JPS5918990B2 - 新生理活性物質コンプレスタチンおよびその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は補体活性阻害作用、抗炎症作用を有する新生理
活性物質およびその製造法に関する。

゛多くの自己免疫性疾病およびある種の薬物アレルギ一
では体内で抗原一抗体複合体により補体が活性化されそ
のため炎症が起こると考えられている。そこで本発明者
らは補体の活性化を阻害することによりこれらの疾病に
よる炎症を抑制することが可能であるとの考えにもとず
き微生物の代謝産物から補体活性阻害物質を検索し、そ
の結果ストレプトマイセス属の菌体から阻害物質を採取
した。

この物質はモルモツトを用いた動物実験により補体が関
与した疾病に有効であることが判つた。さらにこａ吻質
の物理化学的性質を調べ、新規の物質であることが判明
した。以下本物質をコンプレスタチン（ＣＯｍｐｌｅｓ
ｔａｔｉｎ）と称する。本発明はストレプトマイセス属
に属する微生物を培養して培養物からコンプレスタチン
を採取する方法、特にストレプトマイセス・ラベンデユ
ラ（ＳｔｒｅｐｔＯｍｙｃｅｓｌａｖｅｎｄｕｌａｅ）
からコンプレスタチンを採取する方法に関するものであ
る。本発明において用いうる微生物はストレプトマイセ
ス属に属するコンプレスタチン生産菌であるが、本発明
者らが特に有効であると認める菌株は例えばストレプト
マイセス・ラベンデユラＳＡＮＫ６Ｏ４７７株であつて
、本菌株は通産省工業技術院微生物工業技術研究所に寄
託されており、その寄託番号は微工研菌寄第４０４４号
である。上記以外のストレプトマイセス属でもコンプレ
スタチン生産能を有するものであればその変種あるいは
変異株を問わず、使用し得ることはいうまでもない。上
記の菌は静岡県下の土壌から分離されたものであるが、
文献〔シヤーリングら：「インターナシヨナル・ジヤー
ナル・オブ・システマチツク・バクテリオロジ一」（Ｉ
ｎｔｅｒｎａｔ−Ｊ・Ｓｙｓｔｅｍａｔ−Ｂａｃｔｅｒ
ｌＯｌ・）１６巻、３１３ページ １９６６年〕に準じ
てストレプトマイセス・ラベンデユラ ＡＴＣＣ８６６
４ケ標準株として比較したところ、これと一致したので
本生産菌をストレプトマイセス・ラベンデユラＳＡＮＫ
６Ｏ４７７と命名した。コンブレスタチンはコンプレス
タチンを生産する菌株をストレプトマイセス属の培養法
として公知の方法により好気的に培養して培養物中に生
産せしめられる。

例えばコンプレスタチン生産菌は可溶性デンプン２％、
グルコース１％、ペプトン２％、寒天２％からなる培地
に継代培養され、コンプレスタチン生産のためにこの寒
天培地の発育菌体を直接生産培地に接種して培養できる
。また生産培地に発育させた菌体を新しい生産培地に培
養して、そこにコンプレスタチンを生産させることがで
きる。コンプレスタチン生産菌は７〜３５℃で発育する
がコンプレスタチンの生産には通常２０〜３０℃が好ま
しい。

コンプレスタチンを生産するストレブトマイセス属の菌
を培養するには、ストレブトマイセス属その他の微生物
の培養に公知の栄養源はすべて利用できる。例えば、グ
ルコース、マルトース、デキストリン、デンプン、ラク
トース、サツカロース、グリセリン等を炭素源として利
用できる。これらの炭素源の中でグルコースおよびマル
トースはコンプレスタチン生産に好ましい炭素源である
。コンプレスタチンを生産するためストレプトマイセス
属その他微生物の発育のため公知の窒素源はすべて利用
できる。

