JPS59173759A - 免疫学的検定用の粒子試薬粒径分布測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、表面に結会した分析物質をゼする粒子試薬、
分析物質特異性抗体、及び試験試料からの分析物置を包
含する凝集系中の粒径の分布の変化ｔｉｔｆ接に測定す
ることによって液体媒体中の分析物質′ｆ：定量げｊに
分析するための高感度且つ迅速な方法に関するものであ
る。抗体と分析４質の競争反応によって生じろ、抗体に
よる粒子の凝集の抑制は、レーザー光敗乱装置及び試薬
の接触後の時＋ｔＪＪの関数としてのσシ択的粒子計数
方法によって、正確に測足することができる。

ことＶＣ開示する主題上は本発明と同様に出に一″まし
いる。

臨床的な試験室の化学的診Ｉｇ倹森は、健康管理報告の
重′クツな・慶素である。狭い治ｉｔ　ａ信用が存在す
るのみの≠剤ｉ峙度を倹ｑＬするため、治療と外科的な
選択についての／処定の指針とするため、及び杓気の早
山１　＃（：見のための患者のスクリーニングのための
医師によるこれらの試験の利用は、毎年性なわれる試〜
叔ケ急速に増大させでいる、１９７６−年に行なわれた
ほとんと６ｏ億の試験及び１９８６年に行なわれるもの
と推定される。１２２億（Ｌｒｂｎｉｎｇ　　ｐｒａｌ
ｃ　　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ　　５ｕｒｖｅｙ。

１９８０）に上る試験においては、速度、正確性及び費
用の抑ｔ４ｆｌｌが垂要な問題である。復雑な体液１幕
實中の礪剤、ホルモン及び代謝物のような分析切′ｄ　
ｔ　、ミグ０モル（μＭ）乃至ピコモル（ｐｒ′Ｉｆ　
）の１衾度で測定しようとする欲求は、適度な費用の自
動化しｉ”ｃ方法により機器的に行なうことができる、
複雑な一試験方法の発嗟全みちびいている。

それ故、生物学的物質の存在と量を測定するための広く
応用することができる、正確なスクリーニング分析方法
が必要である。従来、ｌ’Ｌ４本及びがスクロマトグラ
フイー、質量分析、及び種々のバイオアッセイ方法を含
む各種の方法が用いられている。これらの方法は時間を
要し且つ大規模な自動化したスクリーニング計１面に容
易には応用できない。

近年、放射化学的な標識付けの複雑な特徴全回避しなが
ら抗体反応の特異性を利用する多くの免疫学的検定方法
が開発されている。臨床的に興味のある２価の抗体及び
抗原又ｆｌ、−１テン舎包含する凝集反応にＮ広い範：
１１］の１刊菌、亦血体又は重会体粒子において、視覚
的及び定；寸的分析の両りで用いられている。抗体−抗
原橋かけ粒子ＪＪ集二吻の生長がもたらすに’ｂ％反応
り↑、検出することができる広範な網目４１１浩を与え
る。凝集反応は、抗体又は抗原のどららかである時異性
結合相手忙固定化した抗原又は抗体′ｆ！：有する／イ
ア子の１遍ｊｆ＋］液に卯えることによって生じさせる
ことができる。低、ｔ４　Ｋの％轟件七合相手において
（１、備か／：ｔ、粒子のみから成る小さな凝集物が斗
じる。遊離及び粒子固定化試薬の両者の存在は、時売４
結合相手による凝集の抑１１ｉ１．１才もたらす。

一般に製造方法を１１１３して称轟性ケ、また当１亥分
析物算の存在において得られる凝集速度論から定量的情
報を提供する、粒子固定化試薬を用いる臨く試薬系は、
たとえ／ｆｉ心性グリコシド、抗生物質、治療薬、・ト
ルモン及びビタミンのような医療上重要な１剪は定蝋す
るための高感度の順応性のある測定系を提供することが
できる。、ＩＪｏうるに、低濃度の毒素、共晶及び包装
添加剤並びに環境汚染吻のための分析方法が必要である
。

キイネル（Ｃａｎｎｅｌｌ　Ｊらに対する米国特許第４
．１７４．９５２号に、粒度分布の相対的な１尺度とし
て異なる２角度において散乱する元の強度の比、すなわ
ち異方性比を測定するという、粒子に華づく免疫学的検
定方法を開示している。この方法は低水準の凝集におけ
る異方性比の変化を検出するために初期的に単分散の粒
子試薬の使用を必要とする。暇合坏うデツクス中で一般
に認められるようなムい粒度分布に、異ノテ性叱の僅か
な変化しか認められないために、分析物αすなわち流体
鱈発欠Ｍす′吻の所出に対して低い感哩を有している同
様に、この方法は、主としてツ°吐方性比の変化の速度
が入きい昇漠の初ぜ切段階の間にのみ１−イ用である。

キヤ烙了ソｌ　Ｃａｍｂ　ｉαｇｏ）らに対する米国４
”１許第４．１８４．８４９号は異なる２杓状試鳴を用
いる選択的Ｈ′数方法を応用する粒子に斉づ〈兎役孕的
喚定の方法全開承している。この嶺片における粒子ｄ粒
径が少なくとも２の因以だりす品なっていることを必要
とし、且つ各粒子Ｊ代へ物ｆｒｉ〜匝−う：均一でなけ
ればならない。この方法に、系中の−っの粒径の凝集し
ていない（単礒体）粒子の画分を測定する。しかしなが
ら、凝集し−Ｃない粒子のｔｎ失の測定は、１そい温自
時間を必要とする。

アスギリス（ｔ／ｚｇｉγｉｓ）らに対する米国特許第
４．１９１．　？　３９号は、２棟の抗体被覆ラテック
ス粒子懸濁物の混合物の使用による分析物質濃度の測定
を開示している。しかしながら、粒径の反応がなか−り
だとしたら存在しなりであろう粒径の粒子ヶ斂えること
によって行なう。それ故、系は粒径に関して注意深く設
計しなければならず、匪つ１ｉｉｊｌボ欠竹なうために
比頓的嵯雑な電子装置を必′妥とする。

