JPS58183625A - 酸素運搬システム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明はヘモグロビン担持血球に補充または一時的置換
する際に、酸素を循環系を通して供給する目的のために
生でいる咄乳動物に用いることができる酸素運搬システ
ムの生成および利用に関・する。酸素運搬システムは複
合体水−油一水エマルジョンからなり、この場合純粋ヘ
モグロビンを含有する溶液は脂■相に捕捉され、次いで
生理学的に許容されうる等限外部水相に乳化または懸濁
される。

こハ発明における権利はＵ、Ｓ、アーミー　メディ□カ
ル　リサーチアンドデベロツプメント　コマンド（Ｕ、
Ｓ、　Ａｒｍｙ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　
ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐ　−ｍｅｎｔ　Ｏｏｍｍａｎｄ
）により審査され契約Ａ　ＤＡ、ＭＤ　ｌ　７−７９−
０−９０４５１７”’）規則に従って政府が所有してい
る。

従来技術 補性動物における自然の酸素相持赤血球に対する一時的
代用物または部分的代用物についての酸素運搬システム
の開発が多く提案されている。１・一時的不能（ｔｅｍ
ｐｏｒａｒｙ　ｄｉｓｆｕｎｃｔｉ、ｏｎ　）　＋激し
い外１％　（ｔｒａｕｍａ　）および他の災難または事
故においては、しばしば血球に対する代用物または少な
くとも部分的代用部が請求される。多くの場合において
、全必要着の血液を入手することができない・か、また
は入手できたとしても適当でない場合がある。入手でき
るとしても、血漿は循環容緻（ｃｉｒｃｕ］、ａｔ、ｏ
ｒｙ　ｖｏｌｕｍｅ　）を維持する助けをするが＼しか
し酸素担持成分に欠けている。このために、人工的な蘇
生流体（ｒｅｓｕ８ｃｉｔａｔｉｖｅ　ｆｌ、ｕｉｄｓ
　）の開発が多年にわたって研究されているが、しかし
−□般に許容されうる製品は、また提供されていない。

根本的には、人工鈴生流体は次に示すような特性を有す
る必要があるニ ー−この液体は少なくとも数時間にわたって作用し、か
つ約１５〜２０％のへマドクリットを有する正常面液と
【−て作用する必要があること、−液体は無毒性である
必要があること、−液体は無菌で、かつ発熱物質が存在
しないこと、 −液体は抗原を存在しないようにし、すなわち、免疫系
統を活性化せず、また血液型判定分析を必要としないよ
うにすること、および−液体は少なくとも全面液を新し
くする間、またはこれより長い時間にわたる適ＩＷな「
貯Ｒ寿・命」を有することである。

最近、実行可能な酸素運搬システムを達成する種々の手
段が取り上げらねている。その１つの手段はフルオロカ
ーボンエマルジョンを用いることである。このエマルジ
ョンは酸素を非水相に溶解でき、かつ適当な条件下で酸
素を周囲の組織に□放出することができる。フルオロカ
ーホン　エマルジョンはそれ自体抗原の存在しない見地
から生物学的に許容されうるけねども、このエマルジョ
ンは免疫防衛機構の１部である網内系（ＲＥＳ　）（ｒ
ｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｓｙｓｔｅｍ
　’）により循環系から除去されやすい。網内系により
除去さねやすい場合にはフルオロカーボンエマルジョン
の如キ水不活性コロイダルはＲＥＳの［遮断（ｂｌｏｃ
ｋａｄｅ　）１を生ずる。特に、ＲＥＳＩｖ＋ｌｌ］胞
は循環系がら利ｊ繭、つ□イルスおよび多くの他の微粒
子物を除去する作用をする。フルオロカーボン　エマル
ジョンを注入する際に、　ＲＥＳ細胞が多情投与の微粒
子物によってオーバーロードになる場合に、かかる細胞
は［間軸（５ｈｕｔ　ｄｏｗｎ日し、機能な一時的て停
止トシ・、または著しく減少した能力で作用する。この
状態において、生体は感染に対して感受性になる。こｆ
ｌｒＲＥｓｇ断」を生ずる多くのエマルジョンは知られ
ている。

他の手段においては、細胞内脂肪粒子技術な用いている
。細胞内脂肪粒子は内部空間を包囲する□ｌまたは２以
」二の同心脂質二層法（ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｌｉｐｉ
ｄ　ｂｉｌａｙｓｒ　５ｐｈｅｒｅｓ　）からなる小さ
い小胞である。これらの空間は細胞内脂肪粒子に運搬し
、かつある条件下で解放する任意の水溶性活性化剤を含
有する。こい場合、血球の水含有ｔ　（ａｑｕｅｏｕｓ
ｃｏｎｔ、ｅｎｔｑ　）を含有するｉＥ常ヘモグロビン
な被包する細胞内脂肪粒子からなる酸素運搬システムは
人工蘇生流体として利用されている。しかしながら、エ
マルジョンに似ている細胞内脂肪粒子は網内系１・によ
って循環系から主として除去される。このために、細胞
内脂肪粒子を利用する手段はフルオロカーボン　エマル
ジョンに関する多くの問題点がある。

史に、ヘモグロビンは比較的に破壊されやすい１物質で
あって、高温度において減成しやすく、酸化および償元
剤と接触し、かつ処理し難い。ヘモグロビン自体の変性
またはヘモグロビン減成生成物の存在は人工酸素運搬シ
ステムにおいて望ましくない。この減成生成物は抗原性
になりやすく１．。

かつ免疫抗原性を示すから、かかる減成生成物はＲＥＳ
によって吸収されやすい。また、自然赤血球（ｎａｔｕ
ｒａｌ　ｒａｄ　ｂｌｏｏｃｌ　ｃｅｌｌｓ　）の全含
有量は、人工酸素運搬システムに包含するのに理想的で
あるが、事実は正反対である。赤血球内の種々の蛋白質
および酵素は細胞内容物の存在する脂質膜に取入れられ
る。これらの蛋白質および酵素は抗原性、免疫抗原性を
誘発し、血液凝塊反応に反抗する。

