JPH0233098B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新しいTSG抗体即ちTSG抗原
（tumor soluble glycoprotein antigen）に対し
て反応する抗体の製造法に関する。 本発明者らは、かねてより免疫学的研究を重ね
てきたが、その過程においてある特定の抗原か
ら、抗原−抗体反応によつて生成する抗体が、あ
る種のDBA−レセプター（Dolichos Biflorous
Agglutinine−receptor）を有する癌細癌由来の
糖鎖と反応し、上記癌細胞の認識、定量等を可能
とするとの新しい知見を得た。本発明はこの知見
により完成されたものである。 即ち本発明は、DBA−レセプターを有するガ
ン細胞由来のTSG抗原を哺乳動物体に投与して、
テラトカルシノーマOTT6050の幹細胞及び内胚
葉細胞、テラトカルシノーマF9細胞並びにGRSL
白血病細胞に反応性を有し、マウスリンパ球、マ
ウス赤血球、マウス肝臓細胞、ヒツジ赤血球及び
ヒトＡ型赤血球には反応性を有しない抗体を採取
することを特徴とするTSG抗原の製造法に係る。 本発明方法においては、抗原としてDBA−レ
セプターを有するガン細胞由来のTSG抗原を利
用することを必須とする。該TSG抗原は、公知
のDBA−レセプターを有するガン細胞例えばテ
ラトカルシノーマOTT6050、テラトカルシノー
マPCC3、テラトカルシノーマ−F9等のテラトカ
ルシノーマやヒト胃ガン細胞等より細胞膜糖蛋白
を分離し、次いで該糖蛋白よりDBAと結合する
ものを分離することにより容易に入手できる。 上記においてガン細胞拾からの細胞膜糖蛋白の
分離は、通常の方法例えばホモジネート法や可溶
化剤を用いる可溶化法等により行ない得る。より
有利には例えばガン細胞を生理食塩水又は適等な
緩衝液中でホモジネートした後、沈殿部分を遠心
分離等により採取し、これを生理食塩水又は緩衝
液中に可溶化剤を用いて溶解し、上清部分を遠心
分離等により取り出すことにより実施できる。用
いられる可溶化剤としては、一般に細胞膜を可溶
化できることの知られている各種の界面活性剤例
えば「トリトンＸ−100」（和光純薬社製）、「NP
−40」（シエル社製、ジキトニン、尿素等の非イ
オン性界面活性剤、ドデシル硫酸ナトリウム
（SDS）等の陰イオン界面活性剤等を例示できる。 また上記により得られる細胞膜糖蛋白からの
DBAと結合する糖蛋白の分離は、該糖蛋白の性
質を利用した通常の物理化学的又は生化学的手段
により行ない得る。該手段としては例えばDBA
を含むカラム担体を利用するアフイニテイ−クロ
マトグラフイー、DBA抗体等を用いる免疫沈殿
法、透析法、ゲル過法、電気泳動法、ポリエチ
レングリコールやアセトン等の糖蛋白沈殿剤を用
いる物理的沈殿法等又は之等を適宜組み合せた方
法を例示できる。より有利にはDBAを含むカラ
ム担体を利用したアフイニテイ−クロマトグラフ
イーによるのがよく、該カラム担体は、例えば不
溶化支持体上に固定化することにより容易に収得
できる。ここでDBAの不溶化支持体上への固定
は、従来公知の生体物質の固定化方法に従い行な
うことができる。これらのうちでも臭化シアン活
性化多糖体法、Ｎ−ヒドロキシサクシミドエステ
ル法等を使用する固定化方法によるのが好適であ
る。このうち臭化シアン活性化多糖体法は、不溶
性支持体を臭化シアンで処理し、次いで得られる
活性化物をDBAと緩和条件下にカツプリングさ
せ、DBAを固定化する方法である。不溶性支持
体を臭化シアンで処理するに当つては、例えば水
酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等の塩基性
