JPS5853919B2 - シンコウセイブツシツ ｃ２０−１２ ノセイホウ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新抗生物質Ｃ２０−１２の製法に関する。

本発明者らは、新たに発見した放線菌ストレプトミセス
に属するＣ２０−１２生産菌（微工研菌寄第２７３６号
）が、その培養泥中に抗グラム陽姓菌性抗生物質を産生
蓄積することを見出し、その培養物から抗生物質Ｃ２０
−１２物質を採取することに成功した。

本発明はこの知見に基づくもので、新抗生物質Ｃ２０−
１２を生産する能力を有するストレプトミセス・エスピ
ーＣ２０−１２（微工研菌寄第２７３６号）を培養し、
培養物から抗生物質Ｃ２０−１２を採取することを特徴
とする、新抗生物質Ｃ２０−１２の製法である。

本発明に使用される微工研菌寄第２７３６号菌（Ｃ２０
−１２）は下記の菌学的性質を有するストレプトミセス
属に属する１菌株である。

（Ｉ）形態学的性質 栄養菌糸はよく発達し、分岐するが通常は隔壁を有せず
、直径は０．４〜０．８ミクロンで、液体培地たとえば
グルコース・イーストエキス液体培地、トリプトン酵母
エキス培地などで静置または振盪培養した時に桿菌状又
は球菌状に分断せず、培地を混濁させることがない。

気菌糸はスターチ寒天培地、ベネット寒天培地、イース
ト麦芽寒天培地、ＡＴＣＣの胞子形成寒天培地などの各
培地に豊富に着生し、成熟時には外観は粉状を呈し、主
調色は茶灰色である。

顕微鏡では主軸は波状又は直線状で、側枝は互生もしく
は対生であるが、真正の車軸分枝を示さす単軸分枝であ
る。

胞子柄は定型的には２〜３回、時に６回転以上に達する
、やや固く巻いたらせん状で、１０個以上の胞子の連鎖
となる。

胞子の表面は不整で粗い刺状の突起を有する粗面状であ
り、電子線の透過の良好な鞘でおおわれている。

胞子と胞子の境界は一般に不鮮明であるが、円筒形ない
し長円形で、大きさは電子顕微鏡写真によると大体０．
６ＸＯ，８□クロンである。

菌核や胞子嚢、遊走子は見出されないが、菌糸が融合し
た集束菌糸や気菌糸の一部又はほとんどが湿って黒色と
なるものもある。

また全菌体の加水分解物からはＬ−ジアミノピメリン酸
が検出され、メン及びヒドロオキシ−ジアミノピメリン
酸は検出されず、さらにガスクロマトグラフィーによる
脂肪酸の分析でも相違が見出されないのでＣ２０１２号
菌はス１レプトミセス属の１菌株である。

（ＩＩ）培養上の諸性質 実験の方法はイー・ビー・シャーリングラノ報文（イン
ターナショナル・ジャーナル・オフ・システマテイツク
・バクテリオロジ −１６，３１３〜３４０，１９６６
）に準じ、それに付加的に公知の培地及び実験方法も併
せて使用した。

色調の決定にはクセノン標準光源装置を光源とし、標準
色衣ハカラー・ハーモニー・マニュアル第４版（コンテ
ナー・コーポレーション・オフ・アメリカ、シカゴ、１
９５８年）を用いて、一致する色票があれば初めに一般
名を示し、続いて括弧内に色票のコードを併せて記した
。