このために、ヘモグロビン減成生成物または自然赤血球
からの蛋白質および酵素が混入する酸素運１・・搬シス
テムは循環系からすみやかに清浄にする。

それ故、循環する酸素運搬システムの分量はすみやかに
低下し、酸素運搬効果が消失する。同時に、ＲＥＳによ
るすみやかな吸収はその随判する望ましくない作用によ
って「ＲＥＳ　ｇ断」を生ずる。

人工酸素運搬システムは上述する問題を解決するために
現在多くの研究がされている。

発明の開示 本発明は抗原性および免疫抗原性成分の存在しない、か
つＲＥＳから［マスク（ｍａｓｋ　）　Ｊ　ｔ、て循、
、。

環を延長させて酸素を生体全体に比較的長時間に゛わた
り運搬できる人工酸素運搬システムを提供することであ
る。

本発明の酸素運搬システム（ＯＴＳ　）は複合体水−油
一水エマルジョン（シバしハ複エマルジョンド称される
）からなり、この場合純粋の真の支質の存在しない結晶
ヘモグロビン水溶液は内部水相からなり；「マスキング
」脂質を含有する注意深く選択された脂質混合物は中間
油相な含み、および等張水溶液は外部水相を含んでいる
。内部水相お１・゛よび包囲油相は酸素運搬システムの
主要の１作業（ｗｏｒｋｉｎｇ　）　Ｊ成分を構成する
。外部水相は作業ＯＴＳを循環系に輸送または注入する
液体媒質からなる。

また、本発明は人工ＯＴＳを製造する方法を提供１・す
ることである。この本発明の方法においては純粋ヘモグ
ロビンを減成することなく、または望ましくない抗原お
よび免疫抗原を生成することなく、またはヘモグロビン
の酸素相持能力を減退することなく　ＯＴＳを製造する
のに成功（−だ。特に、酸素・・運搬システムは複合体
水−油一水エマルジョンで□ある。油相は「膜」を形成
するタイプの自然に生ずる燐脂質および更にエマルジョ
ン微粒子を吸収する織組結合およびＲＥＳを最小にする
合成「マスキング」脂質を含んでいる。この油相は一ヒ
述する脂質または脂質誘導材料の混合物からなる。−！
た、油相は自然膜およびこれらのマイクロカプセルのよ
うに作用し、内部水相を外部懸濁水相から分離および単
離する。内部水相は間質の存在しない結晶ヘモグロビン
を構成するヘモグロビン溶液、グ１″リセリン酸塩また
は燐酸塩、緩衝剤（ｐＨ約７．４）および最終溶液を血
漿によるイソオスモラ（ｉｓｏｏｓｍｏｌａｒ　）にな
る溶寅からなる。外部水相は緩衝（ｐＨ７，４）等張溶
液からなる。

本発明において、２種の内部エマルジョン相、１・すな
わち、中間油相および内部水相は油相が内部水相に酸素
担持ヘモグロビンを包囲するカプセルを効果的に構成す
る。油相および包囲水相は溶解結晶へ化グロビンが肺胞
硝子状膜を通過する酸素□を吸収し、この酸素を循環系
の他の部分に効果的−・・・に輸送する合成血球を構成
する。

本発明の目的のために油−水相は赤血球を効果的に模擬
するが、赤面体中に通常見出される糖蛋白質お、１：び
／または糖脂質を油相に簡単に取入れることは望ま（−
なく、生成酸素運搬系が組織と相互作用するのを避ける
ことを予想される。自然赤面法の外膜な構成する糖蛋白
質および糖脂質は「白液型」に対する第１基準であり、
これらを一般の酸素運搬系に含有することは望ましくな
い。

他方において、これらの炭水化物は緩衝またはり・・・
ツションとして作用して赤血球または赤小板表面が組繊
細胞表面と直接接触するのを防止する。

」二連するように自然に生ずる糖蛋白質および／または
糖脂質を一般の運搬系に含有することは望ましくないか
ら、ＯＴＳとＲＥＳ組繊細胞表面との　・直接接触を防
ＩＦするのが望ましい。こい問題点は本発明においてＯ
ＴＳをＲＥＳから［おおい隠す（ｈｌｄ）」作用をする
マスキング脂質の油相に含ませることによって解決する
ことができる。

坤論的に、「マスキング作用」はＯＴＳ　ｆｆ面を組織
に対して僅かな親和力を有するかまたは有し□ない周知
のスクロース、デキストランまたはイヌリンの如き不活
性炭水化物で被覆することによって４成することができ
る。しかしながら、これらの炭水化物はビオ［（ｂｉ○
ｍｅｍｂｒａｎｅｓ　）に対して僅かな親和力を有して
いるから、これらの炭水化物はＯＴＳの油相中に存在す
る他の脂質に結合することがない。上述する不活性炭水
化物はＯＴＳを永久的に保護するために、本発明におい
てはこれらの炭水化物な油相中の脂質成分に直接に結合
または１・・共有的に付着する。これらの炭水化物−脂
質分子は炭水化物を予じぬ形成した粒子表面に直接に共
有的付着するか、または炭水化物含有脂質を合成し、次
いでこれをＯＴＳの形成中に膜用に混入することによっ
て形成することができる。この後者の１手段は本発明に
おいて好ましい。

いかなる場合においても、「マスキング」炭水化物含有
脂質は他の脂質と共にＯＴＳの油相に混入してＯＴＳ膜
を形成し、ＯＴＳを生体のＲＥＳ系から効果的に「マス
ク」する。

