JPS5910793B2 - グルコ−スイソメラ−ゼの固定化法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、グルコースインメラーゼを担体に固定化する
方法の改良、さらに詳しくいえば、長期間安定な活性を
示す優れたグルコースイソメラーゼの固定化方法に関す
るものである。

グルコースを接触的にフラクトースに変換するグルコー
スイソメラーゼ酵素な担体、例えば繊維などに固定化し
、固定化酵素としてその酵素反応を利用して各種物質を
工業的に製造することはすでに行なわれている。

酵素は、通常水溶性であるため、その特性を工業的に回
収利用することが困難であり、また反応生成物と酵素と
の分離が厄介なため、適当な支持体に固定化した、いわ
ゆる、固定化酵素として実用に供されていくことは広く
知られている。

グルコースイソメラーゼ結晶酵素を固定化することも行
なわれているが、その寿命は比較的短かく、寿命延長の
ために、例えばグルコースの基質溶液にマグネシウム化
合物やコバルト化合物を添加し、マグネシウムイオンや
コバルトイオンを溶存させると有効であることが一般に
知られている。

しかし、基質溶液にコバルト化合物を添加することは、
その毒性のために得られる食品物質の安全性をそこなう
ので不適当であり、この方法は事実工業的には使用され
ていない。

本発明者らは、グルコースイソメラーゼの長期間安定な
活性を有し、しかも工業的に採用できる固定化方法につ
いて鋭意研究の結果、固定化浴にコバルトイオン及びマ
グネシウムイオンを共存サせるとき優れた固定化効果が
得られることを見出し、この知見に基づいて本発明をな
すに至った。

すなわち、本発明は、酵素固定化担体にグルコースイソ
メラーゼを固定什するに際し、該グルコースイソメラー
ゼ酵素タンパクｉｍｙ当りコバルトイオン１〜７０μｇ
及びマグネシウムイオン３〜３５０μｇを共存させたグ
ルコースイソメラーゼ含有固定化浴に担体を浸せきする
ことを特徴とするグルコースインメラーゼの固定化法を
提供するものである。

本発明の方法においては、グルコースインメラーゼを担
体に固定化するに先だって、グルコースイソメラーゼ固
定化浴中にコバルトイオン及びマグネシウムイオンのそ
れぞれの特定範囲量を共存させることにより、顕著な相
乗効果が得られ、従来の固定化グルコースイソメラーゼ
より格段に延長された寿命を示す固定化効果が得られる
もので、酵素反応において基質溶液中へのコバルトイオ
ンの脱落ないし溶出もなく、工業的価値の極めて高い固
定化グルコースイソメラーゼが提供される。

本発明の方法におけるグルコースインメラーゼ酵素固定
化担体としては、アミノ基を有する繊維状担体及び粉粒
状担体が有利に使用される。

本発明の方法に用いられる固定化浴は、任意の濃度のグ
ルコースイソメラーゼ水溶液中に水溶性のコバルト化合
物及びマグネシウム化合物を添加することにより調製さ
れる。

コバルトイオンを提供するコバルト化合物及びマグネシ
ウムイオンを提供するマグネシウム化合物は、水溶性塩
であれば特に制限されないが、通常それぞれの塩酸塩、
硫酸塩及び硝酸塩などの塩類が有利に用いられる。

それぞれの塩の固定化浴への添加は、コバルト塩では、
コバルトイオンとしてグルコースイソメラーゼ酵素タン
パク１■当り１〜７０μｇの範囲量となるように加えら
れ、好ましい添加量は５〜５０μｓである。

またマグネシウム塩は、マグネシウムイオンとして該酵
素タンパク１〜当り３〜３５０μｇの範囲量となるよう
に添加される。

好ましいイオン量は１０〜１００μｇである コバルト
イオン量が１μｇ未満及びマグネシウムイカン量が３μ
ｇ未満ではいずれも固定化グルコースイソメラーゼの寿
命延長効果が乏しく、また、コバルトイオン量が７０μ
Ｉを超え、マグネシウムイオン量が３５０μｙを超える
と、いずれの場合にも担体への酵素吸着量が低下するの
で好ましくない。