コーエン１ｃｏｈｅｎｌらに対する米国＠許第４、０８
０．２６４号に、擬弾性光散乱を応用する、粒子に椛づ
く免役学的検定方法を開示している。

ることかできる。η（体中の標的分析物質の存在に、分
析物・葭の幾度と関係する凝集と粒径の増犬をもたらす
。しかしながら、一般に、この方法は均一粒径の柁子う
テックス懸ｔｙＡ′吻においてのみ使用され且つ平均拡
散系６タの大きな変化が存在する反応の初ｊＱ」段階に
おける測定に対してのみ用いられる。またテークの分析
ｔま、存在する粒子凝集物の粒径分布についての推定ケ
必要とする、マノンン（ＪＬｉａｓｓｏｎ）らに対する
米国特許第４、２７９．６１７号は、アレルギー、感染
又は自己免疫疾患を指示する少量の抗体についてヒトの
血清を分析するための２杓子免疫字的・１英定及び選択
的粒子計にヅｋ　１４ｉ’Ｊ示している。この方法は凝
集し−〔ない第−又は第二の尼ｌ状試欅≦の、・、得度
を＋Ｑｌｌ定するのみであり、目一つ信頼性のある粒子
計数を達成するためには２，１ζｉ子試薬の中の一方が
少なくとも０．６ミクロメ一ドル以上の粒径のものであ
ることを必要とする。

高感度、迅速であり且つ自Ｍｌ化することができる、粒
子ＴｔＣ４づく免役化学的検定を必用する、改良した、
今ｊ用の炉からない方法に差■する明確な要望が存在す
る。特に、大きな粒子拡散系数を得るために０．１ミク
ロメートルというような小さな平均直径を有する粒子を
含有する、粒径の不均一な重合体粒子試薬懸濁４吻を１
吏用することができる方法が、迅速で正確な臨床分析の
提供に対して必要である。このような方法は、高価で生
産が制限された単分散重合体粒子懸濁物の匣用を必要と
しない。

微初に多少の凝集した物質を含有しているものであ−り
てすら、不均一な粒径のラテックス粒子試薬縣伽物の使
用を可能とする、新規な選択的粒子計数免疫学的検定方
法が見出はれた、この方法は、分析物員特異性抗体と分
析物質の存在において粒子試薬が凝４を生じる際の時間
の関数として、試験試料中に存在する所定の粒径範囲に
ある粒子の数を実際にｊｉｌｊ定することによる粒径分
布の測定を包含する。試験条件下の実際の粒径分布につ
いての知見は（１１粒性分布の時間による変化、１２）
所・この時ｉｉｊにおける与えられた粒径の粒子のＹｈ
Ｊ監、（３）与えられた粒径の粒子の生成の速度、又は
（４）与えられた粒径の杖子の定常状ρε係大がＩ犀の
測尼を含む（ヴ々の方法によりて試喋試料甲に最初に存
在する分析物質の遺と相関させることができる。詳細に
は、本・ｉｉち明は： Ａ９分析物ｒ（ｔを含有するｔｉｊ体４体を：（１）分
析、吻實特異性抗体、及び （２）　　不溶化した分桁物ノｅｔで１１超グした粒子
試−１，外 を含む試薬と接触させてへ集す、る反１芯混汁物金形成
させ； Ｂ−該反応混合自衛光学的に限定した視野区域を通禍１
せ、そこに焦点欠結ぶレーザー光線ケ入射し； Ｃ０該反し６混合物から散乱したレーザー光線ケ集光し
；次いで り、該散乱したレーザー光線を分有することによって該
成体媒体と、咳試薬との接触後の時間の関数として該反
応混汗吻中の粒径分布を決、定し、それはよって該液体
４体中に最初に存在する該分析物質を定量する、 段階ケ有する、該液体ｊ媒体中の分析・上質の定量方法
を包謬する。

不発明は不明ｉ？−ｉＢ仔の一部を構成する付随する図
面と関連δせた以ドの本発明の詳細な説明によって町に
完全にｆｉＪｉ屏しうるでめろう。

光散乱及びフ′べ択的粒子計数方法を便用することによ
ってきわめて高感度で巨つ応用範囲の広い免疫化学杓検
炬方法が開＠された。この方法は粒子試薬、分析物質・
「存異性抗体及び試噛試料の接触後の時間の関数として
単量体粒子、二量体、三量体及びＮ量体粒子αを果物の
数を直接に測定する。

０．１ミクロメートルというような小さな径に＝何する
粒子を・ｉＪｊ出し且つ和えるための実内系ｔｉｔ、所
定波長の平何化した放射線源、好捷しく１丁レーザー源
、ケ・・１春込んであり、それが凝東した粒子及び個Ｊ
ｙの粒子の両賃を含有する流ｉｉｉ　４生懸濁液が流れ
ている１′・目０−１２１７ノトルの元−チ的に限定し
た視野区域を■するセル（ｃｒｔ、υｅｔｔｌＪ）’ｔ
’を照射する。

Ｃ俟姫中の各粒子によって散乱した光ＩｉψのＩＡｉ度
に感応する検出べ診が、オ、−χ子の１毛に１史数＋、
Ａ＞に（］１関する或気イド号全発生する。、検出器に
９＋Ｌ＋作的に伴なわれた計数器城・ｔ、”ｒ　（ｎｅ
ｔ　ｗｏｒｋ　）が、予め定めた粒径峨囲内にある／仮
流中のわ子の的の酩砂ケ記録する、選択的な粒子の計数
と結び付けた粒子状試薬の１更用に基づく不発明の方法
に、免役化学的分析に対して捗〈の利益を提供する。単
分散の懸濁物よりも安価に且つ容易に入手することがで
きる粒径の不均一な粒子状試薬を利用することができる
。

時間の関ルタとしての粒径の分布（単位体積当りの単量
体、二量体、三量体及びＮ遣犀の数）についての知見は
、単量体粒子として数えられる小さな二量体粒子により
結果するものと思われる不明確性を排除する。選択的な
粒子の計数は、二量体粒子の生成の速度を追跡すること
ができるので、短とし、それ故、凝渠の進行した段ｌ竹
に対して最適である。かくして撞々の径の入子の・φ度
を直接に測定すべき選択的な粒子の計数は、種々の粒子
試薬と測定時間に関して融通性をもたらす。　　□不明
・４Ｂ４の文味においてに、−以ドの用后を仄のように
尾翼する：”分析物質“は液体媒体中におけるその存在
又は量を測定すべき物質又ｌ−１：物質群であり；”粒
子試薬２は共有結合又は物理的な吸着によって粒子に付
加させた固定化した分析物質、ハプテン又は分析物質−
担体蛋白抱合体の外殻を有するコア市合体粒子であり；
”分析物質−旬体蛋白質抱付体”は、その中で分析物質
分子が蛋白質、たとえ１ば、ヒトの面ン青アルフ゛ミン
（ｌｌ　ＳＡ　ｌ、に共刹結合していて共有結合又は物
理的吸料によ−ってボ２子に付査することがでさる”抱
曾体″を形成する化合物であす；°°凝凝集゛は、セれ
によって粒子の史ＶＣ高次の網目を住しる）１へ向であ
る。