以下は特記しないかぎシ２８°Ｃ１３週目の各培地上の
生育の状態である。

（１）シュクロース・硝酸塩寒天平板培地（ディフコ・
バクト） 生育：隆起するが、あ１り拡がらない、しわのない中位
の生育でうす黄色（２ｆｂ）。

裏面：透明なため、気菌糸の色に影響され観察できない
。

気菌糸：粉状で良好に着生し、白色ないし明るい灰味赤
茶色（５ｆｅ）ないし茶灰色（５ｉｈ）。

溶性色素：作らない。

その他：生育の色は０．０５Ｎ塩酸又は０．０５Ｎ苛性
ソーダ溶液を加えても変色しない。

（２）グルコース・アスパラギン寒天平板培地生育：隆
起しやや拡がる、しわのｉい良好ｉ生育でうす黄色（２
ｆｂに近似する）。

裏面：透明なため観察できｉい。

気菌糸：ややうすいが粉状で良く着生し、茶灰色（４１
ｉ ）で白色の斑点が存在する。

局部的に湿った小点ができて黒色となる（ハイグロスコ
ピックである）。

（３）グリセリン・アスパラギン寒天平板培地（Ｉｓｐ
＃５） 生育：隆起するが、あまり拡がらない、しわのない中位
ないし良好な生育で、明るい灰黄色（２ｉｃ）。

裏面：全茶色（３ｐｇ）。

気菌糸：粉状で厚く着生し、茶灰色（５ｉｈ）で白色の
小点があり、湿って黒色となる部分が見られる（・・イ
グロスコピツク）。

溶性色素：明るい黄色。

（４）スターチ寒天平板培地（Ｉｓｐ＃４）生育：隆起
するがあ１り拡がらない、しわのない良好な生育でうす
黄色（２ｆｂ）。

裏面：透明なため観察できない。

気菌糸：粉状で旺盛に着生し、明るい茶灰色ないし暗灰
色（３ｐｏ）で、湿った黒い部分がかなり存在する（ハ
イグロスコピック）。

溶性色素：作らない。

（５）チロシン寒天平板培地（Ｉｓｐ ＋ ７ ）生育
：隆起するがあ１り拡がらない、しわのない良好な生育
で、黄茶色（２ｎｅ）。

裏面：黄茶色（２１ｅ）。

気菌糸：粉状で厚く旺盛に着生し、茶灰色（５ｆｅに近
似する）で、明るい灰色の小点とハイグロスコピックな
点とが存在す る。

溶性色素：黄色 （６）栄養寒天培地（ディフコ・バクト）生育：中位、
うす黄色（２ｆｂ）。

裏面；うす黄色（２ｆｂ）。

気菌糸：うすいが良好に着生し、粉状で黄白色。

溶性色素二作らない（非クロモジェニックである）。

（７）イースト・麦芽寒天平板培地（Ｉｓｐ＃２）生育
：隆起し、やや拡がり、しわのない良好ないし旺盛な生
育で黄土色（４ｎｅ）。

裏面：黄土色（４ｎｅ ）。

気菌糸：粉状で厚く旺盛に着生し、汚白色、明るい灰味
赤茶灰色（５ｆｅ）及び暗茶灰色のモザイツク状となる
。

溶性色素：黄色調。

（８）オートミール寒天平板培地（Ｉｓｐ ＃ ８ ）
生育：隆起し、やや拡がる、しわのない旺盛な生育てう
す黄色（２ｆｂ）。

裏面：半透明なため観察不能。

気菌糸：粉状でやや厚く良好に着生する。

明るい灰味赤茶灰色（５ｆｅ）にチョコレート色（５ｎ
ｌ）の部分がモザイツク状に存在する。

溶性色素二作らないか、ｌたはうすい黄色。

（９）グリセリン・硝酸塩寒天培地 生育：はとんど隆起せず、あ１シ拡がらない、しわのな
い中位の生育で全茶色（３ｐｇ）。

裏面：黄茶色（２ｎｅ）ないし全茶色（３ｐｇ）。

気菌糸：粉状でうすいが良好に着生し、白色で部分的に
灰色となる。

酸性色素：黄色。

（１０） グリセリン・リンゴ酸石灰寒天平板培地生
育：しわのない隆起しない、中位の生育で黄茶色（４ｐ
ｉ）。

裏面：黄茶色（４ｐｉ）。

気菌糸：うすく、中位の着生で、粉状白色にとど筐る。

溶性色素：濃黄色。

その他：培地のｐＨはアルカ’Ｊｆｌとなり、リンゴ酸
石灰はかなり溶解する。

（１１） ヘンセンのセルロース寒天平板培地（アル
ヒーフ・フユール・；ミクロビオロギー＼１゜２１４〜
２３１．１９６７） 生育：僅かに生育し、透明でほとんど無色。