本発明の目的は機能合成酸素運搬システムを提“供する
ことである。

本発明の他の目的は結晶ヘモグロビンを不活性水相に溶
解する水−油一水エマルジョンからなる機能酸素運搬シ
ステムを提供することである。

本発明の他の目的は結晶ヘモグロビンを内部水相に溶解
（−１油相が生理学的に許容しうる脂質および酸素運搬
成分を生体の網内系に結合および／または吸収する組織
から「マスク」する作用をする添加量の化学的に変性し
た脂質を含んでる水−自・・油−水エマルジョンからな
る機能酸素運搬システムを提供することである。

史に、また本発明の他の目的は長時間にわたり脈管系に
循環できる生理学的に許容しうる酸素運搬システムを提
供することである。

本発明の酸素運搬システムは主成分として、脂質または
油相内に内部水相として被包して油中水型エマルジョン
を形成する水溶液に溶解する１に間質の存在しない結晶
ヘモグロビンからなる。被包Ｍ粋ヘモグロビンを循環系
に送出する目的のだ−８゜めに、油中水型エマルジョン
を外部等張水相に懸１濁する。生体に注射または輸注す
るために作られた、または血液標準として使用される酸
素運搬システム（ＯＴＳ）は内部水相からなる結晶ヘモ
グロビンの水溶液を有する水−油一水エマルジョンから
なる。油相は燐脂質、および組織結合からまたは網内系
により吸収される脂質被包ヘモグロビンを保護する作用
する変性脂質を含む自然に生ずる脂質からなる。外部水
相はかかる成分を生体に注射または輸注する場合に脂質
被包ヘモグロビンに・・・対する担体として作用する等
張水溶液からなる。

ヘモグロビンは免疫反応を誘導できる蛋白質成分から完
全に除去することが重要である。間賃を存在しないよう
にし、更にＯＴＳの製造中極めて注意深く処理してメト
ヘモグロビン、ミオグロビン１およびグロビンの如き生
成物に変性または転化するのを避けるようにする。かが
る生成物は生理学的特性または滞在的抗原性（ｐｏｔｅ
ｎｔｉａｌ　ａｎｔｉｇｅｎｉ　−ｃｉｔ、ｙ）および
酸素運搬との相互作用のために望ましくない。このため
に、ＯＴＳに用いるヘモグロビンはＪ、　Ｌａｂ、　０
１ｉｎ、　Ｍｅｄ、　、　８０　、４　ａ　、ページ１
５０９〜５１６　（’　１９７　ｑ　）にｄ己載されて
いるデベヌ）　（Ｄｅｖｅｎｕｔｏ　）氏らの方法によ
り純粋結晶生成物として作る。

純粋結晶ヘモグロビンは水に溶解して少なくとも１５重
量％のヘモグロビンを含有する水溶液を生成する。この
ヘモグロビン溶液を安定化させ、かつＩＥ常血液による
インオスモル（ｉｓｏｏｓｍｏｌａｒ　）の水相にする
ために、ヘモグロビンの１モル当り約１〜２モルｏ）２
　、８−ジホスホグリセラートまたしｉ約０．５．、。

〜１モルのイノシトールへキサホスフェート並びに２０
〜８０ミリオスモルのｐＨ７，４燐酸塩緩衝剤を含有さ
せる。また、ミクロエンカプセル化方法の開始前に血漿
によるインオスモルの最終溶液を得る必要のある場合に
は、デキストロースの１如き十分に溶解する溶質を含有
することができる。

かかるヘモグロビン水溶液はヘモグロビン自体以外の白
球誘導蛋白質を含有しておらず、完全な新鮮面液の使用
寿命に近い、すなわち、約８祠間にわたる使用寿命を有
する。

内部ヘモグロビン水相を包囲する油相はボスフ□アチジ
ルコリン、ホスファチド酸、コレステロールおよびα−
トコフェロールの如き自然に生する脂質からなる。この
脂質は通常混合物の状態で存在するが、しかし時にα−
トコフェロールはヘモグロビンおよび脂質の自動酸化を
（Ｉ）ｉ　ｌ卜する抗酸化剤として重要である。脂質の
酸化を生じさせた場合には、生成生成物自体ヘモグロビ
ンを変性しおよび／または生体を抗原性にする。ヘモグ
ロビンの酸化が生じた場合には、生成生成物は酸素を結
少□合しないメトヘモグロビンである。どのために、α
−トコフェロールの如き抗酸化剤は常にＯＴＳの油相に
含有させる。

また、油相は自然に生ずる脂真の外にエマルジョン　ミ
クロエンカプセルの組織結合特性を最小１にする「マス
キング」脂質を含有する。このために、ＲＥＳによる吸
収を減少し、循環系におけるＯＴＳの使用寿命を長くす
る。

「マスキング」１１旨質はスクロース、デキストラン、
イヌリン等の如−生物学的に不活性な炭水化・・・物と
ホスファチジルエタノールアミンの如き自　１然に生ず
る脂質との反応生成物からなる。ある種の「マスキング
」脂質の生成およびその脂質の膜用への導入については
後述する例において記載する。

「マスキング」脂質は分離生成物として生成し、しかる
後に膜相に導入するか、または予じめ形成した粒子によ
る炭水化物反応によって直接に生成する。一般に、前者
の方法が好ましい。いずれの場合においても、［マスキ
ング」脂質は油相の約・・□１〜５０重針％からなる。

特に、機能マスキング脂質（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｒ
ｎａｓｋ−ｉ、ｎｇ　１１ｐｉｄ　）は８部分、すなわ
ち、脂質または燐脂質ベース単位；オリゴサツカリドま
たはポリサツカリド；および末端モノ−またはジ−サラ
カリ１ド単位からなる。一般に、サツカリド末端単位は
オリゴサツカリドまたはポリサツカリドの部分からなる
。かかるマスキング脂質の１例はメレジトールおよびホ
スファチジルエタノールアミンの反応生ＩｊＷ物である
。