本発明の方法は、それに対する特嚢件抗体が存在する如
何なる分析物ノ点の１灸出に対しても適用することがで
きる。ヤＡ５体は全抗曲消１、現／Ｆ１１性梢・：晃し
たモノ時異性・Ｉ！炉碌のような、ＩｑＧ画分、又はモ
ノクローナル誘、＋物護からｉＪよることができる。本
発明の定量的な測定の局面は、試験試料中に存在１−る
物質及び粒子試薬の表面上の不溶化分析物質が、反応混
合物に対して既知量だけ加えた分析物實特異性抗体と競
争的に反応するという事実に基づいている。試験転科中
に存在する分析物質の敵が大であるほど、粒子試薬と結
６して祭集を＠発するために用いられる抗体が少なくな
り、はつ粒子試薬の凝楽の抑制が大と５′する。それ故
、かくして生じる凝集ｌは、たとえば、抗体と粒子状・
砺全分析’ｌＰＪ質試、強試料と組み曾わせて反応混合
、吻を形成きせたのらの所定の時においての単量体粒子
（単量体ｊＭ　）の斉ンの低Ｆによって又はそれらの１
戊ドの初速度によつ−Ｃ１所定時間における二量体粒子
の砿の増大によって、又（徒それらの増大の初速度によ
って、あるいは所定時間における種々の径の粒子の分布
によって、試験試料中に当初に存イモする一分析物質の
破に相関する。

試薬の種々の混合方法（ｍｉ７Ｊｉｎｇ　　ｐ’ｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ及び接触時間を用いることができる。試薬を
約−５°乃至５０℃の範囲の温度と約５〜，１０の範囲
、通常は６〜８のｐＨで、連続的に、又は同・寺に接触
させることができる。与えられた未知量の分析物質の分
析は］ａ常に、時間間隔及び試薬量についての同一の条
ｆ’ｔ−Ｆにおける上記の分析劣質の濃度と適当な粒子
分布特性を関係付ける標準曲線との比較によっている。

本発明に生勉学的且つ臨床的に事姥な薬剤、代謝物、ビ
タミン、殺虫剤、ステロイド、ペプチドホルモン及びあ
る種の楠標識物質のような、それに対する結合剤がイ芋
在する広い種類の分析物質の検出と測定に対して適用す
ることができる。

特に興！＃、ある分析−１′／Ｉ誓としては、生物学的
敵体中できわめて低い濃度を有するか又は狭い治療範テ
ロイトジゴキシ／は、ヒトの血清中で０．８ｎｌｌ／−
（１−当りのｔノグラムン以下の４度では心臓不整脈の
治療に対して無効であるのに対して、λ０ｎｌｌ／ゴを
超える濃度ではしばしば毒性であるために、両方の基準
を満足する。同、鎌に低１ｆＩｋ度で又は狭い治療範囲
で存在するその他の分析物質はビタミンＢＩ２、葉酸及
び大部分のステロイド、ペプチド及び蛋白質ホルモンを
包含する。たとえばミオグロビンのような分析＊質は帷
常は血清中ではきわめて低端咬であるが心筋梗塞後には
劇的に増大する可能性があるので、その状態の表示とな
る。たとえばｆｉ１１菌性及び癌細胞標識物質のよつな
分析物質は一般に、早期の検出（長期にわたる・洲胞の
増殖以前の）がきわめて望筐しいがら、低濃度である。

アミノグルコシド剤、バルビッル酸塩剤及びたとえばテ
オフィリンのような多くの各種薬剤にμｉ／ｍｌ（ミク
ログラム／ミリミツトル）の水準の比較的高い一度で存
在するが、しかし狭い治療範囲を有し−Ｃいる。ｌ８Ａ
１表は本発明の実施において特に興味がある各種の分析
物質を示す。

第１表 分析、物質 アルカロイド剤　　　　キニン ペンゾイルエクゴニン　　　□ コカイン　　　　　　　　アミカシン コディン　　　　　　　　　ｒンタマイシンデキストロ
メトルファン　カナマイノン１０イン　　　　　　　　
　ネオマイ７ノリゼルグ葭　　　　　　　トブラマイシ
ンモルヒネ キニジン 抗生物質剤　　　　　　　バルビッル酸剤アクチノマイ
シン　　　　ジフェニルヒダントイン カミマイシン エトスクシミド クロルγムフエニコール フェノパルビタール クａ口マイセテン プリミドン クミルテトラサイクリン セコパルぐタール エリトロマイシン マリファナ誘導体 オキシテトラナイフリン ペニシリン　　　　　　　カンナビノールポリばキシン
Ｂ　　　　　テトラヒドロカンナビノール テラマイシ／ 代謝物質 テトラサイタリン ストレプトマイシン　　　ガラクトースフェニルピルビ
ン酸 ゛　　　ポルフィリン スペルミン 各種薬剤　　　　　　　　各種薬剤（続）抗コリン性薬
剤　　　　　Ｎ−アセチルプａカインアミド 抗ヒスタミン剤 ナルセイン アトロビン ノルトリブチリ／ ブチロフェノン剤 オキサゼパム カフェイン パ）ぞペリン カルマゼピン 、　　　　　　　　　　　　　ｆロカイン了ミドクロａ
プロマジン デロノぞノール ダリセオフルビン テグレトール イミプラミン テオフィリン Ｌ　−ドーノぞ セロトニン “））”′４７　　　　７．２ｆ。２ゆメペリジ／ メプａバメート ペプチドホルモン　　　　ステロイド アンギオテンシン　　　　アンドｏｆｆン傾メト−及び
ａイーエンケ　胆汁酸類 ファリン ジゴキシン オキシトシン ジゴキシｒニン トリイオドチロニン　　　ロール バンプレノシン　　　　　エストａｒン殺虫剤　　　　
　　　　　ダストログン食品中の毒素 カルバメート殺虫剤 チオホスフェート殺虫剤　アララドキシン類ミド殺虫剤
　　　　　　　オクラトキシンパタリン 食品中の毒素（続）　　　　蛋白質ホルモンペニシリン
酸　　　　　　絨毛膜ゴナドトロピントリコテセン毒素
　　　　絨毛膜チａトロピンゼアルクロノン　　　　　
−グルカゴンビタミン類　　　　　　インシュリン 神経成長因子 ビチオン 上皮小体ホルモン 葉素 胎盤ラクトダン チアミン ゾロラクチン／ ビタミンＡ ｆａインシュリン ビタミンＢ。

