JPS59152321A - リポソ−ム製剤の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、リポソーム製剤の製法、ことに予め薬剤を包
含させたリポソームを作り、次いで塩化ナトリウム、糖
類又は緩衝剤を加えることにより、薬剤の包含率を改良
したり示ソーム製剤の製法に関する。

リポソームは、通常水性物質により相互に一定の間隔を
保った多数のりん脂質二層からなるタマネギ様の多源層
構造を有し、他の構造として、水性物質を含む単一のり
ん脂質二層からなる（小胞といわれる）ことが知られて
いる。かようなリポソームを薬剤の運搬体として応用し
ようとする試みが多数報告されており（例えばＧ　、　
Ｇ　ｒｅｇｏｒｉａｄ−ｉｓ、　Ｎｅｗ　　Ｅｎｇｌ　
、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　２９５　．７６５（１９７６））
、本発明者らはすでに有機溶媒を用いないリポソームの
新規な製造方法を見い出している（特公昭５５−８４８
８．特開昭５７−８２３１０．同５７−８２３１１　）
。その他、例えば、す／ｖ脂貿薄膜に薬物水溶液を加え
て振どうするハイドレーション法や、界面活性剤を用い
てりん脂質を可溶化してそこに薬物水溶液を加えた後透
析等により界面活性剤を除去づる方法や１−チル注入法
、逆相然発法などリボソーノ＼の製造法は多数報告され
てＪ５す、その概要（マ例えばＦ　、　Ｓ　ｚｏｋａ、
　Ｄ　、　Ｐ　ａｐａｈａｄ、１ｏｐａｕｌｏｓ。

Ａｎｎ、　　　Ｒｅｖ、　　　１３１ｏｐｈｙｓ、　　
　１３　　ｉｏｃｎｇ　、　　　９．　　１１１６　７
（′１９七３０）にＪ、とめられている。

−１５ｉｔ”剤を包含さけたリポソームを薬物運搬体と
しＣ非経［１的に投！−５する場合（例えば静脈両投！
づ、筋肉両投！−Ｊなど）に（よ該リポソーム製剤の浸
Ｊ６　Ｊ−Ｃｉ′）ＩＩ　ｌ−１を調整したり、薬剤の
安定化或いは投りの際の無１ｒｒｉ化を図るために塩化
ブー　１−リウム、糖類又は緩衝剤を添加する場合があ
る。しかし既知のプ）法（こＪ：す、塩化す１−リウム
、糖類又は緩衝剤などを甲に加え−（リポソームを製ｊ
告づるとリポソームへの薬剤の包含率（取込み率）がｌ
ｆｌ　”Ｆ　？ｌ’るの（・、本発明者らは種々研究を
重ねた結束、塩化す１ヘリウム、糖類又は緩衝剤が存在
しても薬剤の取込７／率が低下し１．ｆい新規なリポソ
ーム製剤の製法を児い出し本発明を完成させるに至った
。

づなわＩ−５、本発明によれば既知の方法に−Ｃ予めリ
ポソームに薬剤を取込ませた後、または必要がある場合
には例えば遠心分離、限外濾過、ゲル濾過ｖ５にＣリポ
ソーｌ＼に取込、１、れイｒか・〕だ檗剤を分離除去し
た後塩化すｌ〜リウム、糖類又は緩衝剤を加えることに
より、薬剤の取込み率が高くかつ塩化ナトリウム、糖類
又は緩衝液を含んだリポソーム製剤を製することができ
る。

本発明方法を実施するに際し、予めリポソームに薬剤を
包含させる方法としては例えば特公昭５５−８４８８．
特開昭５７−８２３１０．同５７−８２３１１．同５３
−１４２５１４に記載された方法の他既知の方法が利用
できる。その−例を示せば、りん脂質を水性媒体中に分
散さけた後、該分散液に薬剤含有溶液を加えて薬剤含有
りん脂質分散液を調製し、かくして得られＩＣ薬剤含有
りん脂質分散液を凍結して、該薬ｆＮＪを含有せるりん
脂質の微粒子を形成せしめた接、解凍処理することによ
り調製でき、かくして調製された薬剤含有リポソームは
解凍処理したＩＪん濁液を遠心分離ケるなどの公知の分
−１操作により単離することができる。

本発明において使用されるりん脂質としては、フＡスフ
ァチジルコリン、フＡスファチジルエタノールアミン、
フＡスファチジルレリン、フＡスフン・ブジルイノシト
ール、フオスファチジルグ１ノＬ−［］−ル、スフィン
ゴミエリンなどの卵黄、大豆その他動植物の組織に由来
するもの、また【よこれらの混合物である卵黄りん脂質
、大豆りん脂質あるいはシバルミ１へイルフオスファチ
ジルコ！ノン’Ｊどの合成により得られるものがあげら
れる。

