JPS5843080B2 - 血液凝固能検査用診断剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は人間または動物起源のトロンボ−′ゲン組織特
Ｏこ人間の胎盤組織から得られるトロンボプラスチン、
およびカルシウムイオンから成る血液凝固能検査用診断
剤に関する。

更に、本発明は標準化された因子■および因子Ｘに感受
性のトロンボプラスチンをトロンボーゲン組織から収得
する方法に関する。

本発明はまた更にカルシウムイオン含有トロンボプラス
チンの安定剤に関する。

外生的凝固系障害の検査試験は１９３７年に初めて報告
されたクイック（Ｑｕ ｉｃｋ ）による−投法凝固時
間試験である。

凝固因子■、ｘ、ｖ、ｎおよびＩの共同作用に基づく外
因的凝固系の機能は、トロンボプラスチンと呼ばれる、
温血動物臓器からの標準化された組織抽出物を添加する
ことにより測定される。

トロンボプラスチンの作用の下に凝固因子■（プロコン
パ−チン）が活性化され、それが因子Ｘ（スチュアート
ープロワー−Ｆ）をその活性型に変える。

カルシウムイオンの存在下ではホスフォリピドおよび活
性化された因子Ｘおよび■（アクセレリン）から活性な
酵素−リピド錯体が生じそれはまたそれで因子■（プロ
トロンビン）をその活性型であるトロンビンに変える。

血漿の因子Ｉ（フィブリノーゲン）はトロンビン量の生
成速度に比例してフィブリンに変えられる。

その際測定される供試血漿の凝固時間（秒）は凝固能の
評価に関連づけられる。

いわゆるクイック値は、外生的凝固系に参画する因子の
先天性または後天性不足状態を明らかにするのに適して
いる。

更に、−投法凝固時間測定により経口抗凝血素治療の監
視が可能である。

そのために用いられるトロンボプラスチンに対しては外
因的凝固系の凝固因子特にトロンビンを含まないこと、
しかも一方これらの因子に対して高い感受性を示すこと
が本質的な品質基準である。

高活性トロンボプラスチンの製造法については、数次に
わたり文献に記載されている。

これに対しては一部、入間の胎盤が出発材料として用い
られる。

しかしながら、因子■および因子Ｘ感受性のトロンボプ
ラスチンかトロンボーゲン組織特に胎盤から収得できる
ことはこれまで知られていない。

新鮮で洗浄された胎盤組織を出発物質とする既知のトロ
ンボプラスチン製造方法においては、一般に水性抽出液
が用いられる。

別のトロンボプラスチン製造方法は組織ホモゲネートを
水性エタノールまたはフェノールを用いて抽出すること
から成る。

これらの方法の場合はすべてｐＨ値は中性ないし弱アル
カリ性に維持される。

しかしながらこれらの方法により得られたトロンボプラ
スチン調製物は種種の安定化手段例えば紫外光による処
理または空気遮断下での保存などにかかわらず限られた
貯蔵能および使用能を示すにすぎない。

それはトロンビンを完全には不含有でなく、また特に、
正常凝固像と病理学的凝固像との間の正確な差異を保証
するには因子■およびＸに対する感受性が充分でない。

今般、因子■および因子Ｘ感受性のトロンビン不含有ト
ロンボプラスチンを含有し、当該トロンボプラスチンは
血液不含有に洗浄されたトロンボーゲン組織の水性懸濁
液から１０〜１２のｐＨ値で１５分ないし４８時間３０
℃〜１℃で抽出しく最高温度Ｏこは最短抽出時間および
最低温度には最長抽出時間が対応しそしてその中間（こ
位する値は適宜調整できる）そして弱酸性ｐＨ域で処理
後前記組織から分離したものであることを特徴とするト
ロンボプラスチンおよびカルシウムイオン含有する血液
凝固能検査用診断剤を用いた場合には、前述のトロンボ
プラスチン調製物に伴なう欠点は生じないことを見出し
た。

抽出を１１．４〜１１．８のｐＨ値で好ましくは３０℃
で１５分、２２℃で３０分または４℃で少なくとも２０
時間の温度一時間組合せで行ないそしてその組織を抽出
溶液を分離する前に、４，５〜７．０好ましくは６．０
〜６．４のｐＨ値で更に処理すると特に感性のあるトロ
ンボプラスチンか得られる。