レノクシ／ ビタミンＢ６ 蛋白質 ビタミンＢ２．　　　　　　　　□ ビタミンＣアルブミン ビタミンＤ　　　　　　　　α、−晴糖低糖蛋白質ビタ
ミンＥ　　　　　　α、−、−リプシンビタミンＫ　　
　　　　　　α１−糖蛋白質蛋白質（続ン　　　　　　
　蛋白質（続）α１−リポ蛋白質　　　　免疫グロブリ
ンＭα、−抗トリゾシン　　　ハグトゾロビンα、−マ
クログａプリン　ヘモグロビンαツー糖蛋白質　　　　
　　セルログラスミンα、−リボ蛋白質　　　　コリン
エステラーゼβ−リポ蛋白質　　　　　へモペキシ／β
−糖蛋白質　　　　　　ミオグロビンＣ−反応性蛋白質
　　　　リューマチ因子物質　　　　　　　　　　　ト
ランスフェリンフィブリノダン　　　　　トランスコル
チン免疫グロブリンＡ　　　　　、ｆラス免疫グロブリ
ンロブリンＤ　　　　神具性抗体類免疫グロブリンＥ　
　　　凝集因子 免疫グロブリンＧ 細菌性表面標識物質 細菌性抗原 真菌性抗原 寄生抗原 ウィルス性抗原 癌細胞標識物質 発癌性抗原 ガングリオシド類 抗体 分析物質とそれらの特異性抗体は迅速に反応し且つ結合
して強固に結合した複合体を形成する。

先に示した分析物質に対する抗血清は公知である。

ブミンにハプテン化して（共有結合によって免疫抗体は
この分析において、血清画分とし七、免疫精製したー特
異抗体画分として、又はモノクローナル抗体として使用
することができる。これらの各種の抗体画分の調製は文
献において公知である。

［ｒｌ’ｅ　ｉｒ　、　　Ｄ、　　Ｍ、　、　実験免疫
学ハｙ　）”フ：７　り、ブラックウェル科学出版、オ
ックスフォード１９７８年、ａ　１−１０．５１３゜ 粒子試薬 粒子試薬の調製は以下のようにして行なうことができる
：たとえば、分析物質又は蛋白質性物質を重合体粒子の
表面上に吸着させたのち、適当なｐＥ条件下に重合体粒
子の表面上の官能基、たとえばエポギシ基、を分析物質
又は蛋白質材料の相補的な官能基と反応させる。次いで
未反応物質を粒子試薬から分離する。反応条好は実質的
に粒子の架橋が生じないようなものとする。

蛋白質物質によって共有結合により結合した生物学的に
興味ある化合物を含有する粒子試薬を調製するための２
方法が好適で・烏る。たとえば分析物質のような、生物
学的に興味の、ある物・度を先ず担体蛋白質に、次いで
重合体粒子に結合させることができる。別法として、先
ず蛋白質を重合体粒子に結合させ、次いで分析物質を蛋
白質に結合させることができる。第二の方法は、生物学
的に興味のある種々の化合物が結合している粒子試薬の
合成に対して同一の蛋白質粒子試薬を用いること抱合体
ｉ　ｃ、ｏｎｊｕｇａｔｅ　）の表面談Ｉｔ　ｉ／：ｌ
：、反応時間によって、生物学的に興味のある化合物の
不活性希釈剤による希釈によって、又は粒子の分散を助
ける添加剤によって、変化させることができる。

龜１４の表面濃度は高い凝集反応速度を与えることがで
きるけれども、分析の感度を高めるためには比較的低い
表面ａ度が重要でみることがある。

かくして得た粒子試薬を緩衝剤、血清成分及び界面活性
剤をも含有することができる実質的に水性の媒体中に懸
濁させることによって、光散乱免疫或定における使用の
ための分散した単量体試薬とすることができる。

計測 て（ｌＧｉ々の粒子及び凝集した粒子によ、り散乱した
Ｖ−ザー光線をモニターして散乱光を記録し且つ分析す
ることによって行なわれる。

粒径分析並びにエーロゾル及び不透明流体媒体（主とし
て液体）流中に同伴される粒子を数えるために適した光
散乱方法に基づく計数装置は公知である。このような装
置の１例は、ポリテツク孕 オプトニックス、インコーポレーテンド　オブエル　ト
ロ、カリホルニアによりＨＣｌ５型としし市販されてい
る。照射波長と比較して小さい径を有する粒子及び／又
は媒体の屈折率に近い屈折率を有する粒子の数の計数又
はその他の表示による度数分布図を得ることがしばしば
有利である。

しかしながら、一般に市販されているような装置１．ｔ
は、このような粒径又は屈折率を南する粒子の数の定量
的な測定を行なうことができるようには思われない。

ある。全般的には、Ｋ　ｅ　ｒ　ｋ　ｅ　ｒ著゛′光及
びその他の放射線の散乱゛、アカデミツク　プレス社（
１９６９）を参照するとよい。本発明の目的に対しては
、粒子の１粒径ノＲラメり”という用語は、α”で表わ
され且つミーによって次のようここでｍ２は粒子を同伴
している媒体の屈折率であり１、 ａは粒子の半径であり、且つ λ０は粒子に対する入射放射線の自由空間波長である。

”比屈折率”とい９用胎は１１で表わされ且つ次のよう
に定義することがで＾る： ｔ ここでｍ、ｊｄ粒子の屈折率である。

Ｓ　＝　　ｌ　（ｍ−１）　ｌα それぞれ粒子を同伴している媒体の屈折率に近い屈折率
と０．０５ミクロメートルの程度の半径を有している粒
子を歓えるために適している粒子計数装置を用意するこ
とが有利であると思われる。

ミー理論によれば、０．６３３ミクロメートルの程度の
自由空間波長を有する入射想、１．５９の程度のｍｌ及
び１．３３の程度の常、に対しては、このような粒子は
少なくとも０．１２９の検出感度限界Ｓを有している。

