JPS5834362A - Ｔｓｇ抗体の製造法 - Google Patents
Ｔｓｇ抗体の製造法Info
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- JPS5834362A JPS5834362A JP13313081A JP13313081A JPS5834362A JP S5834362 A JPS5834362 A JP S5834362A JP 13313081 A JP13313081 A JP 13313081A JP 13313081 A JP13313081 A JP 13313081A JP S5834362 A JPS5834362 A JP S5834362A
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
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- Pathology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新しいＴＳＧ抗体即ちＴＳＧ抗原（ｔｕｇσｒ
５ｏｌｕｂｌｅ ｇｌｙｅｏ戸ｒｏｔｔｉｎ ａｎＮ
ｙｔｎ ）に対して反応する抗体の製造法に関する。
５ｏｌｕｂｌｅ ｇｌｙｅｏ戸ｒｏｔｔｉｎ ａｎＮ
ｙｔｎ ）に対して反応する抗体の製造法に関する。
本発明者ら頃かねてより免疫学的研究を重ねてきたが、
その過程においである特定の抗原から、抗原−抗体反応
によって生成する抗体が、ある種のＤＢＡ−レｐブタ−
（Ｄｏｌｉｔｋｏｘ ＢｉｆｌａｒａｕｚＡｙｙｌｕｔ
ｉｎｉｎｔ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ ）を有する癌細癌出来
の糖鎖と反応し、上記癌細胞の認識、定量等を可能とす
るとの新しい知見を得た。本発明はこの知見により完成
されたものである。
その過程においである特定の抗原から、抗原−抗体反応
によって生成する抗体が、ある種のＤＢＡ−レｐブタ−
（Ｄｏｌｉｔｋｏｘ ＢｉｆｌａｒａｕｚＡｙｙｌｕｔ
ｉｎｉｎｔ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ ）を有する癌細癌出来
の糖鎖と反応し、上記癌細胞の認識、定量等を可能とす
るとの新しい知見を得た。本発明はこの知見により完成
されたものである。
即ち本発明は、ＤＢＡ−レｔブタ−を有するガン細胞由
来のＴＳＧ抗原を、哺乳動物体に投与し、生成する抗体
を採取する仁とを特徴とするＴＳＧ抗体の製造法に係る
。
来のＴＳＧ抗原を、哺乳動物体に投与し、生成する抗体
を採取する仁とを特徴とするＴＳＧ抗体の製造法に係る
。
本発明方法においては、抗原としてＤＢＡ−レｔづター
を有するガン細胞出来のＴＳＧ抗原を利用することを必
須とする。該ＴＳＧ抗原は、公知のＤＢＡ−レ℃づター
を有するｊ５シ細胞例えばテラトカルシノーマ０ＴＴ６
０５０、テラトカルシノーマＰＣＣ３、テラトカルシノ
ーマ−Ｆ９等のテラトカルシノーマやしト冑ガン細胞等
より細胞膜糖蛋白を分離し、次いで該糖蛋白よりＤＢＡ
と結合するものを分離することにより容易に入手できる
。
を有するガン細胞出来のＴＳＧ抗原を利用することを必
須とする。該ＴＳＧ抗原は、公知のＤＢＡ−レ℃づター
を有するｊ５シ細胞例えばテラトカルシノーマ０ＴＴ６
０５０、テラトカルシノーマＰＣＣ３、テラトカルシノ
ーマ−Ｆ９等のテラトカルシノーマやしト冑ガン細胞等
より細胞膜糖蛋白を分離し、次いで該糖蛋白よりＤＢＡ
と結合するものを分離することにより容易に入手できる
。
上記においてガン細胞からの細胞膜糖蛋白の分離は、通
常の方法例えばホモジネート法や可溶化剤を用いる可溶
化法等によシ行ない得る。より有利には例えばガ、７和
胞を生理食塩水又は適等な緩衝液中でホモジネートした
後、沈殿部分を遠心分離等によυ採取し、これを生理食
塩水父性緩衝液中に可溶化剤を用いて溶解し、上清部分
を遠心分離等によシ取シ出すことによシ実施できる。用
いられる可溶化剤としては、一般に細胞膜を可溶化でき
るととの知られている各種の界面活性剤例えば「トリト
ンＸ−１００Ｊ（和光純薬社製）、「ＮＰ−４０４（シ
ェル社製）、ジ＋トニン、尿素等の非イオン性界面活性
剤、ドダシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の陰イオン界
面活性剤等を例示できる。
常の方法例えばホモジネート法や可溶化剤を用いる可溶
化法等によシ行ない得る。より有利には例えばガ、７和
胞を生理食塩水又は適等な緩衝液中でホモジネートした
後、沈殿部分を遠心分離等によυ採取し、これを生理食
塩水父性緩衝液中に可溶化剤を用いて溶解し、上清部分
を遠心分離等によシ取シ出すことによシ実施できる。用
