DE2356493B2 - Verfahren zur herstellung eines thromboplastins und diagnostisches mittel zur kontrolle der gerinnungsfaehigkeit des blutes - Google Patents

Verfahren zur herstellung eines thromboplastins und diagnostisches mittel zur kontrolle der gerinnungsfaehigkeit des blutes

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DE2356493B2 DE19732356493 DE2356493A DE2356493B2 DE 2356493 B2 DE2356493 B2 DE 2356493B2 DE 19732356493 DE19732356493 DE 19732356493 DE 2356493 A DE2356493 A DE 2356493A DE 2356493 B2 DE2356493 B2 DE 2356493B2
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Description

waschenem thrombogenem Gewebe mit einer Alkali- des erfindungsgemäß aus menschlichen Plazenten lauge bei einem pH-Wert zwischen 10 und 12 für gewonnenen Calcium-Thrombop'astins zugegeben und
15 Minuten bis 48 Stunden bei 30 bis 1°C, wobei die der Gerinnungseintritt von diesem Zeitpunkt an bekürzeste Extraktionszeit der höchsten Temperatur stimmt. Die so erhaltene Gerinnungszeit des Proban-
und die längste Extraktionszeit der niedrigsten Tempe- 5 denplasmas wird mit einer Gerinnungszeit eines
ratur und die dazwischenliegenden Werte sinngemäß Plasmas als Mischung von mindestens fünf gesunden
zuzuordnen sind, extrahiert und den Extrakt nach Spendern in Beziehung gesetzt. Hierzu wird das
einer Behandlung im schwachsauren pH-Bereich vom Mischplasma unverdünnt, ferner in einer Verdünnung
Gewebe abtrennt. 1 : 2, 1 : 4 und 1 : 10 in der gleichen Weise wie für
Ein besonders empfindliches Thrombop!astin wird io das Probandenplasma beschrieben, mit dem erfin-
erhalten, wenn die Extraktion bei einem pH-Wert dungsgemäßen Calcium-Thromboplastin inkubiert und
zwischen 11,4 und 11,8 vorzugsweise in den Tempe- die resultierenden Gerinnungszeiten als Abszisse den
ratur-Zeit-Kombinationen 15 Minuten bei 30° C, reziproken Werten der Verdünnungen als Ordinate
30 Minuten bei 22°C oder mindestens 20 Stunden bei zugeordnet, woraus sich eine geradlinige steile Stan-
4° C erfolgt und das Gewebe vor Abtrennung der 15 dardkurve ergibt. Von der Gerinnungszeit des Pro-
Extraktionslösung bei pH-Werten von 4,5 bis 7,0, bandenplasmas auf der Abszisse ausgehend, wird der
vorzugsweise von pH 6,0 bis 6,4, nachbehandelt wird. Schnittpunkt auf der Standardkurve ermittelt und der
Als thrombogenes Gewebe wird bevorzugt Hirn- entsprechende reziproke Wert auf der Ordinate ab- oder Plazentengewebe menschlichen oder tierischen gelesen. Durch folgende Umrechnung wird der ProUrsprungs verwendet. ao zentwert der Gerinnungszeit des Probanden- in bezug
Das erfindungsgemäße diagnostische Mittel zur auf ein normales Mischplasma errechnet:
Kontrolle der Gerinnungsfähigkeit des Blutes ent- 1: Wert des Ordinatenabschnittes · 100 = %-Wert
haltend Thromboplastin und Calcium-Ionen ist da- der Gerinnungsaktivität als %-Wert der Norm,
durch gekennzeichnet, daß es ein Faktor-VII- und Werden beispielsweise die in der folgenden Tabelle
Faktor-X-empfindliches, thrombinfreies Thrombo- as angeführten Plasmaverdünnungen eines normalen
plastin enthält, das nach dem oben beschriebenen Ver- Mischplasmas den resultierenden Gerinnungszeiten
fahren hergestellt worden ist. zugeordnet, läßt sich die Standardkurve erstellen.
