JPS5886450A - 酵素電極膜とその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、電気化学的センサーに用いて好適な膜及び核
新規な膜の製造方法に関する。膜は、通常、ポーラログ
ラフセルと称される（以下においては、そのように称す
る）電気化学的分析電位差調定用セルにおいて使用され
る。これらのセルは、未知物質を、セルからの電気的信
号によって測定しうみ物質に変換する酵素を含んでいる
。多種多様な分析技術及びセンサー類が、各種物質の測
定に利用可能である。医学的分野に特に重要なことは、
血液等の体液、体組織、食物等に含まれる各種物質の微
量分析である。このような物質には、グルコース、原票
、尿酸、トリグリ上リド類、す７層質類、タレアチニン
、アミノ酸類、乳酸、キサンチン、コンド四イチン等が
ある。血中又はその他の体液中Ｏｒダルコース濃度制御
又は監視する丸めの七ンを−の開発は、糖尿病患者の正
常な血中ダルコース濃度を維持するために、特に１賛で
ある。通常、血液試料は、生成し九過酸化水嵩のｌ−う
ロダラフィーによる測定器（検出器）を備見えダルコー
スオキシメーゼ電極を用いてダルコース濃度をオンライ
ン分析するために患者から採取される。通常、このよう
な測定器は、陽極、陰極、電解質、及び固定化酵素を含
む特殊な組成の馬を備えた、過酸化水素測定用ｗｐ票電
極から成る。

酵素は、測定すべき未知物質自体が電気化学的に不活性
であっても、その未知試料の酵素による変換又は反応に
よシ、得られる生成物が測定可能となる場合、即ち、−
一うロダラフィーを用いる手段によって測定可能となる
場合には、ポーラログラフセルと共に使用されてきた。

前述したように、医学的に１！！な最も一般的表問題は
、血中ダルコースを測定せんとする要請である。この測
定ある。ダルフースオキシメーゼ存在下、次の反応２即
ち、 が起こる。この反応によシ生じる過酸化水素は、ポーラ
ログラフ測定器にょシ測定可能であや、その結果、適当
な検量及び計算によって、遊離し九迅０２量から、もと
の試料中のグルコース量を測定することが可能となる。

一般に、Ｉ−ラログラフセルは、電気的絶縁性の容器、
膜と！気菌に接触している指示もしくは感知電極及び該
層と電気的に接触している参照電極とから成る。＠接触
１という表現は、膜と電極との接触が、直接的に又は電
解質層を介してなされている場合を含むものである。各
種形態のセルが従来技術において広く知られ、−また認
められている。本発明の目的のために特に好適なセルは
、クレメンス（ｃｌｅｍｅｎｓ）らの米国特許第４，０
９２，２３３号に示されている。

従来技術で紘、酵素膜の構造に関して、第２の履水性膜
を第１０前記し一＃：、ＷＸから一定の距離を置いて配
置することが知られている。両膜間の空間には、高濃度
の酵素層が介在する。第２の膜の開放面は被検物質が接
触する試験表面となる。この種の酵素膜は、デ・ニュー
璽−クアカデンー・オツ・サイエンス（ｔｈ＠Ｎ＠ｗ　
Ｙｏｒｋ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃ　ｆｅｎｃｅ）
の年報、１０！　、　！９−４９（１９６２）に記載さ
れている。

この論文には、−感知電極が反応によシ生じたグルコン
酸を測定するために使用されることが示されている。そ
Ｏ装置では、酵素が２つの酢酸セルロース膜間に補促さ
れていることが開示されている。グルコースは膜を介し
て拡散し、更に酵素によってグルラン１１に：変換され
、しかる後、グルコン酸は一感知ガラス側へ向かう方向
と供給〔ドナー　（ｄｏｎｏｒ）　）清液側に戻る方向
へと拡散する。

感知電極に面する前記第１の層線、感知電極が感受性を
有する物質が透過し得る物質から成る。

例えば、との膜は酵素反応基質に対して透過性であるが
、酵素自体に対しては非透過性である。それがキュプロ
ファン（Ｃｕｐｒｏｐｈａｎ・）からできていてもよい
が、反応生成物の一つが常温常圧下で気体であって、こ
の気体を介して測定することが望まれる場合には、該層
は、イオンに対して非透過性であるが酸素、二酸化炭素
又はアンモニア等の気体に対してわずかに透過性である
親水性合成樹脂から成っていてもよい。シリコンゴム、
テトラフルオロエチレン等をはじめとする、このような
性質を有する各種の合成１ｆｔ４脂が知られている。