この方法で得られたトロンボプラスチンにカルシウムイ
オンを水溶性カルシウム塩有利には塩化カルシウムの形
で添加する。

更にまた、コラン酸好ましくはデスオキシコール酸また
はコール酸および水溶性重金属塩例えばＵＯ２＋十塩、
Ｚｎ＋十塩、Ｎ ｉ＋＋ｔ！特にマンガン（■連灯まし
くは塩化マンガン（ＩＩ）を添加することにより著しい
貯蔵安定性が得られることを見出した。

本発明の診断剤を凍結乾燥に適したものとする特に良好
な安定性は糖アルコールの添加、例えばマンニットまた
はソルビットまたは単糖類または三糖類の添加（こより
得られる。

前記添加物の最適重量比はマンニット：デスオキシコー
ル酸：塩化マンガン（Ｉｆ）＝３００：３：１により与
えられ、その際塩化マンガン（１）は溶液中（こ１０−
３〜ｌ０−４モル好ましくは５Ｘ ｌ Ｏ”−４モルの
濃度で存在する。

このような蒸留水に容易に再懸濁できる診断剤は、溶液
として貯蔵する間、３７℃で１０時間まで完全に活性に
保つことができ、また２０°Ｃでは少なくとも２日間維
持することができる。

凍結乾燥した形では、冷蔵庫（約４℃）で２年間にわた
って貯蔵しても活性低下は全く認められない。

活性の最も強い因子■感受性トロンボプラスチンは人間
の脳から得られる。

同じく、より高い活性のトロンボプラスチンを含有する
一層入手の容易な材料は人間の胎盤である。

トロンボプラスチン活性が徐徐に低下する順でいうと、
更に猿の脳、家兎の脳、家兎の肺、牛および豚の脳が挙
げられよう。

本発明により、例えば次の操作によってクイックによる
一段法凝固時間の測定を可能にする診断剤が得られる。

凝固生理学的に検査すべきシトレートまたはオキザレー
ト血漿０．１ ｒｕｌを３７℃に予熱した試験管にピペ
ットでとる。

３０秒のインキュベーション時間の後、本発明により人
間の胎盤から得たカルシウム−トロンボプラスチンの予
め加温された水性懸濁液０，２−を添加しそして凝固開
始をこの時点から測定する。

そのようにして得られた被験者血漿の凝固時間を少なく
とも５人の健康給血者の血液を混合したものの血漿の凝
固時間と対比する。

これにはその混合血漿を希釈しない場合の外に更に１：
２，１：４および１：１０の希釈度で被験者血漿（こつ
いて記載したのと同様の方法で本発明によるカルシウム
−トロンボプラスチンとインキュベートし、そして得ら
れる凝固時間を横軸にとりそして希釈度の逆値を縦軸に
とると、それより直線状斜線の標準曲線が得られる。

横軸の被験者血漿の凝固時間から出発して標準曲線に対
する切点を見出し、そして縦軸上の相当する逆値を読み
取る。

次の換算により正常な混合血漿に対する被験者血漿の凝
固時間の％値を計算する。

１：縦軸（ｉＸ１００＝凝固活性の筒底（正常値に対す
る％値） 例えば次表に挙げた正常な混合血漿の血漿希釈度を得ら
れる凝固時間に対しプロットすれば標準曲線が得られる
。

典型的な因子■欠乏血漿は約５８秒の凝固時間となる。

それは標準曲線により正常の約１２％に相当、する。

病理学的血漿および標準化された混合血漿の凝固時間の
商（いわゆるプロトロンビン比）はトロンボプラスチン
の感受性の尺度をなす。

この商が太きければ犬さい程そのトロンボプラスチンは
凝固欠陥の検査解明に適している。

本発明の場合そのプロトロンビン比は約５であることが
わかる。

このプロトロンビン比は、本発明による診断剤は病理学
的凝固状態特に因子■欠乏の状態の解明に著しく適して
いることを示している。

本発明により診断剤を家兎の脳、家兎の肺臓または豚の
胎盤から得た場合、正常な混合血漿に対してはクイック
による一段法凝固時間測定法により次表に掲げる値が与
えられる。

本発明を更に実施例により説明する。

実施例 １ １５に２の凍結した入間の胎盤を肉切刻器を用いて微細
化する。

その胎盤ホモゲネートを１８回１２０１の０．９％塩化
ナトリウム溶液を用いて＋１０℃で洗浄しそして各洗浄
過程で沈降および傾瀉により洗浄水を除去する。

その際、最後の上澄は無色である。

この方法により洗浄した胎盤ホモゲネートを３０分３０
００ｙで遠心分離することにより残留洗浄水を除去する
。

その湿った沈降物を凍結乾燥装置で３０時間、残留水分
５％となるまで乾燥する。

乾燥物質収量は約１５に２である。その血液不含有（こ
洗浄された乾燥胎盤組織１．５に２を３０Ｉｌの蒸留水
に浮遊させそして１０分間１０℃の温度でホモゲナイザ
−（Ｊａｎｋｅ ｕｎｄＫｕｎｋｅ１社製Ｕｌ ｔｒａ
−Ｔｕｒ ｒａｘ 、 １００ ／２１！ａ！！ ）
を用いて微細化する。