Dem diagnostischen Mittel kann eine hervorragende
Lagerstabilität verliehen werden durch Zusatz einer Plasma-Verdünnung Konzen- 1:2 1:4 1:10
Cholansäure, vorzugsweise Desoxycholsäure oder 30 triert
Cholsäure, und eines wasserlöslichen Schwermetall-
salzes, wie UO2 4+-, Zn++-, Ni++-Salze, insbesondere Gerinnungszeiten 11,5 17,0 30,4 81,3
eines Mangan(II)-Salzes, vorzugsweise Mangan(II)-
Chlorid. Ein typisches Faktor-VII-MangelpIasma führt zu
Eine besonders gute Stabilität, die das diagnostiche 35 einer Gerinnungszeit von etwa 58 Sekunden. Das entMittel auch zur Gefriertrocknung geeignet macht, spricht laut Standardkurve etwa 12% der Norm,
wird durch Zusatz eines Zuckeralkohols, beispiels- Ein Maß für die Empfindlichkeit des Thromboweise Mannit oder Sorbit, oder von Mono- oder plastins bildet der Quotient aus der Gerinnungszeit Disacchariden erreicht. eines pathologischen Plasmas und eines standardi-
Ein optimales Gewichtsverhältnis der Zusätze ist 40 sierten Mischplasmas — die sogenannte »Prothrombin-
durch Mannit: Desoxycholsäure : Mangan(II)-Chlorid Ratio«. Je größer dieser Quotient wird, um so ge-
= 300 : 3 : 1 gegeben, wobei das Mangan(II)-Chlorid eigneter ist das Thromboplastin zum Aufdecken eines
in der Lösung ΙΟ"3- bis 10-*molar, vorzugsweise gesuchten Gerinnungsdefektes. Im vorliegenden Fall
5 · 10-4molar, vorliegt. ergibt sich die Prothrombin-Ratio mit etwa 5. Diese
Ein solches in destilliertem Wasser leicht resuspen- 45 Prothrombin-Ratio erweist, daß das diagnostische
dierbares diagnotisches Mittel ist während einer Mittel nach der vorliegenden Erfindung sich für die
Lagerung als Lösung bei 37° C bis zu 10 Stunden voll Aufdeckung pathologischer Gerinnungszustände ins-
aktiv und bei 20° C mindestens 2 Tage haltbar. In der besondere von Faktor-VII-Mangel hervorragend eignet, gefriergetrockneten Form ist bei einer Lagerung im Werden gemäß der Erfindung die diagnostischen
Kühlschrank (etwa 4°C) über 2 Jahre kein Aktivitäts- 50 Mittel aus Kaninchenhirn, Kaninchenlunge oder
abfall feststellbar. Schweineplazenten gewonnen, so ergeben sich für
Die aktivsten Faktor-VIT-empfindlichen Thrombo- ein normales Mischplasma bei der Bestimmung der
plastine sind aus menschlichem Hirn zu gewinnen. Einphasengerinnungszeit nach Quick die in der
Ein leichter zugängliches Material, das ebenfalls folgenden Tabelle zusammengestellten Werte:
Thromboplastine hoher Aktivität enthält, sind mensch- 55
liehe Plazenten. In der Reihenfolge abnehmender Konzen- 1:2 1:4 1:10
Thromboplastin-Aktivität seien noch Affenhirn, Ka- triert
ninchenhirn, Kaninchenlunge, Rinder- und Schweinehirn angeführt. Kaninchenhirn 16,5 24,8 43,1 111,2
Ein gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltenes 60 Kaninchenlunge 10,2 14,2 22,4 52,5
diagnostisches Mittel erlaubt beispielsweise nach Schweineplazenten 27,1 41,4 66,5 210,0
folgender Methode eine Bestimmung der Einphasen-
Gerinnungszeit nach Quick: Die Erfindung soll nachstehend an Beispielen er-
0,1 ml eines gerinnungsphysiologisch zu unter- läutert werden.