いられる可溶化剤としては、一般に細胞膜を可溶化でき
るととの知られている各種の界面活性剤例えば「トリト
ンＸ−１００Ｊ（和光純薬社製）、「ＮＰ−４０４（シ
ェル社製）、ジ＋トニン、尿素等の非イオン性界面活性
剤、ドダシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の陰イオン界
面活性剤等を例示できる。
また上記によシ得られる細胞膜糖蛋白からのＤＢＡと結
合する糖蛋白の分離は、該糖蛋白の性質を利用した通常
の物理化学的又は生化学的手段によシ行ない得る。該手
段としては例えばＤ ＩＩ Ａを含むカラム担体を利用
するアフィニティークロマドクラフィー、ＤＢＡ抗体静
を用いる免疫沈殿３− 法、透析法、ゲル沖過法、電気泳動法、ポリエチレング
リコールやアセトン等の糖蛋白沈殿剤を用いる物理的沈
殿法等又は之等を適宜組み合せた方法を例示できる。よ
シ有利にはＤＢＡを含むカラム担体を利用したアフィニ
ティークロマドクラフィーによるのがよく、該カラム担
体は、例えばＤＢＡを不溶化支持体上に固定化すること
により容易に収得できる。ここでＤＢＡの不溶化支持体
上への固定は、従来公知の生体物質の固定化方法に従い
行なうことができる。これらのうちでも臭化ジアジ活性
化多糖体法、Ｎ−しド０士シサクシ三ドエステル法等を
使用する固定化方法によるのが好適である。このうち臭
化シアン活性化多糖体性は、不溶性支持体を臭化ジアジ
で処理し、次いで得られる活性化物をＤＢＡと緩和条件
下にカップリンクさせ、ＤＢＡを固定化する方法である
。
合する糖蛋白の分離は、該糖蛋白の性質を利用した通常
の物理化学的又は生化学的手段によシ行ない得る。該手
段としては例えばＤ ＩＩ Ａを含むカラム担体を利用
するアフィニティークロマドクラフィー、ＤＢＡ抗体静
を用いる免疫沈殿３− 法、透析法、ゲル沖過法、電気泳動法、ポリエチレング
リコールやアセトン等の糖蛋白沈殿剤を用いる物理的沈
殿法等又は之等を適宜組み合せた方法を例示できる。よ
シ有利にはＤＢＡを含むカラム担体を利用したアフィニ
ティークロマドクラフィーによるのがよく、該カラム担
体は、例えばＤＢＡを不溶化支持体上に固定化すること
により容易に収得できる。ここでＤＢＡの不溶化支持体
上への固定は、従来公知の生体物質の固定化方法に従い
行なうことができる。これらのうちでも臭化ジアジ活性
化多糖体法、Ｎ−しド０士シサクシ三ドエステル法等を
使用する固定化方法によるのが好適である。このうち臭
化シアン活性化多糖体性は、不溶性支持体を臭化ジアジ
で処理し、次いで得られる活性化物をＤＢＡと緩和条件
下にカップリンクさせ、ＤＢＡを固定化する方法である
。
不溶性支持体を臭化シアンで処理するに当っては、例え
ば水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等４− の塩基性化合物を用いてｌ’ Ｈ７，５〜１２に保ち室
温下水、アセトニトリルや０．１ Ｍ炭酸水素ナトリウ
ム緩衝液（ｔＨ中８．７）、 ０．０１ Ｍリシ酸緩衝
液（ｐＨＨＩ３７）等のｐＨ７，５〜１２の緩衝液等の
溶媒中にて約１−１２分間程度処理すればよい。
ば水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等４− の塩基性化合物を用いてｌ’ Ｈ７，５〜１２に保ち室
温下水、アセトニトリルや０．１ Ｍ炭酸水素ナトリウ
ム緩衝液（ｔＨ中８．７）、 ０．０１ Ｍリシ酸緩衝
液（ｐＨＨＩ３７）等のｐＨ７，５〜１２の緩衝液等の
溶媒中にて約１−１２分間程度処理すればよい。
不溶性支持体に対する臭化シアンの使用量としては通常
およそ等重量とするのがよい。ここで不溶性支持体とし
ては、生体物質一般に対する非特異的吸着が低く、高い
多孔性を有し、緩和条件下に生体物質を固定化し得る官
能基を有し、しかも化学的・物理的に十分安定な従来公
知の不溶性支持体をいずれも使用できる。例えばアミノ
エチル七ル０−ス、カルボ十ジメチルｔル０−ス、づ０
℃アｔチルｔル０−ス、戸−アニリノセル０−ス等のｔ
ル０−ス糸支持体、ｔファデックス、ＣＭ−七ファデツ
クス（ファルマシア社製）等の架橋デ十ストラン糸支持
体、セファロース２＃、ｔフア。−ユｌ’、ｔファ０−
ス６ＢＣファルマシア社製）等のアガロース糸支持体等
を挙けることができる。斯くして得られる臭化シアン活
性化支持体をＤＢＡとカップリンクさせるに際しては、
ＤＢＡに対して臭化シアン活性化支持体を３０〜８０倍
Ｍ【量用い、適当な溶媒、例えば０．１七ル炭酸水素ナ
トリウム（０，５モル塩化すトリウム含有、戸Ｈ８，４
）水溶液中、通常Ｏ〜４０°Ｃ程度、好ましくは２〜８
℃にて約ｌＯ〜２０時間反応させればよい。このように
してＤＢＡを含むアフィニティークロマドクラフィー用
担体が製造される。
およそ等重量とするのがよい。ここで不溶性支持体とし