クラーク（Ｃ１ａｒｋ）によシ開発され、米国特許第３
．５３９．４５５号に記載された納屋のポーラログラフ
セルにおいて、酵素は、膜の電極側に配置され、白金電
極が生成した過酸化水素を測定している。

グルコースは低分子種で、膜を通過し、ＷＩｐ累と反応
するが、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ等の高分子物質
は阻害されて通過しない８酪累分子を保持するに十分大
きな空孔を有する多孔質フィルム上に酵素を置くことに
よって、プラチナ表面と膜との閾の薄いフィルムにｉｓ
累が直接保持されることが開示されている。しかしなが
ら、セロファン膜は、尿酸又はアスコルビン酸等の低分
子量阻害物質が感知電極に達することを防止することは
ない。クラークは、２１１０電極装置がその問題を克服
することを示唆している。補償電極が、酵素非存在下で
、阻害物質に関する信号を発し、一方、酵素電極が過酸
化水素及び阻害物質を検出する。計算値から、ダルコー
ス濃度が決定される。しかしながら、その２つＯセンサ
ー装置においては、２つのセルの整合に問題がある。

そこで、尿酸、アスコルビン酸等の低分子量阻害物質の
通過を防止し、一方、最小限の妨害で過酸化水素を通過
せしめ得る薄いフィルター膜を用ＩＡ九酵素電極を使用
することが提案された。ここに、過酸化水素は通過させ
るが、阻害物質に対しては有効なバリヤーであるシリコ
ンがム、酢酸セルロース等の膜物質があげられる、この
種の膜は、感知電極と感知系の幾つかの構成物との間に
載置しまければならないので２膜は、できるだけ速やか
に＃ｌｌｌ平定となるように選択性を保持しつつ可能な
隈）薄くなければなら力い。過酸化水素感知針Ｏ場合、
この膜は２μ未満の厚さであることが必要である。しか
し、このような厚さの膜は、強度が不十分であるため、
実用化が困難である。

そこで、多孔質基材上に薄層上に上記物質を付着せしめ
ることによシ、所要の強度を付与し、同時に過酸化水素
の通過をほとんど妨害しないようにする試みがなされた
。かくして、弱い阻害物質の排除層を薄くして、反応速
度を高めることができる。

ニューマン（Ｎｅｗｍａｎ）　　の米国特許第３．９７
９．２７４号に記載されているように、積層された二重
の薄膜において、酵素接着剤が、該二重の層を互いに結
合するために使用されている。この膜は、基質の拡散を
抑制しさらには、高分子量物質及び未知物質と反応し、
かつ層を互いに結合するためＯＷＩ累ｖ累加４製物リヤ
ーとして働く支持層並びに低分子量物質を阻止するバリ
ヤーとして作用するが、過酸化水素を通過させる実質的
に均質な層を含む。

しかしながら、こ′れを開発するに当っては、Ｗ＃索が
接着剤又は結合剤として作用する酵素層をその間に介在
させた２つの膜からなるサンドイッチ構造を形成すゐこ
とが必要である。この種の構造のものでは、ｗＩ累の使
用が多すぎると、拡散量の拡散速度が許容できない程度
にまで低下する。よに薄い酵素層を用いると、許容し得
る拡散量となるが、酵素の充填量は十分ではなくなる可
能性がある、さらにその後、英国特許第１，４４２，３
０３号（放射針）において新九なる展開が見られるが、
これによれば、一単位として形成された不均質膜である
複合膜が提案されている。この膜は２つの異な酵素は膜
の表面に結合している。他の先行技術は多くの欠点を示
していた、 コヤマらの方法〔アナリテイカ・ケミ力・アクタ（Ａｎ
ａｌｙｔｉａａ　Ｃｈａｍｉｅａ　Ａｅｔａ）、　１１
６　、３０７−３１１（１９８０））　ハ、ｒ　ルコ−
ｘオキシダーゼヲ酢讃＊ルロース膜に固定している。こ
の方法は、多くの時間を費やす。即ち、多くの工程を含
み、ＬＪｈ４、単分子層が最大限可能な酔累量を担持さ
せるという点において難点があった。