オリゴサツカリド単位は脂質または燐脂質ペー゛ス単位
に一麿非還元（ｎｏｎｒｅｄｕｃｉｎｇ　）付着する。

一般に、オリゴサツカリドはマスキング脂質で保護し、
良好な「スペーサー」として作用するから、オリゴサツ
カリドを大きくするほど好ましい。末喘サツカリド単位
は還元しないようにする。史に、末姻サツカリド単位は
アミン糖にも、またガラクトースまたはマンノースにも
すべとではない。最も好ましくは、かかる末端サツカリ
ド単位は非還元形態のグルコースまたはフラクトースに
する。゛′脂質または燐脂質ベース単位は天然脂質にす
るか、または非反応形態で代謝により転換しうるように
および非毒性にする。また、オリゴサラカリ５ドに付着
する官能基を有するようにし、また膜不安定なくＯＴＳ
膜に導入しやすくする。理想的には、他１の自然に生ず
る脂質を用いることができるけれども、ホスファチジル
エタノールアミンはこれらの要件を満たすようにする。

代表的な「マスキング」脂質を製造する例については後
述する例において□記載する。

ＯＴＳの外部水相は緩衝等銀溶液（埋肋的には　ｐＨ７
，４）からなる。外部水相は液体媒質として作用してＯ
ＴＳ粒子を循環系に運ぶ。外部水相は医薬目的のために
通常使用される標準緩衝生理食塩水にすることができる
。

ＯＴＳ懸濁物の製法について多くの手順が研究開発され
ている。上述する手順は結晶ヘモグロビン溶液を劣化し
ないようにする。また、手順は脂質油相内にヘモグロビ
ン水溶液を効果的に懸濁するように選択する。次に記載
する手順はへモグロビト・ンな変性することなく　ＯＴ
Ｓな生成するように研究されている。

製造手ｌｌｌ１ｉ１Ａ 先づ、抗酸化剤、α−トコフェロールおよびマスキング
脂質を含有する所望の燐脂質を一定匍１ノエーテルノ如
き４［Ｉｍ（ジエナルエーテルおよび／またはプロピル
エーテル）に溶解する。出来るだけエーテルの蒸気圧に
等しい蒸気圧を有する十分なハロカーボン（フレオン）
、例えばトリフルオロ−トリクロロエタンをエーテル溶
ｉ１に、。

混合脂質−エーテル−ハロカーボン溶液の密度が□被包
するヘモグロビン水相の密度と等しくなるまで添加する
。次いで、脂質−エーテル−ハロカーボン溶液をヘモグ
ロビンおよび上述する他の水性成分の予じめ作らねた水
溶液に添加する。次いで、混合油−水相を極ぬて速やか
に塾盪させて油−水−油タイプの複エマルジョンにする
。ヘモグロビンは部分的に変性するから、超音波手段（
８ｏｎ１ｃａ−ｔｉｏｎ　）を使用しないようにする。

乳化は＃液−ガス相の接触割合を最・小にする手段によ
って行う。１・・これに関連して、液相上のガス相とし
て窒素またはアルゴンの如き不活性ガスを用いるのが有
利である。

油および水相の振帰は、完全乳化を達成するまで、すな
わち、粒子大きさが直径で約２　、　（ｌミクロ１゜ン
メートルまたはこれ以下である油−水一油復エマルジョ
ンを生成するまで継続させる。

一旦、油−水一油エマルジョンが生ｒｉｂ　ｌ、た場合
には、エマルジョンを一定湛庁に維持しながら有機溶剤
を低真空下で除去する。溶剤を除去する際。

に、全懸濁物の粘庁が増加する。有機溶剤成分の′蒸発
はその溶剤を１％以下になり、著しく粘度が増加するま
で激しく撮盪しながら継続する。この粘＋ｆの増加は油
−水一油条件から水−油一水エマルジョンへのエマルジ
ョン相転換によるものである。

水−油一水エマルジョンへの転換生成後、生成水懸濁物
をニュクレオボール膜（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅｍｅｍｂ
ｒａｎｅ　）、例えば０．４ミクロメーター直径の孔を
通して押出す。

押出された懸濁物に最初の水相に等しいモル濃度のイソ
オスモル緩衝剤（ｐＨ１，４）を４倍添加する。次いで
生成懸濁物を遠心分離してＯＴＳ粒子を懸濁ヘモグロビ
ン水溶液から分離する。次いで、上部液相をパックド（
ｐａｃｋｅｄ　）　ＯＴＳから除去する６次いで、同量
の水性緩衝剤を再！ｆＡｉＩｊｉｌするパックドＯＴＳ
に添加し、再び遠心分離する。緩衝剤を再び除去して最
終容纏・の水性緩衝剤でＭ換し、ＯＴＳを再懸濁して最
終生成物にする。

順次容量の水性緩衝剤の添加および除去は任意、。

の非被包ヘモグロビン溶液を＠濁物から除去する□役割
をする。また、ヘモグロビンに冨んだ粒子をヘモグロビ
ンに乏しい粒子から分離するのに用いることができる。

曲者のヘモグロビンに富人７だ粒子は高い密度を有し、
遠心分離する傾向があり、後者はＯＴＳとしての利用性
が比較的に低い。このために、生成最終＠濁物はヘモグ
ロビンの存在しない外部水相、脂質または油、中間相お
よび被包内部ヘモグロビン水相からなる。

１例においては、押出し後生成した懸濁物を遊１・・離
ヘモグロビンをＯＴＳ粒子から分離する適当なゲル押出
しカラムに添加することができる。次いで、適当者の外
部ヘモグロビンσ）存在しない水性緩衝剤を溶離ＯＴ８
粒子に添加する。

他の例においては、最初１７”）　ＯＴＳ懸濁物を上述
すｊるようにして作り、油相内に被包されない遊離ヘモ
グロビンをＯＴＳから一定容檀濾過技術および適当な膜
濾過器を用いてｆＦ　３ｍする。