化合物を用いてPH7.5〜12に保ち室温下水、アセ
トニトリルや0.1M炭酸水素ナトリウム緩衝液
（PH≒8.7）、0.01Mリン酸緩衝液（PH（≒7.7）等
のPH7.5〜12の緩衝液等の溶媒中にて約１〜12分
間程度処理すればよい。不溶性支持体に対する臭
化シアンの使用量としては通常およそ等重量とす
るのがよい。ここで不溶性支持体としては、生体
物質一般に対する非特異的吸着が低く、高い多孔
性を有し、緩和条件下に生体物質を固定化し得る
官能基を有し、しかも化学的・物理的に十分安定
な従来公知の不溶性支持体をいずれも使用でき
る。例えばアミノエチルセルロース、カルボキシ
メチルセルロース、ブロモアセチルセルロース、
ｐ−アニリノセルロース等のセルロース支持体、
セフアデツクス、CM−セフアデツクス（フアル
マシア社製）等の架橋デキストラン系支持体、セ
フアロース2B、セフアロース4B、セフアロース
6B（フアルマシア社製）等のアガロース系支持体
を挙げることができる。斯くして得られる臭化シ
アン活性化支持体をDBAとカツプリングさせる
に際しては、DBAに対して臭化シアン活性化支
持体を30〜80倍重量用い、適当に溶媒、例えば
0.1モル炭酸水素ナトリウム（0.5モル塩化ナトリ
ウム含有、PH8.4）水溶液中、通常０〜40℃程度、
好ましくは２〜８℃にて約10〜20時間反応させれ
ばよい。このようにしてDBAを含むアフイニテ
イークロマトグラフイー用担体が製造される。 上記DBAを含むアフイニテイークロマトグラ
フイー用担体を利用したクロマトグラフイーによ
れば、目的とする糖蛋白が上記担体中のDBAと
結合してカラムに捕集される。次いで該カラムに
例えばＮ−アセチルガラクトサミン等のDBAと
結合する物質を通し交換反応を行なうか又は例え
ばチオシアン酸カリウム水溶液、硼酸緩衝液等の
吸着分離剤（溶出液）を通すことにより、カラム
に捕集された目的物質を分離回収できる。 かくして本発明において抗原とするDBA−レ
セプターを有するガン細胞由来のTSG抗原を収
得できる。該TSG抗原は、DBAと結合する性質
を有するガン細胞由来の糖蛋白である。 本発明によれば上記TSG抗原を哺乳動物体に
投与し、該動物体より血清を採取し、該血清より
目的とする抗体を収得する。 上記本発明方法において用いられる哺乳動物
は、特に制限はないが、通常兎やモルモツトを用
いるのが望ましい。抗体の産生に当つては、上記
により得られる抗原の所定量を生理食塩水で適当
濃度に希釈し、フロインドの補助液（Complate
Freund′s Adjuvant）と混合して懸濁液を調整
し、之を哺乳動物体に投与すればよい。例えば兎
に上記懸濁液を皮内注射（抗原の量として、0.05
〜５mg／回）し、以後２週間毎に１〜10ケ月好ま
しくは１〜３ケ月間投与し免疫化させればよい。
抗体の採取は、上記懸濁液の最終投与後抗体が多
量産出される時期、通常上記最終投与１〜２週間
経過後、免疫化された動物から採血し、之を遠心
分離後血清を分離採取することにより行なわれ
る。殊に本発明方法によれば、用いる抗原の特殊
性に基づいて、ヒト及びその他の動物のTSG抗
原に対して優れた特異性を有し、高力価、高感度
の抗体を再現性よく収得できる利点がある。 かくして本発明のTSG抗原を得る。これは精
製する必要のない場合もあるが通常好ましくは更
に精製される。精製方法としては、例えば上記で
得られる血清を更に、末端にＮ−アセチルガラク
トサミンを有する糖、糖ペプチド、糖蛋白等の糖
誘導体又は之等誘導体を含むカラム担体と接触さ
せて、之等に吸着されるものを採取する方法或は
ホルスマン抗原（Forsman antigen）を有する
羊赤血球やＡ型抗原を有するヒト血球等と上記血