ては、生体物質一般に対する非特異的吸着が低く、高い
多孔性を有し、緩和条件下に生体物質を固定化し得る官
能基を有し、しかも化学的・物理的に十分安定な従来公
知の不溶性支持体をいずれも使用できる。例えばアミノ
エチル七ル０−ス、カルボ十ジメチルｔル０−ス、づ０
℃アｔチルｔル０−ス、戸−アニリノセル０−ス等のｔ
ル０−ス糸支持体、ｔファデックス、ＣＭ−七ファデツ
クス（ファルマシア社製）等の架橋デ十ストラン糸支持
体、セファロース２＃、ｔフア。−ユｌ’、ｔファ０−
ス６ＢＣファルマシア社製）等のアガロース糸支持体等
を挙けることができる。斯くして得られる臭化シアン活
性化支持体をＤＢＡとカップリンクさせるに際しては、
ＤＢＡに対して臭化シアン活性化支持体を３０〜８０倍
Ｍ【量用い、適当な溶媒、例えば０．１七ル炭酸水素ナ
トリウム（０，５モル塩化すトリウム含有、戸Ｈ８，４
）水溶液中、通常Ｏ〜４０°Ｃ程度、好ましくは２〜８
℃にて約ｌＯ〜２０時間反応させればよい。このように
してＤＢＡを含むアフィニティークロマドクラフィー用
担体が製造される。
」二記ＤＢＡを含むアフィニティークロマドクラフィー
用担体を利用したり０マドクラフイーによれば、目的と
する糖蛋白が上記担体中のＤＢＡと結合してカラムに捕
集される。次いで該カラムに例え１ｄＮ−ア℃チルカラ
クトサ三ン等のＤＢＡと結合する物質を通し交撲反応を
行なうか又は例えばチオジアジ酸カリウム水溶液、硼酸
緩衝液等の吸着分離剤（溶出液）を通すことによシ、カ
ラムに捕集された目的物質を分離回収できる。
用担体を利用したり０マドクラフイーによれば、目的と
する糖蛋白が上記担体中のＤＢＡと結合してカラムに捕
集される。次いで該カラムに例え１ｄＮ−ア℃チルカラ
クトサ三ン等のＤＢＡと結合する物質を通し交撲反応を
行なうか又は例えばチオジアジ酸カリウム水溶液、硼酸
緩衝液等の吸着分離剤（溶出液）を通すことによシ、カ
ラムに捕集された目的物質を分離回収できる。
かくして本発明において抗原とするＤＢＡ−レｔブタ−
を有するカシ細胞由来のＴＳＧ抗原を収得できる。該Ｔ
ＳＧ抗原は、ＤＢＡと結合する性質を有するガン細胞膜
由来の糖蛋白である。
を有するカシ細胞由来のＴＳＧ抗原を収得できる。該Ｔ
ＳＧ抗原は、ＤＢＡと結合する性質を有するガン細胞膜
由来の糖蛋白である。
本発明によれば上記ＴＧＳ抗原を哺乳動物体に投与し、
該動物体よシ血清を採取し、該血清よシ目的とする抗体
を収得する。
該動物体よシ血清を採取し、該血清よシ目的とする抗体
を収得する。
上記本発明方法において用いられる哺乳動物は、特に制
限はないが、通常兎やｔ Ｌ ’ｅワット用いるのが望
ましい。抗体の産生に当っては、上記によシ得られる抗
原の所定員を生理食塩水で適当濃度に希釈し、フロイシ
ドの補助液（Ｃ’ｏｍ戸１ａｔｅＦｒｔｕｎｄ ｓ Ａ
ｄｊｕｖａｎｔ ）と混合して懸濁液を調整し、之を哺
乳動物体に投与すればよい。例えば兎に上記懸濁液を皮
内注射（抗原の量として０．０５〜５ダ／回）し、以後
２週間毎に１〜１０ケ月好ましくは１〜３ケ月間投与し
免疫化させればよい。抗７一 体の採取は、上記懸濁液の最終投与後抗体が多量産出さ
れる時期、通常上記最終投与１〜２週間経過後、免疫化
された動物から採血し、之を遠心分離後血清を分離採取
することによシ行なわれる。
限はないが、通常兎やｔ Ｌ ’ｅワット用いるのが望
ましい。抗体の産生に当っては、上記によシ得られる抗
原の所定員を生理食塩水で適当濃度に希釈し、フロイシ
ドの補助液（Ｃ’ｏｍ戸１ａｔｅＦｒｔｕｎｄ ｓ Ａ
ｄｊｕｖａｎｔ ）と混合して懸濁液を調整し、之を哺
乳動物体に投与すればよい。例えば兎に上記懸濁液を皮
内注射（抗原の量として０．０５〜５ダ／回）し、以後
２週間毎に１〜１０ケ月好ましくは１〜３ケ月間投与し
免疫化させればよい。抗７一 体の採取は、上記懸濁液の最終投与後抗体が多量産出さ
れる時期、通常上記最終投与１〜２週間経過後、免疫化
された動物から採血し、之を遠心分離後血清を分離採取
することによシ行なわれる。
殊に本発明方法によれ社、用いる抗原の特殊性に基づい
て、しト及びその他の動物のＴＳＧ抗原に対して優れた
特異性を有し、高力価、高感度の抗体を再現性よく収得
できる利点がある。
て、しト及びその他の動物のＴＳＧ抗原に対して優れた
特異性を有し、高力価、高感度の抗体を再現性よく収得
できる利点がある。
かくして本発明のＴＳＧ抗体を得る。これは精製する必
要のない場合もあるが通常好ましくは更に精製される。
要のない場合もあるが通常好ましくは更に精製される。
精製方法としては、例えば上記で得られる血清を更に、
末端にＮ−アｔチルガラクトサ三シを有する糖、糖ペプ
チド、糖蛋白等の糖誘導体又社之等騎導体を含むカラム
担体と接触させて、之等に吸着されるものを採取する方
法或はホＬ ス？ ｙ抗原（Ｆｏｒｅｍａｎ ａｎｔｉ