いずれの場合においても、最後の水−油一水エマルジョ
ンを使用のために用意するか、または冷凍上で貯蔵する
。

また、幾分異なる手順なＯＴＳの製造に用いることがで
きる。この手順においては、最初の油−水−油エマルジ
ョンを前述する手順のようにして作る。しかし、油−水
一油エマルジョンの形成において温度を一７６゛Ｃに急
激に低下する。この冷凍温度において水相を液体から凍
結固体に速やかに転換する。同時に、その低い氷点のた
めに油相は液体状！＠な維持する。？１Ｍｆは、ヘモグ
ロビンに損ｉな与える任意の１大きい」氷結晶の形成を
避け・・・るために、急速に低くする必要がある。いず
れの場合においても、冷凍は液体懸濁物中に固体を生成
する。

冷凍した水相を維持しながら液体−非水相に成９を与え
て−５’Ｃ以下の怒度を維持しながら有機・溶剤を除去
する。溶剤な１％以下に維持する際、？Ｍ　ｌ＆’は振
盪または回転させながら常温に急速に上昇する。この方
法はエマルジョンを転化させ、所望のＷ　１０　／Ｗを
生成する。次いで、生成する水性懸濁物は」二連する手
順に記載するニュクレオボー、６゜ル嘆を圧通させる。

次いで、順次容量の７．４緩衝溶液を添加（−２匝瀉し
て非被包ヘモグロビンな除去する。手順を上述すると同
様に行い、すなわち、水性緩衝剤をＯＴＳに添加する。

溶液を遠心分離してＯＴＳを分離し、次いで水性緩衝剤
相を頗瀉（−１付加分附の水性緩衝剤等によって再懸濁
する。生成する生成物はヘモグロビンの存在しない外部
水相（ｐＨ７，４）；中背脂質油相および被包ヘモグロ
ビン内部水相である。生成物は上述する手＋１［におい
て生成した生１成物と同様である。

上述するように、マスキング脂質を別に作り、次いでＯ
ＴＳの油相からなる他の脂質に添加することができる。

或いは、またマスキング脂質なＯＴＳの油相を既に形成
した脂質の１部分との炭水１・化物反応によってその場
で（ｉｎ　８ｉｔｕ　）形成することができる。後述す
る例においては油相に関係なくしてマスキング脂質を導
入する各方法の２つの例を説明している。

最初の２つの例ではマスキング脂質なＯＴＳから・・分
離して作る方法を記載している。次の２つの例□ではマ
スキング脂質を炭水化物と形成ＯＴＳに既に存在する脂
質と直接反応【−て作る方法について記載【２ている。

この手順はＪ、ファン　ジレ（ＶａｎＺ１１θ）氏等の
千用自に基づ＜　（Ｊ、　Ｂｉｏ、　Ｏｈｅｍ、　、　
２５４（９）　。

８５４７〜８５５８　（１９７９）。

ラフインアルデヒドな次に示す反応式によって１・・ガ
ラクトース　オキシダーゼを用いてラフィノース（ガラ
クトース−スクロース三糖類）から作った：５モル／ｍ
ｌのラフィノース溶液（ｐＨ７）Ｋｇｏ　　・・・単位
／ｒｎｌのガラクトース　オキシダーゼおよび　　”１
８０単位のカタラーゼを添加し、ｄ７”ｃで４時間にわ
たり保温した。次いで、ラフインアルデヒドおよび未反
応ラフィノースを酵累からセファデックス　カラム（５
ｅｐｈａｄｅｘ　ｃｏｌｕｍｎ　）上で溶離剤として蒸
留水を用いて分離した。次いで、カラムがら選択したト
リオース　ビークを凍結乾燥し、テトラヒドロフランに
溶解した。最初のラフィノースの各モル当り０．８モル
のＰＥを０．８■のＮａ　ＢＨａ　ＯＮと一緒に添加し
た（沈殿が生ずる場合には稀釈お１′□よび加熱する）
。反応を５０゛Ｃで８時間継続し、次いで反応混合物を
還元し、真空下で乾燥した（　ＰＲ５％が未反応の場合
には繰返す）。次いで、残留物を最小電の加温メタノー
ルに溶解した。上述する反応は次の反応式に示すように
シップ塩基゛′を形成し、還元する： ＰＫ−ラフイノース 次いで、ＰＥ−ラフィノース脂質を他の油相脂　□質と
混合して上述する０ＴＳＩＩ＜４を形成した。

また、ＰＥ−マラビオースを上述する手順においてガラ
クトース　オキシダーゼの代りにグルコース　オキシダ
ーゼを用いてＩ？ｒ１様に処理して得た。

マラビオースはり＋レコースースクロース三塘類Ｔある
。

例Ａ−２スクロース−ＰＥの製造 本例の合成は標帖の合＋ｊ１２手順に基づいて実施し、
次のノゾ応式で示す： Ｒ−ＯＰＯ（Ｏφ）−０−０２Ｈ５−Ｉ　＋６−アミツ
デオキシスクロースーーン（１＞　　　　　　　　　　
　（ＩＩ）（ＰＥ−スクロース） Ｒ’０ＯＯＨ＝脂肪酸）を示す。

上記化合物（■）は次の反応式によって作った二゛（ホ
スファチ）Ｗ）　　（ａされたベンジル）　　　　　　
　　　　　（■）（ｆｆｆ　）　＋Ｔ８０］→ＲＯＰＯ
（Ｏφ）−００Ｈ２０Ｈ２−０Ｔ８（ＴＶ　）（ｒＶ）
　十Ｎａ　Ｉ　−＋　ＲＱＰＯ（Ｏφ）−α）Ｈ２０Ｈ
，−Ｉ　　　　　　　　（Ｉ　）上記化合物（■）は次
の反応式によって作った＝４．６−ベンジリデン−１’
＋　２　＊　ｄ　１８’Ｌ　４’１６’−スクロースヘ
キサアセテート６−トジルースクロース　へブタアセテ
ート　　　（■）次いで、ＰＥ−スクロース反応生成物
を上述する他の脂質成分と一緒にＯＴＳに混合した。