裏面：透明で観察不能。

気菌糸：粉状できわめてうすいが、かなり良好に着生し
、湿って黒色となる（・・イグロスコピツク）。

溶性色素二値らない。

その他：培地中の粉末セルロースは透明にならない。

（１２）ベネット寒天平板培地（グルコース・消化カゼ
イン・イースト・牛肉エキス寒天） 生育：隆起するが、あ１り拡がらない、しわのない旺盛
な生育で黄茶色（３ｐｉ）。

裏面：黄茶色（５ｐｉ）ないし濃い茶色（５ｐｉ）。

気菌糸：粉状で厚く旺盛に着生し、明るい灰色、明るい
灰味赤茶灰色（５ｆ６）及び茶灰色（５ｉｈ）のモザイ
ツク状となる。

溶性色素：黄色。

（１３ＮＲＲＬのアスパラギン・デキストロース寒天平
板培地 生育：あ−１拡がらない、しわのない良好な生育でうす
黄色（２ｆｂ）。

裏面：うす黄茶色（２ｇｃ）。

気菌糸：粉状で、やや厚く旺盛に着生し、茶灰色（５ｉ
ｈ）と明るい茶灰色とのモザイツク状となる。

溶性色素：きわめてうすい黄色。

（１４） イースト・スターチ寒天培地生育：あ１り
拡がらない旺盛な生育、明るい灰黄色（２ｉｃ）。

裏面：明るい灰黄色（２ｉｃ）。

気菌糸：粉状でやや厚い旺盛な着生、明るい茶灰色と濃
茶灰色とがモザイツク状になる。

溶性色素：明るい黄色。

（１５１ＡＴＣＣの胞子形成寒天平板培地（ＡＴＣＣ＃
５）生育：やや拡がる、隆起した旺盛な生育で明るい茶
色（３１ｇ）。

裏面：黄茶色（４ｐｉに近似する）。

気菌糸：粉状で厚く旺盛に着生し、明るい灰色、茶灰色
（５ｉｈ）及び濃茶灰色のモザイツク状となる。

溶性色素：黄色。

（Ｌ６）脱脂乳（ディフコ、バク１１０％スキムミルク
） 生育＝（２８°Ｃ）厚い画壇とコロニーを作る、黄色。

（３７℃）厚い画壇、黄ないし濃黄色。

気菌糸：（２８℃）粉状でうずく着生、白色。

（３７’Ｃ）粉状で貧弱に着生、汚白色。

溶性色素：（２８℃）黄色。

（３７’Ｃ）濃黄色。

その他：（２８℃）培地はほとんど中性、完全にペプト
ン化する。

（３７’Ｃ）培地は微アルカリ性、完全にペプトン化す
る。

（ｍ）生理的な諸性質 実 験 結 果 （１）ゼラチンの液化（２５℃） （２）スターチの加水分解 （３）脱脂牛乳の凝固、ペプトン化（ および３７°Ｃ） 陽性 陽性 ２８ 凝固せず ペプトン 化する （４）メラニン様色素の形成 （イ）チロシン寒天培地（Ｉｓｐ ＃ ７ ） 陰
性（ロ）ペプトン・イースト・鉄寒天培地 陰 性（
ディフコ・パクト） （）→メラニン形成寒天培地穿刺 陰性（３ 週目灰黄 色） 陰性 に）トリプトン・イースト液体培地 （Ｉｓｐ ＃ １ ） （（ホ）ゴートン・ミームのチロシン寒天培地 （へ）ゼラチン穿刺（２５°Ｃ） （５）生育温度範囲（イースト・麦芽寒天培地、温度勾
配培養装置による） 陰性 陰性 適温２８ 〜３８°Ｃ 最高５０℃ 実 験 結果 （６）セルロースの分解（ヘンセンのセルロース寒天培
地） （７）硝酸塩の還元 （８）ゴートン・ミームの寒天培地における溶解性 （イ）チロシン（０，４％） （ロ）キサンチン（０，５％） （）→ヒポキサンチン（０，５％） （９）耐塩性（イースト・麦芽寒天培地十〇、４，７，