清を接触させて、之等に吸着される物質を除去す
る方法を採用でき、之等方法は勿論組み合せ採用
することもできる。特に前者の方法は好ましく、
この際上記血清と糖誘導体を含むカラム担体との
接触を、アフイニテイークロマトグラフイーによ
り行なうのが好適である。 上記において用い得る糖誘導体としては、例え
ばDBA−レセプターを有するガン細胞、好まし
くはテラトカルシノーマ又は胃ガン細胞に由来す
る糖、糖蛋白もしくは糖ペプチドや、テラトカル
シノーマの未分化細胞由来の糖、糖蛋白もしくは
ペプチドを例示でき、之等のうちでは特にテラト
カルシノーマ由来の糖ペプチド及びテラトカルシ
ノーマ未分化細胞由来の糖ペプチドが好ましい。
之等好ましい糖ペプチドは、例えばテラトカルシ
ノーマ又はテラトカルシノーマ未分化細胞より細
胞膜糖蛋白又は該糖蛋白中のDBAに吸着される
部分を、前述したガン細胞よりその膜糖蛋白及び
TSG抗原を分離する方法と同様の方法に従い分
離し、これに通常の蛋白分解酵素を作用させるこ
とにより収得される。蛋白分解酵素としては公知
の各種のもの例えばパパイン、プロナーゼ、トリ
プシン、キモトリプシン、カテプシン等を単独で
又は二種以上混合して使用でき、特にパパイン、
プロナーゼ等が好適に利用できる。また上記蛋白
分解酵素による酵素反応は、使用される酵素の至
適条件下に実施されるのが好ましい。上記酵素反
応後、目的とする糖ペプチドの分離は、通常の方
法例えばゲル過法、沈殿法、遠心分離、透析
法、抽出法等又は之等手段を適宜組み合せること
により行い得る。更に上記により分離収得される
糖ペプチドを利用し、これを含む担体を作成する
に当つては、前述したDBAを不溶性支持体上に
固定化する方法と同様の方法を採用することがで
きる。 かくして得られる本発明の精製されたTSG抗
体を得る。 本発明により得られるTSG抗体は、例えばテ
ラトカルシノーマOTT6050、テラトカルシノー
マ未分化幹細胞F9、GRSL白血病細胞等のガン細
胞に特異的に結合する性質を具備するものであ
り、これは未分化細胞ガンの鑑別診断薬として有
用なものである。 以下本発明を更に詳しく説明するため参考例及
び実施例を挙げる。 参考例 １ DBA−セフアロースの製造法 臭化シアン活性化セフアロース4B 15ｇを
0.001N塩酸３に懸濁し、30分間静置した後ガ
ラスフイルター上で、0.1M炭酸水素ナトリウム
（PH8.5）１で洗浄する。全体で約50mlの容量の
活性化セフアロースが得られる。これを0.1M炭
酸水素ナトリウム（PH8.5）200mlに懸濁し、
DBA50mgを含む0.01Mリン酸塩緩衝液（PH7.7）
５mlを加え、室温で時々撹拌しながら２時間反応
させる。反応後、反応液をガラスフイルター上で
洗浄し、反応物を１モルのモノエタノールアミン
溶液200ml（PH8.5）に加え、室温にて２時間反応
させる。次いで、ガラスフイルター上で洗浄す
る。洗浄は、0.1M酢酸緩衝液（0.5M NaClを含
む）１と0.1Mホウ酸緩衝液（0.5M NaClを含
む）１とで交互に３回行なう。かくしてDBA
−セフアロースを得る。 参考例 ２ TSG抗原の製造 村松等の方法〔J.Biochem.、89、473（1981）〕
に従い、24ｇのテラトカルシノーマOTT6050を、
100mlのリン酸塩緩衝食塩水（カルシウムイオン
及びマグネシウムイオンを含まない）でホモジネ
イトし、続いて１時間遠心分離（110000×ｇ）す
る。沈殿物を２％「トリトンＸ−100」（和光純薬
社製）の0.01Mトリス塩酸緩衝液（0.15M塩化ナ
トリウム含有、PH7.6）の80mlでホモジネイトす
る。氷上30分間放置する。１時間遠心分離
（110000×ｇ）して、上澄液をDBA−アガロース