例Ｂ−１０ＴＳ油相中その場所でのＰＥ−イヌリンの製
造 インシュリンの飽和溶液を０．１５　Ｍアセテート緩衝
剤、ｐＨ５，０で作った。１０ｍ１の０．１　ＭＮａＩ
Ｏ４（ｐＨ５−０）溶液を各１ｏ　ｏ　ｍｔのイヌリン
溶液に添加し、暗所で１時間にわたり反応させた。

次いで、混合物を２０　ｍＭ　　ＨＢＢＯ６，２０ｍＷ
Ｎａ２Ｂ、０７およびｌ　００　ｍＭ　　Ｎａ０Ｌから
なるｐＨ８，５ｌ＋にｖＩ４整した還元溶液に対して２
時間にわたり透析した。透析後、この溶液を予じめ作っ
たＯＴＳ溶液と混合した。この場合、ＯＴＳ膜には次の
炭水化物反応のための基体として一定量のホスファチジ
ルエタノールアミンを含有させ、脂質ｌ１ＩＩｆはｐＨ
８，５硼酸塩緩衝剤において１０ｆｆ１モル／ＬＫｇ周
整した。

２０゛Ｃで１２時間後、Ｎａ　ＢＨｓを添加して０．８
９／Ｌの最終濃■にした。１時間後、ＯＴＳを遠心分離
によって分離し、等張燐酸塩緩衝剤（ｐＨ７，４）で２
回洗浄した。この手順においては、イヌリンを油相表面
ＰＥの１０〜５０３部分的に酸化した。

例Ｂ−２ＰＥ−デキストランのその場での製造ＰＥ−デ
キストランを製造する手順を上述する例Ｂ−ＩＫ紀載す
るように行った。イヌリンと異なった可溶性デキストラ
ンを合成する前に精製し１・・て所望の分子量フラクシ
ョンを得た。例えば、セフエデックスＧ−１０クロマト
グラフィを用いて４０００〜８０００ＭＷフラクション
を、先づ分離した。次いで、手順を例Ｂ−１に記載する
と同様に行い、上紀例Ｂ−１またはＢ−２とほぼ同様の
結果！・を得た。

ＯＴＳの生体外試験 ＯＴＳの二三の変化を試験してそのＰ　、ヒル数０ （Ｈｉｌｌ　ｎｕｍｂｅｒ　）　、　ｎおよび肝清掃率
を測定した。

□　便宜のために、各ＯＴＳの最終組成を各成分の相対
・、。

モルで示した。輸注（ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ　）のた
めの　□ＯＴＳの種々のタイプは最終の製造手１１１１
に従って選定した。確認σ）目的のために、ＯＴＳは神
々のタイプとして示した。

押出処理後、内部（エンドラップト）および夕１部水相
をｐＨ９，４、８０ｍｏｓ＋ｎ　ＶＣ，維持する場合に
は、ＯＴＳはタイプＡにする。タイプＢにおいては、内
部および外部水相は８０　ｍｏｓｍ燐酸塩緩衝剤および
２７０　ｍｏｓｍデキストロースのためにｐＨ７，４お
よび８００　ｍｏｓｍにし；タイプＢにおいて、ＯＴＳ
　　ふ・は血漿と同溌透圧性である。また、タイプＧは
ｐＨ７，４および８００　＋ｎｏｓｍであるが、しかし
緩衝剤は燐酸塩σ）みからなるようにし、この結果−ノ
ー高いイオン強ずを賀する。タイプＤは押出ステップを
経たタイプＡと同じであるが、しかし透析前・における
外刑塚透度をａ　ｏ　ｏ　ｍｏｓｍに徐々に調節する（
　ＯＴＳの破壊なく）。過剰の非破包ヘモグロビンの滲
透に次いで、旨い密度の場合にはヘモグロビンに冨んだ
ＯＴＳを６００Ｏｆで１５分間にわたり遠心分離してす
べての他のＯＴＳから分離しくこ。

の遠心分離は全ＯＴＳ容城の１／２を遠心分離物とし・
て回収ｆる）、次いでこれらのＯＴＳをＲ（「冨んだ」
ヘモグロビンに対して）、すなわち、タイプＯＲで示す
。種々のＯＴＳの生体外試験の結果を表１に示す。

生体内試験 生体内試験において、二十日ネズミの循ｆｆ１Ｋおける
ＯＴＳの残存時１川（５ｕｒｖｉｖａｌ　ｔ、ｉｍｅ　
’）または酸素運搬システムとしてネズミに作用するＯ
ＴＳの能力の評価を調べた。「輸ｆＥＥ　（Ｔｒａｔ＋
ｑｆｕｓｉｏｎ　）Ｊ　　”１１７　、Ａ（１、ページ
５５５〜５６１　（ｌｏｑｑ＞の文献に記載されている
手順を用い、相対循環保持性を血液ｍｌ肖り残留する注
射ＯＴＳ投与量の割合で示した。これらの試験のために
、上述するよウレこ更紗の　Ｃ−イヌリンを正当なマー
カーと（−て＠１・有させた。

輪圧試験において、同じ手１１Ｍを次Ｑ）ように行った
。長時間試験において、ネズミにリンゲル液に＠濁した
ＯＴＳを輸注した。２５０〜８００？のネズミを用いた
場合、約５　ｍｌσ）血液を採取し、５ｍＡ、、。

１１１”）ＯＴＳ懸濁物で置換した。約３〜５分後、こ
０）処□理を繰返し、採取／添加を全体で１０１川まで
繰返した。（２かる後、処理な全不ズミ血液で繰返した
。

この手順をリンゲル液だけを用いて行一つだ場合、１０
回目の採取／添加処理し処理前にネズミθ）約５０％が
死滅（−だ。残留するネズミは９回目の採取／添加処理
と１０回目の採取／添加処理の後１０分経過後との間に
死滅した。