次いでｐＨ値が１１．５に調整されるだけの（約２１０
７ｄ）５Ｎ苛性ソーダを激しく攪拌しながら添加する。

その混合物を２５分間攪拌し次いで５Ｎ塩酸（約２１０
ｍ１）を添加することにより６．６のｐＨ値とする。

次いで前記ホモゲナイザー装置による混合物の第二回目
の処理を３０分間にわたって行なう。

組織残留物を３０００ｇでの遠心分離する。

ここで２０７のトロンボプラスチンか得られる。

各１１のトロンボプラスチンに対し１．１９の塩化カル
シウム、３０ｆＩのマンニット、０．３ｐのデスオキシ
コール酸および０．１９の塩化マンガン（ＩＩ）四水塩
を添加する。

そのｐＨ値を少量の塩酸または苛性ソーダの添加により
正確に６．３に調節し、次いで各２． Ｏｒｎｌの分注
体として凍結乾燥する。

凍結乾燥の間、トロンボプラスチンの何らの活性低下も
おこさない。

実施例 ２ 家兎の脳の灰色物質を既知方法で得、０．９％ＮａＣ１
ｊ溶液を用いて血液不含有に洗浄する。

この洗浄過程は残留ヘモグ陥ビン含有量の測定を経て分
光光度測定により調整する。

次いで、未だ湿っている脳組織１２０ｐに４００−の蒸
留水を注ぎそして１０分間１０℃で実験室用ホモゲナイ
ザ−（Ｊａｎｋｅ ＆ Ｋｕｎｋｅ１社製）を用いて
微細化する。

次いで５Ｎ ＮａｏＨを用いてｐＨ値を激しく攪拌しな
がら１１．６に調節し、その混合物を２５分間そのよう
に放置する。

次いで５ＮＨＣ１ｌを用いてｐＨ値を６．４に調節し、
軽く冷却しながら上記装置を用いて３０分間改めてホモ
ゲナイズする。

次いでその組織を３０００ｇの遠心分離しそしてトロン
ボプラスチン含有上澄（２８０ｒＩＬｌ）を傾瀉により
得る。

各１００ｍ１のトロンボプラスチンを０．１ｐの塩化カ
ルシウム、３．０ｐのソルビット、３０ｍ９のデスオキ
シコール酸、１４■の硫酸亜鉛（７Ｈ２０）と混合する
。

そのトロンボプラスチンのｐＨ値を正確に６．３に調節
しそして２ＴＬｌずつ分注して凍結乾燥する。

実施例 ３ ２４０９の血液不含有に洗浄された豚の胎盤に４００継
の蒸留水を注ぎそして１０分間１０°Ｃで実験室用ホモ
ゲナイザ−（Ｊａｎｋｅ ＆ Ｋｕｎｋｅ１社製）を
用いて微細化する。

次いで５Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨ値を激しく攪拌しな
がら１１６に調節しそしてその混合物を２５分間そのま
ま放置する。

次いでそのｐＨ値を５ＮＨＣＪを用いて６．４（こ調節
しそして軽く冷却しながら上記装置を用いて３０分間新
たにホモゲナイズする。

次にその組織を３０００ｇで遠心分離し、トロンボプラ
スチン含有上澄（２５０ｍ１）を傾瀉により得る。

各１００ｙｄのトロンボプラスチンを０．１ｇの塩化カ
ルシウム、３．０９のマンニット、０．３９のデスオキ
シコール酸、０．１ｇの塩化マンガン（Ｉ）Ｘ４Ｈ２０
と混合する。

そのトロンボプラスチンのｐＨ値を正確Ｏこ６３に調節
しそして２ｒｕｌずつ分注して凍結乾燥する。

以下に本発明により開示された新規な技術的事項を要約
して示す。

１、血液不含有に洗浄されたトロンボーゲン組織の水性
懸濁液から１０〜１２のｐＨ値で１５分〜４８時間３０
°Ｃ〜１°Ｃで抽出しくその際最高温度には最短抽出時
間および最低温度には最長抽出時間が対応しそしてその
中間に位する値は適宜調整される）そして弱酸性ｐＨ域
で処理後前記組織から分離した、因子■および因子Ｘ感
受性のトロンビン不含有トロンボプラスチンを含有する
ことを特徴とする、トロンボプラスチンおよびカルシウ
ムイオンからなる血液凝固能検査用診断剤。