しかしながら本明細書に記載された発明は、はるかに多
量の酵素を膜中に空間的に分布せしめることを可能にし
たものであって、その結果、はるかに多くの酵素が、基
質の拡散経路に沿った前記基質との反応に有効に利用さ
れることになる。

ザ・ジャーナル・オプ・バイオメディカル・マテリアル
ス・リサーチ（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｔｏ
ｍｅｄｌｅａ１Ｍａｔ＠ｒｌａｌａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
）、１３．９２１−９３５（１９７９）において、ウィ
ンが−ド（Ｗｉｎｇａｒｄ）らは、酵素の固定化のため
に、プラチナのスクリーン又は線条を開示している。こ
の方法は、コヤマらの方法よシも太き表面積が結合に利
用されることを可能にし九もので、それ故、更に多量の
酵素分子を存在させることが可能となるであろう。しか
しながら、ウィンガードの試みは、酵素の単分子層に限
られるし、また、プラチナ線条の表面近傍のみにおいて
、プラチナ智スクリーンの開放空間を通して拡散する基
質の速やかな変換速度が維持されうるにすぎない。この
ため、この先行技術は、以下の本発明に従って打電われ
るように、酵素が、基質が拡散する膜全体に空間的に分
布され、かつ、理論的に可能な変換速度を達成すること
ができない、本発明によれば、分離酵素層を調製すると
いう必要性は、酵素を、それが膜の相全体に均一に分散
されてそこに固定されるようなやり方で膜の一部分に直
接組み込むことによルと）除かれる。

本発明は、多くの利点、例えば調製が容易であるとと、
剥離するおそれがない２相の膜が永久的に結着している
とと；即ち、積層する必要がない等の利点によって特徴
づけられる。又、新しい膜は、浸漬鋳型法に容易に適合
せしめることができるので、小型電極に直接膜を固着す
ることが可能となる。

更に、膜中に均一に分布せしめることによシ、二層間に
酵素を挟着せしめるよシも、より均一な酵１濃１度−を
得ることもできる。

本発明の原理は、グルコース量についての血液の分析に
関連づけると、より十分に理解されるであろう。血液の
液状部分は、蛋白質、脂質、そのス、ｌＩ−累（カタラ
ーゼ等）かどが存在し、電解質トシては、アスコルビン
ｆｆ（ビタミンＣ）及び各種の金属塩（ナトリウム、カ
リウム、マグネシウム、カルシウム、鉄及び銅等の陽イ
オン及び塩累化物イオン、リン酸イオン、重炭酸イオン
、並びに炭酸イオン等の陰イオンから放る）等がある。

リン酸塩、炭酸塩及び重炭酸墳は、正常な通常の条件下
で、血液の−を一定値に維持するための緩価剤として作
用する。仮に、血液試料がセル中の膜の片側に配置され
、かつグルコースオキシダーゼ及び酸糖の水溶液が膜の
他の側に配置されたならば、ある低分子量物質は、血液
から膜を通過してグルコースオキシダーゼ溶液に移行す
るであろう。しかし、酵素等の高分子量物質は膜を通過
しない。各種物質の膜透過速度は、膜の性質によって一
定となる。不発明において、比較的に薄い相は、分子を
約３００で分割する。これは約３００以上の分子量を有
する物質は通過しないということを意味する。

低分子量物質であるダルー−スは、−を通過し、酸素Ｏ
存在下、ダルプースオキシ〆−ゼと反応して、ダルツノ
ラフシン及び過酸化水素を生成する。

水の存在下で、ダルコノラクトンは、自然に加水分解し
てダルコン酸を生成する。

ダルコン酸及び過酸化水素は、ダルコースオキＶ〆−ゼ
に比べて比較的低分、子量の物質であり、膜を通過する
。速やかにＨａＯｔに分解し得る高分子量ＯＷＩ素であ
〉、また生化学的液体中に存在しているペルオキシダー
ゼ及びカタラーゼ拡、膜を通過できない、 本発明では、膜は電気化学的分析用セルに使用され、こ
のセルは米国特許第４．０９２．２２３号に示されてい
るように、一般に、−縁性の容器、陽極及び陰極から成
る。本発明の膜は、よシ古い湿式の装置に使用してもよ
い。この渥の装置は、容器内で一定の間隔に弾丸れた感
知電極（陽極）と参照電極（陰極）とを利用するもので
、参照電極は、感知電極から隔離され、また電解質を保
持できるようにされている。膜は電気的に電極と接触し
ておシ、電流は陽極と陰極との間に、又は参照電極と感
知電極との間に流れる。また、膜は二つの構成要素から
成るもの、すなわち、ここで述べる一体的″＆＃Ｉ＃素
膜である７ 本発明の膜の一部分は、比較的高密度で、かつ比較的薄
く、また膜の他の部分は、比軟的低密度で断面が厚い。