両金属イオンは、上妃それぞれの範囲量を固定化浴に共
存させることにより、その相乗作用によって顕著に改善
された固定酵素の寿命延長効果が得られたのであって、
いずれか一方のイオンが存在しないか、上記それぞれの
範囲量下限未満の場合には、具体的に後述するように寿
命延長効果は極めて小さい。

本発明の方法における固定化浴は、酵素活性の安定性や
担体への酵素吸着量からＰＨ５〜９の水素イオン濃度が
望ましく、コバルト塩及びマグネシウム塩の添加後調整
することがよい。

このようにして調整されたグルコースインメラーゼ固定
化浴から担体にグルコースイソメラーゼ酵素を固定する
方法には特に制限はないが、例えばコバルト塩及びマグ
ネシウム塩を添加して調製した固定化浴を十分混和して
１〜２時間常温に放置後、固定化担体な入れ、３０℃で
一夜放置するとグルコースイソメラーゼは担体に充分固
定化される。

固定化された担体は、とり出して十分水洗しグルコース
の転換反応に用いることができる。

このようにして得られたグルコースインメラーゼ担体は
、バッチ方式で利用することもできるが、通常力ラムに
充填してグルコース基質溶液を流し、連続的に転換物質
、フラクトースを得ることが好都合である。

基質溶液の通液速度は固定された酵素量、担体の形状、
充填量などにより選択されるが、簡単な予備実験により
最善の条件を容易に確認決定できる。

固定化酵素の寿命は、上記カラムに基質溶液を連続的に
、例えば空間速度（ ＳＶ）１で通液し、フラクトース
への転換率で示される酵素活性が半減する半減期を測定
することにより比較評価することができる。

本発明の方法により固定化されたクルコースイソメラー
ゼは、コバルトイオン及びマグネシウムイオン不存在浴
で固定化されたものに比較して半減期が２〜２．５倍も
の大巾な寿命延長が得られる。

コバルトイオン又はマグネシウムイオンの単独を存在さ
せた場合にも、ある程度の寿命延長効果は認められるが
、その効果は小さく、本発明の方法におけるような両金
属イオンの共存下に固定化するとき、予想をはるかに超
えた相剰的寿命延長効果が得られたことは驚くべき発見
であった。

本発明者らは、本発明の方法により得られたグルコース
イソメラーゼ固定化担体について両金属を分析したとこ
ろ、コバルトイオンは定量されたが、マグネシウムイオ
ンは通常の分析精度では検出できなかった。

したがって固定化担体中にコバルトイオンは吸着などに
より保持されているが、マグネシウムイオンは固定化の
際になんらかの好ましい作用機能を果しているものと推
定される。

そのメカニズムは全く不明であるが、固定化酵素の寿命
延長に大きく関与していることは明白である。

このことは両金属イオンを含まない浴に担体な浸せき接
触させて固定化したのち、両金属イオンを含有する水溶
液中に浸せきしても、本発明の方法により得られる酵素
寿命延長効果は全く認められない事実からも容易に理解
できる。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。

実施例 １ 平均重合度１２００の実質的に完全にケン化されたポリ
ビニルアルコールを常法の乾式紡糸法により延伸倍率４
倍に延伸して水中軟化点８５゜ｄ、繊度１００ｄ／４０
ｆのポリビニルアルコール繊維を得た。

この繊維をプロムアセタール化処理し、さらにホルマー
ル化して耐熱水性を付与した。

次いでトリメチルアミンを反応させて，ｌｍｅｇ／ｇの
中性塩交換能及び２．８の膨潤比を有する繊維状の４級
アミン化担体な得た。

一方， ０．３ｑｂのグルコースイソメラーゼ溶液１０
０ｍｌ（添加活性１２２００ＧＩＵ）中に酵素タンパク
１■に対し、コバルトイオンとしてθ〜５０μｓ及びマ
グネシウムイオンとして０〜１００μｇの範囲の各種量
となるよう塩化コバルト及び硫酸マグネシウムを加え、
それぞれの液を３０゜ｄの温度で１時間放置したのち、
これらの酵素浴中に上記担体をそれぞれ浴比１：５０で
３０℃の温度条件下に１夜浸漬した。