また、りん脂質朕の強化、酸化防止、荷電イ」与等のた
め例えばコレステロール、α−１−コフエＩＩ−ル、ジ
セチルフオスフエート、ステアリルアミン等をりん脂質
１重量当り１〜０．１重量部ｆ！（！度加えてもよい。

本発明にＪ３いて使用される薬剤として【ま（伺え（ま
ジルチアＵム、グルタチオンなどの他にシフ７ノコバラ
ミンのごときビタミン類、Ｌ−アスパラギプー−ゼ、ウ
ロギナーゼのごとき酵素剤、アミンペンシルペニシリン
、α−カルボキシベンジルペニシリンのごとき抗生物質
、フルオロウラシル、アラシヂシンのごとき制Ｗｔ　７
！ＩＩＩ　、コルチコ１へ［１ピン、′Ａ−キシドシン
のごとき脳下垂体ホルモン剤、エピネフリン、酢酸コル
チゾンのごとき副腎ホルモン斉１゜プロゲステロンのご
とき黄体ホルモン剤など力〜挙げられる。しかし本発明
に使用される薬斉ｊ＆よ、これらに特に限定れさるもの
ではなく、１ノポソーム製剤の形成が望まれる薬剤であ
ればよ（Ａ。なお、中でも酵素剤のごとき水溶性高分子
薬剤の場合′ｈ＜好適である。

上記のごとくして調製された薬剤含有１ノポソームより
塩化ナトリウム、糖類又は緩衝剤を含んだ薬剤含有リポ
ソーム製剤を製するには、既知方法で得られた薬剤含有
リポソームの水性（すん濁液に塩化ナトリウム、糖類又
は緩衝剤を加える力１、または単離された薬剤含有リポ
ソームを塩化ナト１ノウム、糖類又は緩衝剤含有液に加
えることにより行うことができる。

本発明で用いる糖類としては、例え＆ｆ、グルコース、
マンニトール”、ソルビトール、キシ１ノトールなどが
あげられる。又、緩衝剤として【ま１列え【ま゛、リン
酸１カリウム／リン酸２ナト１ノウム、６Ｙ酸／酢酸ノ
トリウ１１，１〜リスアミノメタン／塩酸などか＋９け
られる１、塩化ナトリウム、糖類又は緩衝剤の添加間は
特に制限されないが、たとえば塩化す１〜リウム又は糖
類を′６張化剤として用い薬剤含有′リポソームを血し
Ｊうの浸透圧と等しい浸透圧とづる１易合は、終濃度が
、塩化す］〜リウムの場合は０　、９　Ｗ／　Ｖ％、グ
ルーコース及びマンニトールの場合は５Ｗ／Ｖ％になる
ように覆るのが好ましい。

かくして、薬剤の取込み率が従来法ど比較し−Ｃ顕しく
向」−シたリポソーム製剤が得られる。

本発明によるリポソーム製剤は、注射剤の形′Ｃ１まノ
ζ凍結乾燥もしくはスプレードライして同化さけ、）′
！Ｔ）末剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、膏剤イ１どの
網形にし−（使用することができる。これらの網形の製
造は、当該分野く・公知の技術を利用り−ればＪ、い。

次に木凡用を実施例によって説明り−るが、これに特に
限定されるものＣはない。

（実施例１）　卵黄りん脂質１０ｇを０．０５Ｍ−トリ
スアミノメタン／塩酸緩衝液（ｐｔ−１８）中に加えウ
シ１〜ラツラツクス（Ｊａｎｋｅ　　Ｕ、　Ｋｕｎｋｅ
ｌ　Ｋ、Ｇ、製タイプ″ｒ　Ｐ　１−８−１０　＞で粗
分散し全量を１００　ｙｉｌとする。この粗分散液を超
音波処理する（　ＩＪ　１ｔｒａ　　３　ｏ＋１ｉｃｓ
　　ｌ　ｔｄ、　　製モデルＡ３５０Ｇ使用）。この分
散液を温時、孔径０．４５μｍのメンブランフィルタ−
で濾過する。この分散液濾過液に、等容量のし一アスパ
ラギナーゼ溶液（０，０５Ｍトリスアミノメタン／塩酸
緩衝液／ｐＨ８中２０００１Ｕ／厭、孔径０．４５μ１
１メンブランフィルタ−濾過）を加え２　ｍｌずつをバ
イアルに分注し綿栓する。つぎにこれらを冷凍庫（約−
２０℃）にて凍結しつづいて室温にて解凍してし一アス
パラギナーゼを取込まぜたリポソームを作製する。

