JPS5850202B2 - プロトロンピンの製法 - Google Patents
プロトロンピンの製法Info
- Publication number
- JPS5850202B2 JPS5850202B2 JP52134950A JP13495077A JPS5850202B2 JP S5850202 B2 JPS5850202 B2 JP S5850202B2 JP 52134950 A JP52134950 A JP 52134950A JP 13495077 A JP13495077 A JP 13495077A JP S5850202 B2 JPS5850202 B2 JP S5850202B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- prothrombin
- arginine
- plasma
- solution
- agarose
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- Expired
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
プロトロンビンは、血漿中に含まれる分子量約６８００
０の血漿糖蛋白質の一種であり、血液凝固機序における
第一段階の役割をはたすもので、血液凝固機序と深い関
連があり、これを研究するものにとって一度はあつかわ
なければならない物質であり、その定量、純化、分離等
は臨床的意義は非常に高いものである。
０の血漿糖蛋白質の一種であり、血液凝固機序における
第一段階の役割をはたすもので、血液凝固機序と深い関
連があり、これを研究するものにとって一度はあつかわ
なければならない物質であり、その定量、純化、分離等
は臨床的意義は非常に高いものである。
しかしプロトロンビンを物質として血漿より抽出する方
法としては、正本らによる硫酸バリウム吸着ＤＥＡＥ−
セルロースクロマトグラフィー法があるが、操作が繁雑
で収率も非常に低く、到底実用できるものではなかった
。
法としては、正本らによる硫酸バリウム吸着ＤＥＡＥ−
セルロースクロマトグラフィー法があるが、操作が繁雑
で収率も非常に低く、到底実用できるものではなかった
。
そこで、本発明者らは研究を重ね、純度の高いプロトロ
ンビンを収率よく容易に得る本発明を完成した。
ンビンを収率よく容易に得る本発明を完成した。
本発明法は、血漿又は市販プロトロンビン溶液をリジン
−ポリアクリルアミド又はアルギニンアガロースかアル
ギニン−アクリルアミドのカラムを通過させることによ
り高純度のプロトロンビンを製造する方法である。
−ポリアクリルアミド又はアルギニンアガロースかアル
ギニン−アクリルアミドのカラムを通過させることによ
り高純度のプロトロンビンを製造する方法である。
リジン−ポリアクリルアミド、アルギニン−アガロース
及びアルギニン−ポリアクリルアミドは参考例の如き方
法で容易に製造される。
及びアルギニン−ポリアクリルアミドは参考例の如き方
法で容易に製造される。
原料としては血漿でも、種々の蛋白質を夾雑している市
販プロトロンビンでもよい。
販プロトロンビンでもよい。
血漿又は市販プロトロンビン溶液を０．１〜０．４％、
好ましくは０．１〜０．２％の濃度でクロマトグラフィ
ーに付する。
好ましくは０．１〜０．２％の濃度でクロマトグラフィ
ーに付する。
濃度が０．１％以下でも目的は達せられるが、液量が多
くなり好ましいとは言えない。
くなり好ましいとは言えない。
希釈には例えば０．００５Ｍ燐酸緩衝液に塩化ナトリウ
ムを０．７〜１．４％となるように溶解した液が用いら
れ、このときのｐＨは６〜８．５程度であり、７．５附
近が好ましい。
ムを０．７〜１．４％となるように溶解した液が用いら
れ、このときのｐＨは６〜８．５程度であり、７．５附
近が好ましい。
この市販プロトロンビン溶液又は血漿を前述の樹脂カラ
ムに流せば、プロトロンビンが吸着し、これを塩濃度を
変えることにより、プロトロンビンを流出させることが
出来る。
ムに流せば、プロトロンビンが吸着し、これを塩濃度を
変えることにより、プロトロンビンを流出させることが
出来る。
得られるプロトロンビン含有液は凍結乾燥して保存する
こともできる。
こともできる。
普通は、血漿１．５ｍｌに対し、略々１〜２ｒＩ′Ｌｌ
の樹脂を用いるが、市販プロトロンビンの０．１％溶液
では６０ｒｒＬｌに対し、略々１〜２ｍｌの樹脂を用い
るのが適当である。
の樹脂を用いるが、市販プロトロンビンの０．１％溶液
では６０ｒｒＬｌに対し、略々１〜２ｍｌの樹脂を用い
るのが適当である。
次に参考例及び実施例を挙げて本発明を説明し、実験例
により、本発明で得られるプロトロンビンがより高純度
のものであることを説明する。
により、本発明で得られるプロトロンビンがより高純度
のものであることを説明する。
参考例 １
アルギニン−アガロースの樹脂の製造
アガロース（５ｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｂ ） １０１
′Ｌｌにシアン化臭素１１゛を加え攪拌しなから６ＭＮ
ａＯＨを滴下してｐＨ１１前後に漸時保ち、次いで硼酸
緩衝液（ｐＨ８，９）で洗滌する。
′Ｌｌにシアン化臭素１１゛を加え攪拌しなから６ＭＮ
ａＯＨを滴下してｐＨ１１前後に漸時保ち、次いで硼酸
緩衝液（ｐＨ８，９）で洗滌する。
このものに２１のＬアルギニンを含む硼酸緩衝溶液を加
えて５°Ｃで約２時間攪拌し洗滌する。
えて５°Ｃで約２時間攪拌し洗滌する。