ｇｅｎ ）を有する羊赤血球やＡ型抗原を有するヒト血
球等と上記血清を接触させて、之等に吸着される物質を
除去する８一 方法を採用でき、之等方法は勿論組み合せ採用すること
もできる。特に前者の方法は好ましく、この際上記血清
と糖誘導体を含むカラム担体との接触を、アフイニテイ
ーク０７トグラフイーによシ行々うのが好適でおる。
末端にＮ−アｔチルガラクトサ三シを有する糖、糖ペプ
チド、糖蛋白等の糖誘導体又社之等騎導体を含むカラム
担体と接触させて、之等に吸着されるものを採取する方
法或はホＬ ス？ ｙ抗原（Ｆｏｒｅｍａｎ ａｎｔｉ
ｇｅｎ ）を有する羊赤血球やＡ型抗原を有するヒト血
球等と上記血清を接触させて、之等に吸着される物質を
除去する８一 方法を採用でき、之等方法は勿論組み合せ採用すること
もできる。特に前者の方法は好ましく、この際上記血清
と糖誘導体を含むカラム担体との接触を、アフイニテイ
ーク０７トグラフイーによシ行々うのが好適でおる。
上記において用い得る糖誘導体としては、例えばＤＢＡ
−レｔブタ−を有するガン細胞、好ましくはテラトカル
シノーマ又は胃ガン細胞に由来する糖、糖蛋白もしくは
糖へづチドや、テラトカルシノーマの未分化細胞由来の
糖、糖蛋白もしくはペプチドを例示でき、之等のうちで
は特にテラトカルシノーマ由来の糖ペプチド及びテラト
カルシノーマ未分化細胞由来の糖ぺづチドが好ましい。
−レｔブタ−を有するガン細胞、好ましくはテラトカル
シノーマ又は胃ガン細胞に由来する糖、糖蛋白もしくは
糖へづチドや、テラトカルシノーマの未分化細胞由来の
糖、糖蛋白もしくはペプチドを例示でき、之等のうちで
は特にテラトカルシノーマ由来の糖ペプチド及びテラト
カルシノーマ未分化細胞由来の糖ぺづチドが好ましい。
之等好ましい糖ペプチドは、例えばテラトカルシノーマ
又はテラトカルシノーマ未分化細胞よシ細胞膜糖蛋白又
は該糖蛋白中のＤＥ、Ａに吸着される部分を、前述した
ガン細胞よシその膜糖蛋白及びＴＳＧ抗原を分離する方
法と同様の方法に従い分離し、これに通常の蛋白分解酵
素を作用させることによシ収得される。蛋白分解酵素と
しては公知の各種のもの例えばババイシ、プ０ナーで、
トリプシシ、十七トリプシン、カテプシシ等を単独で又
は二種以上混合して使用でき、特にパパイシ、プロｊ−
で等が好適に利用できる。また上記蛋白分解酵素による
酵素反応は、使用される酵素の至適条件下に東施される
のが好ましい。上記酵素反応後、目的とする糖ペプチド
の分離は、通常の方法例えばゲル濾過法、沈殿法、遠心
分離、透析法、抽出法等又は之等手段を適宜組み合せる
ことによシ行ない得る。更に上記によシ分離収得される
糖ペプチドを利用し、これを含む担体を作成するに肖っ
ては、前述したＤＢＡを不溶性支持体上に固定化する方
法と同様の方法を採用することができる。
又はテラトカルシノーマ未分化細胞よシ細胞膜糖蛋白又
は該糖蛋白中のＤＥ、Ａに吸着される部分を、前述した
ガン細胞よシその膜糖蛋白及びＴＳＧ抗原を分離する方
法と同様の方法に従い分離し、これに通常の蛋白分解酵
素を作用させることによシ収得される。蛋白分解酵素と
しては公知の各種のもの例えばババイシ、プ０ナーで、
トリプシシ、十七トリプシン、カテプシシ等を単独で又
は二種以上混合して使用でき、特にパパイシ、プロｊ−
で等が好適に利用できる。また上記蛋白分解酵素による
酵素反応は、使用される酵素の至適条件下に東施される
のが好ましい。上記酵素反応後、目的とする糖ペプチド
の分離は、通常の方法例えばゲル濾過法、沈殿法、遠心
分離、透析法、抽出法等又は之等手段を適宜組み合せる
ことによシ行ない得る。更に上記によシ分離収得される
糖ペプチドを利用し、これを含む担体を作成するに肖っ
ては、前述したＤＢＡを不溶性支持体上に固定化する方
法と同様の方法を採用することができる。
かくして得られる本発明の精製されたＴＳＧ抗体を得る
。
。
本発明により得られるＴＳＧ抗体は、例えばテラトカル
シノーマ０ＴＴ６０５０、テラトカルシノーマ未分化幹
細胞Ｆ９、ＧＲ５ＬＲ５病細胞等のガン細胞に特異的に
結合する性質を具備するものであシ、これは未分化細胞
ガンの鑑別診断薬として有用なものである。
シノーマ０ＴＴ６０５０、テラトカルシノーマ未分化幹
細胞Ｆ９、ＧＲ５ＬＲ５病細胞等のガン細胞に特異的に
結合する性質を具備するものであシ、これは未分化細胞
ガンの鑑別診断薬として有用なものである。
以下本発明を更に詳しく説明するため参考例及び実施例
を挙げる。
を挙げる。
参考例Ｉ ＤＢＡ−ｐフチ０−スの製造法臭化ジアジ
活性化セファ０−ス４Ｂ １５Ｆを０．００１ Ｎ塩
酸３１に懸濁し、３０分間静置した後カラスフィルター
上で、ｏ、ｔｎｙ酸水累ナトリウム（戸＃８．５）１ｊ
で洗浄する。全体で約５０ｍ１の容量の活性化セファ０
−スが得られる。これを０．１ Ｍ炭酸水素ナトリウム
（ｐＨ８，５） ２００鱈ｌに懸濁し、ＤＢＡ５０１’