厚い断面を有する膜の部分に線、Ｗ＃素が組み込まれて
、そこに固定化され、全体的に均一に分散されている。

１合膜は、二つの別工程で形成され、また、膜表面に対
して平行ＷＣｉ４なった層又は部分を有している　、と
いうことが本発明の％ｇｉ、点である。しかしながら、
必要ならば、＃索がない別の層が第１層と第２層との間
に介在してもよい。高密度層と相変換Ｗ＃素層との間に
第２相褒換層（酵素なし）を設けると、よシ直締的な反
応％往を示す良質な膜が得られるように思われる。多重
積層膜は、尿酸、アスコルビン酸、非ガス状高分子等の
阻害物質の感知電極への移行を阻止し、一方、溶媒及び
低分子種、例えば過酸化水素等の酪素変換生成物を通過
させる。

これらの特性を示す膜は、酢酸セルロースの共重合体等
のような他の物質と同様に、酢酸セルロースから製造さ
れる。

測定時間を適度に短縮化するには、被測定物の種類によ
り変わゐが、膜厚が約７０μを超えないことが要求され
る。２〜５μの薄い高密度層と約６８ｊ１１の厚い低密
度層−とから成るように膜を形成す為ことによって、例
えば、過酸化水素等の拡散平衡化に要する応答時間を短
縮化することができる。

従来技術において存在していた欠点は、本発明の新規方
法に従い複合膜を形成″することによシ克服された。そ
れは必ずしも明確に分かれている必要暖ないが、互いに
、別々にかつ独立に形成される場合、次のような特徴を
有する２つの相からなっている。即ち、複合膜中で電極
に面し高度に多孔性で比較的厚い相と、複合膜中で試料
、例えば血液試料に面し比較的非多孔性・高密度でかつ
薄い相として特徴づけられる：相から成る。この複合膜
において、２つの膜の気孔率と厚さは、それらを互いに
融合するため変化する。多孔質相全体に粒状の酵素を均
一に分散せしめる。しかしながら、この酵素は複合膜全
体に分散されていてもよい。皺両層の混和又は拡散が起
こる丸め、層又は相という唾は、接触面で相互作用を起
こす層を意味し、互換性をもって使用される。

複合膜を形成している相の個々の性質は、別個に形成し
た場合、次の通シである。即ち、比較的非多孔性の相は
、それ自体を形成して試験した場合、分子量を約３００
で分割し、高度に多孔性の相は、それ自体を形成して試
験した場合、それが形成（鋳型）された表面に近接した
面で、酵素基質を自由に通過させるが、巨大蛋白質等の
高分子を線断する。

分析物の検出に際し、所望の性質を獲得すゐために、本
発明の幌は二段階の工程で製造される。

まず、極薄の酢酸セルロース膜は、鉄膜と相互に作用す
ることがないか、又は結合しない適当動表藺上で形成さ
れ又は展開される、フィル人形成支神体用の代表的表面
は、ガラス及びＩリエチレン等のある種の金成樹脂であ
る。フィルムは、最終的にフィルム膜厚さを制御するこ
とが可能な通常の装置を用いて形成される。蚊表面上に
展開し友後、形成フィルムは乾燥される。この薄いフィ
ルム嬬、比較的非多孔性の薄い相として供される。

仁の相の厚さは、通常約１〜１０μ、好ましくは２〜８
７１＋の範囲である・ 次に、酵素含有酢酸セルロース膜のよシ厚い相Ｏ変換屋
が超薄膜０＠面に直接形成される。周形成用溶液は同一
０１リマーを含んでおシ、好ましくは同−ＯＳ癩が使用
されているので、その接触面又は境界藺には、両者の拡
散領域が形成され、その結果、両相間には明確な区別が
なくなる。壜ず薄いフィルムを形成することが好ましい
が、実際嬬、形成順序を入れかえてもよい。フィルムロ
雰囲気（常温、常圧）条件下で乾燥させてもよいし、又
は加熱装置を利用してもよい。第２のフィルムがＫＩＯ
フィルム上に形成される場合、第１のフィル入社必ずし
も完全に乾燥して匹なくてもよい、即ち、触れると粘着
性を有していてもよい。