第１図は全般的に参照着号ｌＯで示した本発明による粒
子計数装置の概念図である。　この粒子計数装置１０は
所定の波長（典型的には０．６３３マイクロメーター゛
）で平行化した放射線の源泉１５、同伴する計数すべき
粒子を有する担体流体媒体流が流れるキュベツトすなわ
ち試料セル１６及び媒体流中の各粒子によって散乱した
放射線の強度に応答して粒径に相関する電気信号を生じ
る検出器１７を包含している。計数器機構１８は検出器
」７に動作的に付随して媒体流中で所定の粒径範囲内に
ある粒子の数の総数を与える。本発明によるセル１６は
全般的に参照番号２２で示す第一（入射）の光学径路及
び全般的に参照番号２４で示す第二（収光）光学径路の
交差点に位置する。

入射径路２２は集光径路２４に対して垂直であることが
好ましいが、そうでなければならないといつことはない
。

第一の光学径路２２は放射線源１５を包含する。

線訪１５は焦点を結ぶため対物レンズ２８に向う平行化
した放射線（参照番号２５で表わす）を与える。対物レ
ンズ２８に、参照番号２９で示すように、セル１６に向
って放射線を集中する。これらの要素は、後記するセル
１６の幾何宇と部間して、セル１６の内部に規定した概
して円筒状の視野区域３０（第３図参照）を光学的に限
定し且つ明るく照明する。本発明に従がうと視野区域３
゜は約１ピコリツトル（すなわち　１０−１２リツトル
ノの容積を占める。この容積は１辺０．１間の立方体の
体積に相当する。この視野区域３ｏの容積のためのレー
リー散乱により検出外１７によって集められる放射線が
減少する。かくして、それぞれ０．０５ミクロメ一ター
程度の低い範囲にある径（すなわち半径）及び１．５９
程度（ＷＬ、＝　１．５９　）の屈折率を有し、かくし
て少なくとも＋３．１２９の検出感度限界Ｓ（前記のと
おり）ｋ市する粒子を含有する比較的高い粒子始度の液
体流（Ｉｏｌ１粒子／リットルの程ｅ）を検出し、解像
し且つ計数することができる。での上、視野区域３ｏの
小さな寸法は、視野区域中の２粒子を同時に検出する確
率を低下芒せる。ａ源１５は、たとえば２ミ■ノワツト
のヘリウム−ネオン装置のような、レーザーであること
が好１しく、これは視野区域３０の強い回折の限られた
照明を提供する。いう贅でもなく、強い回折、の限られ
た照明のどのよう、な線源をも用いることができる。

第二の光学径路２４は参照盃号３５で示すように円錐状
に散乱した放射線を集光する正の対物レンズ３４を含む
。対物レンズ３４け、参照番号３６で示すように、巣め
た放射線を検出器１７の前に位置させたスリットマスク
３７に向って集中させる。これらの要素はセル１６の幾
何学的形状と喚問して比較的大きな（０，４）開口４０
をもって円錐３５中で散乱した光を集める。

ｌ；ｇ２Ａ及び第２Ｂ図を参照すると、これらの図はそ
れぞれ本発明に従が９セル１６の平面図及び匍ｊ立面図
である。セル１６はノぐイレツクスガラスから成る実質
的に円筒形の部材であるけｉＬども、線源１５が放射し
且つ粒子が散乱する放射線に対して透明な如何なる材料
を用いることもできる。

セル１６の製作に用いる材料は、セルと媒体の間の界面
における散乱光の内部反射を最少限とするために、粒子
を同伴している担体流体媒体の屈折率に近いように選ん
だ屈折率を有する。セルは射出成形を含む、任意の適当
な手段で製作することができる。

平滑な穴１６Ｂがセル１６を貫通して、計数すべき粒子
を運んでいる担体流体媒体４Ｅ通り抜けることができる
流路を限定する。穴１６Ｂの軸１６Ａは流体の流れの方
向に対して平行（すなわら、第１図の而に対して垂直）
である。軸１６．（はセル１６の軸と一致することが好
ましい。セル１６の長さは穴１６Ｂの直径の少なくとも
約１０倍でなければならず且つ絶対的に必要というわけ
ではないが、約２５倍であることが好ましい。

第一の光の径路２２に対して提供されるセル１６の外面
は平面状に平らにした部分１６Ｆを有している。この平
らにした部分１６Ｆは光学的に滑らかな表面を有してい
る。部分１６Ｆは、第一の光学径路２２に沿って光源１
５から視野区域３０中に導入される放射線による実質的
に収差のない該区域の照明を許すために充分な距離にわ
たって、セル１６の高さに沿ってのびている。セル１６
の外部表他はくぼんだ円筒形の切り欠き１６Ｎをもゼし
ている。切り欠き１６Ｎの円筒形の表面は穴１６Ｂの軸
１６Ａに対して直角に配置することが好ましい軸１６Ｓ
１有している。入射光径路２２が集光径路２４に対して
直角になっている好適な場合においては、切り欠き１６
Ａ’の表面の軸１６Ｓは平らにした部分１６Ｆの表面に
対しても垂直にのびている。いうまでもなく、との関保
は入射及び集光の両極路間の角度に適合するように変更
することが適当である。円筒形の切り欠き１６Ｎの表面
が存在する円筒の半径１６７？は一般に、穴１６Ｂの半
径よりも大である。くぼませた円筒形の表面１６Ｎの半
径１６Ｒの寸法は、視野区域３０を通過する粒子により
散乱する放射線のほとんど収差のない集光を可能とする
ために、担体流体媒体とセル１６の材料の屈折率に基づ
いた幾何学的光線追跡方法によって選ぶ。

円筒形の切り欠き１６Ｎｆｄ、セル１６と担体流体媒体
の屈折率の差及び穴１６Ｂの白兎によって集光径路２４
の部分３５中に導入される非点収差を補償する。この非
点収差に対する補正は、穴１６Ｂの比較的近くでもつと
もよく行なわれ且つ入射光径路２２（典型的には０．０
２の開口数）の部分２９の開口数と比較して集光径路２
４の部分＝３５の比較的大きな開口数（すなわち０．４
）のた４・ めに集光径路２４中のみ必要である。円筒形の切１６Ｎ
中に挿入し−Ｃ穴１６Ｂに近く位置させることができる
ような大きさとする。円筒形の穴１６Ｂ及び切し欠き１
６Ｎの凹表面は、対物レンズ３４に対して少なくとも０
．４の開口数を与えるようにした凹の円筒形光学表面の
直交する対を形成する。この大きな開口数は、広範囲の
角度にわたって小さな粒子により散乱した放射線を観測
することを可能とし、それによってこのような粒子の検
出可能性Ｓ増大させる。