１０，１３％食塩） （１０）炭素源の利用性（プリドハム・ゴツトリープ基
礎培地を使用した） 無添加（陰性コントロール） Ｄ−’ｆルコース（［ｌｔＥコントローノ０Ｌ−アラビ
ノース Ｄ−キシロース Ｄ−フラクトース シュクロース イノジット Ｌ−ラムノース ラフィノース Ｄ−マンニット セロビオーズ ガラクトース グリセリン ラクトース マルトース マンノース メレチトース メリビオース トレハロース リボース エスクリン（０，５％） サリシン イヌリン アドニット ヅルシット ソルビット 最低２２′Ｃ 陰性 不定 陽性 陰性 弱陽性 ７％１で 生育する が１０％ では生育 しない 什 ストレプト□セスＣ２０−１２号株（微工研菌寄第２７
３６号菌）の主な菌学的性質を要約すると、胞子表面は
粗面状、胞子柄は比較的短いらせん状をなし、胞子の境
界は不鮮明である。

培養上の諸性質としては、栄養菌糸は大体黄色調でｐＨ
の変化により変色せず、気菌糸の代表的な色調は灰色な
いし茶灰色でしばしばモザイツク状をなし、渣た湿って
黒色化する傾向があシ、メラニンは陰性で、グルコース
、キシロース、フラクトース、シュクロース、マンニッ
トを良く利用し、アラビノースとラムノースは生育がや
や劣り、イノジットとラフィノースは利用しない。

公知文献から本菌に類似する菌種としてストレプトミセ
ス・ヒグロスコピクス・（ジエンセン）ワクスマン・ア
ンド・ヘンリッチがあげられる。

バージ−・マニュアル・オプ・デクーミテイーフ・バク
テリオロジー第８版、ザ・ウイアムス・アンド・ウイル
キンス・カンパニー、バルチモア、１９７４年の第７７
１頁及び第７７６頁の記載およびイー・ビー・シャーリ
ングらの報文（インターナショナル・ジャーナル・オフ
・システマテイツク・バクテリオロジ−２２，３０７，
３０９及び３１１，１９７２）と比較すると、新標準株
として提案されているＮＲＲＬ２３８７株はシュクロー
スを利用せず、抗生物質としてはハイグロマイシンを生
産する点で異り、他の性質は良く一致するので本Ｃ２０
−１２号株はストレプトミセス・ヒグロスコピクスのＣ
２０−１２物質を生産する１菌株であると同定された。

本発明を実施するに際しては、一般の放線菌の培養方法
あるいはその改変法を用いうるが、工業的には通気攪拌
培養が有利である。

培養温度は２５〜３５℃が好１１．い。

培地としては放線菌培養に一般に用いられる原料、すな
わち炭素源、窒素源、無機塩類、有機微量成分、消泡剤
などを適宜に組合せたものを使用することができる。

通常は培養時間７２〜１２０時間でＣ２０−１２物質の
産生蓄積量が最大となる。

培養物からのＣ２０−１２物質の採取は、その理化学的
性質を利用して行なわれる。

本物質は脂晦性であるから、各種有機溶媒による抽出法
あるいは各種活性吸着剤によるクロマトグラフィーなど
を用いることにより、目的物質を得ることができる。

たとえば抽出法とクロマトグラフィーを組合わせた分離
法では、濾過助剤たとえばラジオライト７００などを加
えた培養物を濾過し、炉液及び菌体をそれぞれ適当な尋
媒たとえば酢酸エチルなどで抽出する。

