JPS5886085A - 酵素の固定化法 - Google Patents
酵素の固定化法Info
- Publication number
- JPS5886085A JPS5886085A JP18307881A JP18307881A JPS5886085A JP S5886085 A JPS5886085 A JP S5886085A JP 18307881 A JP18307881 A JP 18307881A JP 18307881 A JP18307881 A JP 18307881A JP S5886085 A JPS5886085 A JP S5886085A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- enzyme
- polyamide
- urease
- immobilized
- invertase
- Prior art date
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- Pending
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- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は酵素の固定化法に関する。
従来高分子材料をマトリックスとする酵素の固定化は包
括法によって行なわれてきたが、この方法に従って得ら
れる固定化酵素は活性の経時変化が大きく実用上満足の
できるものではなかった。
括法によって行なわれてきたが、この方法に従って得ら
れる固定化酵素は活性の経時変化が大きく実用上満足の
できるものではなかった。
本発明者らは安定性の改良された一高活性の固定化酵素
を得るべく鋭意検討した結果、以下に述べる本発明に到
達した。すなわち本発明は、６級窒素を有するポリアミ
ドを４−級化し次いでこれに酵素を結合せしめることを
特徴とする酵素の固定化法である。本発明に用いられる
３級窒素を有するポリアミドとは、４級化可能な塩基性
６級窒素を主鎖または側鎖に持つポリアミＲ２は低級ア
ルキル基、特にメチルまたはエチル基）を側鎖に有する
ポリアミドが特に好ましく用いられる。かかるポリアミ
ドの具体例としては、次の式で示される繰返し単位を主
鎖に含む重合体をあげることができる。
を得るべく鋭意検討した結果、以下に述べる本発明に到
達した。すなわち本発明は、６級窒素を有するポリアミ
ドを４−級化し次いでこれに酵素を結合せしめることを
特徴とする酵素の固定化法である。本発明に用いられる
３級窒素を有するポリアミドとは、４級化可能な塩基性
６級窒素を主鎖または側鎖に持つポリアミＲ２は低級ア
ルキル基、特にメチルまたはエチル基）を側鎖に有する
ポリアミドが特に好ましく用いられる。かかるポリアミ
ドの具体例としては、次の式で示される繰返し単位を主
鎖に含む重合体をあげることができる。
’ｉ： ＮＨ（ＣＨ２）ｎ ＣＨＣＯ’３−（ただしｎ
は４〜１０特に４もしくは１０；Ｒ工。
は４〜１０特に４もしくは１０；Ｒ工。
Ｒ２は低級アルキル基特にメチルまたはエチル基である
） 本発明において４級化のために使用される試薬は、ハロ
ゲン化アルキル、ハロゲン化アルコールなどである。こ
こで分子中のハロゲン（Ｂｒ。
） 本発明において４級化のために使用される試薬は、ハロ
ゲン化アルキル、ハロゲン化アルコールなどである。こ
こで分子中のハロゲン（Ｂｒ。
ＣＩもしくは■）は通常１もしくは２個であり、炭素数
は１〜１９のものが用いられる。このような４級化試薬
の具体例としては、Ｃ２Ｈ５Ｂｒ。
は１〜１９のものが用いられる。このような４級化試薬
の具体例としては、Ｃ２Ｈ５Ｂｒ。
ＣＩＣ２Ｈ４Ｂｒ、 ＨＯＣ２Ｈ４Ｂｒ１（ＣＨ３）２
ＣＨＢｒ１ＣＨ３（ＣＨ２）１５ Ｂ ｒおよびグリセ
０− ルー、（！、 α’ −ジハロゲンヒドリン（１
，３ジブロム２プロパツール）などをあげることができ
る。水酸基を含有する４級化試薬を用いた場合には、固
定化酵素の活性が他の試薬を用いた場合と比較して増加
し基質との親和性も増すので好ましい。
ＣＨＢｒ１ＣＨ３（ＣＨ２）１５ Ｂ ｒおよびグリセ
０− ルー、（！、 α’ −ジハロゲンヒドリン（１
，３ジブロム２プロパツール）などをあげることができ
る。水酸基を含有する４級化試薬を用いた場合には、固
定化酵素の活性が他の試薬を用いた場合と比較して増加
し基質との親和性も増すので好ましい。
本発明方法によって固定化される酵素に特に限定はない
か、例えばウレアーゼ、インベルターゼなどをあげるこ
とができる。
か、例えばウレアーゼ、インベルターゼなどをあげるこ
とができる。
次に本発明を好ましい実施態様に基いて説明する。
３級窒素を有するポリアミドとしては、前記（１）の式
で示される繰返し単位と（−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＣＨ２−