乾燥後に皮膜が、厚いフィルムの最上の表面上に形成さ
れると考えられる。

薄く、かつ、よシ高密度膜成分の形成用酢酸セルロース
溶液は、ケトン類等の不活性有機溶媒中に酢酸セルロー
スＩリマーを溶解するととによって調製される。代表画
表ものとして、アセトン、シクロヘキサノ／、メチルエ
チルケトｙ等があげられる。溶解し合う溶媒の混合喉も
使用可能である。溶媒中のポリマーの濃度は、１〜５％
、好ましくは２〜３嘩の範囲である。フィルムは、最終
生成物を１〜１０μの厚さ、好ましくは２〜５μにＩＩ
＃ｌ與できるような適当なフィルム塗布装置を用いて製
造される。

本発明の複合膜の比較的多孔性で淳い相転換膜は、ケシ
７類等の不活性有機溶媒中で、酢酸竜ルロース４リマー
溶液を調製することにより製造される。エタノール、水
等の、酢酸セルロースに対する非藩媒又は非溶媒混合液
を、次に酢酸セルロースＩＷ媒と混合する、エタノール
等の特定０１ｊ−溶媒に限られず、他のものを使用して
もよい。通常、水と混合し九低級アルコール類が、本目
的の丸めには好ましい。酵素水溶液は、非溶媒相の一部
分として含まれている。ダルプースオキシ〆−ゼは、通
常、水！・−ｍ）ｓｏｏ〜５０００の酵素単位を含有す
る水溶液中で用いられるが、これは当業者にとって明ら
かな範囲内で変更され得る。本発明ｏｙｓが使用される
代表的な電気化合的センサーとして紘、マイルス・うｆ
ットリーズ（Ｍｉｌｅ畠ｋｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　Ｉ
Ｉ（）バイオステーター（ＢＩＯ８’ＦＡＴＯＲ）ダル
コース電極（米国特許第４．０９２．２３３号参照）が
あげられる。

本発明の属Ｏ全体的な厚さ絋、約４０〜約１００声ｏｍ
ｍであ）、好ましくは約７０μである。薄い高密度層は
°、約１〜１０ｉｓ、好ましくは２〜ＳＳＯ範囲であ）
、また、厚い低密度層は約４０〜＠ＯｓＯ範■である。

ヒれらの数値の変更は、本発明の所望の範囲内で許容さ
れる。好ましい膜は、一層が約２ｓｓ他層が約６ｓμの
膜厚的’１０ｓのものが好オしい。

されている。該セルは、合成樹脂、ｆラス又はその他の
逼巖な物質から成る絶縁性容器１０を構成ｌ！票とし、
その断面積、断面形状はいかなるものであってもよいが
、好ましくは円筒状である。＃セルは絶縁量１１によシ
被蓋されている。容器内に社、絶縁ロンドすなわち導１
１１３を内包する円筒状カラム１２が設置されている。

この導線は、白金、金、鎖、ａ鉛（ダラファイト）等か
ら成る活性／訃部材１４に接続されている。

四ツドもしくはカラム及びり、Ｃ電圧源ｌｓと導通され
た蓋を介して、リード纏が電極に付設されている。

容器の下端部には、リング又はリティナー（ｙ＠ｔａｉ
ｎ＠ｒ　）等の支持部材１６が設けられ、また、本発明
の膜１７が中央電極に最も近い支持＠粉の端部全周に、
電極の活性面からごく近接し九距離をおいて設けられて
゛いる。膜は、あらゆる適宜の手段によシ閤着されるが
その手段としては、例えば、容器の冠状溝ＫＯ）ンダを
はめ込む等０遭宣が手段があげられる。セルには通常の
測定器具（Ｅ示せず）が連結されている。

容器内圧が過度に上昇することを防止するため、例えば
、容器に拡ガス排出孔１ｇが設けられている。

中央ロツｒと容器−とＯ閲ｉｃａ輪状空間が設けられ、
例えば、塩化銀で皺覆され九鎖線等の参照電１ｉ１９が
装置されている。空間２０には、少なくとも−１１に、
好鵞しくけ全部Ｋ１１合液体電解質が充填されてか）、
電解質は空孔から室内に導入１れる。