菌体抽出液と炉液抽出液を合併し、尋媒を留去した残置
をクロマトグラフィーに付する。

次いで溶出剤として酢酸エチル、エタノールなどを用い
、Ｃ２０−１２物質を溶出する。

この尋出液を減圧濃縮後、残置を適当な酸媒たとえばア
セトン、メタノールなどで処理すると、Ｃ２０−１２の
結晶が析出する。

こうして得られたＣ２０−１２ナトリウム塩の性状は次
のとおシである。

（１）無色針状結晶 （２）融点：２０２〜２０４°Ｃ （３）元素分析： ＣＨＯＮａ 実測値（至） ６２．２３ ８．９８ ２５．７７ ２
．５（４）分子量：９０１（ＶＰＯ法：クロロホルム溶
液）（５）比旋光度： （□’：］Ｌ５ ＋ ２２．６
（ｃ ＝１ 、Ｍｅ ０Ｈ）（６）紫外部吸収スペク
トル：末端吸収 （乃赤外線吸収スペクトル：第１図及び第２図に示す。

（８）ＮＭＲスペクトル：δ（ＣＤＣｌ５）３．３７（
ＣＨ３０、Ｓ ）３．４４（ＣＨ３０ｔ Ｓ ） ３．５４（ＣＨ３０ｊ Ｓ ） （９）ｇ解性：メタノール、エタノール、酢酸エチル、
エーテル、アセトン等に躊解し、水に不醇である。

００）構造式 Ｃ２０−１２物質のナトリウム塩の生物学的活性を示す
と下記のとむりである。

最小発育阻止濃度は寒天希釈法により測定した。

表に示すようにＣ２０−１２物質はダラム陽性菌に対し
て抗菌作用を示す。

実施例 クリセリン２．５％、シュークロース２．５％、大豆粉
２．５％、イース）０．５％及び炭酸カルシウム０．２
％の組成を有する培地（ｐＨ６，８） １００ ｌにＣ
２０−１２生産菌（微工研菌寄第２７３６号）を接種し
、３０’Ｃで９０時間２００１タンクの中で通気攪拌培
養する。

通気量は１００１／分、回転数は２５０回／分とする。

次いで培養液に珪藻±４％を加えて濾過し、炉液と菌体
を分離する。

炉液は酢酸エチル４０１で抽出し、菌体はアセトン３０
Ａで抽出する。

菌体のアセトン抽出液は濃縮してアセトンを除去したの
ち、酢酸エチル２０１で抽出し、この抽出液と炉液より
の抽出液を合併する。

得られた５５１の合併渣を減圧濃縮し、活性アル□＋５
００ｇを酢酸エチルで充填したカラムに吸着させたのち
酢酸エチル−エタノール（９：１）の溶液を流す。

得られた活性区分を合わせて減圧下濃縮乾固した。

次いでクロロホルム０．５１に溶解したのち希水酸化ナ
トリウム液０．１１と振盪し、次いでクロロホルム族を
濃縮すると、ナトリウム塩の粗結晶８ｇが得られる。

これをメタノールー水の混合溶媒より再結晶すると、Ｃ
２〇−１２ナトリウム塩の結晶約６ｇが得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図はＣ２０−１２ナトリウム塩の臭化カリウム錠で
測定した赤外線吸収スペクトル、第２図はＣ２０−１２
ナトリウム塩のクロロホルム溶液中の赤外線吸収スペク
トルを示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ストレプトミセス・エスピーＣ２０−１２を培養し
   、培養物から抗生物質Ｃ２０−１２を採取することを特
   徴とする、新抗生物質Ｃ２０−１２の製法。