例えば、ペプトン、肉工キズ、酵母、酵母工キズ、大豆
粉、落花生粉、コーンスチーブリカ一、米ぬか、無機窒
素源等を利用できる。コンプレスタチン生産菌の培養で
コンプレスタチンを生産させる場合、必要とするときは
、無機塩、金属塩を加える。また必要とするときは重金
属の微量を加えることもできる。コンプレスタチンはそ
の生産菌を好気的に培養して得られるが、通常用いられ
る好気培養法例えば固体培養法、振とう培養法、通気撹
拌培養法が用いられる。

培養あるいは培地滅菌中消泡を必要とするときはシリコ
ンオイル、界面活性剤等の消泡剤が使用できる。培養温
度は２０〜３０℃が好ましい。コンプレスタチンは補体
活性阻害をみる以下の方法により検定できる。

すなわちうさぎ抗羊赤血球抗体で感作した羊赤血球（感
作赤血球）とモルモツト補体を３７℃、６０分間反応せ
しめ溶出したヘモグロビンの吸光度（４１０ｍμ）を測
ることによつて溶血度を測定する。

一方反応開始時にコンプレスタチンを加えて同様に操作
して溶血度を測定することにより、コンプレスタチンの
阻害効果を定量的に判定できる。

なお上記の定量法のかわりにマイクロタイタ一法（西岡
ら、蛋白質、核酸、酸素 １１巻１６０５ページ（１９
６５年））により溶血阻害度を目で判定することにより
活性を半定量的に測定できる。培養はコンプレスタチン
が実質的に蓄積されるまで続け、本物質の培養液からの
抽出は、後記実施例に示すごとく、本発明者らによつて
明らかにされた本物質の性状にもとづいて、種々の方法
を適当に組み合せることによつて行ない得る。すなわち
、たとえばエーテル、酢酸エチル、クロロホルムなどの
有機溶剤による抽出、アセトン、アルコール等極性の大
きい溶剤への溶解、石油エーテル、ヘキサン等極性の小
さい溶剤による不純物の除去、セフアデツクスカラムに
よるゲル沢過、活性炭、シリカゲル等を用いる吸着クロ
マトグラフイ一等である。これらの手段を適当に組み合
せて使用することにより本物質は培養物から粉状物とし
て単離される。コンプレスタチンは２４０℃で褐色化し
、２６０℃で黒色化する黄色の粉末で、メタノール、エ
タノール、プロパノール、ブタノールなどの低級アルコ
ール、アセトン、ピリジン、ジメチルスルホキシド、ジ
メチルホルムアミドなどに可溶で、クロロホルム、酢酸
エチルなどに少し溶ける。

また中性酸性の水には溶けず、アルカリ性の水に溶ける
酸性物質である。コンプレスタチンの紫外線吸収スペク
トルを第１図に示す。

酸性メタノール溶液中（ＰＨ２．Ｏ）１％では２８３ｍ
μ（Ｅ −２００）、２９０ｍμｍＣｒｒＬ）（Ｅ｛
？＝２０５）に吸収を示し、そのアルカリ１％性溶液中
（ＰＨｌｌ．Ｏ）では３００ｍμ（ＥｌＣｒｌＬ収を示
す。

赤外線吸収スペクトルは第２図に示す。核磁気共鳴吸収
スペクトルは重水素化ジメチルスルホキシド沖で少量の
テトラメチルシランを内部基準物質として１００ＭＨｚ
で測定した。そのスペクトルを第３図に示す。図中Ｘ印
は再結晶溶媒に用いた酢酸エチルのシグナルである。コ
ンプレスタチンは比施光度〔α〕〒＝ ＋２４．５タ（Ｃ＝０，１３、メタノール：０．０１Ｎ
−ＮａＯＨ２：１混合溶媒）を有する。

コンプレスタチンの酸性解離定数は６８％ジメ′チルホ
ルムアミド中で測定すると、ＰＫａ＝５．２、８．３を
有する。

）コンプレスタチンの元素分析値は炭素５４．１４％、
水素３．９９％、窒素、６．９６％、塩素１５．４７％
、硫黄０％であり、残りの割合を酸素元素と考えると酸
素１９．４４％となる。