一−ラａダラ７分析法にあっては、通常２つの電極が使
用畜れ、そのうちの一つは分極されており％微積物質が
脱分極される迄は通電しない。第１１１に示し九七ル構
造に＄Ｐいて、電極１９Ｆｉ、陰極であり、分１１１１
れて、通常、参照電極として用い←れる。４ｈう一方の
電極、即ち第１図に示されてい為電極１４紘陽極として
機能し、被検物質存在下で社分極し象い。従って、比較
的大電＠０過流を抑制するしと社なく、通常センサー電
極とじて用いられる。第１図に示された電極は絶縁関係
にあ）、室内に充填された電解質は両電極間で導通経路
を形成する１代表的な電解質として嬬、例えば、塩化す
）１７ウム４しくは塩化カリウムが挙げられ、炭酸塩、
す／酸塩、重炭酸塩、酢酸塩、アルカリもしくは希土類
塩を含む緩衝液又は他の有機緩衝液又はこれらの混合物
が用いられる。かかる電解質Ｏ′ｆＩＩ媒としては当業
者であれば周知であゐ水、ダ秩コール類、グリセリンお
よびこれらの混合物があげられる。

１１１２図は、膜の詳細な横断面図である。この不均質
膜は高！１［薄膜層２１と低密度多孔性厚膜層２２とを
有し、これらは一体化されて複合構造を形成している。

点符号−で表わされた酵素は膜の厚い部分すなわち層中
に均一に分散されている。しかしながら、酵素のあるも
のは、膜の調製中、酢酸セル四−スの溶媒が蒸発される
前に薄膜層に拡散する。膜表面２４祉電極と電気的Ｋ１
ｍ触している。膜は２つの層と１Ｉ３１Ｅとの不均質な
組合せから成）、そＯ外側の自由表面２３は被検漆液と
接触する試験表面となる。

好ましい態様においては、電極と電気的に接触している
内嵌１ｉｉ２４が厚さ約６５μで被検試料と電気的に接
触している反対側の層の厚さは約２μである。全膜厚は
、好ましくは、約７０μである。

本発明の属は、極薄で比較的高密度の第１の酢酸セルロ
ース膜を逼尚な面上に形成し、これを乾燥して製造すみ
、薄膜層を省略するならば、ダル冨−ス分子ｏＨ拡散量
の増大と１＃票反応とで次に酵素の欠乏が生じこれによ
って測定は更に非Ｉ纏的になり１〈、なる。厚層相変換
型であって比較的多孔性の酢酸セルロース膜は、直接薄
膜表面上に形成される。厚膜部分を先に形成し、次にそ
の表面上に直接薄い部分を形成することも可能である。

１金属の相変換構成物又は多孔質部分は、ア竜）ｙＩＩ
Ｉの不活性有機溶媒で酢酸セルロース溶液を調製するこ
とにより形成される。溶液には酢酸セール謬−スと非溶
媒とが混合されている。好適な非溶媒としてはエタノー
ルと水との混合物があげられゐ。

非溶媒相の一部分には、酵素水溶液が含まれていること
が望ましい。

以下の冥施例は本発明の使用法を示すものであるが、辷
れにより本発明が制限されるものではない。

実論例 第１のフィルム部分を調製するために、３１Ｇ酢酸セル
ー−スのアセトン溶液を２ｍ１ｌフイルム塗布器を用い
て清浄なガラス板上に、塗布しえ。

１．５０：０エタノールを１０％酢酸セルａ−スのアセ
トン溶ｉｌｌ［５０ｅと混合して、相変換酢酸セルロー
ス形成用溶液を調製した。次に、これを氷水塩浴中にあ
け、撹拌した。ついで総量１．Ｏｅｅ±０．１αのダル
コースオキシダーゼ水溶液を前記溶液に加え友。この溶
液には、１ａｅ当り２．０００〜３．０００単位のダル
コースオキシダーゼが含まれている。

