposoma es un anfífilo catiónico, aproximadamente un 10% molar de la bicapa de lípido del liposoma es un esterol y aproximadamente un 30% molar de la bicapa de lípido del liposoma es fosfatidil-etanolamina (PE) y/o dioleilfosfatidil-etanolamina (DOPE).
Description
Tratamiento de levaduras.
La invención se refiere a liposomas para la
introducción de una molécula dentro de una célula de levadura y a
un proceso para obtener células de levadura, que consiste en
introducir una molécula exógena.
Las especies de levadura, como las de los
géneros Kluyveromyces y Saccharomyces, tienen un gran
número de utilidades en las industrias alimentaria y cervecera, por
ejemplo para proporcionar productos de fermentación y para
proporcionar intensificadores de sabor.
Existe demanda de cepas de levadura nuevas y
mejoradas en estas industria y actualmente estas cepas se obtienen
ya sea por cultivo y selección de una cepa de un fenotipo
particular, ya sea utilizando la tecnología de DNA recombinante
para introducir uno o más genes en una célula con el fin de obtener
un fenotipo particular. Aunque tales procesos sean útiles para
generar cepas de levadura, hay ciertas limitaciones que afectan a la
idoneidad de estos procesos para este fin. Por ejemplo, el cultivo
y la selección de una cepa con arreglo a un fenotipo particular es
una labor que requiere dedicación de tiempo, es cara y no permite
crear el fenotipo deseado. La tecnología del DNA recombinante
permite crear un fenotipo, pero las células de levadura producidas
por estas tecnología se reconocen típicamente como organismos
modificados genéticamente y esto conlleva a menudo consecuencias
perjudiciales para los productos que se obtienen a partir de tales
organismos.
A menudo, el factor crítico para obtener la
función efectora deseada y, con ello, el fenotipo útil en una nueva
cepa de levadura es la acción de una o más macromoléculas, por
ejemplo proteínas. Por consiguiente sería ventajoso que se pudieran
transfectar, en otras palabras introducir macromoléculas del tipo
proteínas en una célula de levadura para obtener el fenotipo
deseado, porque esto permitiría evitar las limitaciones de las
técnicas de cultivo y selección y también las técnicas basadas en la
tecnología del DNA recombinante.
Una manera de transfectar macromoléculas, por
ejemplo proteínas, en células consiste en el uso de liposomas. Un
liposoma es una estructura que contiene una o más esferas
concéntricas de una bicapa de lípido, que incluye un compartimento
acuoso. Hasta el momento no ha sido posible generar un liposoma que
sea capaz de transfectar una macromolécula, por ejemplo una enzima
activa, en una célula de levadura.
Los agentes o intensificadores de sabor, en
especial los ribonucleótidos y el glutamato monosódico se producen
de modo típico a partir de células de levadura según el
procedimiento siguiente. En primer lugar se lisan las células de
levadura para liberar una o más fracciones que contengan el RNA. En
segundo lugar se ponen en contacto las fracciones que contienen el
RNA con la 5'-fosfodiesterasa para producir
ribonucleótidos. Finalmente se calienta las fracciones para evitar
la posterior degradación de los ribonucleótidos. Estos procesos
suelen ser caros, requieren mucha dedicación de tiempo y habilidad
técnica y es notorio que dan lugar a productos que tienen un valor
bajo en el mercado.
Además, los ribonucleótidos se utilizan de modo
conveniente como intensificadores de sabor por adición de
nucleótidos como ingrediente a una mezcla destinada a la fabricación
de un alimento o de un producto alimentario. Un inconveniente de
ello es que en algunas circunstancias, el ribonucleótido tiene que
declararse con una etiqueta de aditivo para el producto
alimentario. Esto tiene consecuencias en el valor de mercado del
producto alimentario.
En vista de lo anterior, existe la necesidad de
mejorar las células de levadura, incluidas las células de levadura
destinadas a proporcionar intensificadores de sabor.
La invención busca por lo menos minimizar uno o
más de los problemas o limitaciones recién descritos para obtener
mejoras en las células de levadura, en especial células de levadura
destinadas a intensificadores de sabor.
En un aspecto, la invención proporciona un
liposoma para fusionarlo con una célula de levadura. Este liposoma
se caracteriza porque un 40-50% molar de la bicapa
de lípido del liposoma es fosfatidil-colina (PC), un
10-20% molar de la bicapa de lípido del liposoma es
un anfífilo catiónico, aprox. un 10% molar de la bicapa de lípido
del liposoma es un esterol y aprox. un 30% molar de la bicapa de
lípido del liposoma es la fosfatidil-etanolamina
(PE) y/o la dioleilfosfatidil-etanolamina
(DOPE).
Aquí se describe un proceso para la obtención de
una célula de levadura para su fusión con un liposoma. El proceso
consiste en tratar la célula de levadura para formar un esferoplasto
o protoplasto de célula de levadura.
Se describe aquí un proceso para introducir una
molécula exógena dentro de una célula de levadura. El proceso
consiste en poner en contacto un esferoplasto o un protoplasto de
célula de levadura con un liposoma que contiene una molécula
exógena en condiciones que permitan al esferoplasto o al protoplasto
la recepción del liposoma. El liposoma empleado en este proceso es
el que se ha descrito antes.
En otro aspecto, la invención proporciona un
proceso para producir una célula de levadura que contenga una
molécula exógena. El proceso consiste en poner en contacto un
esferoplasto o protoplasto de célula de levadura con la molécula
exógena en condiciones que permitan que el esferoplasto o el
protoplasto reciban al liposoma. El liposoma utilizado en este
proceso es el que se ha descrito antes.
Aquí se describe una célula de levadura
producida por el proceso recién descrito, así como el uso de una
célula de levadura, recién descrita, para producir un alimento, un
producto alimentario, un aditivo o un ingrediente para fabricar un
alimento o un producto alimentario.
En otro aspecto, la invención proporciona un
liposoma capaz de fusionarse con una célula de levadura. El liposoma
se caracteriza porque un 40-50% molar de la bicapa
de lípido del liposoma es PC, un 10-20% molar de la
bicapa de lípido del liposoma es el
1,2-dioleil-sn-glicero-3-trimetilamonio-propano
(DOTAP), aprox. un 10% molar de la bicapa de lípido del liposoma es
ergosterol y aprox. un 30% molar de la bicapa de lípido del liposoma
es PE y/o DOPE. El liposoma contiene además una
5'-fosfodiesterasa para hidrolizar la molécula de
RNA y formar un ribonucleótido en la célula de levadura.
En otro aspecto, la invención proporciona un
liposoma capaz de fusionarse con una célula de levadura. El liposoma
se caracteriza porque un 40-50% molar de la bicapa
de lípido del liposoma es PC, un 10-20% molar de la
bicapa de lípido del liposoma es el (DOTAP), aprox. un 10% molar de
la bicapa de lípido del liposoma es ergosterol y aprox. un 30%
molar de la bicapa de lípido del liposoma es PE y/o DOPE. El
liposoma contiene además una 5'-adenildesaminasa
para desaminar el adenilato y formar un nucleótido de
5'-inosina-fosfato.
Se describe aquí un proceso para producir un
liposoma que contenga una enzima, ya descrita antes. El proceso
consiste en obtener una dispersión de PC, de DOPE y/o de PE, de
ergosterol y de DOTAP en un disolvente orgánico, secar la
dispersión para formar lípidos secos y redispersar los lípidos secos
en un medio que contenga la enzima para formar un liposoma.
En otro aspecto, la invención proporciona un
proceso para producir una célula de levadura que contenga una
5'-fosfodiesterasa para hidrolizar una molécula de
RNA y formar un ribonucleótido. El proceso consiste en poner en
contacto un esferoplasto o protoplasto de célula de levadura con un
liposoma que contenga una enzima, ya descrita antes, que permita
que el esferoplasto o el protoplasto reciban al liposoma.
Aquí se describe una célula de levadura que
contiene una 5'-fosfodiesterasa que hidroliza a una
molécula de RNA para formar un ribonucleótido. La célula de
levadura es un producto del proceso recién descrito.
En otro aspecto, la invención proporciona un
proceso para producir una célula de levadura que contiene una
5'-adenildesaminasa para desaminar el adenilato y
formar un nucleótido de
5'-inosina-fosfato. El proceso
consiste en poner en contacto esferoplasto protoplasto de célula de
levadura con un liposoma que contiene una enzima, ya descrita
antes, para permitir que el esferoplasto o el protoplasto reciban al
liposoma.
Aquí se describe una célula de levadura que
contiene la 5'-adenildesaminasa para desaminar el
adenilato y formar un nucleótido de
5'-inosina-fosfato.
