JPS5836384A - 微生物用保存培地 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は単に滅菌水を加えるだけで、例えば微生物保存
の培地とすることができる乾燥培地に関するものである
。

臨床検査においては、検体を一個所に集めて検査したシ
、休日があるなどの作業の都合上、患者よシ分離した検
体の病原菌を最長で１力月程度まで変異させずに簡単に
保存できる培地が望まれている。ところが、溶連菌、イ
ンフルエンザ菌などを の多く病原菌は外界での生存性が弱いために保存中に死
滅しやすく、また、例えば継代培養すると病原性が変異
するなど一般に変化しやすいため、保存が難しいという
問題点があった。このことは何ら臨床検査に限られるも
のではなく、一般に病原菌等の微生物を保存する必要が
ある場合に広くいえることである◎ 従来、病原菌等の細菌の保存法は、リン菌を中心として
種々研究されてきた。リン菌はやけシ死滅しやすくかつ
変異しやすいところから、保存法としては菌懸濁液を凍
結乾燥する方法が広く′採用されてきたが、この方法は
手間と時間がかがシ、凍結乾燥設備のないところでは実
施できないという欠点があった。また、凍結乾燥処理に
よって細胞が損傷され、細菌の性質が変ってしまうこと
もあった０ リン菌の別の保存法として、リン菌検体を検査機関へ輸
送する場合などに用いる５ｔｕａｒｔらやＡｍ１ｅｓの
輸送培地があるが、このものは精々３日間程度しか保存
できず、しかも純化菌保存用の培地ではない。

また、Ｓ　ｔ　ａｍｐのゼラチン・ディスク法をリン菌
の保存に適用した例も知られているが、この方法ではイ
ンフルエンザ菌の保存は困難であり、また下記の炭末ゼ
ラチンディスク法と共通の欠点がある。ゼラチン・ディ
スク培地に炭末を加えた小原らの炭末ゼラチン・ディス
ク法の場合にはインフルエンザ菌の保存も可能であるが
、菌を植えてからゼラチンを乾燥しているので乾燥過程
で細菌細胞の損傷が起こるためか、生菌数が少く々す、
ゼラチンディスクを溶解してから更に一晩培養しないと
菌液として使用できないという欠点があった。

本発明者らは、外界での生存性が弱い病原菌であっても
簡便な手段で長期間安定保存できる手段を開発すべく種
々検討の結果、小原らの炭末ゼラチン・ディ、スフ法の
培地用の三液を予め混合して凍結乾燥し、低温で保存し
ておけば、この乾燥培地は使用時に、単に滅菌水で希釈
して菌を加えて低温で保存しておくだけで、菌が病原菌
のような外界での生存性が弱いものであっても長期間安
定して保存できることを見出し、これに基いて本発明を
完成するに到ったものである。

すなわち本発明は、ゼラチン好捷しくは、さらに炭素粉
末を含有する細菌用栄養培地の凍結乾燥物に関するもの
である。

ゼラチンは細菌培地に通常用いられてｈるものでよく、
含有量は滅菌液を加えて復原した状態で３〜１０チ、好
ましくは６〜８チが適当である。

炭素粉末も細菌培地用のものがよく、例として各種の脱
色炭とか獣炭末などを挙げるこ゛とができる。含有量は
保存しようとする細菌の量などによって異なるが通常は
復原状態の培地の０．０５〜５％程度である。

その他の培地成分としては、細菌用培地に含まれている
通常の栄養成分、すなわち、炭素源、窒素源、ビタミン
その他の栄養物、及び無機塩類がｌｊ要である。炭素源
としては、グルコース、シークロース、各種デキストリ
ン、デン粉などの糖類、あるいは酢酸、クエン酸などの
有機酸類、窒素源としては、づキムミルク、ミルクカゼ
イン、大豆蛋白、−！！ノトン、肉エキス、アミノ酸混
合物、コーンスチーゾリカーなどの含窒素有機物、ある
いは硫酸アンモニウム、コハク酸アンモニウム、アンモ
ニアガスなどの窒素化合物、無機塩類としてはリン酸１
カリ、硫酸マグネシウム、鉄、マンガン等の微量の化合
物等種々のものが知られている。

これらは細菌の種類等に応じて適宜組合せて用いるＯ 本発明の乾燥培地の調製方法としては、まず各培地成分
を所定の濃度に添加溶解後、オートクレーブ加熱あるい
は滅菌ｐ過等により滅菌する。そして、必要により試験
管等の培養容器に一定量づつ分注してから凍結乾燥する
。凍結乾燥方法は天然有機物を凍結乾燥する常法によっ
て行なえばよく、例えば、当該培地を液体窒素で急速凍
結してから減圧して乾燥すればよい。

得られた乾燥培地は培地成分にもよるが通常は低温で保
存するのがよい。温度としては、１０℃以下が適当であ
り、特にアスコルビン酸塩のような分解しやすいものを
含んでいる培地は０℃以下で保存するのが望ましい。