このような免疫学的検定の友めのセル１６を含有してい
る粒子計数装置１２を使用する系１０の操作を、概念的
に第３図に示す。単量体、三量体、三量体又は７ｖ量体
の大きさの粒子のランダム流を有する担体流体媒体は円
筒形の穴１６Ｂ及びその中に光学的に限られた視野区域
３０中を通り抜ける。粒子の屈折率は担体流体媒体の屈
折率に近似する。この条件が小さな粒子径と結び付いて
、計数のためのそれらの検出を円錐とする。一般に、こ
のような粒子は少なくとも０．１２９の検出感度限界Ｓ
（前記）を有している。

光源１５からの放射線は対物し／ズ２８及びセル１６上
の表面１６Ｆの作用によって視野区域３０甲に焦点を結
ぶ。視野区域３ｏ中を通過する粒子によって散乱し且つ
集光円錐３５内に表われる放射線は、担体流体感体、穴
１６Ｂ１切り欠き１６７Ｖ及び対物レンズ３４（第３図
の概念図中には示してない］を包含する来光系の各要素
の結び付いた効果によって集光される。円ｆｓ３６は検
出器１７に対して入射する散乱光のみを表わし且つ元軸
（同じく第３図の概念図中には示されていない）に対し
て垂直なマスク３７中のスリット上に１家を結ぶ照明さ
れた視野区域を包含する。かくして、視野区域３０中の
穴子によって散乱され且つ集光光学系によって集光され
る放射線の強度は集光光学系の倍率とマスク３７中のス
リットの幅に比例する。マスク３７中のスリットを通過
する放射線は、検出器１７によって、一般にはたとえば
ＲＣＡにより７）Ｆ１００６の型番号で製造及び市販さ
れているもののような光検出装置によって、検出器れる
。

検出器１７の出力は一連のパルス４２であって、その振
幅は放射線を散乱させる粒子の粒径に相関し、巨°りそ
の持続時間ｔ（第３図）ｉｊ視野区域中の粒子の滞留時
間に相関する。本発明の方法の実施に対して使用する場
合には、単量体、二量体、三量体及びＮ軟体粒子が、そ
れぞれ振幅の増大する・ぐルスを生じさせる。この特性
は、各粒径範囲のそれぞれ内にある粒子の総数を求める
ことができる便利な手段を提供する。

かくして、検出器１７の出力は、次の別個の４−チャン
ネルを含む計数器機構１８に接続している：単量体粒子
の計数のための１チヤンネル（４６＆）；二量体粒子の
計数のためのボニのチャンネル（４６Ｄｌ；三量体粒子
の計数のための４三のチャンネル（４６Ｔ）及びＮ量体
粒子の計数のための第四のチャンネル（４６Ｎ）。適当
な計数器機構１８の詳細な概念図を第４図に示す。第４
図には、チャンネル４６の典型的な一つである三量体計
数チャンネル４６Ｄを更に詳しく示す。

検出器１７の出力を、たとえばテキサス　インストルメ
ント社からＴＬＯ８０の型番号で製造１１反先している
装置のような、増幅器４８によって増幅する。増幅器４
８の出力を、たとえばパー−ブラウンによって製造され
且つ３５５０の型番号で市販されている　示差増幅器と
して形成せしめたもののような　Ｆ　Ｅ　Ｔ　ＩｊｔＪ
Ｉ作増幅６５０の逆変換出力に印加する。示差増幅６５
０の限界値（ｔｈｒｅ〜５ｈｏｅｄ　）は、増幅器５０
への非逆変換出力に接続する電位差計５２の包含によっ
て当該各チャンネルに対して予定した限界値を規定する
よりに変化させることができる。たとえばナショナル　
セミコンダクター社から７４１の型番号下に市販されて
いるもののような、動作増幅器５４Ａを包含する補償機
構５４の作用により限界値を連続的に調節することによ
って、検出器の出力の変動に適応させる。

増幅器５０の逆変換端子に対して印加した信号が、その
非逆変換端子に印加した調節した限界値水準を超える場
合には、出力信号を（適当な逆変換と増幅６５６による
増幅後に）生じさせ且つ、たとえばフェアチャイルドに
より？４１２１の型番号によ°りて市販されているもの
のような単女矩マルチパイブレーク−５８に印加する。

増幅器５６は増幅器４８と同様である。装置５８の出力
を、たとえばゾリンストン　アプライド　リサーチ社に
より１１０９の型番号下に＃造されているもののようケ
デジタル計数′＃６０Ｄに接続させる。

各チャンネル４６Ｕ同様にｈノ作して出力を生じ、それ
が付随する計数器６０に増分を与える。しかしながら、
演出器１７が発生する信号の関係のために、Ｎ　’、！
を体粒子によって生じるノぐルス４２が４６Ｍ、４６Ｄ
、４６Ｔ及び４６Ｎの各チャンネルに対する限界：直を
超えると同時に、それらのイ６チャンネルに伴なわれる
各計数器６０に増分を与える。ヨ吠体粒子によって生じ
る・ぐルスの量はチャンネル４６Ａ５４６Ｄ及び４６Ｔ
Ｖ（伴なわれる計数器に増分を与える。同様に二量体粒
子はチャンネル４６Ｍ及び４．６Ｄに付随する計数器に
増分を与える。単量体粒子にチャンネル４６Ｍに付随す
る計数器のみに増分を−与える。かくして、各粒径頓…
１中の各粒子の延数を求めるために１．Ｑ−術的論理装
置６２又はその他の適当な機能的要素の系列を接続する
ことによって、Ｎ量体（計数器６ＯＮと６０Ｔの間の差
）、三量体の数（ｉｒｔ数器６゜Ｔと６０Ｄの荒）及び
二量体の数（計数１６ｏｎと６０Ｍの間の苑）を表示す
る信号を生じさせる。