Aquí se describe un proceso para producir un
intensificador de sabor en una célula de levadura. El proceso
consiste en tratar una célula de levadura para formar un
esferoplasto o un protoplasto, poner en contacto el esferoplasto o
protoplasto con un liposoma que contenga una enzima para hidrolizar
una molécula de RNA y formar un nucleótido, en condiciones que
permitan que el esferoplasto o protoplasto reciban al liposoma y
proporcionar condiciones que permitan la hidrólisis de una molécula
de RNA en una célula de levadura por acción de la enzima del
liposoma, para obtener un intensificador de sabor.
Aquí se describe un proceso para producir un
intensificador de sabor en una célula de levadura. El proceso
consiste en tratar una célula de levadura para formar un
esferoplasto o protoplasto, poner en contacto el esferoplasto o
protoplasto con un liposoma que contenga una enzima para la
desaminación del adenilato y para formar un nucleótido de
5'-inosina-fosfato, en condiciones
que permitan al esferoplasto o protoplasto recibir al liposoma y
generar las condiciones que permitan la desaminación de un adenilato
en una célula de levadura por acción de la enzima del liposoma para
formar el intensificador de sabor.
Tal como se describe aquí, el inventor ha
producido un liposoma que es capaz de fusionarse con una célula de
levadura y, lo que es importante, es capaz de transferir una
molécula contenida en el liposoma al citoplasma de la célula de
levadura para permitir que la célula realice una función deseada en
la célula de levadura. La invención proporciona, pues, un liposoma
caracterizado porque:
- un 40-50% molar de la bicapa
de lípido del liposoma es PC,
- un 10-20% molar de la bicapa
de lípido del liposoma es anfífilo catiónico,
- aprox. un 10% molar de la bicapa de lípido del
liposoma es esterol y
- aprox. un 30% molar de la bicapa de lípido del
liposoma es PE y/o DOPE.
En una forma de ejecución, un 50% molar de la
bicapa de lípido del liposoma es PC. En otra forma de ejecución un
20% molar de la bicapa de lípido del liposoma es anfífilo. En otra
forma de ejecución, aprox. un 30% molar de la bicapa de lípido del
liposoma es DOPE. En otra forma de ejecución, aprox. un 30% molar de
la bicapa de lípido del liposoma es PE.
Típicamente, el esterol es el ergosterol o una
molécula que tenga una estructura similar, por ejemplo el
colesterol.
La esterilamina o la DOTAP son especialmente
útiles en el liposoma de la invención como anfífilos catiónicos.
La bicapa de lípido del liposoma puede contener
también ácido oleico. En una forma de ejecución, aprox. un 5% molar
de la bicapa de lípido del liposoma es ácido oleico. Es típico que,
cuando la bicapa de lípido del liposoma contiene también ácido
oleico, entonces menos del 30% molar de la bicapa de lípido del
liposoma sea PE y/o DOPE.
Los siguientes liposomas son especialmente
útiles para la fusión con y la transferencia e una macromolécula
contenida en el liposoma a una célula de levadura.
(a) un liposoma caracterizado porque:
- un 50% molar de la bicapa de lípido del
liposoma es PC;
- aprox. 30% molar de la bicapa de lípido del
liposoma es DOPE;
- un 10% molar de la bicapa de lípido del
liposoma es DOTAP; y
- aprox. un 10% molar de la bicapa de lípido del
liposoma es ergosterol.
\vskip1.000000\baselineskip
(b) un liposoma caracterizado porque:
- un 40% molar de la bicapa de lípido del
liposoma es PC;
- aprox. 30% molar de la bicapa de lípido del
liposoma es DOPE;
- un 20% molar de la bicapa de lípido del
liposoma es DOTAP; y
- aprox. un 10% molar de la bicapa de lípido del
liposoma es ergosterol.
\vskip1.000000\baselineskip
(c) un liposoma caracterizado porque:
- un 50% molar de la bicapa de lípido del
liposoma es PC;
- aprox. 30% molar de la bicapa de lípido del
liposoma es PE;
- un 10% molar de la bicapa de lípido del
liposoma es DOTAP; y
- aprox. un 10% molar de la bicapa de lípido del
liposoma es ergosterol.
\vskip1.000000\baselineskip
(d) un liposoma caracterizado porque:
- un 40% molar de la bicapa de lípido del
liposoma es PC;
- aprox. 30% molar de la bicapa de lípido del
liposoma es PE;
- un 20% molar de la bicapa de lípido del
liposoma es DOTAP; y
- aprox. un 10% molar de la bicapa de lípido del
liposoma es ergosterol.
De forma típica, el liposoma de la invención
contiene además una molécula que se tiene que introducir en una
célula de levadura. La molécula está contenida en el liposoma, en el
sentido de que puede estar encapsulada en el liposoma; es decir,
puede estar confinada dentro de un compartimento acuoso que está
definido por la bicapa de lípido del liposoma. Como alternativa, la
molécula puede estar ocluida o insertada dentro de la bicapa de
lípido y/o puede haber penetrado (protrusionado) dentro del
compartimento acuoso definido por la bicapa y/o protrusionado desde
la superficie de la bicapa de lípido del liposoma para establecer
contacto con la célula de levadura.
Además, la molécula contenida en el liposoma es
una "molécula exógena", en el sentido de que es una que no se
ha producido, ni se ha derivado ni se ha obtenido de la célula de
levadura, a la que dicha molécula va a transferirse. Por
consiguiente son moléculas exógenas las moléculas producidas por
métodos sintéticos o artificiales, incluidas las que no son de
origen natural y las moléculas producidas por células que no sean
células de levadura.
Sin embargo, se entenderá que una molécula
exógena puede ser idéntica a una molécula producida por una célula
de levadura. Por ejemplo, una 5'-fosfodiesterasa que
se obtiene de una célula de levadura es una molécula exógena para
una célula de levadura, a la que se pretende transferir la enzima,
en el caso en el que la enzima no se haya producido por ni obtenido
de la célula de levadura.
Se entenderá que la molécula contenga en el
liposoma pueda ser cualquier molécula que sea capaz de ser contenida
en un liposoma y que pueda impartir un efecto deseable una célula
de levadura. Son ejemplos de tales moléculas aquellas que son
útiles para producir productos de fermentación, tales como
proteínas, en especial enzimas, aminoácidos, ácidos nucleicos,
azúcares, compuestos orgánicos y glutamato monosódico.
Se entenderá además que en circunstancias
particulares, el liposoma antes descrito puede no contener la
molécula que se quiere introducir en la célula de levadura. Más en
concreto, en algunas circunstancias se reconoce que el liposoma
tiene una utilidad particular como superficie para la reacción de
uno o más sustratos. En tales circunstancias, el liposoma de la
invención no está dotado de otra molécula a introducir dentro de una
célula de levadura.
Tal como se describe aquí, se cree que el
liposoma de la invención transfiere o, en otras palabras, introduce
una molécula contenida en el liposoma en una célula de levadura por
endocitosis. Por consiguiente, el liposoma tiene de modo típico un
diámetro que permita la endocitosis del liposoma en la célula de
levadura. Un diámetro apropiado para el liposoma se sitúa entre 100
y 400 nm y un liposoma particularmente útil es el que tiene un
diámetro entre 200 y 400 nm.
Se cree que la desestabilización de la bicapa de
lípido del liposoma es un paso importante en el proceso de fusión
del liposoma con la bicapa endosómica de la célula de levadura, que
conduce a la transferencia de una molécula que puede estar
contenida en el liposoma a la célula de levadura. Una estrategia
para provocar la desestabilización de la bicapa de lípido del
liposoma consiste en adaptar el liposoma de manera que la bicapa de
lípido sea sensible a las fluctuaciones del pH. Por ejemplo, el
liposoma de la invención se adapta a la desestabilización de las
bicapas de lípidos de liposoma en el pH del endosoma de la levadura.
Es particularmente útil un liposoma que contenga bicapas de lípido
adaptadas a la desestabilización a un pH entre 5,0 y 6,0.
En los ensayos que han conducido a la invención,
el inventor ha reconocido que ciertas manipulaciones de una célula
de levadura pueden ser especialmente útiles para permitir la fusión
del liposoma con la célula de levadura, por ejemplo para transferir
una molécula contenida en el liposoma a la célula de levadura. Más
en concreto, el inventor reconoce que sería necesario quitar por lo
menos en parte ciertas moléculas, incluidos los complejos de
\alpha-(1-6)- y
-(1-3)-manano (goma de
levadura)/proteína y el complejo de \beta-(1-6)- y
-(1-3)-glucano (celulosa de
levadura)/proteína con un armazón de quitina, de la célula de
levadura para formar un esferoplasto de célula de levadura o
quitarlas de forma más sustancial para formar un protoplasto de
célula de levadura. Tal como se describe aquí, la membrana exterior
de lípido de un protoplasto de célula de levadura, también conocida
como plasmalema o membrana plasmática, contiene fundamentalmente
proteínas, esteroles, esfingolípidos y fosfolípidos. La plasmalema
es suficiente para proporcionar una barrera que regula el transporte
de especies moleculares hacia dentro y hacia fuera de la célula de
levadura. El inventor ha encontrado de modo sorprendente que el
tratamiento aquí descrito es suficiente para quitar por lo menos
parcialmente la goma de levadura y la celulosa de levadura y
todavía es suficientemente sensible para proporcionar esferoplastos
o protoplastos de células de levadura viables que son capaces de
endocitosis del liposoma de la invención.