suchenden Citrat- oder Oxalatplasinas wird in ein auf 65 B e i s η i e 1 1
37° C vorgewärmtes Reagenzröhrchen pipettiert. Nach
einer Inkubationszeit von 30 Sekunden werden 0,2 ml 1.5 kg gefrorene menschliche Plazenten werden
der ebenfalls vorgewärmten wäßrigen Suspension mitiels eines Fleischhackers zerkleinert. Das Plazenten-
homogenat wird lSmal mit je 1201 einer 0,9 %igen über die Bestimmung des Rest-Hämoglobingehaltes Natriumchloridlösung bei +10° C gewaschen und bei spektralphotometrisch kontrolliert,
jedem Waschvorgang durch Sedimentation und De- Danach werden 120 g des noch feuchten Hirnkantation das Waschwasser entfernt. Der letzte gewebes mit 400 ml aqua dest. übergössen und 10 Mi-Überstand ist dann farblos. Das auf diese Weise ge- 5 nuten bei 1O0C mit einem Laborhomogenisator waschene Plazentenhomogenat wird 30 Minuten durch (Janke & Kunkel) zerkleinert. Danach wird mit Zentrifugation bei 3000 g vom restlichen Waschwasser 5 n-NaOH der pH-Wert unter kräftigem Rühren auf befreit. Das feuchte Sediment wird 30 Stunden in einer 11.6 gestellt und das Gemisch 25 Minuten so belassen, geschlossenen Gefriertrocknungsanlage bis auf eine Anschließend stellt man den pH-Wert mittels
Restfeuchtigkeit von 5 % getrocknet. Die. Ausbeute io 5 n-HCl auf 6,4 ein und homogenisiert erneut unter an Trockenmaterial beträgt etwa 1,5 kg. leichter Kühlung mit obigem Gerät 30 Minuten lang.
1,5 kg des blutfrei gewaschenen getrockneten Pia- Dann wird das Gewebe bei 3000 g abgeschleudert
zeniengewebes werden mit 301 destilliertem Wasser und der thromboplastinhaltige Überstand (280 ml) aufgeschwemmt und 10 Minuten bei einer Temperatur durch Dekantieren gewonnen,
von 1O0C mit einem Homogenisator (Ultra-Turrax der 15 Je 100 ml des Thromboplastins werden mit 0,1g Fa. Janke und Kunkel, Typ 100/2 M) zerkleinert. Calciumchlorid, 3,0 g Sorbit, 30 mg Desoxycholsäure, Danach wird unter heftigem Rührej so viel (etwa 14 mg Zinksulfat (7 HsO) versetzt.
210 ml) einer 5 N-Natronlauge zugeführt, daß sich Der pH-Wert des Thromboplastins wird exakt auf
der pH-Wert auf 11,5 einstellt. Das Gemisch wird 6,3 eingestellt und in Abfüllungen von 2 ml gefrier-25 Minuten gerührt und sodann durch Zusatz von ao getrocknet.
5 N-Salzsäure (etwa 210 ml) auf einen pH-Wert von B e i s D i e 1 3
6,6 gebracht. Anschließend erfolgt eine zweite Behandlung des Gemisches mit dem Homogenisator- 240 g blutfrei gewaschene feuchte Schweineplazenten gerät für die Dauer von 30 Minuten. Der Geweberück- werden mit 400 ml aqua dest. übergössen und 10 Mistand wird in einer Zentrifuge bei 3000 g abgetrennt, as nuten bei 1O0C mit einem Laborhomogenisator Man erhält hierbei 201 Thromboplastin. (Janke & Kunkel) zerkleinert. Danach wird mit
Zu je Liter des Thromboplastins werden 1,1 g 5 n-NaOH der pH-Wert unter kräftigem Rühren auf Calciumchlorid, 30 g Mannit, 0,3 g Desoxycholsäure 11,6 gestellt und das Gemisch 25 Minuten so belassen. und 0,1 g Mangan(II)-Chlorid-Tetrahydrat zugegeben. Anschließend stellt man den pH-Wert mittels
Der pH-Wert wird durch Zugabe einer geringen Menge 30 5 n-HCl auf 6,4 ein und homogenisiert erneut unter Salzsäure oder Natronlauge exakt auf 6,3 eingestellt leichter Kühlung mit obigem Gerät 30 Minuten lang, und anschließend in Abfüllungen von jeweils 2,0 ml Dann wird das Gewebe bei 3000 g abgeschleudert
gefriergetrocknet. Während der Gefriertrocknung er- und der thromboplastinhaltige Überstand (250 ml) leidet das Thromboplastin keinen Aktivitätsverlust. durch Dekantieren gewonnen.