ｊｆ／を含む０．０１ Ｍリス酸緩衝液（／’Ｈ７，７
） ５ｍ１／を加え、室温で時々攪拌しながら２時間反
応させる。反応後、反応液をガラスフィルター上で洗浄
し、反応物をｔ５ルのｔノエタノールアミシ溶液２００
譚１（ｐＨ８，５）に加え、室温にて２時間反応させる
。次いで、カラスフィルター上で洗浄する。洗浄は、０
．Ｉ Ｍ酢酸緩衝液（Ｑ、５ Ｍ ＮａＣ１１を含む）
１１と０．１ Ｍホウ酸緩衝液（Ｑ、５ Ｊ／ ＮａＣ
４を含む）ＩＩ！とで交互に５回行なう。かくしてＤＢ
Ａ−ｐファＤ−スを得る。
活性化セファ０−ス４Ｂ １５Ｆを０．００１ Ｎ塩
酸３１に懸濁し、３０分間静置した後カラスフィルター
上で、ｏ、ｔｎｙ酸水累ナトリウム（戸＃８．５）１ｊ
で洗浄する。全体で約５０ｍ１の容量の活性化セファ０
−スが得られる。これを０．１ Ｍ炭酸水素ナトリウム
（ｐＨ８，５） ２００鱈ｌに懸濁し、ＤＢＡ５０１’
ｊｆ／を含む０．０１ Ｍリス酸緩衝液（／’Ｈ７，７
） ５ｍ１／を加え、室温で時々攪拌しながら２時間反
応させる。反応後、反応液をガラスフィルター上で洗浄
し、反応物をｔ５ルのｔノエタノールアミシ溶液２００
譚１（ｐＨ８，５）に加え、室温にて２時間反応させる
。次いで、カラスフィルター上で洗浄する。洗浄は、０
．Ｉ Ｍ酢酸緩衝液（Ｑ、５ Ｍ ＮａＣ１１を含む）
１１と０．１ Ｍホウ酸緩衝液（Ｑ、５ Ｊ／ ＮａＣ
４を含む）ＩＩ！とで交互に５回行なう。かくしてＤＢ
Ａ−ｐファＤ−スを得る。
参考例２ ＴＳＧ抗原の製造
村松停の方法（Ｊ、Ｂｉａｃｋｅｍ、 、 ８９．４７
３（１９８＋））に従い、２４１０テラトカルシノー？
ＯＴＴ ６０５０ ヲ、１００ ｗｅ（Ｄ リｙ ’
ｔｌｌＮｍｌｔ１食塩水（カルシウムイオン及びマグネ
シウムイオシを含まない）でボｔジネイ１−シ、続いて
１時間遠心分Ｍ（１１０，ｏｏｏＸｆ）ｆる。沈Ｎ６１
１ｅ２％戸１１７．６ ）の８０厘ｔでホｔシネイトす
る。氷上３０分放置する。１時間遠心分離（１１０，０
００×ｇ）して、上澄液をＤＢＡ−アガロース（ＥＹ−
ラボラトリ−社ｗりカラム（１，４Ｘ５．２ｆｆ）で精
製する。カラムを ０．１５Ｍ％化ナトリウム及び０．
１％ｒ）’Ｊ）ンＸ−１００Ｊｔ含む ０．０１ Ｍ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）約２０Ｃ）ｓｌで洗
浄し、続いてＱ、１ＭＮ−アｔチルガラクトサ！シ（牛
丼化学社製）を含む０．０１ Ｍ ）リス塩酸緩衝液（
１’Ｈ７，６＞の２０ｄで溶出し、溶出液を透析後凍結
乾燥して、ＴＳＧ抗原３．５１１ｇを得る。
３（１９８＋））に従い、２４１０テラトカルシノー？
ＯＴＴ ６０５０ ヲ、１００ ｗｅ（Ｄ リｙ ’
ｔｌｌＮｍｌｔ１食塩水（カルシウムイオン及びマグネ
シウムイオシを含まない）でボｔジネイ１−シ、続いて
１時間遠心分Ｍ（１１０，ｏｏｏＸｆ）ｆる。沈Ｎ６１
１ｅ２％戸１１７．６ ）の８０厘ｔでホｔシネイトす
る。氷上３０分放置する。１時間遠心分離（１１０，０
００×ｇ）して、上澄液をＤＢＡ−アガロース（ＥＹ−
ラボラトリ−社ｗりカラム（１，４Ｘ５．２ｆｆ）で精
製する。カラムを ０．１５Ｍ％化ナトリウム及び０．
１％ｒ）’Ｊ）ンＸ−１００Ｊｔ含む ０．０１ Ｍ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）約２０Ｃ）ｓｌで洗
浄し、続いてＱ、１ＭＮ−アｔチルガラクトサ！シ（牛
丼化学社製）を含む０．０１ Ｍ ）リス塩酸緩衝液（
１’Ｈ７，６＞の２０ｄで溶出し、溶出液を透析後凍結
乾燥して、ＴＳＧ抗原３．５１１ｇを得る。
この抗原は、ファイルバシクス等（Ｆａげｂａｎｋｓｚ
ｌａｌ）の方法（Ｂｉａｅｌｔｔｖｚｉｚｌｒｙ 、
ｌ Ｑ 、 ２６０６−２６１７（１９７１））に従う
ＳＤＳゲル電気泳動法の結果分子量４５万〜５ｏ万であ
り九。
ｌａｌ）の方法（Ｂｉａｅｌｔｔｖｚｉｚｌｒｙ 、
ｌ Ｑ 、 ２６０６−２６１７（１９７１））に従う
ＳＤＳゲル電気泳動法の結果分子量４５万〜５ｏ万であ
り九。
参考例３ 糖ペプチドの＃造
５５ｊＦ（Ｄテ５）力ＪＬ＋シ／ ？ＯＴ７’６０５
０胚様体を２３０ ｍｌのリシ酸樵緩衝生理食塩水（カ
ルシウムイオン及びマクネシウムイオンを含ｔない）で
ホ℃シネイトし、つづいて１時間遠心分離（１１０，０
００Ｘ ｆ ）する。沈殿物を２％［トリト：／Ｘ −
＋ ００Ｊ Ｏ，０３Ｍ ） ’）スー塩酸１１８Ｍ
（／Ｈ７，６，０，１５Ｍ塩化ナトリウム含有）でホ
七シネイトし、氷上３０分間放置する。１時間遠心分離
（＋１０，０００ Ｘｆ）後、上澄液に４倍体積量の
水冷ア七トシを加える。氷上３分間放置し、３０分間遠
心分離（２５００Ｘｆ）する。沈殿物を減圧で一胤夜乾
燥する。乾燥粉末９２０ＭｙｅＯ，Ｉ七ル トリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ８，４） ９２鱈ｌに懸渇し、それに０