単量体粒子の数は直接に計数器６０Ｍによって得られる
。

いつ１でも７堂＜、そのほかの計数装置もまた１更用可
能であり且つ本発明の目的内にある。たとえ（・コ、適
当にインターフェースで接続し且つプログラムしたマイ
クロコンピュータ市１ｊ釧ｊ装置を用いてこの作業を行
なうことができる。たとえばコン・母レーク−５０のよ
うな単一のコンノぞレータを使用し、その出力を振動数
−電圧変換器に接続し且つその非逆変換入力が１０グラ
ムしつる入力限界値を受は入れる（共に、それぞれマイ
クロコンピュータ−によ−；）で読み取り又は改変する
フことにょつて、限界値の値を掃引し且つ生じた電圧を
記録することにより、試料に対する・ぐルス波高め゛よ
り大きな”ｆロットを得ることができる。たとえばダイ
ナミック　メジャーメンツ　コーポレーションによって
９１１０型として市販されているよ・、つな撮勤敬−電
圧変換６冷及びデジタル　エクイッテメント　コーポレ
ーション　Ａｆ　Ｉ　／Ｖ　Ｃコンピューターのような
振動数−電圧変換器を用いることができる。Ｍ　Ｉ　Ｎ
　Ｃベーシックぎ語翻訳（ｌゴａｓｉｃ　　Ｌａｎｇｕ
ａｇｅ　　Ｖｅｒｓｉｏｎ）２．０における適当なプロ
グラムを付属させ且つ本発明の部分ならしめる。

上記の噌明から、少なくとも０．１２９の、Ｍｔｌ記の
ような演出の＠ＪＫ限４￥Ｓを有する粒子を演出し、分
解し且つ計数することができる粒子計数装置を開示した
ことを了」ｔし得よう。

実施例 他のことわりがない限りは、分析条件及び試薬の調製に
ついての全記述において、温度は摂氏で表わし且つ百分
率としてのｌ濃度は重量／容量による。全体にわたって
国際単位（ＳＩ）を使用する。

攪拌機及び温度制御した加熱マントルを備えた０、３リ
ツトルの丸底フラスコを用いて、窒素雰囲気下に７０℃
における重付によって重合体粒子を調製した。０．２１
１のエーロゾル（Ｊ７”−１００（アメリカン　シアナ
ミド　カン・ぐニーから入手したスルホコハク雪ジオク
チル　ナトリウムＪ及び０、２　、！ｉ’の過硫鑓カリ
ウムを貧有する０、２１の水に対して０．５　ｒｎｅの
スチレンを麻加することによ°りて、シードｘｑルショ
ｙ　（５ｅｅｄ　　ｅｍｕｌｓｉｏｎ　）を調製した。

２時間後に、２０−のスチレンと０５１５ｇのエーロゾ
ルＣ）７’−１００から成るモノマーの仕込みを０．２
　ｍｆ　／分の速度で開始した。モノマーの添那の完了
後に、エマルジョンを７０°′ＣでＭ＆保存することに
よってスチレンの転化の完結を確実にした。最終的な固
形物含量Ｆｉ９．７％、コアポリスチレン　エマルジョ
ンの粒径（５４６ｎｍＫおけるｒａ　リ度測定によって
求める）は０．１１μｍであり、表面張力（ドヌーイ　
リング法を用いて張度計によって測定）は３７ダイン／
　ｒｙｌｌであった。

−ル中に溶解した。１４４ｉの０．１　ｌＷ過沃累酸ナ
トリウムを攪拌下に４加して反応を３０℃で２５分間継
続させた。この時点で、水中に＠解した３、　２６４　
ｍｌの０，１Ｍグリセリンを加えて反応を停止させた。

５分区に、反応混合物を１４４−の脱イオン水中の３．
６ＩのＨ５Ａ　（５％炭酸カリウムによってｐＨを９．
２に調節した］中に？薗加した。

反応の過程（ａＯ分、２５℃）で５％炭酸カリウムによ
ってｐＨを９．０〜９，５に保った。水素化ホウ素ナト
リウム（１，２７２、Ｐ　）を刀口え、３時間後に３．
６５Ｍｌ１Ｃ１によってｐＨを６．５に調節した。

次いで溶液を脱イオン水に対して透析した。透析投機ニ
、溶液をＰＭ１０Ｆｉ紙を用いてアミコン１ｉｎｔ縮器
ＶＣ，ｃす１３０ｍに横縞した。次いでｍ液を凍結乾燥
してジゴキシン−Ｈ５Ａ抱合体を得た。硫酸炭化法によ
るジゴキシン含量及び２８０ｆＺｍにおける吸光ｊ屍に
よる蛋白質含量についての分析は、Ｈ’ＳＡ蛋白質分子
当り１３．５のジコ千シン分子という比率を示した。

上記実施例１αの重合体粒子調製物（固形物ｌＯ％）６
−を攪拌及び超音波処理下にｌｌＮｉ／ｍのジゴキシン
−Ｈ５Ａ抱合体を含有する１、２ｊの溶液＜０．３Ｍ　
　ＮａＣ１，０，０２Ａｆリン酸塩、ｐＨ９，７’）に
４加した。

かくして得た懸濁液を攪拌し、超音波処理し且つ加熱（
５０℃で１時間）した。次いで＠濁液をデュポン　ソー
パルＲＣ−ｓＢ型遠心分離機とＧＳＡＣｔ−ターを用い
て１２，５００Ｏｒ、ｐ、ｍで７時曲遠心分１＃ｉｉ　
して未吸着の抱合体をすべて除去した。粒子のペレット
を緩衝液＜０．３Ｍ　　ＮａＣ１゜０、０２　Ｍリン酸
塩、ｐＨ９，７）中に溶解した５ＯＯ−の０．１％ドデ
シル硫峙ナトリウム（ＳＤＳ）中に再懸濁し、５０℃で
１時間加熱したのら、同じ条ヰを用いて再び遠心分離し
た。粒子ペレットを再び２５０−のＯ，１％ＳＤＳ中に
懸濁し、超音波処理し７ｔのら、５Ｓ３４Ｃ１−ターを
用いて１９，５００ｒ、ｐ、ｍ、で２時間遠心分離した
。

（１ｄ）　ジゴキシンに対する粒子計数分析元散乱粒子
横出器を、既知の均一な粒子径の重合体粒子懸濁液をセ
ル中に送入し且つプリンストン　アプライド　リサーチ
計数器１１０９型の４チヤンネル中で所定の弁別が得ら
れるようにコン・ぞレータ−の出力を調節することによ
って、較正した。第２表中に示すように１．０．３ｉ　
　ＮａＣＬ。