Aquí se describe un proceso para la obtención de
una célula de levadura para la fusión con un liposoma que consiste
en el paso de tratar una célula de levadura para formar un
esferoplasto de célula de levadura o un protoplasto de célula de
levadura.
La célula de levadura se trata por ejemplo para
formar un esferoplasto o un protoplasto de célula de levadura
poniendo en contacto la célula de levadura con una o más enzimas
para la digestión por lo menos parcial de la goma de levadura y de
la celulosa de levadura. Para este fin son enzimas especialmente
indicadas la liticasa y la \beta-glucuronidasa.
El proceso puede consistir en el paso adicional de aislamiento del
esferoplasto o del protoplasto. Para este fin es particularmente
indicado un gradiente de densidad. Por ejemplo, las células de
levadura para el tratamiento en el proceso para producir
esferoplastos o protoplastos de célula de levadura son células que
existen en fase de crecimiento exponencial. Antes del tratamiento de
las células de levadura para formar un esferoplasto o un
protoplasto de célula de levadura, las células de levadura pueden
lavarse para eliminar el medio de cultivo de dichas células de
levadura.
Aquí se describe un proceso para introducir una
molécula exógena dentro de un esferoplasto o protoplasto de célula
de levadura. El proceso consiste en poner en contacto un
esferoplasto o protoplasto de célula de levadura con un liposoma
que contenga la molécula en condiciones que permitan que el
esferoplasto o protoplasto reciban al liposoma. El liposoma
empleado para este proceso es por ejemplo el que se ha descrito
antes.
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Tal como se describe aquí, el inventor ha
observado que el liposoma de la invención es recibido por un
esferoplasto o un protoplasto de célula de levadura por
endocitosis. El esferoplasto o protoplasto de célula de levadura se
ponen en contacto con el liposoma por ejemplo para que permitan al
esferoplasto o protoplasto recibir al liposoma o, en otras
palabras, la endocitosis del liposoma, a una temperatura en torno a
37ºC. Tal como se describe aquí, el esferoplasto o protoplasto y el
liposoma pueden ponerse en contacto por endocitosis en un tampón
que tenga una osmolaridad compatible con una célula de levadura.
La invención proporciona un proceso para
producir un esferoplasto o protoplasto de célula de levadura que
contenga una molécula exógena. El proceso consiste en poner en
contacto un esferoplasto o protoplasto de célula de levadura con un
liposoma que contenga una molécula para permitir que el esferoplasto
o protoplasto reciban al liposoma. El liposoma empleado en este
proceso es el que se ha descrito antes.
El esferoplasto o protoplasto de célula de
levadura pueden ponerse en contacto para permitir al esferoplasto o
protoplasto recibir al liposoma según las condiciones descritas
antes. El proceso puede consistir en el paso adicional de cultivar
un esferoplasto o protoplasto de célula de levadura provistos de una
molécula exógena para proporcionar una célula de levadura.
Aquí se describe una célula de levadura, un
esferoplasto o un protoplasto producidos por el proceso recién
descrito. Son células, esferoplastos y protoplastos especialmente
idóneos para el uso en el proceso recién descrito los
pertenecientes a los géneros Kluyveriomyces y
Saccharomyces.
Aquí se describe el uso de una célula de
levadura, descrita antes, para producir un alimento, un producto
alimentario, un aditivo o un ingrediente para producir un alimento o
un producto alimentario. El uso de la célula de levadura puede ser
un proceso que consiste en el paso de poner en contacto la célula de
levadura con una composición para producir un alimento, un producto
alimentario, un aditivo o un ingrediente para la producción de un
alimento o de un producto alimentario.
Aquí se describe además un alimento, un producto
alimentario, un aditivo o un ingrediente para la producción de un
alimento o de un producto alimentario, producido por una célula de
levadura aquí descrita. El alimento, el producto alimentario, el
aditivo o el ingrediente para la producción de un alimento o de un
producto alimentario es por ejemplo un producto producido por
fermentación o por reacción de Maillard. Los ejemplos incluyen a
los productos que contienen proteínas vegetales hidrolizadas.
Un liposoma especialmente útil para la invención
contiene la 5'-fosfodiesterasa que hidroliza
moléculas de RNA de una célula de levadura para producir
5'-ribonucleótidos. Por consiguiente, la invención
proporciona un liposoma caracterizado porque:
- un 40-50% molar de la bicapa
de lípido del liposoma es PC,
- un 10-20% molar de la bicapa
de lípido del liposoma es DOTAP,
- aprox. un 10% molar de la bicapa de lípido del
liposoma es ergosterol y
- aprox. un 30% molar de la bicapa de lípido del
liposoma es PE y/o DOPE; dicho liposoma contiene
5'-fosfodiesterasa.
Este liposoma es particularmente útil porque,
tal como se ha descrito antes, tal liposoma puede transfectar una
5'-fosfodiesterasa a una célula de levadura que
permita a la 5'-fosfodiesterasa hidrolizar moléculas
de RNA del citoplasma para producir ribonucleótidos. Por
consiguiente, una ventaja especial de tal liposoma es que pueden
proporcionarse ribonucleótidos para el uso como intensificadores de
sabor sin los pasos previos de purificación del RNA de un lisado de
células de levadura, digiriendo el RNA con la enzima y aislando los
productos ribonucleótidos. Otras enzimas o compuestos capaces de
formar un compuesto para proporcionar sabor a un alimento o
producto alimentario o para proporcionar sabor a ingredientes para
fabricar un alimento o producto alimentario pueden incluirse en el
liposoma. Un ejemplo de tal enzima es la
5'-adenil-desaminasa.
Otro liposoma especialmente útil de la invención
contiene la 5'-adenil-desaminasa
para desaminar el adenilato y producir un nucleótido de
5'-inosina-fosfato. La invención
proporciona, pues, un liposoma caracterizado porque:
- un 40-50% molar de la bicapa
de lípido del liposoma es PC,
- un 10-20% molar de la bicapa
de lípido del liposoma es DOTAP,
- aprox. un 10% molar de la bicapa de lípido del
liposoma es ergosterol y
- aprox. un 30% molar de la bicapa de lípido del
liposoma es PE y/o DOPE; dicho liposoma contiene
5'-adenil-desaminasa.
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Aquí se describe un proceso para producir un
liposoma que contiene una enzima, ya descrita antes. El proceso
consiste en formar una dispersión de PC, DOE y/o PE, ergosterol y
DOTAP, en un disolvente orgánico, secar la dispersión para obtener
los lípidos secos y redispersar los lípidos secos en un medio acuoso
que contenga la enzima en forma de liposoma. Tal como se describe
aquí, es particularmente útil una solución 2:1 de
cloroformo-metanol como disolvente orgánico para
formar una dispersión de los lípidos. De forma típica, el proceso
consiste en un paso adicional de aislamiento de liposomas que
tengan un diámetro de unos 400 nanómetros.
La invención proporciona además un proceso para
producir un esferoplasto o un protoplasto de célula de levadura que
contenga una enzima recién descrita. El proceso consiste en poner en
contacto un protoplasto de célula de levadura con un liposoma que
contenga la enzima para permitir al esferoplasto o protoplasto
recibir al liposoma. Tal como se describe aquí, el inventor ha
observado que el liposoma de la invención es recibido por un
esferoplasto o protoplasto de célula de levadura por endocitosis. De
modo típico, el esferoplasto o protoplasto de célula de levadura se
ponen en contacto para permitir que el esferoplasto o protoplasto
reciban al liposoma o, en otras palabras, para efectuar la
endocitosis del liposoma a unos 37ºC. Tal como se describe aquí, el
esferoplasto o protoplasto y el liposoma se ponen en contacto para
efectuar la endocitosis en un tampón que tenga una osmolaridad que
sea compatible con una célula de levadura.
Aquí se describe una célula de levadura que
contiene una enzima para hidrolizar una molécula de RNA y formar un
ribonucleótido. La célula de levadura es la producida por el proceso
descrito antes.
Se describe también aquí una célula de levadura
que contiene una enzima para la desaminación del adenilato y la
formación de un nucleótido
5'-inosina-fosfato. La célula de
levadura es la producida por el procedimiento descrito antes.
Aquí se describe un proceso para producir un
intensificador de sabor en una célula de levadura. El proceso
consiste en tratar una célula de levadura para formar un
esferoplasto o protoplasto, poner en contacto el esferoplasto o
protoplasto con un liposoma que tenga una enzima tal como se ha
descrito antes para permitir al esferoplasto o protoplasto recibir
al liposoma y proporcionar condiciones para que la enzima del
liposoma pueda realizar funciones de enzima de una célula de
levadura y producir el intensificador de sabor.