（計）　　ＭＬ−マスキング脂質 ＰＣ＝ホスファチジルクロリン ＰＡ　＝ホスファチン酸 ＯＨニコレステロール Ｔ−α−トコフェロール に　表１における各試験において、組成はＸ　：　４−
Ｘ　：　ｌ　：　５　：　０．ｌｃ７’）モル比ノＭＬ
／ＰＣ／ＰＡ　／ＧＨ／Ｔとし、この巻合表面における
ＭＬ　（７’）割合を表１の第２欄に示している。ｐＨ
は７．小にした。多くの試験圧おいて、特に記載しない
限りボ１゛。

スホグリセレートをヘモグロビン（Ｈｂ）　ト１．６　
：ｌのモル比で包藏した（　ｅｎｔｒａｐｐｅｄ　）。

すべての場合、Ｍｅｔ、−）（ｂレベルは５％以下であ
った。全脂質は出発Ｈｂ溶液のｍＡ当り約５０モルであ
った。

２：　マスキング脂實の性′ＩＭにおける変化を除い゛
て、組成は上述する通りであった。ＭＬを含む全ｍ脂質
は５０モル％に保持した。ＯＴＳ表面上のマスキング脂
質である全燐脂質の割合はカッコにかこんで示し、含有
したＭＬの分針およびＯＴＳの平均表面種から評価した
（ビジェオン（ＰｌｄｇｅｏＩｌ）１・（δ８　　） およびハント（Ｈｕｎｔ　）氏ｒ　Ｊ、　Ｐｂａｒｍ、
　Ｓｃｉ、ｌ　７０　　’（２）、１７；１１〜１７６
　（１９８１））。ＭＬとしてＰＧを使用することによ
って、ＯＴＳにおけろＰＣ全階す全燐脂質の８０％に増
加させた。これらのＯＴＳは炭水化物含有ＭＬと対照す
るための対照物としての役目なした。

８：ＯＴＳ形成後、アリコートを遠心分離し、過剰の緩
衝剤を除去（、た。生成ＯＴＳは９０〜］、　０　（１
％のヘモグロビンを有（−でいた。この最終懸濁物にお
けるＨｂＮＪ％）は関連する０２の最大纏に基　１・つ
いて定めた。

４：　数値は肝抽出率（ｈｅｐａｔ、ｉｃ　ｅｘｔｒａ
ｃｔ、１ｏｎｒａｔ、１ｏＳ）　ＥＲである。この場合
、−回通過（ｓｉｎｇｌ、ｅｐａｓｓ　）におけるネズ
ミ肝臓から除去された細胞内脂肪粒子の％を実験的に測
定するＣ摘出、環流し゛た（　１８ｏ１ａ、ｔ、ｅｄ　
ｐｅｒｆｕ８ｅｄ　）ネズミ肝臓系を用いる）。

ＭＬを含有しないＯＴＳ組成の場合、ＥＲは平均して２
．３．５　＋４．５％である。この数値における減少は
ネズミの使用による循環半減値（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏ
ｎ　ｂδ１ｆ・１ｉｆｅ　）θ）増加によるものである
。

５：　これらのＯＴＳの場合、ＰＣの５０％をスフ”イ
ンゴマイリンで置換した。

６：　長い循環による半減生存（ｌｏｎｇｅｒ　ｃｊ、
ｒｃｕ−１ａｔｉｏｎ　ｈａｌｆ　−１ｉｖｅｓ　）に
よる値に対する対照値である。

表２には循環におけるＯＴＳの保持時間に一ついての試
験データを示している。

（ｄ＋） １：ＯＴｓのポルス投与駿（ｂｏｌｕ８ｄｏｓｅｓ　）
を二十日ネズミに与えた。放射−ラベル付き水性スペー
ス　マーカー（ｒａｄｉｏ　−１ａｂｅｌｌｅｄ　ａｑ
ｕｅｏｕｓｓｐａｃｅ　ｒｎａｒｋｅｒ　）を定量のた
めに含有させた（了ブラ（Ａｂｒａ’）およびハント（
Ｈｕｎｔ　）氏。

「Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙ８．　Ａｃｔ、ａ、
　Ｊ　６６　ｆｌ　、　４０１８〜５０５　（１９８１
）。包蔵したＨｂの分量は０ＴＳ（＠環時間中において
の影響をあまり受けなかった。

２：　表１における（料）■をお照。

８＝　表１における（註）２を８照。

４：　全脂質投与綾を２０２の二十日ネズミ（平均ｚ４
７）に対して投与した。ＯＴＳの脈管外結合を満足にで
き、このために高投与曖は大きい８４時間血液保持値が
達成できることが予想される。