Ｃｏ−）（ｍは４もしくはｉｏ）で示される繰返し単位
（旧とを含む〔ただしく１）の割合が１０〜１００モル
％である〕アルコールに可溶性の（共重合）ポリアミド
を用いる。
で示される繰返し単位と（−ＮＨ（ＣＨ２）ｍＣＨ２−
Ｃｏ−）（ｍは４もしくはｉｏ）で示される繰返し単位
（旧とを含む〔ただしく１）の割合が１０〜１００モル
％である〕アルコールに可溶性の（共重合）ポリアミド
を用いる。
このポリアミドのエタノール溶液に４級化試薬を加え６
０〜８０℃で１〜４時間加熱還流した後溶液を流延し、
エタノールを蒸発させフィルム状に成形加工する。この
フィルムをｐＨ５〜６の緩衝液に浸し重合体のイオン性
基を平衡にし減圧乾燥して水分を除去する。次いで、必
要に応じて固定化する酵素の等電点と同じｐＨの緩衝液
中に入れ、平衡にせしめる。このように処理されたフィ
ルムを酵素飽和溶液中に４〜２０℃で１２〜７２時間浸
すことによって目的とする酵素固定化物が得られる。
０〜８０℃で１〜４時間加熱還流した後溶液を流延し、
エタノールを蒸発させフィルム状に成形加工する。この
フィルムをｐＨ５〜６の緩衝液に浸し重合体のイオン性
基を平衡にし減圧乾燥して水分を除去する。次いで、必
要に応じて固定化する酵素の等電点と同じｐＨの緩衝液
中に入れ、平衡にせしめる。このように処理されたフィ
ルムを酵素飽和溶液中に４〜２０℃で１２〜７２時間浸
すことによって目的とする酵素固定化物が得られる。
なお、水に可溶なジアルキルアミノ基を有するポリアミ
ド溶液に、グリセロール−α、αパ−／ブロムヒドリン
などの水酸基をもつジハロゲン化物および飽和酵撫溶液
を加え、常温で７〜２４時間穏やかに攪拌すると可溶性
重合体がゲル化し、ゲル状の固定化酵素が得られる。
ド溶液に、グリセロール−α、αパ−／ブロムヒドリン
などの水酸基をもつジハロゲン化物および飽和酵撫溶液
を加え、常温で７〜２４時間穏やかに攪拌すると可溶性
重合体がゲル化し、ゲル状の固定化酵素が得られる。
実施例１゜
前記式（１）においてｎ ＝ ４、Ｒ，＝Ｒ２＝メチル
の繰返し単位３６モル％および前記式（ＩＩ）において
ｍ ＝ ４の繰返し単位６７モル％からなる共重合ポリ
アミド５１を２０ｍ／のエタノールに溶解し、５グのエ
チルブロマイドを加え６０℃で２時間加熱還流した。こ
の溶液をテフロン板上に・広げ常法に従ってフィルム状
物を得た。残留溶媒を水で十分に抽出し蒸留水で洗浄後
、インベルターゼ飽和水溶液中に４℃で２４時間浸し固
定化インベルターゼを得た。固定化インベルターゼは、
Ｚ等電点ｐＨ４，５の緩衝液中４〜１０℃で保存した。
の繰返し単位３６モル％および前記式（ＩＩ）において
ｍ ＝ ４の繰返し単位６７モル％からなる共重合ポリ
アミド５１を２０ｍ／のエタノールに溶解し、５グのエ
チルブロマイドを加え６０℃で２時間加熱還流した。こ
の溶液をテフロン板上に・広げ常法に従ってフィルム状
物を得た。残留溶媒を水で十分に抽出し蒸留水で洗浄後
、インベルターゼ飽和水溶液中に４℃で２４時間浸し固
定化インベルターゼを得た。固定化インベルターゼは、
Ｚ等電点ｐＨ４，５の緩衝液中４〜１０℃で保存した。
調整後、直ちに活性を測定した結果、Ｔ）Ｈ４，５’Ｉ
ｃｍ×１ｃｍのフィルム状インベルターセはＺＯμｍｏ
ｌ／ｍｉｎの速度でしょ糖を分解した。
ｃｍ×１ｃｍのフィルム状インベルターセはＺＯμｍｏ
ｌ／ｍｉｎの速度でしょ糖を分解した。
なお１．サッカロースの定量には、テトラゾリウム法を
使用した。
使用した。
実施例２゜
実施例１においてインベルターゼに代えてウレアーゼを
用い、種々の４級化試薬を使用して同様の実験を行々つ
た。
用い、種々の４級化試薬を使用して同様の実験を行々つ
た。
なお、ウレアーゼの等電点け５．５であるので保存はｐ
Ｈ５，５の０．２Ｍリン酸緩衝液中、４〜１０℃で保存
した。得られた固定化ウレアーゼから１ ｃｍ Ｘ １
ｃｍのフイ・ルム状サンプルを作成し、アンモニア発
生量を測定してウレアーゼ活性を調べた（アンモニア発
生量はインドフェノール法によって定量した）。また各
々の固定化ウレアーゼについてミカエリス定数（ＫＭ）
を求めた（ＫＭが小さいほど基質との親和性が高い）。
Ｈ５，５の０．２Ｍリン酸緩衝液中、４〜１０℃で保存
した。得られた固定化ウレアーゼから１ ｃｍ Ｘ １
ｃｍのフイ・ルム状サンプルを作成し、アンモニア発
生量を測定してウレアーゼ活性を調べた（アンモニア発
生量はインドフェノール法によって定量した）。また各
々の固定化ウレアーゼについてミカエリス定数（ＫＭ）
を求めた（ＫＭが小さいほど基質との親和性が高い）。
これらの結果を第１表に示す。
第 １ 表
４級化試薬 活性ｔ）（μｍｏｌ／ｍ１ｎ） ＫＭ
（ＣＨ３）２ＣＨＢｒ ３．８ １５．３８ＣＨ
３（ＣＨ２）＋５Ｂｒ ２．９ １０．５０Ｃ２Ｈ
５Ｂｒ ６．７ ４．６５ＣＩＣ２Ｈ４Ｂｒ