35 Je 100 ml des Thromboplastins werden mit 0,1 g
Beispiel 2 Calciumchlorid, 3,0 g Mannit, 0,3 g Desoxycholsäure,
0,1 g Mangan(II)-Chlorid · 4 H2O versetzt.
Die graue Substanz von Kaninchenhirn wird in Der pH-Wert des Thromboplastins wird exakt
bekannter Weise gewonnen und mit 0,9 %iger NaCl- auf 6,3 eingestellt und in Abfüllungen von 2 ml Lösung blutfrei gewaschen. Der Waschvorgang wird 40 gefriergetrocknet.

Claims (11)

stisches Mittel zur Kontrolle der Gerinnungsfähigkeit Patentansprüche: des Blutes enthaltend Thromboplastin und Calcium- Ionen.
1. Verfahren zur Herstellung eines gegenüber Em Suchtest für Störungen im exogenen Gerinden Blutgerinnungsfaktoren VII und X empfind- 5 nungssystem ist der erstmals 1937 mitgeteilte Einlichen, thrombinfreien Thromboplastin^ d a- phasen-Gerinnungszeit-Test nach Q u ι c k. Die Funkdurch gekennzeichnet, daß man eine tion des exogenen Gerinnungssystems, die auf ein wäßrige Suspension von blutfrei gewaschenem Zusammenwirken der Gerinnungsfaktoren VII, X, thrombogenem Gewebe mit einer Alkalilauge bei V, II und I beruht, wird durch Zusatz eines als Thromeinem pH-Wert zwischen 10 und 12 für 15 Minuten io boplastin bezeichneten standardisierten Gewebeextrakts bis 48 Stunden bei 30 bis 1°C, wobei die kürzeste aus Warmblüterorganen bestimmt. Unter der Wirkung Extraktionszeit der höchsten Temperatur und die des Thromboplastins wird der Gerinnungsfaktor VII längste Extraktionszeit der niedrigsten Temperatur (Proconvertin) aktiviert, der den Faktor X (Stuart- und die dazwischenliegenden Werte sinngemäß Prower-F.) in seine aktive Form überfuhrt,
zuzuordnen sind, extrahiert und den Extrakt nach 15 In Gegenwart von Calcium-Ionen bildet sich ein einer Behandlung im schwachsauren pH-Bereich aktiver Enzym-Lipid-Komplex aus Phospholipid und vom Gewebe abtrennt. den aktivierten Gerinnungsfaktoren X und V (Acce-
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch ge- lerin), der seinerseits den Faktor II (Prothrombin) in kennzeichnet, daß die Extraktion bei einem pH- seine aktive Form, das Thrombin, überführt. Der Wert zwischen 11,4 und 11,8 in den Temperatur- ao Faktor I (Fibrinogen) des Plasmas wird proportional Zeit-Kombinationen 15 Minuten bei 3O0C, 30 Mi- zur Entstehungsgeschwindigkeit der Menge von nuten bei 22°C oder mindestens 20 Stunden bei Thrombin in Fibrin übergeführt. Die dabei gemessene 4°C erfolgt. Gerinnungszeit eines Testplasmas in Sekunden wird
3. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 und 2, zur Beurteilung der Gerinnungsfähigkeit herangezogen, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewebe vor Ab- 25 Der sogenannte Quick-Wert ist geeignet, angetrennung von der Extraktionslösung bei einem borene oder erworbene Mangelzustände der am exopH-Wert zwischen 4,5 und 7,0, vorzugsweise genen Gerinnungssystem beteiligten Faktoren aufzuzwischen 6,0 und 6,4 nachbehandelt wird. decken. Weiter ist durch Messung der Einphasen-
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, Gerinnungszeit eine Überwachung der oralen Antidadurch gekennzeichnet, daß als thrombogenes 30 koagulantien-Therapie möglich. Für das dazu einGewebe Hirn- oder Plazentengewebe menschlichen gesetzte Thromboplastin ist ein wesentliches Qualitätsoder tierischen Ursprungs verwendet wird. kriterium, daß es frei von den Gerinnungsfaktoren