（EY−ラボラトリー社製）カラム（1.4×5.2cm）
で精製する。カラムを0.15M塩化ナトリウム及び
0.1％「トリトンＸ−100」を含む0.01Mトリス−
塩酸緩衝液（PH7.6）約200mlで洗浄し、続いて
0.1M Ｎ−アセチルガラクトサミン（半井化学社
製）を含む0.01Mトリス塩酸緩衝液（PH7.6）の
20mlで溶出し、溶出液を透析後凍結乾燥して、
TSG抗原3.5mgを得る。 この抗原は、フアイルバンクス等（Fairbanks
et al）の方法〔Biochemistry、10、2606〜2617
（1971）〕に従うSDSゲル電気泳動法の結果分子量
45万〜50万であつた。 参考例 ３ 糖ペプチドの製造 55ｇのテラトカルシノーマOTT6050胚様体を
230mlのリン酸塩緩衝生理食塩水（カルシウムイ
オン及びマグネシウムイオンを含まない）でホモ
ジネイトし、つづいて１時間遠心分離（110000×
ｇ）する。沈殿物を２％「トリトンＸ−100」
0.01Mトリス−塩酸緩衝液（PH7.6、0.15M塩化ナ
トリウム含有）でホモジネイトし、氷上30分間放
置する。１時間遠心分離（110000×ｇ）後、上澄
液に４倍体積量の氷冷アセトンを加える。氷上３
分間放置し、30分間遠心分離（2500×ｇ）する。
沈殿物を減圧で一昼夜乾燥する。乾燥粉末920mg
を0.1モル トリス−塩酸緩衝液（PH8.4）92mlに
懸濁し、それに0.2Mトリス−塩酸緩衝液（PH
8.4、10mMシステイン及び46mgパパインを含む）
4.5mlを加える。24時間37℃でインキユベートし、
混合物をさらに0.2Mトリス−塩酸緩衝液（PH
8.4、10mMシステイン及び46mgパパインを含む）
4.6mlを加え、37℃で24時間インキユベートする。
その後46mgのプロナーゼＥ（科研化学社製）を加
える。24時間37℃でインキユベート後、混合物を
8.0mlまで濃縮し、セフアデツクスＧ−50（フアル
マシア社製、1.5cm×80cm）のカラム（溶出液：
0.05M酢酸アンモニウム緩衝液、PH5.0）で精製
する。溶出液を蒸留水で透析後12mlまで濃縮す
る。クロロホルム−メタノール（２：１、Ｖ／
Ｖ）で抽出後、水層を乾固する。0.01Mトリス−
塩酸緩衝液（0.1M塩化ナトリウムを含む、PH
7.6）2.0mlにとかしDEAE−セフアデツクスＡ−
25カラム〔フアルマシア社製、1.5×５cm、溶出
液：0.01Mトリス−塩酸緩衝液（0.1M塩化ナト
リウムを含む、PH7.6）の３倍カラム体積量〕で
精製して、所望の糖ペプチドを含有する0.01Mト
リス−塩酸緩衝液（0.1M塩化ナトリウムを含む、
PH7.6）を得る。この溶液を0.1M炭酸水素ナトリ
ウム及び0.5M塩化ナトリウム含有透析液（PH
8.7）を用いて一昼夜透析する。 参考例 ４ 糖ペプチドを含むカラム担体の製造 上記参考例３で得た透析後の液中の中性糖含有
量を、デユボイスら（Dubois M.et al）による
文献〔Analitical Chemistry、28、350（1956）〕
に記載のフエノール硫酸法により測定する。求め
られた中性糖の0.65mgに相当する量に対して、臭
化シアン活性化セフアロース4B1mlの割合で、上
記透析後の液中に臭化シアン活性化セフアロース
4Bを加え、混合液を４℃下一昼夜放置し、カツ
プリング反応を、0.1mlの1Mエタノールアミン塩
酸塩（PH8.0）を加えることにより終結させる。
得られるセフアロースビーズを、0.1M炭酸水素
ナトリウム緩衝液0.5M塩化ナトリウム含有、PH
8.7）30mlと蒸留水50mlとで洗浄する。 かくして糖ペプチドを含むカラム担体を得る。 実施例 １ ニユージーランド白兎のフツトパツド（foot