．２ Ｍ ）リス−塩酸緩衝液（７Ｈ８・４・ ｌＱｍ
Ｍシスティン及び４６ダバパイ、を含む）４．５ｗＩｔ
を加える。２４時間３７℃でイシ士ユベートし、混合物
にさらに０．２ Ｍ ）リスー塩酸Ｍ衝液Ｃｆ１１１Ｂ
、４、ＩＣ１ｍ＃！ｚス？イシ及び４６ダパパイシを含
む）４．６鱈ｌを加え、３７℃で２４時間イシ＋ユベー
トする。その後４６１ｇの″ｊｏナーセＥ（科研化学社
製）を加える。２４時間３７°Ｃでイン＋ユベート後、
混合物を８．０１まで濃縮し、セファデックスＧ−５０
（ファルマシア社製、１．５ｃＩＩＩＸ８０Ｑ１１）の
カラム（溶出液： ０．０５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝
液、ｉ’ＪＩ５．ｏ）で精製する。
０胚様体を２３０ ｍｌのリシ酸樵緩衝生理食塩水（カ
ルシウムイオン及びマクネシウムイオンを含ｔない）で
ホ℃シネイトし、つづいて１時間遠心分離（１１０，０
００Ｘ ｆ ）する。沈殿物を２％［トリト：／Ｘ −
＋ ００Ｊ Ｏ，０３Ｍ ） ’）スー塩酸１１８Ｍ
（／Ｈ７，６，０，１５Ｍ塩化ナトリウム含有）でホ
七シネイトし、氷上３０分間放置する。１時間遠心分離
（＋１０，０００ Ｘｆ）後、上澄液に４倍体積量の
水冷ア七トシを加える。氷上３分間放置し、３０分間遠
心分離（２５００Ｘｆ）する。沈殿物を減圧で一胤夜乾
燥する。乾燥粉末９２０ＭｙｅＯ，Ｉ七ル トリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ８，４） ９２鱈ｌに懸渇し、それに０
．２ Ｍ ）リス−塩酸緩衝液（７Ｈ８・４・ ｌＱｍ
Ｍシスティン及び４６ダバパイ、を含む）４．５ｗＩｔ
を加える。２４時間３７℃でイシ士ユベートし、混合物
にさらに０．２ Ｍ ）リスー塩酸Ｍ衝液Ｃｆ１１１Ｂ
、４、ＩＣ１ｍ＃！ｚス？イシ及び４６ダパパイシを含
む）４．６鱈ｌを加え、３７℃で２４時間イシ＋ユベー
トする。その後４６１ｇの″ｊｏナーセＥ（科研化学社
製）を加える。２４時間３７°Ｃでイン＋ユベート後、
混合物を８．０１まで濃縮し、セファデックスＧ−５０
（ファルマシア社製、１．５ｃＩＩＩＸ８０Ｑ１１）の
カラム（溶出液： ０．０５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝
液、ｉ’ＪＩ５．ｏ）で精製する。
溶出液を蒸留水で透析後１２ｇ＋？まで濃縮する。りｏ
Ｏホルム−メタノール（２冒、Ｖ／Ｖ ）で抽出後、水
層な乾固する。 ０．０１ Ｍ ）リス−塩酸緩衝液（
０，１Ｍ塩化ナトリウムを含む、戸／／７．６）２．０
ｍｌにとかしＤＥＡＥ−ｐファデックスＡ−２５カラム
〔ファルマシア社製、１．５Ｘ５ｃＷｔ、溶出液：Ｏ，
Ｏ１＆）リス−塩酸緩衝液（０，Ｉ Ｍ１４ｉ化ナトリ
ウムを含む、／Ｈ７，６）の３倍カラム体積片〕で精製
して、所望の糖ペプチドを含有する ０．０１Ｍトリス
−塩酸緩衝液（０，１Ｍ塩化ナトリウムを含む、ｐＨ７
，６）を得る。この溶液をｏ、１１ｗ酸水素ナトリウム
及び０．５Ｍ塩化ナトリウム含有透析液（７７７８，７
）を用いて一胤夜透析する。
Ｏホルム−メタノール（２冒、Ｖ／Ｖ ）で抽出後、水
層な乾固する。 ０．０１ Ｍ ）リス−塩酸緩衝液（
０，１Ｍ塩化ナトリウムを含む、戸／／７．６）２．０
ｍｌにとかしＤＥＡＥ−ｐファデックスＡ−２５カラム
〔ファルマシア社製、１．５Ｘ５ｃＷｔ、溶出液：Ｏ，
Ｏ１＆）リス−塩酸緩衝液（０，Ｉ Ｍ１４ｉ化ナトリ
ウムを含む、／Ｈ７，６）の３倍カラム体積片〕で精製
して、所望の糖ペプチドを含有する ０．０１Ｍトリス
−塩酸緩衝液（０，１Ｍ塩化ナトリウムを含む、ｐＨ７
，６）を得る。この溶液をｏ、１１ｗ酸水素ナトリウム
及び０．５Ｍ塩化ナトリウム含有透析液（７７７８，７
）を用いて一胤夜透析する。
参考例４ 糖ペプチドを含むカラム担体の製造上記参考
例３で得′＃、、透析後の液中の中性糖含有■を、デュ
ボイスら（Ｄｕｂｏｉｓ Ｍ、 ｔｔ ａｌ ）による
文献（Ａｎａｌｉｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 、
２８．３５ Ｑ（１９５６））に記載のフェノール硫
酸法によシ測定する。求められた中性糖の０．６５
＃に相当する邸に対して、臭化シアン活性化セファ０−
ス４Ｂｌ鰐ｌの割合で、上記透析後の液中に臭化シアン
活性化上ファ０−ス４Ｂを加え、混合液を４℃下−照査
放置し、カップリング反応を、０−１ｍ１の１Ｍエタノ
−ルアエン塩酸塩（戸＃８．０）を加えることにより終
結させる。得られるｔノア０−スピースを、０．１ Ｍ
次階水素ナトリウム緩衝液Ｃ０，５Ｍ塩化ナトリウム含
有、ｌ’Ｈ８゜７）３０ｇ／と蒸留水５０厘ｌとで洗浄
する。