Aquí se describe además un intensificador de
sabor producido por el proceso antes descrito. El intensificador de
sabor producido por el proceso de la invención es por ejemplo un
ribonucleótido, tal como el
5'-guanosina-monofosfato, el
5'-citosina-monofosfato, el
5'-adenosina-monofosfato o el
5'-uracil-monofosfato. El
ribonucleótido es con preferencia el
5'-guanosina-monofosfato o el
5'-inosina-monofosfato. El
intensificador de sabor puede ser también un compuesto del tipo
glutamato monosódico.
Aquí se describe un alimento o producto
alimentario o un ingrediente para producir un alimento o producto
alimentario que contiene un agente o intensificador de sabor
producido por el proceso antes descrito. El alimento o producto
alimentario o el ingrediente o el aditivo para producir el alimento
o producto alimentario por el proceso descrito antes es típicamente
un producto fermentado o un producto de sabor o una bebida producida
por fermentación o por reacción de Maillard o que contenga un
producto de una de estas reacciones.
Aquí se describe una composición que contiene un
liposoma ya descrito antes.
Se adquieren a la empresa Sigma Aldrich (Castle
Hill, Australia) la fosfatidil-colina de soja (PC),
la dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE), la
fosfatidil-etanolamina de soja (PE), el
1,2-dioleil-sn-glicero-3-trimetilamonio-propano
(DOTAP), el ergosterol (ERGO), la calceína,
fluoresceína-isotiocianato-dextrano
(FITC-FD 250S), dextrosa, base trisma, Ficoll tipo
70, FC-77 fluorado, aceite de baño de punto de
fusión,
I-sucrosa-ul-14C,
aceite de silicona AR 200, liticasa y
\beta-glucuronidasa - tipo H2. La Sepharose
CL-4B se adquiere a la empresa Amersham Biosciences
(Castle Hill, NSW). La sorbita se adquiere a la empresa
Med-Chem (Kew, Vic). El extracto de levadura y la
peptona bacteriana se adquieren a la empresa Oxoid Chemicals
(Heidelberg, Vic). El Saccharomyces cerevisiae y el K.
marxianus (FRR 1337) se obtienen por cesión gentil de la empresa
Food Science Australia (North Ryde, NSW). Los productos químicos y
disolventes restantes son de calidad HPLC.
Se utilizan un evaporador rotatorio Büchi y un
liofilizador Heto FD-3 para secar inicialmente y
después eliminar todas las trazas de disolventes orgánicos de las
películas de fosfolípidos obtenidas por
re-hidratación realizada en un baño de agua de
temperatura controlada Braun Certomat WT. La formación de vesículas
multilamelares (MLV) se realiza inicialmente en un baño de
ultrasonidos Braun 1200 con la adición de esferillas de vidrio de 2
mm para facilitar la eliminación del lípido seco de las paredes del
matraz. La reducción de tamaño de los liposomas de las MLV para
obtener vesículas unilamelares grandes (LUV) se realiza en una
extrusora Avestin Lipo-fast basic con estabilizador
que incorpora filtros de membrana de policarbonato de 400 nm después
de una serie de ciclos de pasos de congelación y descongelación en
un intervalo de -80ºC y 40ºC utilizando un congelador de
laboratorio y un baño de agua caliente. Este paso tiende a
incrementar el volumen de captura con el liposoma formado. Las LUV
se separan de cualquier material no encapsulado por filtración a
través de gel empleando un sistema completo de FPLC de proceso de
gradiente Amersham Pharmacia AKAT con un monitor modelo 900,
lámpara y detector (ajustado a 280 nm), una bomba modelo 920 e
incorporando un colector de fracciones Frac 950 conectado a un
ordenador del tipo Compaq Desk Pro Pentium III, que soporta
programas informáticos analíticos Unicorn. La columna empleada en
el cromatógrafo es una columna K9-30 con relleno de
esferillas de Sepharose CL 4B (de 45 \mum a 165 \mum) y
provista de dos filtros soportes de 25 \mum. Se monta la columna
en una depósito de envasado RK16/26 y se lleva empleando una bomba
peristáltica de velocidad variable. El tamaño de partícula de los
liposomas de LUV formados se estima con un analizador de partículas
de lecho largo del tipo Malvern Mastersizer-S
conectado a un ordenador del ACO Pentium II, que soporta programas
informáticos analíticos del tipo Mastersizer, versión 2.18. Para
incubar la levadura se emplea un agitador orbital Bioline,
realizando el lavado, formación de culotes y separaciones de
densidad de las células y protoplastos en una centrífuga Beckman
J2-H2 utilizando un rotor JA 20 de cabezal fijo así
como un rotor de cabezal de cangilón oscilante
JS-13 específicamente para la separación del
protoplasto. La confirmación de la viabilidad del protoplasto se
realiza por absorción de sucrosa C14 y se mide en un analizador de
centelleo de líquidos del tipo Packard 1600 TR, después de
centrifugar los protoplastos en un aparato del tipo Beckman 152
Microfuge con un gradiente de silicona y aceite.
La confirmación de la endocitosis fluorescente
se realiza con un microscopio del tipo Leica TCS-4D
Confocal equipado con un láser de mezcla de gases criptón y argón y
una longitud de onda de excitación de 488 nm, que está conectado a
un ordenador Dell Pentium 2 que soporta programas informáticos de
análisis por la imagen del tipo Leica Scan-ware. El
análisis por la imagen detallado de las células para identificar la
posición de los liposomas dentro del citoplasma y la membrana
plasmática se realiza con un microscopio de transmisión electrónica
del tipo Philips CM 100 y las imágenes se captura con una cámara
digital del tipo Gatan Dual Vision.
Antes de utilizarse en los ensayos, todos los
objetos de vidrio se lavan con un detergente exento de fosfato y
después se sumergen en ácido nítrico 5M y se enjuagan en agua
tratada con Milli Q para eliminar cualquier traza de material
proteináceo, lípido o sal residuales en un intento de evitar
cualquier oxidación inesperada de los fosfolípidos y cualquier
posible inserción de materiales extraños a las bicapas de lípidos
formadas, que pudieran cambiar la carga o la densidad de
empaquetamiento de los liposomas creados.
Se preparan soluciones patrón de 20 mg/ml de PC,
PE, DOPE, DOTAP y ERGO. Se preparan disolviendo 20 mg de cada
lípido en 1 ml de una solución 2:1 (v/v) de cloroformo y metanol,
que se filtra a través de un filtro Millipore de 0,45 \mum y se
almacena a 4ºC hasta el momento del uso.
Se utilizan exclusivamente matraces, probetas,
jeringuillas de vidrio y agujas de acero inoxidable para preparar
estas mezclas y evitar la posible migración de monómeros de plástico
desde las puntas de la pipeta o desde los filtros que pudieran
contaminar y alterar la configuración de empaquetamiento de las
micelas de fosfolípidos, que podría traducirse en un vertido
prematuro de los materiales ocluidos durante el almacenaje de la
suspensión de liposoma.
En un matraz de fondo redondo Quick fit de 100
ml, que se ha lavado, se introducen 5 ml de la solución 2:1 de
cloroformo-metanol para asegurar la dispersión
adecuada de los fosfolípidos. Después se añade un total de 250
\mul de la mezcla de lípidos de soluciones patrón de 20 mg/ml y se
agita suavemente durante 1 hora. Se forran los matraces con lámina
de aluminio para proteger los lípidos contra la oxidación causada
por la luz UV y se hace un barrido con nitrógeno de la cavidad
superior vacía durante 5 minutos para eliminar el oxígeno de dicha
cavidad antes de conectar el matraz al evaporador rotatorio Büchi.
Se evaporan los disolventes con vacío a 60 rpm durante 90 minutos
en un baño de agua mantenido a 37ºC, que es superior a la
temperatura de transición de fases (TmºC) para el componente
fosfatidilcolina, con lo cual se asegura que todos los lípidos
están en la fase cristalina líquida, permitiendo una dispersión
uniforme. Se cubre el evaporador con una lámina de plástico negro
para asegurar que el paso de luz sea mínimo. Para asegurar la
eliminación de todos los disolventes de los lípidos secados, se
congelan finalmente los matraces a -52ºC con una presión de 0,001
mbar durante 2 horas y después se lavan de nuevo con nitrógeno, se
sellan y se almacenan a -80ºC hasta el momento de la
rehidratación.