５．５２ ４．７６ＨＯＣ２Ｈ４Ｂｒ９６３，２
２ 固定化しないウレアーゼ ６，９１
４．３１実施例ろ。
（ＣＨ３）２ＣＨＢｒ ３．８ １５．３８ＣＨ
３（ＣＨ２）＋５Ｂｒ ２．９ １０．５０Ｃ２Ｈ
５Ｂｒ ６．７ ４．６５ＣＩＣ２Ｈ４Ｂｒ
５．５２ ４．７６ＨＯＣ２Ｈ４Ｂｒ９６３，２
２ 固定化しないウレアーゼ ６，９１
４．３１実施例ろ。
前記式（１）においてｎ ＝ ４、Ｒ１＝ Ｒ２＝メチ
ルの繰返し単位からなるポリアミド５ｖをｐＨ７，５の
緩衝液中に溶解し、グリセロール−α、α′−ジブロム
ヒドリン５７を加え、更にｌウレアーゼ飽和溶液２ ｍ
ｌを加え、常温で、９時間穏かに攪拌を続けると、ゲル
状ポリアミド固定化物が得られた。未反応物をｐＨ５，
５の０．２ Ｍ緩衝液で良く洗浄し直ちに活性を測定し
た結果、ゲル（ｗｅｔ ｙ） Ｉ Ｓ’当りｐＨ７，
５において３μｍｏｌ／ｍ ｉ ｎのアンモニアを生成
した。
ルの繰返し単位からなるポリアミド５ｖをｐＨ７，５の
緩衝液中に溶解し、グリセロール−α、α′−ジブロム
ヒドリン５７を加え、更にｌウレアーゼ飽和溶液２ ｍ
ｌを加え、常温で、９時間穏かに攪拌を続けると、ゲル
状ポリアミド固定化物が得られた。未反応物をｐＨ５，
５の０．２ Ｍ緩衝液で良く洗浄し直ちに活性を測定し
た結果、ゲル（ｗｅｔ ｙ） Ｉ Ｓ’当りｐＨ７，
５において３μｍｏｌ／ｍ ｉ ｎのアンモニアを生成
した。
特許出願人 東 し 株 式 会 社３９９−
Claims (1)
- （１）６級窒素を有するポリアミドを４級化し、次いで
これに酵素を結合せしめることを特徴とする酵素の固定
化法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18307881A JPS5886085A (ja) | 1981-11-17 | 1981-11-17 | 酵素の固定化法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18307881A JPS5886085A (ja) | 1981-11-17 | 1981-11-17 | 酵素の固定化法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5886085A true JPS5886085A (ja) | 1983-05-23 |
Family
ID=16129365
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18307881A Pending JPS5886085A (ja) | 1981-11-17 | 1981-11-17 | 酵素の固定化法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5886085A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999043780A1 (en) * | 1998-02-27 | 1999-09-02 | Buckman Laboratories International, Inc. | Enzyme stabilizing polyamide oligomers |
| US8497107B2 (en) | 2008-09-30 | 2013-07-30 | Fresenius Medical Care Holdings, Inc. | Covalently immobilized enzyme and method to make the same |
-
1981
- 1981-11-17 JP JP18307881A patent/JPS5886085A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999043780A1 (en) * | 1998-02-27 | 1999-09-02 | Buckman Laboratories International, Inc. | Enzyme stabilizing polyamide oligomers |
| US8497107B2 (en) | 2008-09-30 | 2013-07-30 | Fresenius Medical Care Holdings, Inc. | Covalently immobilized enzyme and method to make the same |
| US9187744B2 (en) | 2008-09-30 | 2015-11-17 | Fresenius Medical Care Holdings, Inc. | Covalently immobilized enzyme and method to make the same |
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