この値および下記に示す分子量から組成式を算出すると
次の式が得られる。

コンプレスタチンの分子量はＦＡＢ−ＭＳ（ＦａｓｔＡ
ｔＯｍＢＯｍｂｅｒｄｎｌｅｎｔＭａｓｓＳｐｅｃｔｒ
Ｏｌ）で測定した結果、ｍ／ｚ＝１３２４を小した。

コンプレスタチンはペプタイド試薬、エールリツヒ反応
、リーベルマン反応に対して陽性呈色を示すがモーリツ
シ反応、２・４−ジニトロフエニルヒドラジン試薬、ニ
ンヒドリン試薬に対して陰性である。

シリカゲルを用いた薄層クロマトグラフイ一（タルク社
製 ｆ）．５７１５、キーセルゲル６０Ｆ２５４）にお
いて酢酸エチルリメタノール（２：１）で展開するとＲ
ｆ値０．３に単一のスポツトを紫外線吸収ランプにより
検出できる。

コンプレスタチンはアンプル中で、１２Ｎ一塩酸：酢酸
１：１混合溶液により１０５℃で１８時間加水分解する
ことにより、２個のニンヒドリン反応性成分をアミノ酸
分析機（日立ＫＬＡ−５）および高圧▲紙電気泳動法に
より確認した。

その各々は４−ハイドロキシフエニルグリシン（１）と
３・５−ジクロル４−ハイドロキシフエニルグリシン（
）であることを標準物質との比較から決定した。

化合物（１）（）の割合はアミノ酸分析機から１：２で
あることも同時に決定した。

コンプレスタチンはアルカリ性メタノール中で水素化ホ
ウ素ナトリウムを用いて還元を行うと７コンプレスタチ
ン還元体７を得る。

７還元体″５の紫外線吸収スペクトルはメタノール中で
測定すると、２８３、２９０ｍμに吸収を示しアルカリ
性溶媒中では２４５、３００ｍμに吸収が赤色移動する
。

しかしコンプレスタチンに存在したアルカリ性溶媒中で
の３５８ｍμの吸収はこの７還元体２では消失している
ことから発色団は先に記した化合物１１の他に存在して
いることを示すものである。この７還元体２に存在する
吸収は化合物１、に基づくものであり、文献〔ジャーナ
ル・オブ・アンチビオテイクス（Ｊ−ＡｎｔｉｂｉＯｔ
ｉｃｓ）第２１巻１３８〜１４６ページ、１９６８年〕
に記載された値とよく一致している。７還元体７を先に
記した酸加水分解と同じ条件で分解し、アミノ酸分析機
及び高圧Ｆ紙電気泳動法で分析すると化合物（１）およ
び（）が１：２の割合で存在していることが確認された
。

コンプレスタチンは約０．１μＦ７／ｍｌで一単位の補
体活性（１×１０８個の感作赤血球を１００％溶血させ
るに必要な補体活性）を５０％阻害する。コンプレスタ
チンは補体の第２成分Ｃ２と第５成分Ｃ５と第９成分Ｃ
９の活性を非可逆的に阻害する。コンブレスタチンのマ
ウス静脈注射による急性毒性（ＬＤ５Ｏ）は２０〜／Ｋ
９以上である。

動物を用い゛Ｃコンプレスタチンの実験的自己免疫性疾
病に対する効果を検討したところその有効性が確認され
た。たとえば１群５匹の牛血清アルブミンで感作された
モルモツトに再び牛血清アルブミンを皮内に投与して起
こる炎症（能動的皮膚アナフイラキシ一）に対する効果
を調べたところ、コンプレスタチン無投与にくらベコン
プレスタチンを牛血清アルブミン投与の１５分前に０．
１〜１．０〜／Ｋｇ静注した場合には有意にその炎症を
抑制した。