２、前記抽出を１１．４〜１１．８のｐＨ値で、好まし
くは３０°Ｃで１５分、２２℃で３０分または４℃で少
なくとも２０時間の温度一時間組合せで行なう前記第１
項による診断剤。

３、抽出溶液の分離前に組織を４．５〜７．０好ましく
は６．０〜６，４のｐＨ値で更に処理する前記第１また
は２項による診断剤。

４、前記トロンボーゲン組織が人間または動物起源の脳
または胎盤組織である前記１〜３項による診断剤。

５、安定剤としてコラン酸および水溶性重金属（ＩＩ）
塩を含有する前記第１〜４項による診断剤。

６、添加剤として糖アルコール、単糖類または三糖類を
含有する前記第１〜５項による診断剤。

７、安定剤としてデスオキシコール酸および塩化マンガ
ン（１）を含有する前記第１〜６項による診断剤。

８、添加剤としてマンニットを含有する前記第１〜７項
による診断剤。

９、マンニット、デスオキシコール酸および塩化マンガ
ン（ＩＩ）を３００：３：１の重量比で含有する前記第
１〜８項による診断剤。

１０、前記塩化マンガン（１）を溶液中に１０−３〜１
０−’Ｍの濃度で存在させる前記第９項による診断剤。

１１、コラン酸および水溶性重金属（Ｉ［）塩を含有す
ることを特徴とする、トロンボプラスチンおよびカルシ
ウムイオンを含有する血液凝固能検査用診断剤の安定化
剤。

１２、血液不含有に洗浄されたトロンボーゲン組織の水
性懸濁液を１０〜１２のｐＨ値で１５分〜４８時間３０
℃〜１℃で苛性アルカリを用いて抽出しくその際最高温
度Ｇこは最短抽出時間および最低温度には最長抽出時間
が対応しそしてその中間（こ位する値は適宜調整される
）そしてその抽出液を弱酸性ｐＨ域で処理後前記組織か
ら分離することを特徴とする、因子■および因子Ｘ感受
性のトロンビン不含有トロンボプラスチンおよびカルシ
ウムイオンを含有する血液凝固能検査用診断剤の製造方
法。

１３、前記抽出を１１．４〜１１８のｐＨ値で３０℃で
１５分、２２℃で３０分または４℃で少なくとも２０時
間の温度一時間組合せで行なう前記第１２項（こよる方
法。

１４、前記抽出液の分離前に前記組織４．５〜７．０好
ましくは６０〜６．４のｐＨ値で更に処理する前記第１
２〜１３項による方法。

１５、血液凝固能検査用診断剤としての前記第１項によ
る剤の使用。

１６、トロンボプラスチンおよびカルシウムイオンを含
有する血液凝固能検査用診断剤の安定剤としてのフラン
酸および水溶性重金属（ＩＩ）塩の使用。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 血液不含有に洗浄されたトロンボーゲン組織の水性
   懸濁液から１０〜１２のｐＨ値で１５分〜４８時間３０
   ℃〜１℃で抽出しくその際最高温度には最短抽出時間お
   よび最低温度（こは最長抽出時間が対応しそしてその中
   間に位する値は適宜調整される）そして弱酸性ｐＨ域で
   処理後前記組織から分離した因子■および因子Ｘ感受性
   のトロンビン不含有トロンボプラスチンを含有すること
   を特徴とする、トロンボプラスチンおよびカルシウムイ
   オンからなる血液凝固能検査用診断剤。 ２ 血液不含有に洗浄されたトロンボーゲン組織の水性
   懸濁液を１０〜１２のｐＨ値で１５分〜４８時間３０’
   Ｃ〜１℃で苛性アルカリを用いて抽出しくその際最高温
   度（こは最短抽出時間および最低温度には最長抽出時間
   が対応しそしてその中間に位する値は適宜調整される）
   そしてその抽出液を弱酸性ｐＨ域で処理後前記組織から
   分離した因子■および因子Ｘ感受性のトロンビン不含有
   トロンボプラスチンおよびカルシウムイオンを含有しそ
   して更に糖アルコールおよび水溶性重金属（ＩＩ）塩な
   らびに所望によりコラン酸を含有することを特徴とする
   、トロンボプラスチンおよびカルシウムイオンを含有す
   る安定化された血液凝固能検査用診断剤。