Se hidratan las películas secas de fosfolípido
en un proceso de dos pasos para evitar la precipitación o
floculación del lípido de carga catiónica DOTAP, que se sensible a
la concentración milimolar de polianiones tales como la calceína,
el fosfato o el EDTA, así como la presencia de cationes monovalentes
o divalentes en concentraciones superiores a cinco milimolar. Se
observa el fenómeno de separación de los lípidos catiónicos durante
nuestro trabajo y se investiga y se corrige el proceso durante
nuestros ensayos por hidratación de la película inicialmente en
agua tratada con Milli Q a 37ºC durante 30 minutos para iniciar la
formación de un complejo micelar. Después se realiza una
hidratación de 30 minutos a 1 hora con el encapsulante deseado en
una solución debidamente tamponada a pH 7,2 para inducir una
sensibilidad catiónica en el liposoma. En nuestros ensayos iniciales
se utiliza una solución 20 mM de calceína en Trisma 10 mM ajustada
a pH 7,2 y después se continúa con una solución de 10 mg/ml de
isotiocianato de fluoresceína-dextrano FD 250S para
asegurar que se evita el movimiento pasivo de una molécula más
pequeña a través de la membrana de plasma de nuestros protoplastos,
que se hayan formado. En ensayos tempranos se ha identificado que
cuando se incuba sola la calceína de peso molecular más bajo con
los protoplastos formados existe un poco de migración pasiva de esta
molécula a través de la membrana del plasma o bien nuestras
células, produciendo un resultado positivo falso. La sustitución de
la calceína por el dextrano FITC 250 kDa permite eliminar esta
situación y proporciona datos cuidadosos de la endocitosis
liposómica inducida. Después se someten los lípidos hidratados a
ciclos de congelación y descongelación 3 veces a -80ºC y 37ºC en un
intento de aumentar la captura de volumen del colorante fluorescente
dentro de las bicapas de lípidos al tiempo que se evita el colapso
del dextrano conjugado con FITC. Se realiza un breve tratamiento de
10 minutos en un baño de ultrasonidos para finalizar el desarrollo
de las MLV y a mismo tiempo reducir cualquier agregación excesiva
entre las micelas. Después se extruye cada una de las soluciones en
una extrusora Avestin Lipofast basic con estabilizador.
La extrusora Avestin Lipofast basic es un
aparato de extrusión manual que tiene una capacidad de 1 mililitro
y utilizado 2 jeringuillas Hamilton herméticas al gas incorporadas
al efecto, ajustadas a un par de soportes de membrana de cuatro
agujeros, que incluyen un filtro de policarbonato prisionero de una
carcasa de acero inoxidable. Antes de cada uso se lavan los
componentes de la extrusora con agua y después con una solución 2:1
de cloroformo:metanol para eliminar cualquier lípido residual y se
lavan de nuevo con agua tratada con Milli Q y se dejan secar antes
de volver a montarlos. En nuestros ensayos se emplean filtros de
policarbonato desechables de 400 nm, que se encaja en los soportes
de la membrana con tenazas para evitar la contaminación con lípidos
accesorios. El trabajo posterior permite identificar que los filtros
de 200 nm son más apropiados para una mayor entrada endocitótica de
nuestros liposomas a través de la pared celular basada en las
micrografías electrónicas de transmisión de liposomas grandes que
se adhieren a la pared de la membrana exterior y liposomas pequeños
que pasan al citoplasma de los protoplastos. El inconveniente de
este supuesto es que también se reduce el volumen de captura del
liposoma. Después del montaje de la extrusora se llenan
individualmente las jeringuillas con tampón Trisma 10 mM de pH 7,2
y se extruyen a través del filtro de policarbonato en la jeringuilla
opuesta y se descartan los contenidos. Se repite esta operación con
la otra jeringuilla, pero realiza en dirección opuesta con la
intención de prehumectar el lecho de relleno para un paso más fácil
de la solución de lípido a través de la membrana así como eliminar
cualquier colorante o lípido residuales que se hayan podido adherir
a la carcasa de la extrusora.
Se sumergen en un baño de agua a 37ºC la
extrusora y los matraces que contienen las MLV para precalentar el
aparato y asegurar que los lípidos se hallan en estado cristalino,
lo cual permite un paso más fácil a través de la extrusora. Se
pasan las soluciones a través de la extrusora en un sentido de
avance y de retroceso 23 veces para lograr una dispersión homogénea
de las LUV. Es importante para cada extrusión finalizar el
procedimiento en la jeringuilla opuesta para evitar la resuspensión
de cualquier material atrapado que pudiera estar presente en el
filtro durante el primer paso. Se envasan las soluciones, que se
vuelven transparentes después de extrusiones repetidas, en tubos
Eppendorf preesterilizados de 2 ml, que se cubren con una lámina de
aluminio y se almacenan a 4ºC antes de la filtración a través de
gel.
El tampón para la filtración a través de gel
consiste en sorbita 1 M, cloruro potásico 100 mM, Trisma base 25 mM
y cloruro magnésico 100 \muM, ajustado a pH = 7,2. Antes de su
utilización se filtra el tampón y se desgasifica con vacío durante
10 minutos y se prepara con agua Milli Q. Después de la filtración
el tampón se hierve para eliminar cualquier aire remanente y se
mantiene en un baño encapsulado a 37ºC para asegurar que los
lípidos se hallan en la fase líquida durante la filtración. Los
requisitos para eliminar el aire ocluido del tampón antes de su
utilización son aumentar el grado de separación entre los liposomas
y el colorante libre evitando la compresión de las esferillas
blandas de relleno de Sepharose. Antes del uso se equilibra la
columna con tres volúmenes de tampón para eliminar cualquier etanol
o azida sódica residuales, que se emplean como conservantes dentro
de las tuberías de FPLC y la columna con relleno de Sepharose,
mientras que las columnas que no están en uso se almacenan en un
frigorífico a 4ºC. En el método de separación se emplea un caudal de
0,5 ml/min y se inyectan dos mililitros de suspensión de liposoma
en la columna, con una efica-
cia de elución del 95%. El volumen de proceso que se emplea es de 79 ml y el tiempo de proceso es de 197 minutos.
cia de elución del 95%. El volumen de proceso que se emplea es de 79 ml y el tiempo de proceso es de 197 minutos.
Para la producción de protoplastos de levadura
se descongela un cultivo liofilizado de Saccharomyces
cerevisiae (YNN 281) y después se propaga a 30ºC durante 20
horas en un agitador de 120 rpm a temperatura controlada y se
cultiva en medio YEPD esterilizado que contiene un 1,5% (p/v) de
extracto de levadura, un 2% (p/v) de peptona bacteriana y un 2,0%
(p/v) de dextrosa, ajustado a pH = 6,5. Después de la incubación se
lavan dos veces las células con una solución estabilizada
osmóticamente de cloruro potásico 0,65M, Trisma base 25 mM y
cloruro magnésico 100 \muM, ajustada a pH = 6,5. El requisito de
concentración para el protocolo de suspensión se basa en la
comprensión de la presión osmótica intracelular y la concentración
de la levadura en reposo de Saccharomyces cerevisiae,
definida empleando los datos del punto de depresión por congelación.
Se realiza la centrifugación de las células recolectadas a 4ºC en
una centrífuga Beckman J2 H2 a 10.000 rpm durante 15 minutos.
Se ha identificado que la porosidad y el
contenido de lípidos de la membrana plasmática de la levadura puede
alterarse para un transporte endocitótico facilitado de compuestos
de peso molecular más elevado si se manipulan las condiciones de
tiempo, temperatura y pH, o se modifican los solutos en los medios
soportadores para intensificar el crecimiento de la membrana de
lípidos.
Para la digestión de las paredes de nuestra
célula de levadura se prepara un digesto de enzima que contiene 2
mg/ml de liticasa y 1 mg/ml de jugo intestinal de serpiente
(\beta-glucuronidasa de Helix pomatia) en
una solución de cloruro potásico 0,65M, Trisma base 25 mM y cloruro
magnésico 100 \muM ajustada a pH 6,5. Esta solución es la misma
que se emplea para el lavado y la resuspensión de células de
levadura recolectadas. Se preparan los protoplastos de una
suspensión de 4 ml de células lavadas y se añade 1 ml de preparación
de enzima. Se efectúa la incubación en frascos cónicos sellados y
se ha reaccionar a 37ºC durante 3 en un agitador rotatorio a 120
rpm de temperatura controlada para producir nuestros protoplastos
viables.
Después se construye un gradiente de densidad de
cinco hileras en tubos Falcon para aislar los protoplastos a partir
de células intactas y remanentes de pared celular en el intervalo
comprendido entre 1,04 g/l y 1,10 g/l. Cada solución contiene
sorbita en una concentración de 0,65 M a 1 M, 25 mM de Trisma base,
100 \muM de cloruro magnésico y un 5% o un 10% de Ficoll en las
fracciones más densas. Se estabiliza cada solución a pH 7,2 y se
deposita un total de 5 ml de cada solución en los tubos Falcon
empezando por la fracción más densa y acabando con el digesto de
enzima de levadura. Se cierran los tubos, se colocan en una
centrífuga Beckman y se centrifugan durante 15 minutos a 1000 rpm y
a 4ºC para aislar los protoplastos.