また一群５匹の同様に牛血清アルブミンで感作されたモ
ルモツトに再び牛血清アルブミンを静脈注射し引きおこ
される全身性アナフイラキシ一も前つてコンプレスタチ
ンを０．１〜１．０ｍ９／Ｋｇ静注した場合無投与にく
らべ明らかにそのシヨツク反応たとえばチアノーゼ、セ
キ、ケイレン、シヨツク死を有意に抑制した。

以上のごとくコンプレスタチンは補体活性を阻害するこ
とにより補体が関与した自己免疫性疾病やアレルギ一を
抑制する作用を有し例えば抗アレルギ一剤、抗炎症剤と
して医薬に使用することができる。

コンプレスタチンは経口的または非経口的に例えばカプ
セル剤、錠剤、注射剤の形で投与することができる。

通常は注射剤が好適である。投与量は年令、症状、体重
等により異なるが、通常は成人に対し１日約５〜５０１
１１９を投与する。しかし必要に応じてそれ以上使用す
ることもできる。次に本発明の実施例を示すが、本発明
によつて上述の如き諸性質が明らかにされた以上は、こ
れらの知見に基いて、培養物またはその関連物質からコ
ンプレスタチンの採取には諸種の修飾手段が可能である
。本発明は実施例に限定されるものではなく、すでに記
載された知見から容易に推定されるすべての方法を含む
ものである。実施例 １ スターチ３％、コーンスチープリカ一２％、フアーマメ
デイア１．５％、ミートエキス１％、デイスフオーム０
．０１％を含む培地３０ｅを６０ｅの培養タンクにとり
、ストレプトマイセス・ラベンデユラＳＡＮＫ６Ｏ４７
７株を接種して温度２５℃、通気量３０１／分攪拌３１
０回転／分で１６２時間培養し、得られた培養液をフイ
ルタープレスでｆ過し、菌体１０．２ｋ９を得た。

得られた菌体１０．２１＜９を６０％アセトン４０１で
抽出し、抽出液を減圧下で濃縮し０．５ｅとし６Ｎ塩酸
でＰＨ２．Ｏとしてから２．５ｆ！の酢酸エチルで抽出
した。抽出液２．５ｅを濃縮乾固して得た油状物を１′
のクロロホルムで洗浄した。残渣をトリス一塩酸緩衝液
（ＰＨ７．３、１０ｍＭ）に溶かし、２００７のセフア
デツクスＬＨ−２０のカラムに吸着させた。カラムをト
リス一塩酸緩衝液２ｅ、トリス一塩酸緩衝液−アセトン
（９０：１０）２ｅ、トリス一塩酸緩衝液−アセトン（
８５：１５）２ｅの順で展開した。活性は最後の画分に
溶出され、その画分を５００ｍ１に濃縮後、６ＮＨＣ１
′（′ＰＨ２．Ｏとして１ｅ酢酸エチルで油出したのち
酢酸エチル層を採取した。酢酸エチル層をさらに飽和食
塩水で洗浄したのち茫硝で脱水してから７００ｍ１のシ
リカゲルに吸着させ、酢酸エチル−メタノール（１：１
）４００ｍ１１酢酸エチルメタノール（３：２）４００
ｍ１の順に展開した。活性は最後の画分にありこの画分
を濃縮乾固してコンプレスタチン１．２ｙを採取した。