pads）に、参考例２で得たTSG抗原0.4mgを含む
フロインド補助液１mlを注射する。３週間後同量
のTSG抗原含有フロインド補助液を注射し、こ
の操作を２週間毎に３回繰り返す。第３回目（最
終）の注射から10日後に、試験動物から採血し、
遠心分離して抗血清を採取し、本発明のTSG抗
体を得る。これを「抗体」とする。抗体は−
70℃に保存される。 上記で得られた抗血清（抗体）の２mlを、参
考例４で得た糖ペプチドを含むカラム担体を用い
たカラム（0.9×1.6cm）に通過〔溶出液：リン酸
塩緩衝生理食塩水（カルシウムイオン及びマグネ
シウムイオン含有、PH7.2）〕させる。次に上記カ
ラムに上記溶出液120〜140mlを通し洗浄後、更に
3Mチオシアンカリウムを含むリン酸塩緩衝生理
食塩水（カルシウムイオン及びマグネシウムイオ
ン含有、PH7.2）４mlを通してカラムに吸着され
たTSG抗体を溶出させる。これをリン酸塩緩衝
生理食塩水（カルシウムイオン及びマグネシウム
イオン含有、PH7.2）１で２日間透析し、引き
続き新たに作成した上記緩衝液２で12時間透析
する。かくして精製されたTSG抗体を得る。こ
れを「抗体」とする。これは−20℃で保存され
る。 ＜抗体の特性試験＞ 後記第１表に示す各種細胞を遠心分離（500×
ｇ）し、リン酸塩緩衝生理食塩水（カルシウムイ
オン及びマグネシウムイオン含有、PH7.2）の50
倍量で２回洗浄する。得られる細胞を上記リン酸
塩緩衝生理食塩水に１％（V/V）濃度となる様
に懸濁させ、この懸濁液５mlに、実施例１で得た
抗体（抗体及び抗体）の夫々50μ又は対照
として予めリン酸塩緩衝生理食塩水（カルシウム
イオン及びマグネシウムイオン含有）で20容積倍
に希釈した正常ウサギ血清を混合し、各混合液を
４℃下１時間インキユベートする。その後各細胞
をリン酸塩緩衝生理食塩水（カルシウムイオン及
びマグネシウムイオン含有、PH7.2）の100倍量で
洗浄し、つぎにFITC（フルオレツセインイソチ
オシアナート）が共有した羊抗−うさぎIgG〔マ
イルス−イエーダ（Miles−Yeda）社製〕の1/1
０希釈液を用いて−４℃下１時間インキユベート
する。引き続き、上記リン酸塩緩衝生理食塩水
（PH7.2）の100倍量で２回洗浄後、各細胞を落射
螢光顕微鏡（オリンパスモデルBH−RFL−LB、
オリンパス光学社製）で観察し、富士カラーフイ
ルムASA100（富士フイルム社製）で撮影する。
その結果抗体及び抗体を用いた場合は、カバ
ーグラス上に染色像が認められた。 以上のことから抗体及び抗体は、いずれも
テラトカルシノーマOTT6050と反応することが
判る。 上記において用いた各細胞と抗体及び抗体
との反応性を調べた結果を各抗体毎に下記第１表
に示す。尚第１表には各細胞とDBAとの反応性
をも併記する。第１表における各反応性について
の評価記号は夫々次のことを示す。 ＋…染色像が認められる。 −…染色像は認められない。 また各細胞とDBAとの反応性は、村松等〔J.
Biochem.89、473〜481（1981）〕によるDBA−
FITC法により求めたものである。 【表】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ DBA−レセプターを有するガン細胞由来の
   TSG抗原を哺乳動物体に投与して、テラトカル
   シノーマOTT6050の幹細胞及び内胚葉細胞、テ
   ラトカルシノーマF9細胞並びにGRSL白血病細胞
   に反応性を有し、マウスリンパ球、マウス赤血
   球、マウス肝臓細胞、ヒツジ赤血球及びヒトＡ型
   赤血球には反応性を有しない抗体を採取すること
   を特徴とするTSG抗体の製造法。