例３で得′＃、、透析後の液中の中性糖含有■を、デュ
ボイスら（Ｄｕｂｏｉｓ Ｍ、 ｔｔ ａｌ ）による
文献（Ａｎａｌｉｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 、
２８．３５ Ｑ（１９５６））に記載のフェノール硫
酸法によシ測定する。求められた中性糖の０．６５
＃に相当する邸に対して、臭化シアン活性化セファ０−
ス４Ｂｌ鰐ｌの割合で、上記透析後の液中に臭化シアン
活性化上ファ０−ス４Ｂを加え、混合液を４℃下−照査
放置し、カップリング反応を、０−１ｍ１の１Ｍエタノ
−ルアエン塩酸塩（戸＃８．０）を加えることにより終
結させる。得られるｔノア０−スピースを、０．１ Ｍ
次階水素ナトリウム緩衝液Ｃ０，５Ｍ塩化ナトリウム含
有、ｌ’Ｈ８゜７）３０ｇ／と蒸留水５０厘ｌとで洗浄
する。
かくして糖べづチドを含むカラム担体を得る。
実施例 ！
ニューシーラント白兎のフットバッド（ｆθ０１ｐａｄ
ｓ ）に、参考例２で得たＴＳＧ抗原０．４ｑ＼を含
むフロイシド補助液ｌ譚ｌを注射する。３週間後間量の
ＴＳＧ抗原抗原含有フシイシド補助液射し、この操作を
２週間毎に３回縁シ返す。第３回目（最終）の注射から
１０日後に、試験動物から採血し、遠心分離して抗血清
を採取し、本発明のＴＳＧ抗体を得る。これを「抗体Ｉ
」とする。抗体Ｉは一７０℃に保存される。
ｓ ）に、参考例２で得たＴＳＧ抗原０．４ｑ＼を含
むフロイシド補助液ｌ譚ｌを注射する。３週間後間量の
ＴＳＧ抗原抗原含有フシイシド補助液射し、この操作を
２週間毎に３回縁シ返す。第３回目（最終）の注射から
１０日後に、試験動物から採血し、遠心分離して抗血清
を採取し、本発明のＴＳＧ抗体を得る。これを「抗体Ｉ
」とする。抗体Ｉは一７０℃に保存される。
実施例 ２
実施例１で得た抗血清（抗体Ｉ）の２ ｍｌを、参考例
今で得た糖ペプチドを含むカラム担体を用いたカラムＣ
Ｏ，９Ｘ １．６３ ）に通過〔溶出液ニリン酸塩緩衝
生理食塩水（カルシウムイオン及びマグネシウムイオン
含有、ｐＨ７，２） ）させる。次に上記カラムに上記
溶出液１２０〜１４０＋／を通し洗浄後、更に３Ｍチオ
シアンカリウムを含むリン酸塩緩衝生理食塩水（カルシ
ウムイオン及びマグネシウムイオン含有、１）Ｈ７，２
＞４ｍｌを通してカラムに吸着されたＴＳＧ抗体を溶出
させる。これをリン酸塩緩衝生理食塩水（カルシウムイ
オン及びマグネシウムイオン含有、戸＃７．２）１１で
２日間透析し、引き続き新たに作成した上記緩衝液２１
で１２時間透析する。かくして精製されだＴＳＧ抗体を
得る。これを「抗体■」とする。これは−２０°Ｃで保
存される。
今で得た糖ペプチドを含むカラム担体を用いたカラムＣ
Ｏ，９Ｘ １．６３ ）に通過〔溶出液ニリン酸塩緩衝
生理食塩水（カルシウムイオン及びマグネシウムイオン
含有、ｐＨ７，２） ）させる。次に上記カラムに上記
溶出液１２０〜１４０＋／を通し洗浄後、更に３Ｍチオ
シアンカリウムを含むリン酸塩緩衝生理食塩水（カルシ
ウムイオン及びマグネシウムイオン含有、１）Ｈ７，２
＞４ｍｌを通してカラムに吸着されたＴＳＧ抗体を溶出
させる。これをリン酸塩緩衝生理食塩水（カルシウムイ
オン及びマグネシウムイオン含有、戸＃７．２）１１で
２日間透析し、引き続き新たに作成した上記緩衝液２１
で１２時間透析する。かくして精製されだＴＳＧ抗体を
得る。これを「抗体■」とする。これは−２０°Ｃで保
存される。
〈抗体の特ｔ！１：試験〉
後記第１表に示す各種細胞を遠心分！（５００×９）し
、リン酸塩Ｗ衝生理食塩水（カルシウムイオン及びマグ
ネシウムイオン含有、ｐＨ７，２＞の５０倍址で２回洗
浄する。州られる細胞を上記リン酸塩緩衝生理水に１％
（Ｖ／Ｖ）濃度となる様に懸濁させ、この懸濁液５ ｍ
ｌに、実施例１及び２で得た抗体（抗体Ｉ及び抗体■）
の夫々５０μＥ又は対照として予めリン酸塩緩衝生理食
塩水（カルシウムイオン及びマグネシウムイオン含有）
で２０容積倍に希釈した正常つ＋ｊｆ血清を混合し、各
混合液を４°Ｃ下１時間イシ千ユベートする。その後裔
細胞をリン酸塩緩衝生理食塩水（カルシウムイオシ及び
マグネシウムイオシ含有、／’ Ｈ７，２）の１００倍
量で洗浄し、つぎにＦＩＴ（１’（フルオレツｔイシイ
ソチオシアナート）が共有した羊抗−うさぎＩｆＧ
（マイルスーイエータ（Ｍｉｌｔｓ−Ｙｔｄａ ）社
製〕の１／□。希釈液を用いて４ ”Ｃ下１時間イシ士
ユベートする。引き続き、上記リン酸塩緩衝生理食塩水
（＃Ｈ７，２）の１００倍量で２回洗浄後、各細胞を落
射螢光順徽鏡（オリンパス上デルＥＨ−ＲＦＬ−ＬＢ、
オリンパス光学社製）で観察し、富士カラーフィルムＩ
ＳＡ Ｉ ００ （富士フィルム社製）で撮影する。そ
の結果抗体Ｉ及び抗体■を用いた場合は、カバークラス
上に染色像が認められた。
、リン酸塩Ｗ衝生理食塩水（カルシウムイオン及びマグ