５：ＯＴＳσ）如き粒子の場合、２つの４時間血液値の
比は同時に測定した半減生存の比に一致する。

上述するデータから、本発明における組成な耳ＩするＯ
ＴＳは循環系における保持性を長くし、単なる脂質披包
ヘモグロビンよりも酸素運搬を向上することがわかる。

ＯＴＳの他の用途はガス運搬システムの技術に　゛おげ
ろ技術者によって明らかにわかる。これらすべての用途
は本発明の範囲に包含できるものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 Ｌ　溶解する結晶ヘモグロビンを有する内部水相、およ
   び生理学的に許容されうる脂質および非還元性炭水化物
   −脂質添加生成物を含む前記内部水相を包囲する人工膜
   として作用する油相からなる酸素運搬システム。 ２　前記油相および包囲された前記内部水相は外部水相
   に同伴され、該外部水相は生理学的・・に許容され、か
   つ面液と等張する特許請求の範囲第１項記載の酸素運搬
   システム。 ８　前記外部水相は約ｐＨ７，４に緩衝した生理食塩溶
   液とした特許請求の範囲第１項記載の酸素運搬システム
   。 ４　前記内部水相におけるヘモグロビンは殆んど純粋に
   再結晶したヘモグロビンである特許請求の範囲第１項記
   載の酸素運搬システム。 ５　前記純粋ヘモグロビンの酸素運搬作用をグリゼリン
   酸塩または燐酸塩を前記内相に含ませることによって安
   定にした特許請求の範囲□第４項記載の酸素運搬システ
   ム。 ６　前記純粋ヘモグロビンは酸化防１１二剤を含ませる
   ことによって安定にした特許請求の範囲第５項記載の酸
   素運搬システム。 ？、　前記内部水相は約７．４のｐＨに緩衝し、炭水化
   物を含ませることによって血漿とのイソオスモラを保持
   した特許請求の範囲第４項記載の酸素運搬システム。 ８　前記油相は内部ヘモグロビン水相を外部水相から分
   離する膜と【−だ特許請求の範囲第２項記載の酸素運搬
   システム。 ９、　前記油相は自然に生ずる脂質および少なくとも１
   種の非僅元炭水化物−脂質反応生成物の混合物からなる
   特許請求の範囲第１項記載・の酸素運搬システム。 １０　　脂質と反応する炭水化物は捕乳類網内系に結合
   および吸収される組織に殆んど不活性な炭水化物である
   特許請求の範囲第９項記載の酸素運搬システム。 １Ｌ　　炭水化物−脂質反応生成物は約１〜５０重□綱
   ・％の脂質ベースド膜和からなる特許請求の範囲第１θ
   項記載の酸素運搬システム。 １１　　炭水化物は前記膜油相の表面からなる脂質の少
   なくとも１部分に共有結合した特許請求の範囲第１０項
   記載の酸素運搬システム。 ｌ＆　脂質は脂質の混合物である特許請求の範囲第１項
   記載の酸素運搬システム。 １転　酸化防止剤は脂質混合物に含ませる特許請求の範
   囲第１８項記載の酸素運搬システム。・・１５　　酸化
   防止剤はα−トコフェロールであル％許請求の範囲第１
   ４］有記載の酸素運搬システム。 １０　　脂質の１種はホスファチジルエタノールアミン
   である特許請求の範囲第ｉ８ｇＡ記載の・酸素運搬シス
   テム。 ■？　　脂質の１種はホスファチド酸である％許請求の
   範囲第１８記載の酸素運階システム。 １８、脂質の１種はコレステロールである特許請求の範
   囲ｍ１８１８項記載素運搬システム。。 １９　　脂質の１種はホスファチジル　コリンであ□る
   特許請求の範囲第１８項記載の酸素運搬システム。 ２０、炭水化物はスクロースである特許請求の範囲第１
   ２項記載の酸素運搬システム。 ２１　　炭水化物はラフィノースである％［ｔｆ請求の
   範囲第１２項記載の酸素運搬システム。 ２２−　炭水化物はマラビオースである特許請求の範囲
   第１２項記載の酸素運搬システム。 ２＆　炭水化物はイヌリンである特許請求の範囲す・□
   第１２項記載の酸素運搬システム。 ２４　　炭水化物はデキストランである特許請求の範囲
   第１２項記載の酸素運搬システム。 ２５　　溶解純粋結晶ヘモグロビンを有する内部水相、
   該内部水相を包囲する脂質油相および該１油相に含む脂
   質に共有結合する非還元性炭水化物からなる酸素運搬シ
   ステム。 ２６、　　ｉｉｌ記炭水化物は免疫防衛系の組織によっ
   て吸収減少する特許請求の範囲第２５項記載の酸素運搬
   システム。 ２）、前記炭水化物は組織結合を減少する特許請求の範
   囲第２５項記載の酸素連設システム。 ２８　　炭水化物を共役的に結合して非還元性炭水化物
   を形成する脂質からなる酸素運搬システム組成物。 ２９　　脂質はホスファチジルエタノールアミンである
   特許請求の範囲第２８５５４記載の酸素運搬システム組
   成物。 ８０　　脂質はホスファチド酸を含有する特許請求の範
   囲第２８項記載の酸素運搬システム組成１・・物。 ８Ｌ　　脂質はコレステロールである特許請求の範囲第
   ２８項記載の酸素運搬システム組成物。 ８区　脂質はホスファチジルアルカノールアミンである
   特許請求の範囲第２８項記載の酸素ｌ・運搬システム組
   成物。 ８＆　出発炭水化物はスクロースである％許請求の範囲
   第２８項記載の酸素運搬システム組成物。 ８４Ｌ　　出発炭水化物はイヌリンである特許請求の範
   囲第２８項記載の酸素運搬システム組ｆｊ１？物。”８
   ５　　出発炭水化物はマラビオースである特許請求の範
   囲第２８珀記載の酸素運搬システム組成物。 ８ａ　　出発炭水化物はラフィノースである特許請求の
   範囲第２８項記載の酸素運搬システム組成物。 ８７　　出発炭水化物はデキストランである特許請求の
   範囲第２８項記載の酸素運搬システム組成物。 ８８　　溶解純粋結晶ヘモグロビンを含む内部水相、膜
   として作用し、かつ生理学的に許容される脂質と前記内
   部水相を包囲する前記脂質の少なくとも１部に共有結合
   する非還元性生理学的に許容される炭水化物との混合物
   からなるＩ油相、および該油相および前記包囲内部水相
   を同伴する外部生理学的に許容される等張水用からなる
   復合水−油−水エマルジョンを咄乳動物に輸注するとと
   を特徴とする循環系に□　おける酸素の輸注を補充する
   方法。 ８９　　前記水相を約７．４のｐＨに緩衝し、面液面　
   ”漿によりイソオスモルである特許請求の範囲第８８項
   記載の循環系における酸素の輸注な補充する方法。 ４θ　　前記油相力炭水化物−脂質成分が前記補性動物
   の組織および免疫系により前記油相および包囲ヘモグロ
   ビン水相の吸収を減少する特許請求の範囲第２８項記載
   の循環系における酸素の輸注を補充する方法。