これを１０〜１５分間混合した。ついで混合を停止し、
Ｓ分間脱気した。

次に、１８ｍ１ｌ塗布器で第１膜表面上に第意膜溶液を
塗布した。室温で数時間、散布されたフィルムを乾燥し
え、とれによシ膜は使用可能となり九。

＊素調製濱は、ダルコースオキシダーゼ等の適轟１に酵
素の革なゐ混合水溶液でもよい、もちろん、酵素調製液
には、結合剤又はダルタルアルデヒド等の架橋剤のよう
な他の物質が配合されていてもよい。更に、調製液中の
水に対する酵素の割合は、博Ｉ！にして容易に着榎又紘
圧延できる流動性（−スト又は溶液が形成されるならば
、格別限定されない、測定ｌＩｃ１Ｉシ、十分な反応量
を確保する丸め、溶液中には多量ＯＷＩ素が配合されて
いる。

本発明ＯＩＩ金属はその厚さが約５０〜１００μ、好★
しくは約７Ｏμの自己支持フィルムである。

複金属はいかなゐ特殊な形態もしくは大きさ、に形成さ
れていてもよく、又、いかなる大きさのｌ−う■ｒラフ
セルもしくは電極用の容器にも適含でき為ように、あら
ゆる特殊な手段で裁断、寸法どりされていてもよい、１
！＃に、米国特許第４．０９２．２３３奇に記載されて
いるように、電極に使用される０−リｙダに固定１れて
いて４よい。

適当な大きさのがム性０−リングに膜を固定するには、
接着操作を用いてもよい。さらに又、膜を電極表面上に
直接形成してもよい。

酢酸セルロースに加えて、他のポリマーを溶媒に＃ｌ解
し、少量の溶媒又は非溶媒を追加して相変換を起こさせ
て、膜物質として用いることも可能である。このような
ポリマーとしては、ニトロ七ｋＷ−ス、エチルセルロー
ス及びその他のセルロース誘導体があげられる。加えて
、塩化メチレンがアセトン又はその他ケト／類の代わり
に溶媒として用いられ為ならば、ぼりカー−ネートに代
えてもよい。