０．１％ＳＤＳ、０．０２Ｍリン酸塩及び０．０１％ナ
トリウム　アジド中のｐ　Ｈ７，６、固形物０．００２
５で送入した。粒子の計数は１秒間隔とした。

このようにして較正した検出器を使用して、単量体粒子
並びに二量体、二量体及びＮ量体粒子凝集物からのパル
ス　カウントを正確に分解し且つ記録した。

Ａ粒子試薬溶液（前記実施例１（ｃ）において調製）を
、０．３Ｍ　　ＮａＣ１，０，１％ドデシル硫ｅｔトリ
ウム（Ｓｌ）Ｓ）、０．０２Ｍ　　リンａｐ＝、０．０
１％ナトリウム　アジドを含有するｐ　Ｈ７，６の緩衝
解反ＵＯ，６，５又ｎ　２００　ｎｇ　／ｍｌのジゴキ
シン−ペンチ　トップ超音波発娠器中で１０秒間超音波
処理した。、３４０ｎｍにおける最終的な吸光度＃−ｊ
Ｏ，１１２であった。２０μｌのウサギの抗−ジゴキシ
ン抗体（全血清、カッベル研究所）の添加によって凝集
を開始させた。ジゴキシン−特異性抗体の添加の０．０
５．２及び４分後に、懸濁液の２−の部分試料を取抄出
して、ｐＨ７，６の０．３Ｍ　　ＮａＣＬ　、　　０．
１％ＳＤＳ、０．０２Ｍリン酸塩、及び０．０１％ナト
リウムアジドのｍ液でｌ：４に希釈した。このような媒
体中における希釈は凝集プロセスを効果的に停市させる
。これらの試料を前記のように散乱粒子検出器中に送入
した。

第５図は単量体粒子並びに二量体及び三量体杓子凝集物
の数の変化−ｉｏ、６．５η／−のジゴキシン及び２０
０　ｎｌｉ　／ｍｌのジゴキシンの存在における時間の
関数として示す。この図から明らかなように、単量体判
子の一度は急速に低下するのに対して、二量体粒子と三
斌体粒子のａｄｉｔは増大する。

特に、単量体及び二竜体粒子＃度の変化は、懸濁液の濁
り度め認めうる変化が生じる前に確認することができる
。ジゴキシン濃度が高いほど、それ与えられた時点にお
ける二量体粒子の数を用いて試料中に存在するジゴキシ
ンの量を求めること数をｔ　＝　０．５分において比較
している。

第　３　　表 ジゴキシン量と粒子試薬凝集性の関係 ０　　　　　　　　　　８．２ｘｉＯ”６．５　　　　
　　　　　６．２ｘｌＯ’２００　　　　　　　　　　
°０．３Ｘ１０ｓ０．５分において存在する二量体粒子
の数を既知標準条件下で存在するものと比較することに
よって、未知試験試料中のジゴキシンの量を決定するこ
とができる。

本明細艦・の説明及び実施例は例証のために記したもの
であって限定のためのものでＶ′ｉなく、本発明の精神
及び範囲から逸脱することなく４市々の修飾及び変更を
行なうことができるということは明白であろう。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明による粒子計数装置武の嗟式化した概
念図である。 ｇ２Ａ図及び２Ｂ図は、それぞれ、本発明による粒子計
数装置＾：Ｉ：Ｐで使用するために適したセルの平■図
及び側立面図である。 第３図に、川２図に示すようなセル中の視野区′域を通
過する粒子による放射線の散乱及び集光の様式化した概
念図である。 第４図は、本発明による粒子１°＾父装置中で車用する
ために適した電気回路の概念図である。 第５図は、種々のジゴキシン濃度に対する粒子凝集の運
動論的分析を示し、橢々のジゴキシン濃度について単量
体、二量体及び二量体粒子に対する時間の関数としての
存在する粒子の百分率又は存在する粒子の数の一連の１
０ツトである。 特許出願人　　イー・アイ・デュポン・デ・ニモアス・
アンド・カンノぐニー 外１名 ＦＩＧ、５ 時間　（４ナノ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　時間　（ｅ〕ｆＩｆも ■１　間　（４デノ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 り、敵体媒体中の分析物質の定量のための方法にして、 Ａ、該成体媒体を （１）分析物質特異性抗体、及び （２）　　不溶化した分析物質によって４Ｊｌ覆したべ
   １子試薬 を包含する試棋と接触させて凝集する反応混合物を形成
   させ； Ｂ−該反応ｌ昆会物を光学的に限定した視野区域ケ通過
   させ、そこに焦点を結ぶＶ−ザー光報４・入射し； Ｃ１該反応汎合物から散乱したレーザー介護を集光し；
   目、−ノ Ｄ、該散乱したレーザー光線を分析することによって該
   液体媒体と該試薬との接触後の時間の関数として該反応
   混付物中の粒径分布を決定し、それによって該機体媒体
   中に最初に存在する該分析物質を定量する 段階を有する該方法。 ２　分析物質は薬剤、代謝物、ホ）ｙモン、ステロイド
   、殺虫剤、環境汚染物質、食品毒素、ビタミン、蛋白質
   、細菌性表面標識物質、楠細胞標識物質、真菌類、原生
   動物、ウィルス、細胞父は組織抗ｊ宗である、特許請求
   の範囲第１項記載の方法。 ３、　分析物質は、薬剤である、特許請求の範囲第２項
   記載の方法。 ４、４剤はジゴキシンである、特許請求の軛−第３項記
   載の方法、 ５、該光学的に限定した視野区域Ｖま所足の板長の平行
   化した光線に対して透明であり且つ該媒体の屈折高に近
   い屈折率を有する材料から形成せしめたセルから成り、
   該セルはそれをｉ、ｉｉｌ　ｊ、てのびる円筒形の穴を
   巾し、訪穴の軸はセル中の粒子の【ＡＬれの方向に対し
   て平打であり、該セルはその外面上に円筒形の表ｒＭを
   鳴し、咳表面が存する円筒の軸は該２（の紬に対して垂
   直である、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６、該液体媒体と該試薬との接触後の時間の関数として
   の粒径の分布の変化を該液体媒体中に績初に存在する該
   分析物質の定着のために利用する、特許請求の範囲第１
   瑣記載の方法。 ７、該液体・嘉体と１亥耘薬との接触後の所定の時間に
   おりず６特定の粒径のΔ子のに度を該液体媒体中に最初
   に存在する該分析物質の定量のために利用する　峙許請
   ５１＜の４週１）囲・尤１項記、或の方法。 ８、　該液体Ｉ媒体と該試薬との十か独後の所定の粒径
   の粒子の生成速度を該液体、環体中に最初に存在する該
   分析物質の定量のために利用する、特許請求の範囲第１
   項記載の方法。 存在する該分析９クフ質の定着のために利用する、特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 １０、　　該液体媒体と該試薬との接呻後０．５分乃至
   ＺＯ分の時点における二量体粒子の横変を該液体媒体中
   に最初に存在するジゴキシンの定量のために利用する、
   特許請求の範囲第１項記載の方法。