ネシウムイオン含有、ｐＨ７，２＞の５０倍址で２回洗
浄する。州られる細胞を上記リン酸塩緩衝生理水に１％
（Ｖ／Ｖ）濃度となる様に懸濁させ、この懸濁液５ ｍ
ｌに、実施例１及び２で得た抗体（抗体Ｉ及び抗体■）
の夫々５０μＥ又は対照として予めリン酸塩緩衝生理食
塩水（カルシウムイオン及びマグネシウムイオン含有）
で２０容積倍に希釈した正常つ＋ｊｆ血清を混合し、各
混合液を４°Ｃ下１時間イシ千ユベートする。その後裔
細胞をリン酸塩緩衝生理食塩水（カルシウムイオシ及び
マグネシウムイオシ含有、／’ Ｈ７，２）の１００倍
量で洗浄し、つぎにＦＩＴ（１’（フルオレツｔイシイ
ソチオシアナート）が共有した羊抗−うさぎＩｆＧ
（マイルスーイエータ（Ｍｉｌｔｓ−Ｙｔｄａ ）社
製〕の１／□。希釈液を用いて４ ”Ｃ下１時間イシ士
ユベートする。引き続き、上記リン酸塩緩衝生理食塩水
（＃Ｈ７，２）の１００倍量で２回洗浄後、各細胞を落
射螢光順徽鏡（オリンパス上デルＥＨ−ＲＦＬ−ＬＢ、
オリンパス光学社製）で観察し、富士カラーフィルムＩ
ＳＡ Ｉ ００ （富士フィルム社製）で撮影する。そ
の結果抗体Ｉ及び抗体■を用いた場合は、カバークラス
上に染色像が認められた。
以上のことから抗体■及び抗体■は、いずれもテラトカ
ルシノーマ０ＴＴ６０５０と反応することが判る。
ルシノーマ０ＴＴ６０５０と反応することが判る。
上記において用いた各細胞と抗体ｌ及び抗体用との反応
性を調べた結果を各抗体毎に下記第１表に示す。尚第１
表には各細胞とＤＢＡとの反応性をも併記する。第１表
における各反応性についての評価記号は夫々次のことを
示す。
性を調べた結果を各抗体毎に下記第１表に示す。尚第１
表には各細胞とＤＢＡとの反応性をも併記する。第１表
における各反応性についての評価記号は夫々次のことを
示す。
十・・・・染色像が認められる。
−・・・・染色像は認められない。
また各細胞とＤＢＡとの反応性は、村松等〔Ｊ。
Ｂｉａｔｋｔｐｎ、 ８９ｔ ４７３−４８１ （１９
８１） ）によるＤＢＡ−ＦＩＴＣ法によシ求めたも
のである。
８１） ）によるＤＢＡ−ＦＩＴＣ法によシ求めたも
のである。
第 １ 表
Claims (1)
- ■ ＤＢＡ−レｔブタ−を有するガン細胞出来のＴＳＧ
抗原を、哺乳動物体に投与し、生成する抗体を採取する
ことを特徴とするＴＳＧ抗体の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13313081A JPS5834362A (ja) | 1981-08-24 | 1981-08-24 | Ｔｓｇ抗体の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13313081A JPS5834362A (ja) | 1981-08-24 | 1981-08-24 | Ｔｓｇ抗体の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5834362A true JPS5834362A (ja) | 1983-02-28 |
| JPH0233098B2 JPH0233098B2 (ja) | 1990-07-25 |
Family
ID=15097475
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13313081A Granted JPS5834362A (ja) | 1981-08-24 | 1981-08-24 | Ｔｓｇ抗体の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5834362A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008078148A (ja) * | 2007-10-24 | 2008-04-03 | Toyota Motor Corp | 燃料電池 |
-
1981
- 1981-08-24 JP JP13313081A patent/JPS5834362A/ja active Granted
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| J.BIOCHEM=1981 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008078148A (ja) * | 2007-10-24 | 2008-04-03 | Toyota Motor Corp | 燃料電池 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0233098B2 (ja) | 1990-07-25 |
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