相変換混合物中に混在する低級アルコール類の代わヤに
、ホルムアイドが使用可能である。

当業者であれば容易な本発明の変更は、特許請求０１Ｅ
ＩＩＫ含まれている。

【図面の簡単な説明】

第１図社、本発明の膜を利用した通常の４−ラ冒グラフ
セルの縦断面図（部分的）、第２図は、本発明Ｏ膜の断
面拡大図である、 ｌＯ・・・絶線性容器、１１−・絶縁蓋、１２・・・円
筒状カラム、１３−導線、１４・・・活性／露出部材、
１５・・・Ｄ、Ｃ，電圧源、１６・・・支持部材、１７
・・・膜、１８・・・ガス排出孔、１９・・−参照電極
、２ｏ・・・空間、２１−高密度薄膜層、２２・−低密
度多孔性厚膜層、２３−・外表面、２４−・膜表面。 げ １Ｇ、１ ＦＩＧ、　　　２ 第１頁の続き ０発　明　者　ジエームズ・ニドワード・ジョーンズ アメリカ合衆国インヂアナ４６５１ ４エルクハート・レハイ・ドラ 一イブ２９５４０ ０発　明　者　ブルース・ジエイ・オバハルドアメリカ
合衆国インヂアナ４６５４ ４ミシャウオー力・バーコード ・サークル４０５−４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　　第１のポリマーを不活性有機溶媒に溶解して
   調製し、該ポリマーと反応せず、かつ該ポリマーとは結
   合しない不活性支持体表面上に、溶液状で該Ｉリマーを
   塗布して、 前記溶液からフィルムを形成することによシ、第１層を
   得、 第２の４リマーを不活性有機溶媒に溶解して調製し、溶
   媒中に溶解された該第２ボＩＪ、／−を、該−リマーの
   非溶媒及びダルコースオキシダーゼと混合して分散液を
   得、ついで該分散液を前記第１層上に塗布した後、該ｗ
   Ｊ２Ｉリマーを乾燥して、 隣接積層膜を形成することを特徴とする、未知物質の測
   定に際し、電気化学的センサーに用いて好適な膜の製造
   方法。 （２）第１及び＠２ポリマーと反応しない不活性溶媒が
   同一である特許請求の範囲第１項記載の膜の製造方法。 （３１不活性有機溶媒がケトンである特許請求の範囲ｗ
   ４２項記載の膜の製造方法。 （４）不活性有機溶媒がアセトンである特許請求の範囲
   第２項記載の膜の製造方法。 （５）　　グルコースオキシダーゼが水とエタノールと
   の混合紙中に存在する特許請求の範囲第１項記載の膜の
   製造方法。 （６）　　第１ノーがアセトン中の３％酢酸セルロース
   から形成され、厚さが約２μである特許請求の範囲第１
   項記載の膜の製造方法。 （７）′＠２層が、水又は−衡豫中で、エタノールとグ
   ルコースオキシダーゼとを含む溶液に混合された１０チ
   酢酸セルロースのアセトン溶液から形成される特許請求
   の範囲Ｍ１項記載の膜の製造方法、 （８）酢−セルロース＃ｌ腋が、氷水塩浴中で１．５α
   のエタノールを１０％酢ｄセルロースのア七トン浴？＆
   ５　ｃｃと撹拌しながら混合し分散液を調製す否ため°
   １ｏ〜１５分間撹拌しながら酢酸セルロース溶液に、１
   ｃｃ当シ２，０００〜３．０００単位含まれる酵素水溶
   液ｌωを徐々に加え・５分間脱気することによシ、グル
   コースオキシダーゼと混合され丸ものである特許請求の
   範囲第１項記載の膜の製造方法。 （９）第１層と第２層との間に相変換層を形成して成る
   特許請求の範囲第１項記載の膜の製造方法。 舖　第１のポリマーを不活性有機溶媒に溶解し、溶液中
   の該第１Ｉリマーを該ポリマーの非溶媒及びグルコース
   オキシダーゼと混合スることによ）調製して、分散液を
   得、 該ポリマーと反応せず、かつ該ポリマーとは結合しない
   不活性支持体表面上に前記分散液を塗布し、 該分散液からフィルムを形成することにより、第１層を
   得、 第２のＪ　１７マーを不活性有機溶媒に溶解して調製し
   、前記第１層上に該第２ポリマーを塗布して、該第２Ｉ
   リマーを乾燥し、 隣接積層ポリマー膜を形成することを特徴とする、未知
   物質の測定に際し、電気化学的センサーに用いて好適な
   膜の製造方法。 （１１第１及び第２ポリマーと反応しない不活性溶媒が
   同じである特許請求の範囲第１Ｏ項記載の膜の製造方法
   。 ■　不活性有機溶媒がケトンである特許請求の範！１ｗ
   Ｊ１１項記載の膜の製造方法。 Ｉ　不活性有機溶媒がアセトンである特許請求の範囲ｇ
   ｔＸ項記載の膜の製造方法。 （１４グルコースオキシダーゼが水トエタノールとの混
   合液中に存在する特許請求の範囲第１０項記載の膜の製
   造方法。 １５ｇ１層が、水又紘緩衝液中で、エタノールとグルコ
   ースオキシダーゼとを含む溶液に混合された１０９６酢
   酸セルロースのアセトン溶液から形成される特許請求の
   範囲第１０項記載の膜の製造方法。 （１１Ｍ２Ｍ１が３％酢酸セルロースのアセトン溶液か
   ら形成され、厚さが約２声である特許請求の範囲第１０
   項記載の膜の製造方法。 αη　酢酸セルロース溶液が、氷水塩浴中で１．５ωの
   エタノールを１０％酢酸セルａ−スのアセトン溶液５０
   Ｃと撹拌しながら混合し、分散液を調製するため１０〜
   １５分間撹拌しながら酢酸セルロース溶液に、１０’当
   シ２．０００〜３．０００単位含まれる酵素水溶液１ｃ
   ｃを徐々に加え、５分間脱気することによシ、ダルコー
   スオキシダーゼと混合されたものである特許請求の範囲
   第１０項記載の膜の製造方法。 舖　第１層と第２層との間に相変換層を形成して成る特
   許請求の範囲第１０項記載の膜の製造方法。 Ｕ　　厚さが約５０〜約１００μであって、実質的に均
   質な酢酸セルロースの第１層と酢酸セル目−ス０謳２層
   とから成〕、全体的に分散され九ｆ　＃　：２−スオキ
   シ〆−ゼを含む前記第２層に第１層を結合せしめ、両層
   間の境界部分が拡散領域となっていることを特徴とする
   、未知物質の電気化学的分析用ポークログラフセルに用
   いられる膜。 （至）酢酸セルロースの第１層が約１〜１０ｓの厚さを
   有する特許請求の範囲第１９項記載の膜。 ＠　第２層が約４０〜１００μの厚さを有する特許請求
   の範囲第１９項記載の膜。