上記で得られたリポソーム（プん濁液２７１１Ｆに塩化
ナトリウムを終濃度０．９Ｗ／Ｖ％になるように加えリ
ポソーム製剤とする。この製剤について以下の方法によ
りし一アスパラギナーＵの取込み率を求めたどころ／１
９％であった。

試オ゛＋１の総括１）１（試料にト・す１〜ンＸ−１０
０を加え（リポソーム膜を破壊して測定した活性）およ
び遊離粘付（試料ぞのＪ：まで測定した活１イ１）を測
定しく１）式により締出する。

総話１’１．　　ＭＩｉ１１活性 取込み率（％）＝　　　　　　　　　Ｘ１００　　・・
・（１）総話性 ’、＞　Ｊ＞活ｆ１ノ測定はＹ　０ｌａｎｔａ　　Ｆ　
！５ｌｌｎｌａｌｌら（Ｆｅｂｓ　Ｉ　ｃｌｌｅｒ　、
広則、’Ｉ　７　（１９７５）の／ｉ法に準じた。ただ
し酵素反応の結果生成覆るアンモニアの定ｈλはアンモ
ニア電極（日立堀場製作所製５０（、’）　２−０　！
’ｔ　Ｔ型〉にＪ、り行なった。

なお上記例にＪ′３いて食塩を予めＬ−アスパラ：１′
−ノー−げ溶液に加えて以下同様にリポソームを作製し
ｌご場合取込み率は０％であった。

（実施例２）実施例１　’？″作製したリポソーム【プ
ん濁′ａ、２Ｍｌにグリコースを終′ａ度５　Ｗ　／　
Ｖ％になるＪ、うに加えリボソーｌ−製剤とする。この
製剤に′ついてＬ−アスパラギナーじの取込み率を測定
したところ４７％であった。

なｄ３グルコースを予めＩ−−アスパラギナーゼ溶液に
加えた場合の取込み率は１０％であった。

（実施例３）実施例１で作製したリポソーム（プん濁液
２厭にマンニトールを終濃度５Ｗ／Ｖ％になるように加
えリポソーム製剤とづ゛る。この製剤について１−−ア
スパラギナーゼの取込み率を測定したところ／１８％で
あっ１ｃ。

なおマンニトールを予めし一アスパラギナーゼ溶液に加
えた場合の取込み率は３５％であった。

（実施例４）実施例１で作製したりリポソーム（プん濁
液２　ｆｆ／にソルビトールを終濃度５　Ｗ　／　Ｖ％
になるように加えリポソーム製剤とする。この製剤につ
いで１−−アスパラギナーゼの取込み率を測定したとこ
ろ４８％であった。

なお、ソルビトールを予め１−−アスパラギナーゼ溶液
に加えた場合の取込み率は３６％℃あった。

〈実施例４５）実施例１で作製したりボンームりん濁液
２　ｘｉにキラリ１〜−ルを終濃度５　Ｗ　／　Ｖ％に
なるように加えリポソーム製剤と覆る。この製剤につい
て１−−アスパラギナーげの取込み率を測定したどころ
４８％であった。

なｄ３、キシリトールを予めＬ−アスパラギナーＵ溶液
に加えた場合の取込み率は３３％であった。

（実施例６）人Ωりん脂質５ｇをり］］ロボルム５０１
１１に溶解し、ナスフラスコ中でクロロホルム、を留去
りる。そこにウロキナーゼ溶液（０，０５Ｍ−１ヘリス
アミノメタン／塩酸緩衝液（ｐＩ−１８）中１０、００
０１　（Ｊ／ｗ１．孔径０．４５μｍメンブランノイル
ター濾過＞１００ｉｌを加え、振とうしくリポソームど
する。かくして得られたリポソーム１）／υ濁液に塩化
す［−リウムを終１８ｉ１度０．９Ｗ／Ｖ％になるＪ、
うに加えてリポソーム製剤とする。

この製剤について実施例１と同様に総話性、遊離活（’
ｌにす、ウロ：Ｖブーげの取組み率を測Ｔしたところ／
１５％であった。ただしウロキナーゼの活性測定は、Ｔ
、　Ｍａｒ：ｔａら（Ｊ　、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｌ２．
１４９５’（１９７７））の方法に準じ、グルタニル−
グリシル−アルギニン−４−メチルクマリンを基質とし
、（４朱島津製作所製ＲＦ　−５１０Ｌ。