次いで各浴の担体な取り出し、水洗して、水洗液から金
属イオンが検出されなくなるまで充分に洗い、６２００
〜６４００ＧＩＵ／ｇの発現活性を有する酵素固定化担
体を得た。

得られた固定化担体をそれぞれカラムに充てんし、５ｍ
Ｍの硫酸マグネシウムを含有する，Ｈ８．６の４ ０゛
ｗ ｔ ／ ｖｏｌ ％グルコース溶液なＳＶ＝１で連
続通液してグルコースのフラクトースへの転換率を測定
し、それぞれの半減期を求めた。

なお、固定化浴中に存在させた両金属イオンの各種量条
件と固定化担体中のコバルト量を定量し、半減期との関
係を検べた。

それらの固定化条件及び結果を次表に捷とめた。

関係が一見して理解できるように、この表をグラフとし
て図に示した。

図においては横軸に固定化浴中に添加され溶存するコバ
ルトイオン量（酵素タンパク１■当りのμｇ）をとり、
左側の縦軸に固定化担体中のコバルト量（μｇ／■）及
び右の縦軸に固定化酵素の半減期が目盛られている。

これらから明らかなように、両金属イオン不存在浴で固
定されたものの半減期が２０日であるのにくらべ、コバ
ルトイオン単独のものは３０日でマグネシウムイオン単
独を存在させて得られたものは２１日であるが、両金属
イオンを共存させた本発明の方法によるものは半減期が
５０日にも延長されている。

なお、担体の膨潤比は乾燥重合体重量に対する膨潤重合
体量の割合である。

実施例 ２ 実施例ｌでホルマール化処理された繊維をアンモニアで
処理して、弱イオン交換容量が約１ｍｅｇ／ｇで膨潤比
が２．５の繊維状１級アミン化担体を得た。

この担体なＰＨ８のグルタルアルデヒド４チ水溶液中に
入れ３０秒間反応させたのち、イオン交換水で十分洗浄
し、酵素タンパク１〜当りコバルトイオン３０μｓ及び
マグネシウムイオン６０μｇを共存させたグルコースイ
ソメラーゼ酵素浴に浴比ｌ：５０で浸漬して３０℃の温
度条件下に３０分間固定化後、３０℃のイオン交換水に
より十分水洗を行い、７ｓｏＧＩＵ／．！ｌｉ’の発現
活性を有する共有結合による固定化担体を得た。

この固定化担体をカラム法で、実施例ｌと同様な条件で
グルコース溶液を通液した。

その結果、両金属イオン不存在の浴で固定したものの半
減期が１５日であったのに対し、上記本発明の方法で得
られたもののそれは４０日であった。

実施例 ３ 市販のイオン交換樹脂（商品名デュオライトＡ一７、ダ
イヤモンド・シャムロツク社製）ヲ、添加酵素タンパク
１７７２！ｉｌ！当りコバルトイオン４０μｇ及びマグ
ネシウムイオン８０μｇを共存させた０．３係グルコー
スイソメラーゼ浴１００′ＩＩＩｊ！に入れ（浴比１：
５０）、固定化を行ったのち十分水洗して２０００ＧＩ
Ｕ／ｇの発現活性を有するイオン結合によるグルコース
イソメラーゼ固定化担体を得た。

この担体を実施例１と同様な条件で基質液を通し、半減
期を測定したところ２８日であった。

一方両金属イオン不存在浴から得られたものの半減期は
１６日であった。

【図面の簡単な説明】

図面は、本発明方法における酵素タンパク１■当りのコ
バルト添加量と固定化担体中のコバルト量（実線）及び
その半減期（破線）の関係を示すグラフである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ アミノアセタール化ポリビニルアルコールカら成る
   酵素固定化担体に、グリコースイソメラーゼを固定化す
   るに際し、該グルコースイソメラーセ酵素タンパク１ｍ
   １当りコバルトイオン１〜７０μｇ及びマグネシウムイ
   オン３〜３５０μｇを共存させたグルコースインメラー
   ゼ含有固定化浴に、担体を浸せきすることを特徴とする
   グルコースインメラーゼの固定化法。