Para asegurar la naturaleza competente del
protoplasto formado para realizar la endocitosis se cultivan células
de levadura en medio YEPD modificado, en el que se sustituye un 2%
(p/v) de dextrosa por un 4% (p/v) de sucrosa como fuente de carbono
para facilitar el mecanismo de absorción y de transporte de la
sucrosa C14 a cargo de las células de levadura. Se forman los
protoplastos del modo antes descrito y se aíslan de nuevo
utilizando un gradiente de densidad basado en la sorbita. El
aislamiento en aceite de silicona de los protoplastos es un método
conveniente para separar células radiomarcadas de una solución de
gradiente de azúcar. En este procedimiento se incuban las células
en una solución radiactiva durante un período especificado de hasta
1 hora, tal como se ha visto en nuestros ensayos, y se centrifugan
a través de aceite de silicona en una densidad específica para
separarlas para el recuento de centelleo. Se preparan siete
microtubos (400 \mul) para obtener culotes de protoplastos, cada
uno de ellos contiene 10 \mul de FC 77 fluorado como solución de
captura y 100 \mul de aceite de silicona AR 200 (densidad de 1,05
g/l) como media a utilizar para la separación de protoplastos en
sucrosa C14. En el ensayo se emplean 40 \mul de sucrosa 1M
(preparada en un matraz volumétrico de 50 ml), a los que se añaden
2 \mul del patrón de sucrosa C14. Después se colocan 1,2 ml de la
suspensión de protoplastos en un tubo Eppendorf de 1,5 ml y en el
tapón se sitúan 12 \mul de la solución 1M de sucrosa C14. El
período de incubación se inicia cuando el tapón se sella sobre el
tubo Eppendorf. A continuación se sacan partes alícuotas de 100
\mul de protoplastos cada 10 minutos y se colocan sucesivamente en
una serie de tubos de 400 \mul preparados con gradientes de
aceite de silicona y se centrifugan a 7000 rpm durante 10 segundos.
Se sacan tubos en cada intervalo de tiempo y se vierten a través de
la fracción superior de aceite de silicona para capturar el culote
de protoplastos formados y se resuspende en 100 \mul de agua
tratada con Milli Q en un tubo de centelleo que contiene 3 ml de
líquido de centelleo. Como patrón se toman 100 \mul de volúmenes
de sucrosa 1M que contiene C14 para el recuento, pero no se
centrifuga a través del aceite de silicona como los protoplastos
sin isótopo, sino que estos se centrifugan a través del aceite de
silicona y se cuentan para evitar la corrección de atenuación del
extracto de protoplastos.
Se traza una gráfica de las cuentas, registrada
en forma de nmoles de sucrosa absorbida, frente al tiempo para
confirmar la absorción de nuestro isótopo de sucrosa en los
protoplastos competentes.
Se dispensa una parte alícuota de 0,8 ml de una
suspensión de protoplasto a través de una punta de pipeta de
orificio grande (para asegurar que será minímo el trastorno que
sufra el frágil protoplasto) a un tubo Eppendorf esterilizado, en
el que se han introducido 0,8 ml de la suspensión de liposoma
obtenida por filtración a través de gel. Ambas soluciones son de
densidades equivalentes para asegurar la estabilidad del protoplasto
y se mezclan suavemente antes de iniciar la incubación. Se forran
los tubos individualmente con una lámina y se forran lateralmente
con una lámina de espuma Styrofoam, que a su vez está forrada con
una lámina para asegurar que los tubos permanecerán en su sitio y
después se sumergen en un baño de agua a 37ºC durante un período de
incubación de 90 minutos.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Se aplica una muestra de 20 \mul de la
suspensión incubada sobre un portaobjetos del microscopio, con los
bordes del vidrio deslizante superior sellados con una resina
acrílica para impedir el secado de la muestra. Una vez realizada la
aplicación se almacenan los cristales en la oscuridad para reducir
el riesgo de pérdida de fluorescencia del conjugado de FITC y se
examinan inmediatamente en contraste de fases y fluorescencia
empleando un microscopio confocal.
La técnica utilizada para preparar células
montadas en bloques para el análisis por la imagen requieren 0,5 ml
de la suspensión de protoplasto-liposoma fijados con
50 \mul de glutaraldehído del 1,25% (p/v) y paraformaldehído del
1,0% (p/v) en tampón cacodilato 0,2M de pH = 7,2 durante 1 hora.
Después se mezcla la suspensión fijada con un volumen similar de
agarosa del 5,0% y se deja sedimentar a 4ºC durante 20 minutos. Se
cortan pequeños cubos de la mezcla (aproximadamente 2 mm^{3}) y
se fijan a 4ºC durante 14 horas más. Después se fijan las muestras
con tetróxido de osmio del 1,0% (p/v), se tiñen en bloque con
acetato de uranilo del 2,0% (p/v), se deshidratan a través de una
serie gradual de etanol y se sumergen en resina Epon/Araldit.
Se cortan secciones ultrafinas con un
ultramicrotomo Leica y se recogen en rejillas de cobre/paladio. Se
tiñen las secciones con acetato de uranilo del 4,0% (p/v) y acetato
de plomo Reynolds y se examinan con un microscopio electrónico de
transmisión Philips CM 100 y las imágenes se captan con una cámara
digital Gatan Dual Vision.
Se maceran raicillas de cebada en un mezclador
Waring. Después se filtra la solución resultante a través de una
tela de queso y se centrifugan a 4ºC y a 10.000 rpm durante 20
minutos para eliminar los restos de raicillas. Se separa el líquido
sobrenadante y se calienta a 60ºC durante 1 hora. Se centrifuga de
nuevo la solución a 4ºC y 10.000 rpm durante 20 minutos, se recoge
el líquido sobrenadante y se desaliniza en una columna Hitrap 26/10
en un aparato FPLC. Se pasa la solución desalinizada a través de un
aparato de intercambio aniónico empleando una columna High Prep
16/10 y se recogen las fracciones activas, se desalinizan y se pasan
a través de una columna Mono Q. Después se concentra la enzima
purificada individual en una membrana de ultrafiltración por
centrifugación a través de una membrana Amicon Ultra 4 con corte a
30.000 wt a 4ºC y 7.500 rpm durante 8 minutos.
Después se forman los liposomas por un proceso
de evaporación de disolvente y se liofilizan para producir una
película fina de fosfolípidos de la concentración deseada de PC =
50%, DOPE = 30%, DOTAP = 10% y ergosterol = 10%. Se hidratan las
películas en primer lugar en agua tratada con Milli Q y después con
solución de enzima desalinizada que contiene un tampón estabilizado
osmóticamente de sorbita 0,65M para asegurar que la
5'-fosfodiesterasa no se volverá inactiva después
de congelar y descongelar. Se someten a tratamiento de ultrasonidos
por breve tiempo, durante 2 minutos, las vesículas multilamelares
formadas en un baño de ultrasonidos para reducir la agregación y
continuar la formación de liposomas grandes y después se congelan y
descongelan 3 veces para aumentar el potencial de captura de los
liposomas. A continuación se extruye la solución descongelada de los
liposomas a través de una extrusora Avestin con un filtro de tamaño
de poro 400 nm, las vesículas unilamelares grandes contienen las
enzimas aisladas por filtración a través de gel en un aparato FPLC
empleando una columna de 30 cm por 1 cm con relleno de Sepharose CL
4B. Después se concentran de nuevo los liposomas que tiene fijada
la enzima en un tubo de centrífuga Amicon Ultra 4 y se almacenan a
4ºC hasta el momento necesario.
Los protoplastos y los esferoplastos se obtienen
del modo indicado antes. Después se concentran los protoplastos por
centrifugación en un tubo de membrana de 5 \mum Millipore Ultra
Free CL a temperatura ambiente y 900 rpm durante 50 minutos después
de haber realizado una dilución 1:4 en el tampón de gradiente 1,03
g/l para facilitar la centrifugación. Después se combinan 50:50 los
protoplastos concentrados con el liposoma concentrado que contiene
fijada a la enzima en un tubo Eppendorf y se incuban con agitación
en baño de agua a 37ºC durante 90 para efectuar la transfección de
los liposomas y facilitar la liberación de la enzima fijada. Después
se lisa la mezcla de las células en una prensa francesa y se
centrifuga el material celular a 4ºC y 10.000 rpm durante 20
minutos, se recoge el líquido sobrenadante y se congela para
retardar cualquier reacción posterior de la enzima liberada.
Seguidamente se miden los 5'-ribonucleótidos en
solución por RPHPLC frente a una suspensión de protoplasto de
levadura incubado sin la adición de los liposomas con la enzima
fijada y se comparan los valores obtenidos.