Ｃ型分光光度計によりケイ光強度を測定することにＪ：
り行なった。

なお塩化ナトリウムを予めウロキナーげ溶液に加えた場
合の取込み率は９％であった。

（実施例７）大豆りん脂質１０Ｑ１コレステ［］−ル５
ｇ、α−１〜コフエロール０．１９をＯ，Ｏ’５Ｍ−ト
リスアミノメタン緩衝液に加え、以下実施例１と同様に
してリン脂質の分散液濾液を得る。

この分散液濾液に等容量のウロキナーゼ溶液（０゜０５
Ｍ−１−リスアミノメタン／塩酸緩衝液（ｐｌ−１８）
中１０．０００１　Ｕ／藪、孔径Ｑ、４５μｍメンブラ
ンフィルタ−濾過）を加え以下実施例１ど同様に凍結・
解凍してリポソームを得る。かくして得られたリポソー
ム（プん濁液に終濃度０．９％になるように食塩を加え
リポソーム製剤を得る。

この製剤について・り［］キナーゼの取込み率を測定し
たところ５９％であった。

イ丙１３、」−２例において食塩を予めクロキナ−１溶
液に加えた場合の取込み率は４％であった。

（実施例８）卵黄りん脂質１０ｇを悠溜水中に加え以下
実施例１と同様に粗分散し全量を７５７１１とりる。つ
いで実施例１と同様にしでりん脂質分散液濾液を得る。

この濾液に等容量の１．−−アスパラギノ−−げ溶液（
蒸溜水中２６６７１Ｕ／ｉｆ、孔径（’）、４５μｍメ
ンブランフィルタ−濾過）を加え以Ｉ・実施例１ど同様
に凍結・解凍し−Ｃリボソーｌ＼をｉ！〒る。かくして
得られたリポソームりん濁液に１／３容最の塩化ツート
リウム・緩衝液溶′ａ（０゜２Ｍ−１〜リスアミノメタ
ン、／塩酸緩衝液中に食塩３３．６％を含む、孔径０．
４５μｍメンブランフィルタ−濾過）を加えてリポソー
ム製剤とづる（塩化プ１−リウムの終濃度：０．９％、
緩衝液の終濃度：０．０５Ｍ）。この製剤についＣし−
アスパラギナーげの取込み率を測定したどころ７０％で
あった。

なお上記例において塩化ナトリウム・緩衝液（０，０５
Ｍ−トリスアミノメタン／１３ｉｉ酸緩衝液中に食塩０
．９％を含む）−を最初に加えた場合の取込み率は２％
であった。

（実施例９）実施例８で作製したリポソームけん濁液に
１／３容量の０．４Ｍ−ｔ〜リスアミノメタン／塩酸緩
衝液（０，４５μｍメンブランフィルタ−ろ過）を加え
てリポソーム製剤とするく緩衝液の終濃度：０．１Ｍ）
。この製剤についてＬ−アスパラギナーゼの取込み率を
測定したところ７１％であった。

なお、上記例において０．１Ｍ−トリスアミノメタン／
塩酸緩衝液を最初に加えた場合の取込み率は３１％であ
った。

（実施例１０）実施例８で製作したリポソームけん濁液
に１／３容量の０．４Ｍ−リン酸１カリウム／リン酸２
すｌ〜ツリウム衝液（０，４５μｍメンプランノイルタ
ーろ過）を加えてリポソーム製剤どづる（緩廟液の終濃
度：Ｑ、ＩＭ＞。この製剤について１−−アスパラギナ
ーゼの取込み率を測定したどころ７０％であった。

イ＞４５、上記例に６いてＯ，ＩＭ−リンＭ１カリウム
／リン酸２　′、Ｊ＋−リウｌい緩衝液を最初に加えた
場合の取込み率は４０％であった。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）塩化プ用〜リウム、糖類又は緩衝剤を含みかつ薬
   剤を包含させたリポソームの製剤を製造するに際し、先
   に薬剤を包含させたリポソームを製造し、ぞののち塩化
   す１ヘリウム、ｔＩ８類又は緩衝剤を加えることを特徴
   どするリポソーム製剤の製法。
2. （２）薬剤を包含させたリポソームから、取込まれなか
   った薬剤を分離除去して、塩化ナトリウム。 糖類又は緩衝剤を加えることからなる特許請求の範囲第
   １項記載の製法。
3. （３）糖類が、グルコース、マンニ１〜−ル、ツルど１
   〜−ルも１ノくはキシリトールである特許請求の範囲第
   １項または第２項記載の製法。