乾燥培地を使用する場合には、滅菌水とあ・ブイヨン゛
などの復原液を所定量加えて培地を復原してから使用す
ればよい。

本発明の乾燥培地はゼラチンと好捷しくはさら（５） に炭素粉末を含む培地で、真菌類（特に酵母）、カビ、
細菌等すべての微生物に適用できるが、特に外界で生存
させにくい病原菌に好適である。このような病原菌とし
て、ストレプトコ、ツカス・ビオケ９ネス（５ｔｒｅｐ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、スタフィロコ
ッカス・アウレウス（５ｔａｐｋｙｌｏｃｏｃｃｒｔｓ
（ｒｌｌｒｅｕｓ　）　、ヘモフィルス・インフルエン
ザエ（Ｈａｅｍｏｐ）Ｉｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａ
ｅ　）、ナイセリアａコゝノローエアエ（Ｎｅ１ｓｓｅ
ｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、工７工１ノヒア・
コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、シュード
モナス中エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅ
ｒｒｂｇｉｎｏｓａ　）、リステリア・モノサイトケゞ
ネス（Ｌｉ５ｔｅｒｉαｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ　
）などを例として挙げることができる。

これらの細胞の保存方法としては、復原液を加えて復原
した培地にこれらの菌液を加えて、凍結保存し、使用時
に流水等で解凍すればよい。

ゼラチンを含有する保存培地は、従来はゼラチン液と各
種栄養物の含有液とに分けて２〜３液の形で氷室等であ
るいは凍結して保存されていた。

（６） そして使用に際して所定の割合に混合し、菌液を加え滅
菌したポリンヤーレ等にこの菌浮遊液を滴下シて五酸化
リン等のはいったデシケータ内で減圧下で乾燥、してゼ
ラチン・ディスクを形成してこれを冷凍庫等に保存して
いた。そして使用に際しては、このゼラチン・ディスク
をブイヨン等に溶して培養゛してから菌液として使用し
ていた。

本発明の培地を用いれば、培地を複数液に分けて保存す
る必要がないのみならず、この乾燥培地をメーカーから
供給を受けたユーザーは使用する際に滅菌水等を加えれ
ば直ちに、保存培地として使用でき、更に菌液を加えて
冷凍庫に入れるだけで簡単にしかも１力月以゛上という
長期間にわたって保存できるのである。本発明の乾燥培
地はこのような特性を有するものであり、特に病院の臨
床検査における検体の保存用として好適である。

以下、実施例を示す。

実施例 蒸溜水１００ｍ１にパクト・デキストロース（ディフコ
社登録商標）５ｇ、バクト・スキムミルク（ディフコ社
登録商標）３ｇ、および脱色炭（）ＩＪワット製、特級
品）０．５ｇを加えて加′温し、オートクレーブで１１
０℃、１０分間加熱して滅菌し、これをＡ液とした。ま
た、蒸溜水ｉｏｏｍｇにレーアスコルビン酸ナトリウム
塩（和光紬薬■製）５ｇを溶解し、ミリポアフィルタ−
（０，２２μのｐ過フィルター、ミリボア社登録商標）
で瀘過して滅菌し、これをＢ液とした。Ｃ液は、蒸溜水
１００ｍ１にパクト・ゼラチン（ディフコ社登録商標）
２０ｇを加温溶解し６てオートクレーブで１２１℃、１
５分間加熱滅菌して調製した。

Ａ液、Ｂ液およびＣ液を無菌状態でよく混合し、この混
合液を、予め１６０℃で９０分間乾燥滅菌しておいた、
直径１．０ｃｎＬｓ長さ３．５　ｃｍのスクリーー・キ
ャップ付の小試験管にＱ、　５　ｍｌづつ無菌的に分注
した。分注した各混合液を液体窒素中で急速に凍結させ
、共和式真空凍結乾燥機ＲＬ−２０ＭＢ型を用いて凍結
乾燥した。乾燥条件としては、品温が約３０〜３５℃、
真空度が約０５５Ｔｏｒｒに達したとき棚温を２０℃に
設定し、約１８時間運転を行なった。そして、品温およ
び棚温かいずれも２０℃になシ、なおかつ真空度が一定
になったとき、凍結乾燥を終了した。得られた乾燥培地
は使用直前まで７２０℃のアイス・ストッカーに保存し
た。

このようにして得られた１１７本の各乾燥培地に滅菌類
溜水を０．５　ｍｌ力無菌的に加えて復原し、第１表の
各細菌をｐＨ７，２の食塩ガロリン酸緩衝液に浮遊させ
た液を一定量づつこの復原培地に添加した。菌を加えた
各培地をよく混合してから一２０℃のアイス・ストッカ
ーに保存した。そして、一定日数経過毎に各菌毎に３本
づつアイス・ストッカーより取り出して流水中で溶解し
、溶解液を一定量づつ寒天培地上に撒いて生菌数を測定
した。

得られた結果を第１表に示す。尚、生菌数は３個のデー
ターの平均である。

（９） （１０）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ゼラチンを含有する微生物保存用栄養培地の凍結乾燥物
   。