Hemos incorporado fosfolípidos, PE y PC a la
matriz primaria de un liposoma. La inclusión de un anfífilo cargado,
el DOTAP, se realiza para incitar la fusión inicial a las proteínas
de superficie que se hallan en la membrana plasmática de la
levadura y el agente estabilizador. Se emplea el ergosterol para
facilitar un intercambio más fluido de lípidos entre la pared
celular de levadura y el liposoma. Los compuestos adicionales se
incorporan a la estructura del liposoma para facilitar una
liberación controlada del material encapsulado y se basan en la PE
y su derivado la DOPE, que contiene un grado elevado único de ácidos
grados insaturados.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La PE se utiliza con la DOPE en el mecanismo de
liberación de nuestros liposomas, tiene un grupo de cabeza menor
que la PC, tiene por naturaleza forma cónica y es propensa a formar
micelas invertidas hexagonales en solución, sobre todo a un pH
bajo. La presencia de la PE y en particular de la DOPE con grupos
oleicos insaturados proporciona una mayor curvatura de membrana
dentro del liposoma, lo cual conduce a una liberación más rápida
del material encapsulado y como tal se incorpora para actuar como
compuesto de liberación desencadenada dentro de la fórmula.
Los ensayos realizados contienen las siguientes
combinaciones de fosfolípidos: 1
Todos los ensayos se realizan por duplicado
empleando como control negativo el dextrano conjugado con FITC sin
encapsular para confirmar el transporte no endocitótico del
conjugado sin encapsular.
Hay tres categorías principales de liposomas:
las vesículas multilamelares que contienen 2 o más lamelas
concéntricas dispuestas en la configuración de la corteza de una
cebolla y pueden tener un tamaño comprendido entre 1 \mum y
<100 \mum; las vesículas unilamelares grandes, que tienen una
bicapa única y una distribución de tamaños entre 200 nm y 1 \mum;
y las vesículas unilamelares pequeñas, que tienen un tamaño inferior
a 200 nm. Para nuestro trabajo se han escogido las vesículas
unilamelares grandes (LUV), porque las vesículas multilamelares son
demasiado grandes para atravesar la membrana plasmática de la
levadura y las vesículas unilamelares pequeñas son demasiado
pequeñas e incapaces de acumular cantidades significativas de
nuestro dextrano-FITC o de
5'-fosfodiesterasa.
Las vesículas unilamelares grandes pueden
obtenerse por un gran número de métodos después de la hidratación
inicial de la película lípida para formar las MLV. La exposición a
una sonda o un baño de ultrasonidos es un proceso que requiere
mucha dedicación de tiempo, los liposomas que se producen tienen
tamaños desiguales y potenciales de captura desiguales y en el caso
de exposición a la sonda de ultrasonidos se produce solamente un
pequeño volumen de suspensión que necesita enfriarse con
agua-hielo para disipar el calor generado por la
punta de la sonda. Este proceso no es ampliable ni adaptable al
encapsulado de enzimas, ya que el calor generado y el requisito de
separar los fragmentos de titanio de la suspensión de liposomas
llevarían a la inactivación de las enzimas que se pretende
encapsular.
Puede adoptarse también un procedimiento de
deshidratación-rehidratación y es ampliable hasta
una escala de 100 volúmenes, pero también es variable en cuanto al
potencial de captura. La inyección de etanol con evaporación de
disolvente en fase inversa y la diálisis en detergente pueden
aplicarse también, pero el inconveniente de cada uno de estos
métodos, a pesar de que lo vienen utilizando muchos investigadores,
es que expone a nuestra enzima a disolventes orgánicos o a
detergentes, lo cual reduce significativamente su actividad. El
procedimiento de eliminación del detergente requiere en particular
una diálisis exhaustiva para eliminar los tensioactivos y tendría
un coste prohibitivo para la industria alimentaria.
Se ha empleado también la microfluidización para
preparar vesículas como se hace con la prensa francesa, pero de
nuevo la desnaturalización de las enzimas, debida a las fuerzas de
cizallamiento, convertiría en inaceptables a estos
procedimientos.
Hemos utilizado la evaporación de disolvente
para los lípidos y un método de
congelación-descongelación suave y de extrusión
para la producción de las LUV, porque permite un alto volumen de
captura del colorante fluorescente y
5'-fosfodiesterasa y permite una incorporación más
fácil de un lípido catiónico.
La inclusión de un paso previo de
congelación-descongelación antes de la extrusión
proporciona un aumento del volumen de captura dentro del núcleo de
las LUV formadas, como se confirma también por nuestras
observaciones TEM. El principio de congelación y descongelación
provoca la ruptura y refusión del liposoma, durante este tiempo el
soluto encapsulado se equilibra en las cavidades más profundas del
núcleo del liposoma. Después de la congelación y descongelación,
los liposomas pueden agregarse, pero se ha constatado que un breve
paso de exposición a ultrasonidos antes de la extrusión podría
disgregar el aglomerado y facilitar la formación de las LUV.
En los ensayos con calceína se realizan hasta 6
ciclos de congelación-descongelación para aumentar
el volumen de captura, pero en el caso del dextrano conjugado con
FITC solamente se realizan 3 ciclos en un intento de evitar la
rotura del compuesto fluoresceína, que, si está libre, puede dar
lugar a un falso positivo, tal como se ha comprobado en los
estudios de endocitosis con la calceína.
El tamaño de los liposomas formados se corta a
medida a <400 nm con la acción de la extrusora que reduce el
riesgo de desnaturalización de las enzimas o conjugados así como el
ensuciamiento de las membranas. Los filtros empleados son filtros
de 400 nm, aunque después se ha evaluado el filtro de 200 nm para
aumentar el porcentaje de LUV pequeñas para una migración más fácil
a través de la membrana lípida de la célula. Las membranas de
policarbonato empleadas para la extrusión se fabrican con un proceso
de combinación de láser y mordentado químico, destinada a producir
cavidades de poros de paredes rectas y diámetro exacto.
Se ha encontrado también que durante nuestros
ensayos es necesario hidratar y extruir nuestros lípidos por encima
de la temperatura de transición de fases del lípido de temperatura
para evitar el rajado de los filtros de policarbonato durante la
extrusión.
El procedimiento de extrusión produce LUV de un
tamaño uniforme y definido, según se determina con un Malvern
Mastersizer S y se confirma con las micrografías electrónicas de
transmisión. El tamaño medio es de 0,36 micras.
El proceso de filtración a través de gel se
emplea para fraccionar los liposomas formados con la solución que
contiene el colorante sin encapsular. Para tener éxito en la
separación de los liposomas catiónicos requiere conocer los
principios de separación basados en el tamaño diferencial de los
materiales y la capacidad de empaquetar una columna de filtración
eficaz a través de gel. El material de relleno empleado para la
separación es la Sepharose CL 4B, que es una agarosa en forma de
esferillas que se deriva del agar y se reticula por reacción con el
2,3-dibromopropanol en condiciones alcalinas. Al
igual que en el caso de los almidones reticulados, el efecto de
reticulación de este material proporciona un gel de agarosa con
mayor estabilidad térmica y química en un amplio intervalo de
pH.
Se elige la Sepharose CL 4B porque está en el
centro del intervalo de separación de las Sepharose y tiene un
tamaño de esferillas menor dentro del intervalo inferior, lo cual
facilita un movimiento más rápido de componentes de peso molecular
grande. Su intervalo óptimo de separación se sitúa entre 70 x
10^{2}-20 x 10^{2} y el tamaño de las
esferillas se sitúa entre 45 y 165 \mum.
Los filtros de la columna se eligen
específicamente de 25 \mum para asegurar que las esferillas de
tamaño menor van a permanecer dentro de la columna y los liposomas
van a separarse y no se alojarán en la parte alta del filtro de la
columna, porque de hacerlo restringirían el flujo e impedirían la
separación, como hemos comprobado en las primeras columnas que
utilizamos en nuestros ensayos. Los filtros convencionales se
identifican por un tamaño de 2 \mum, lo cual provoca el
ensuciamiento y la entrada restringida de los liposomas grandes en
la columna, haciendo imposible su aislamiento.
El tampón de separación que se utiliza en los
ensayos se elige de modo que pueda soportar osmóticamente a los
protoplastos formados cuando se combina con los últimos liposomas
para los estudios de endocitosis y se identifica durante las
separaciones de gradiente de los protoplastos formados. La
separación de los liposomas por filtración a través de gel se
identifica en dos picos de eluyente del cromatógrafo, entre los que
la suspensión lechosa que contiene los liposomas sale de la columna
en primer lugar como función de su tamaño molecular y se confirma
por las imágenes TEM, tiñiendo negativamente las rejillas
recubiertas de carbón con soluciones del 2,0% (p/v) de
fosfotungstato sódico ajustadas a pH = 7,0.
Los protoplastos se preparan con arreglo a
técnicas estándar. Se realiza una incubación de tres horas con una
centrifugación posterior a 4ºC y 1000 rpm durante 15 minutos para
aislar los protoplastos. Los protoplastos se encuentran
primariamente en la tercera capa del tubo Falcon, cuya solución
tiene una densidad de 1,07 g/l. Después se utiliza una
concentración del tampón como solución de separación para todos los
ensayos de filtración a través de gel. Se identifican los
protoplastos por contraste de fases y microscopía TEM con los
remanentes de las paredes celulares que están presentes o se han
captura. Se observa durante la microscopía confocal y TEM que los
remanentes de la pared celular que contienen proteínas cargadas
negativamente forman aglomerados con los liposomas de DOTAP, en
particular en una concentración del 20% molar.