更に１．０ＭのＬ−アルギニン硼酸緩衝液を加えて５℃
約２４時間放置する。
約２４時間放置する。
これを水洗して０．５ Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，５）に
貯える。
貯える。
参考例 ２
リジン（又はアルギニン）−ポリアクリルアミドの製法
ポリアクリルアミドゲルに１〜６モルのヒドラジンヒト
ラードを加え、２〜３時間反応させ次いで１／２００Ｍ
燐酸緩衝液（ｐＨ７）で洗滌し、これにｐＨ８〜１１に
おいてリジン（又はアルギニン）を加えて混合し、−液
撹拌反応させる。
ラードを加え、２〜３時間反応させ次いで１／２００Ｍ
燐酸緩衝液（ｐＨ７）で洗滌し、これにｐＨ８〜１１に
おいてリジン（又はアルギニン）を加えて混合し、−液
撹拌反応させる。
その後同じ燐酸緩衝液で洗滌し、０．５Ｍ燐酸緩衝液（
ｐＨ７，５）に貯える。
ｐＨ７，５）に貯える。
実施例 １
血漿１．５ｒ／Ｌｌを参考例で製したアルギニン−アガ
ロース１ ｍｌのカラムに通す。
ロース１ ｍｌのカラムに通す。
次いでこれを０．００５Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，５）に
０．８５％濃度になるよう塩化ナトリウムを加えた液６
．ｏｒｎｌで洗滌する。
０．８５％濃度になるよう塩化ナトリウムを加えた液６
．ｏｒｎｌで洗滌する。
これを０．００５Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，５）に１．０
Ｍ濃度になるように塩化ナトリウムを加えた液６．０
ｍｌで洗滌してプロトロンビン含有溶液を得た。
Ｍ濃度になるように塩化ナトリウムを加えた液６．０
ｍｌで洗滌してプロトロンビン含有溶液を得た。
実施例 ２
０．００５Ｍ燐酸緩衝液に塩化ナトリウムを０．８５％
濃度になるように加え、この液（ｐＨ７５）に市販プロ
トロンビンを加えて０．１％溶液とする。
濃度になるように加え、この液（ｐＨ７５）に市販プロ
トロンビンを加えて０．１％溶液とする。
これを参考例で製したアルギニン−アガロース１ｒｒＬ
ｌのカラムに通し、流出液を実施例１と同様に処理し、
高純度のプロトロンビン含有液を得る。
ｌのカラムに通し、流出液を実施例１と同様に処理し、
高純度のプロトロンビン含有液を得る。
実施例 ３
実施例１におけるアルギニン−アガロースの代りにリジ
ン（又はアルギニン）−ポリアクリルアミドを用い、実
施例１と全（同様にしてプロトロンビン含有溶液を得た
。
ン（又はアルギニン）−ポリアクリルアミドを用い、実
施例１と全（同様にしてプロトロンビン含有溶液を得た
。
実験例 １
実施例１または実施例３で得たプロトロンビン含有液０
．１ ｍｌに０．２％フィブリノーゲン０．２ｒｎｌを
加えておき、これにリオプラスチン「モチダ」１号１管
を１．ｏｗＬｌの０．０１Ｍ塩化カルシウム液に溶解し
た溶液の０．２ ｍｌを３７℃の温浴中で２分間加温後
吹込む。
．１ ｍｌに０．２％フィブリノーゲン０．２ｒｎｌを
加えておき、これにリオプラスチン「モチダ」１号１管
を１．ｏｗＬｌの０．０１Ｍ塩化カルシウム液に溶解し
た溶液の０．２ ｍｌを３７℃の温浴中で２分間加温後
吹込む。
同時にストップウォッチを始動させ、フィブリン膜の形
成の瞬間までの時間を計り、プロトロンビン時間とする
。
成の瞬間までの時間を計り、プロトロンビン時間とする
。
このプロトロンビン時間より標準曲線を用いてプロトロ
ンビン値を求めた。
ンビン値を求めた。
対照として、実施例１で用いたと同じ血漿５ｒ／Ｌｌに
硫酸バリウム１′？をよく混和し、３０００ｒｐｍで１
０分遠心分離し、０．０２Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５，
１）で２回洗滌し、５％クエン酸ナトリウム２．５ ｒ
ｒＬｌで溶出し、蒸留水で５１ｒＬｌとしたものを用い
た。
硫酸バリウム１′？をよく混和し、３０００ｒｐｍで１
０分遠心分離し、０．０２Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５，
１）で２回洗滌し、５％クエン酸ナトリウム２．５ ｒ
ｒＬｌで溶出し、蒸留水で５１ｒＬｌとしたものを用い
た。
この結果得られたプロトロンビン活性度を第１表及び第
２表に表す。
２表に表す。
実験例 ２
実施例２で得たプロトロンビン含有液のプロトロンビン
活性を実験例１と同様に測定し、対照として市販プロト
ロンビンを同濃度に希釈したものを用いた。
活性を実験例１と同様に測定し、対照として市販プロト
ロンビンを同濃度に希釈したものを用いた。
この結果得られた活性度（％）はアルギニン−アガロー
スを通したものが１３０％であり、対照は１１０％であ
った。
スを通したものが１３０％であり、対照は１１０％であ
った。
実験例 ３
実施例１または実施例３で得られたフラクションＱ、
ｌ ｍｌを保存血漿（４℃２５日保存）０．９ｍｌに加
えた後、この０．１ ｍｌを３７℃に温め、リオプラス
チン「モチダ」１号を０．０１Ｍ塩化カルシウム１、ｏ
ｒｎｌに溶解した溶液０．２ ｍｌを吹き込み、同時に
ストップウォッチを始動させ、フィブリン膜の形成の瞬
間までの時間を計り、第５因子活性基準希釈線より第５
因子活性度を測定する。
ｌ ｍｌを保存血漿（４℃２５日保存）０．９ｍｌに加
えた後、この０．１ ｍｌを３７℃に温め、リオプラス
チン「モチダ」１号を０．０１Ｍ塩化カルシウム１、ｏ
ｒｎｌに溶解した溶液０．２ ｍｌを吹き込み、同時に
ストップウォッチを始動させ、フィブリン膜の形成の瞬