【図面の簡単な説明】

第１、第２および第３図はコンプレスタチンの紫外線吸
収スペクトル（１は酸性メタノール溶液中、２はアルカ
リ性メタノール溶液中で測定したもの）、赤外線吸収ス
ペクトルおよび核磁気共鳴スペクトルをそれぞれ示すも
のである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の物理化学的性状を有する新生理活性物質コン
   プレスタチン（１）物質の色と形状：黄色粉末 （２）融点：２４０℃で褐色化し、２６０℃で黒色化（
   ３）比旋光度：〔α〕＾２＾５＿Ｄ＝＋２４．５°（Ｃ
   ＝０．１３、メタノール；０．０１Ｎ−ＮａＯＨ２：１
   混合溶媒）（４）元素分析（測定値）：Ｃ、５４．１４
   ％；Ｈ、３．９９％；Ｎ、６．９６％；Ｃｌ、１５．４
   ７％；Ｓ、０％であり、残りの割合を酸素元素と考える
   とＯ、１９．４４％となる。 Ｃ＿６＿１Ｈ＿４＿２Ｏ＿１＿６Ｎ＿６Ｃｌ＿６または
   Ｃ＿６＿２Ｈ＿４＿６Ｏ＿１＿５Ｎ＿６Ｃｌ＿６（６）
   酸性解離定数：６６％ジメチルホルムアミド中で測定し
   てｐｋａ′＝５．２、８．３を有する。 （７）分子量：ＦＡＢ−ＭＳ（Ｆａｓｔ ＡｔｏｍＢｏ
   ｍｂｅｒｄｍｅｎｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）で
   測定した結果、ｍ／ｚ＝１３２４を示した。 （８）紫外線吸収スペクトル（第１図） 酸性メタノール溶液中（ｐＨ２．０）での極大吸収は２
   ８３ｍμ（Ｅ＾１＾％＿１＿ｃ＿ｍ＝２００）、２９０
   ｍμ（Ｅ＾１＾％＿１＿ｃ＿ｍ＝２０５）に存在し、ア
   ルカリ性メタノール溶液中（ｐＨ１１．０）では３００
   ｍμ（Ｅ＾１＾％＿１＿ｃ＿ｍ＝１６８）、３５８ｍμ
   （Ｅ＾１＾％＿１＿ｃ＿ｍ＝１５６）に吸収を示す。 （９）赤外線吸収スペクトル ＫＢｒディスク中で測定した赤外線吸収スペクトルは第
   ２図に示す通りである。 （１０）核磁気共鳴吸収スペクトル 重水素化ジメチルスルホキシド中で内部基準としてテト
   ラメチルシランを使用して測定した１００ＭＨｚ核磁気
   共鳴吸収スペクトルは第３図に示す通りである。 図中×印は再結晶溶媒に用いた酢酸エチルのシグナルで
   ある。（１１）溶解性：メタノール、エタノール、プロ
   パノール、ブタノール、アセトン、ピリジン、ジメチル
   スルホキシド、ジメチルホルムアミドに可溶、クロロホ
   ルム、酢酸エチルに少し溶ける。 また中性、酸性の水には溶けず、アルカリ性の水に溶け
   る。（１２）呈色反応：ペプタイド試薬、エールリツヒ
   反応、リーベルマン反応に対して陽性を示すが、モーリ
   ツシ反応、２・４−ジニトロフェニルヒドラジン試薬、
   ニンヒドリン試薬に対して陰性である。 （１３）クロマトグラフィー 酢酸エチル：メタノール（２：１）を展開溶媒としたシ
   リカゲル薄層クロマトグラフィー（タルク社製Ｎｏ．５
   ７１５キーセルゲル６０Ｆ２５４）により、Ｒ＿ｆ０．
   ３に単一のスポットを紫外線吸収ランプにより検出でき
   る。 ２ ストレプトマイセス属に属するコンプレスタチン生
   産菌を培養して、コンプレスタチンを単離することより
   なるコンプレスタチンの製造法。 ３ ストレプトマイセス属に属するコンプレスタチン生
   産菌がストレプトマイセス・ラベンデユラである特許請
   求の範囲第２項記載の製造法。 ４ ストレプトマイセス属に属するコンプレスタチン生
   産菌がストレプトマイセス・ラベンデユラＳＡＮＫ６０
   ４７７株（微工研菌寄第４０４４号）である特許請求の
   範囲第２項記載の製造方法。