La adición de un sistema enzimático de dos
componentes, empleando la liticasa y el jugo intestinal de serpiente
(\beta-glucuronidasa de Helix pomatia)
está destinada a hidrolizar los
\beta-(1-3)-glucanos y los
enlaces cisteína de las proteínas de la pared celular para
hidrolizar eficazmente tanto los hidratos de carbono como las
proteínas y producir los protoplastos. Los ensayos de incubación se
realizan a una temperatura constante de 37ºC y a un pH de 7,2
porque se ha comprobado que el pH no es un parámetro crítico y todos
los pasos anteriores de hidratación y purificación se realizan a
esta temperatura. La única variable que se ha revisado es el período
de incubación, que puede variar entre 30 minutos y 90 minutos. Se
decide que 90 minutos es el período más apropiado para lograr los
niveles más altos de transfección de protoplastos.
Para asegurar la absorción de nuestros liposomas
por endocitosis tienen que determinarse los protoplastos viables y
se adopta el uso de un isótopo marcado radiactivamente de la
sucrosa, registrándose la absorción de este metabolito durante un
período de una hora. Se cultivan las células en un medio de sucrosa
para facilitar el mecanismo de transporte celular deseado.
Se preparan patrones y se miden para el
centelleo de base sin añadir el isótopo y se miden 100 \mul de un
patrón de sucrosa 1M que contiene el isótopo para obtener el
recuento de una solución 1 \mumolar de sucrosa. El centelleo pone
de manifiesto que 1 \mumol de sucrosa proporciona aproximadamente
7000 cuentas, por lo tanto se calcula que 1 cuenta equivale a 1 x
10^{-6}/7000 ó 144 x 10^{-12} moles. Las cuentas de base de una
solución de sucrosa no isotópica son 9 cuentas. El resultado de este
ensayo pone de manifiesto una absorción lineal y progresiva del
isótopo de sucrosa, como puede comprobarse en la siguiente tabla que
recoge la naturaleza competente y viable de los protoplastos
formados.
formados.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El movimiento de solutos a través de la membrana
puede realizarse por un gran número de métodos, en función del
tamaño y de la carga de los solutos por el proceso de difusión o de
adsorción. Con la fusión, transferencia entre membrana e
intercambio de lípidos (entre liposomas y membranas celulares) se
consigue una absorción facilitada de compuestos moleculares grandes
en las células, con entrega en los anteriores endosomas. El proceso
de absorción tiene lugar por acción de la fagocitosis, aunque es
habitual la endocitosis, y requiere que los solutos estén
encapsulados en una micela de carga superficial opuesta a la de la
célula.
Durante la endocitosis tiene lugar una
coalescencia inicial de los liposomas con una membrana plasmática
celular, cuando las proteínas o las enzimas de la superficie
celular, que están cargadas negativamente, se fijan sobre una carga
positiva que se ha aplicado al liposoma con la posible adición
ulterior de cationes estabilizadores, anticuerpos o propilenglicol,
para asegurar la protección y la orientación correcta de las enzimas
funcionalmente activas que se han fijado sobre la superficie de las
células.
Una vez fijado sobre la superficie de la célula,
el liposoma acabará envuelto por la membrana plasmática.
Una vez introducido dentro de la célula, el
liposoma reside en el anterior endosoma. La acción de un entorno de
pH reducido dentro de la célula, comprendido entre 5,6 y 5,9,
combinado con una temperatura elevada de incubación de 37ºC
facilita el intercambio de lípidos entre las 2 membranas, lo cual se
traduce en un debilitamiento del liposoma y de la estructura
endosómica.
A una temperatura elevada, la fluidez de las LUV
y la alteración de la densidad de empaquetamiento provocada por el
ergosterol facilitan la liberación del dextrano conjugado e el
citoplasma celular. El principal mecanismo de liberación que se ha
identificado en nuestro trabajo se debe a los componentes PE y DOPE
que contienen ácido oleico, como se ha constatado por fluorescencia
registrada dentro de las células con el uso de las fórmulas 4, 5,
11 y 12.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los ensayos se realizan por duplicado y
con un control negativo para evaluar la endocitosis del dextrano no
encapsulado.
Se utilizan las imágenes confocales para
identificar aquellos liposomas que sufren endocitosis activa con
una liberación controlada de colorante fluorescente encapsulado en
los protoplastos de levadura. La endocitosis se confirma por
microscopía electrónica de transmisión, que proporciona imágenes de
fusión protoplasto-liposoma y liposomas tanto
grandes como pequeños fijados a la pared celular y liposomas
pequeños hallados dentro del anterior endosoma de un citoplasma de
célula de levadura.
Parece que la acción del DOTAP de facilitar la
coalescencia entre los liposomas y el protoplasto de levadura es
esencia para facilitar la fusión celular, mientras que la adición de
la DOPE proporciona en particular una mayor liberación del dextrano
conjugado fijado a los liposomas que contienen la
fosfatidiletanolamina, pero los dos actúan en grados diversos.
Se puede concluir que los liposomas catiónicos
que se forman a un pH más elevado que el pH del citoplasma de las
células diana son capaces de fusionarse y de penetrar en el
citoplasma de las células.
La acción de un mecanismo de liberación
desencadenada que incorpora a la fosfatidiletanolamina es importante
para liberar los componentes fijados dentro del liposoma, sin
embargo la PE sola puede todavía proporcionar una liberación
controlada de los contenidos liposómicos, si se aumentan la
temperatura y el tiempo de incubación.
Claims (18)
1. Un liposoma para fusionarse con una célula de
levadura, el liposoma está caracterizado porque el
40-50% molar de la bicapa de lípido del liposoma es
fosfatidil-colina (PC), el 10-20%
molar de la bicapa de lípido del liposoma es un anfífilo catiónico,
aproximadamente un 10% molar de la bicapa de lípido del liposoma es
un esterol y aproximadamente un 30% molar de la bicapa de lípido del
liposoma es fosfatidil-etanolamina (PE) y/o
dioleilfosfatidil-etanolamina (DOPE).
2. Un liposoma según la reivindicación 1, en el
que el 50% molar de la bicapa de lípido del liposoma es PC.
3. Un liposoma según la reivindicación 1, en el
que el 20% molar de la bicapa de lípido del liposoma es un anfífilo
catiónico.
4. Un liposoma según la reivindicación 1, en el
que el aproximadamente un 30% molar de la bicapa de lípido del
liposoma es PE.
5. Un liposoma según la reivindicación 1, en el
que el aproximadamente un 30% molar de la bicapa de lípido del
liposoma es DOPE.
6. Un liposoma según la reivindicación 1, en el
que el esterol es el ergosterol.
7. Un liposoma según la reivindicación 1, en el
que el esterol es el colesterol.
8. Un liposoma según la reivindicación 1, en el
que el anfífilo catiónico es el
1,2-dioleil-sn-glicero-3-trimetilamonio-propano
(DOTAP).
9. Un liposoma según la reivindicación 1, en el
que la bicapa de lípido del liposoma contiene además ácido
oleico.
10. Un liposoma según la reivindicación 9, en el
que aproximadamente un 5% molar de la bicapa de lípido del liposoma
es ácido oleico.
11. Un liposoma según la reivindicación 1, en el
que el liposoma tiene un diámetro entre 100 y 400 nm.
12. Un liposoma según la reivindicación 1, en el
que las bicapas de lípido del liposoma se desestabilizan a un pH
entre 5,0 y 6,0.
13. Un liposoma según la reivindicación 1, en el
que el liposoma contiene además una molécula exógena, dicha
molécula exógena es una molécula elegida entre el grupo formado por
una proteína, enzima, aminoácido, ácido nucleico, azúcar y
glutamato monosódico.
14. Un liposoma según la reivindicación 13, en
el que la enzima es una 5'-fosfodiesterasa.
15. Un liposoma según la reivindicación 14, en
el que la 5'-fosfodiesterasa es la fosfodiesterasa 1
(fosfohidrolasa de diéster de ácido ortofosfórico, EC 3.1.4.1).
16. Un liposoma según la reivindicación 13, en
el que la enzima es la
5'-adenil-desaminasa.
17. Un proceso para producir un esferoplasto o
protoplasto de una célula de levadura que contiene una molécula
exógena y consiste en poner en contacto un esferoplasto o un
protoplasto de célula de levadura con un liposoma ya definido en
una cualquiera de las reivindicaciones de 13 a 16, que contiene la
molécula exógena para permitir al esferoplasto o protoplasto la
recepción del liposoma.
18. Un proceso según la reivindicación 17, en el
que la molécula exógena es una enzima.
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