間までの時間を計り、第５因子活性基準希釈線より第５
因子活性度を測定する。
対照として血漿０．１ ｒｕｌを保存血漿０．９ ｍｌ
！に加えたものを用いる。
！に加えたものを用いる。
結果を第３表及び第４表に示す。
実施例 ４
市販プロトロンビン中に含有されている実際のプロトロ
ンビン量を蛋白量より換算してみるために、実施例１で
カラムを通す前後において２８０ｍμにおける吸光度か
ら蛋白量を測定し、蛋白比活性を求めたところ、カラム
通過後の蛋白比活性は約１５％減少していた。
ンビン量を蛋白量より換算してみるために、実施例１で
カラムを通す前後において２８０ｍμにおける吸光度か
ら蛋白量を測定し、蛋白比活性を求めたところ、カラム
通過後の蛋白比活性は約１５％減少していた。
この結果より、血漿中のプロトロンビンはアルギニン−
アガロース又はポリアクリルアミドのカラムを通すこと
により、凝固因子のうちでプロトロンビンと共に動きや
すい第５因子及び第１０因子を除去することが出来、更
に市販プロトロンビンには他の蛋白質が８０％以上混在
しており、これをプロトロンビンとして用いるか或いは
測定用に用いるのは非常に危険を伴うのであるが、本発
明方法で血漿よりプロトロンビンを製造することにより
プロトロンビン濃度を約３０％まで引き上げることが出
来た。
アガロース又はポリアクリルアミドのカラムを通すこと
により、凝固因子のうちでプロトロンビンと共に動きや
すい第５因子及び第１０因子を除去することが出来、更
に市販プロトロンビンには他の蛋白質が８０％以上混在
しており、これをプロトロンビンとして用いるか或いは
測定用に用いるのは非常に危険を伴うのであるが、本発
明方法で血漿よりプロトロンビンを製造することにより
プロトロンビン濃度を約３０％まで引き上げることが出
来た。
これらのことにより、本発明は極めて優れたプロトロピ
ンの製法であることが明らかになった。
ンの製法であることが明らかになった。
Claims (1)
- １ 血漿よりプロトロンビンを製する方法において、血
漿をリジン−ポリアクリルアミド、アルギニン−アガロ
ース又はアルギニン−ポリアクリルアミドのカラムを通
過させることを特徴とするプロトロンビンの製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP52134950A JPS5850202B2 (ja) | 1977-11-10 | 1977-11-10 | プロトロンピンの製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP52134950A JPS5850202B2 (ja) | 1977-11-10 | 1977-11-10 | プロトロンピンの製法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10354173A Division JPS5331207B2 (ja) | 1973-09-13 | 1973-09-13 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5366410A JPS5366410A (en) | 1978-06-13 |
| JPS5850202B2 true JPS5850202B2 (ja) | 1983-11-09 |
Family
ID=15140343
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP52134950A Expired JPS5850202B2 (ja) | 1977-11-10 | 1977-11-10 | プロトロンピンの製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5850202B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0700682A3 (de) * | 1994-08-26 | 1996-05-29 | Behringwerke Ag | Arzneimittel, enthaltend Prothrombin zur Antagonisierung von Blut-Anticoagulanzien |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0219400A (ja) * | 1988-07-07 | 1990-01-23 | Green Cross Corp:The | トロンビンまたはプロトロンビンの製造方法 |
-
1977
- 1977-11-10 JP JP52134950A patent/JPS5850202B2/ja not_active Expired
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0700682A3 (de) * | 1994-08-26 | 1996-05-29 | Behringwerke Ag | Arzneimittel, enthaltend Prothrombin zur Antagonisierung von Blut-Anticoagulanzien |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5366410A (en) | 1978-06-13 |
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