5. Diagnostisches Mittel zur Kontrolle der Ge- des exogenen Systems, insbesondere frei von Thromrinnungsfähigkeit des Blutes enthaltend Thrombo- bin, ist, daß es aber andererseits eine hohe Empfindplastin und Calcium-Ionen, dadurch gekenn- 35 lichkeit gegenüber diesen Faktoren zeigt,
zeichnet, daß es ein Faktor-VII- und Faktor-X-emp- Verfahren zur Herstellung von hochaktiytm Thromfindliches, thrombinfreies Thromboplastin ent- boplastin sind in der Literatur beschrieben (z. B. hält, das nach dem Verfahren gemäß einem der US-PS 35 22 148). Teilweise werden hierzu mensch-Ansprüche 1 bis 4 hergestellt worden ist. liehe Plazenten als Ausgangsmaterial verwendet. Es
6. Mittel gemäß Anspruch 5, dadurch gekenn- 40 war jedoch bisher nicht bekannt, daß Faktor-VII-und zeichnet, daß es als Stabilisator Cholansäure und Faktor-X-empfindliche Thromboplastine aus thromein wasserlösliches Schwermetall(II)-Salz enthält. bogenem Gewebe, insbesondere aus Plazenten, ge-
7. Mittel gemäß Anspruch 5 oder 6, dadurch ge- wonnen werden können.
kennzeichnet, daß es als Zuschlag einen Zucker- Bei den bekannten Verfahren zur Gewinnung von
alkohol, ein Mono- oder ein Disaccharicl enthält. 45 Thromboplastin aus frischen gewaschenen Plazenten-
8. Mittel gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7, geweben wird in der Regel eine wäßrige Extraktion dadurch gekennzeichnet, daß es als Stabilisator angewandt. Andere Verfahren zur Gewinnung des Desoxycholsäure und Mangan(II)-Chlorid enthält. Thromboplastins bestehen in der Extraktion der
9. Mittel gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8, Gewebehomogenate mit Hilfe von wäßrigem Äthanol dadurch gekennzeichnet, daß es als Zuschlagstoff 50 oder Phenol. Bei allen diesen Verfahren werden die Mannit enthält. pH-Werte neutral bis schwach alkalisch gehalten.
10. Mittel nach einem der Ansprüche 5 bis 9, Nach diesen Verfahren erhaltene Thromboplastindadurch gekennzeichnet, daß es Mannit, Desoxy- Präparationen sind jedoch trotz verschiedener stabilicholsäure und Mangan(II)-Chlorid im Gewichts- sierender Maßnahmen, wie Behandlung mit Lltraverhäitnis 300 : 3 : 1 enthält. 55 violettlicht oder durch Lagerung unter Luftabschluß,
11. Mittel gemäß Anspruch 10, dadurch gekenn- nur begrenzt lager- und einsatzfähig. Sie sind nicht zeichnet, daß das Mangan(II)-Chlorid in Lösung vollständig frei von Thrombin und sind insbesondere in einer Konzentration von 10~3 bis 10~4 Mol vor- gegenüber den Faktoren VII und X nicht empfindlich liegt. genug, um exakte Differenzierungen zwischen nor-
60 malen und pathologischen Gerinnungsbildern zu
gewährleisten.
Es wurde nun gefunden, daß die geschilderten Nachteile der Thromboplastin-Präparationen nicht auf-
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur treten bei Verwendung eines gegenüber den Blut-Herstellung eines gegenüber den Blutgerinnungs- 65 gerinnungsfaktoren VII und X empfindlichen, thromfaktoren VII und X empfindlichen, thrombinfreien binfreien Thromboplastins, welches nach einem Ver-Thromboplastins. fahren erhältlich ist, das dadurch gekennzeichnet ist, Die Erfindung bezieht sich ferner auf ein diagno- daß man eine wäßrige Suspension von blutfrei ge-
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EP0241613A1 (de) * 1986-04-17 1987-10-21 Bio/Data Corporation Tablettenförmiges mikrokonzentriertes Blutplasma-Thromboplastin-Gerinnungsreagens und Verfahren zu dessen Herstellung

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