JPS5831198B2 - バクテリアによる酸化物の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は酸化方法、特に微生物または酸素による有機化
合物の酸化に関する。

炭素およびエネルギー源としてＣ３有機化合物を同化す
る（ ａｓｓｉｍｉｌａｔｅ ） ことのできる微生
物がかなり以前から知られている。

例えば、ゼーンゲン（Ｓｇｈ■ｅｎ）のバシルス・メタ
ニクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｔｈａｎｉｃｕｓ ）
（Ｚ ０Ｂａｋｔｅｒｉｏｌ ・Ｐａｒａｓｉｎｔｅ
ｎｋ０部門■１５：第５１３−５１７頁）等である。

これらの微生物は現在では接頭辞「メチロ（ｍｅｔｈｙ
ｌｏ ） ｊで一般的に同定されるメタン酸化バクテリ
アを含み、該バクテリアはメタン、メタノールまたはジ
メチルエーテルによってその培養を左右される。

しかしながら、これらのメタン酸化バクテリアは培養物
（ｇｒｏｗ ｔｈ ） は同化しないが、ある種の他
の有機基質、例えばエーテル類、アルコール類およびい
くつかの短鎖アルカン等を酸化することもできる。

例えば、メチロコックス０カプスラツス（ｍｅｔｙｌｏ
ｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ ）のテキサス株
（Ｔｅｘａｓ ５ｔｒａｉｎ ）の「休息している細胞
（ｒｅｓｔｉｎｇ ｃｅｌ ｌ ） Ｊ懸濁液がある種
の第一アルコール類、短鎖アルカン、エタンおよびプロ
パンを酸化する（もつとも該アルカンの酸化速度よりも
かなり遅い）ことが報告されている（フォスター（Ｆｏ
ｓｔｅｒ）とデービス（Ｄａｖｉｓ）、ジャーナル・オ
ブ・バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＢａｃｔ
ｅｒｉｏｌｏｇｙ ）、１９６６年５月、第９１巻、第
５号、第１９２４−１９３１頁）。

従来考えられていたよりも広範囲の有機化合物がある種
の型のバクテリアの培養物（ｃｕＨｕｒｅｓ ）および
酵素抽出物による酸化の影響を受けやすいことが見い出
された。

即ち、本発明はアルカ／特に高級（ｈｉｇｈｅｒ ）短
鎖アルカン、アルケンまたは環状有機化合物の酸化方法
を含むもので、メチロコックス属のメタン酸化バクテリ
アの培養物またはメタン酸化系を含有するその抽出物を
酸化剤として使用する。

ここで使用する「高級短鎖アルカン」という用語は炭素
原子３〜９個を有するアルカン、例えば、直鎖アルカン
類、即ちブタン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタンおよび
オクタンおよびこれらの種々の分枝鎖アルカンや類似物
等を意味する。

本発明方法によって酸化されるアルカンは置換アルカン
を含んでいてもよいが、重＜ （ｈｅａｖｉ ｌｙ ）
置換されたアルカン、特に耐酸化性の基で置換されたア
ルカンは酸化されにくいことがある。

例えば、両端およびその次の炭素原子が耐酸化性置換基
、例えばハロゲン置換基等で完全に置換されたアルカン
類等も酸化に対して抵抗することがある。

アルカン類の酸化は典型的には末端およびその次の炭素
原子上で優先的におこなわれ、一般的には１−および２
−アルコールの混合物を与える。

より短鎖のアルカン類、例えばブタン、ペンタンおよび
これらの類似物等はメタンの酸化速度に比べても有利な
速度で酸化される。

また、より長鎖のアルカン類、例えばヘプタン、ヘキサ
ン、オクタンおよびこれらの類似物等はより遅い速度で
酸化されるが、これらの酸化は驚くべきであり、最も予
期されなかった発見である。

好ましい態様では、本発明方法は置換アルケン類を含む
アルケン類および両端と内部に二重結合を有するアルケ
ン類の酸化に適用できる。

本発明方法は一般にアルケン類に適用でき、特に低級ア
ルケン類、例えば最大の炭素鎖が炭素原子１０個、好ま
しくは８個またはそれ以下のアルケン類に対しては特に
有利である。

従って特に好ましい態様では、本発明方法はエチレン、
ブテン類およびとりわけプロペンの酸化に用いる。

末端二重結合を有するアルケン類は通常二重結合のとこ
ろが酸化され、一般に相当する１、２−エポキシドが生
成され、内部二重結合を有するアルケン類は二重結合の
ところと末端またはその次の炭素原子の両方が酸化され
、普通は相当するエポキシド類と１および２−アルコー
ルが生成される。

また、シス配置の内部アルケン類は酸化によって就中ケ
トン類を生成させることがある。

さらに、予期しないことには本発明方法は環状有機化合
物の酸化に適用してもよいことが見い出された。

酸化される環状化合物はシクロアルカン類、例えばシク
ロヘキサン等、芳香族化合物、例えばベンゼン、トルエ
ンおよびスチレン等を含む不飽和環状炭化水素および複
素環化合物、例えばピリジン等を含む。

酸化は環構造または／および環に結合した置換基でおこ
ることがある。

従って、例えばシクロヘキサンは酸化されてシクロヘキ
サノールになり、ベンゼンは酸化されてフェノールにな
るが、スチレンは酸化されてスチレンエポキシドになる
。

一方、トルエンは酸化されてベンジルアルコールとクレ
ゾールとの混合物になる。

また、複素環化合物の酸化は環構造中の複素原子のとこ
ろでおこることがある。

例えばピリジンは酸化されてピリジンＮ−オキシドにな
る。

本発明方法に使用してもよいバクテリアは特徴としてメ
チロコックス属のメタン酸化バクテリア、即チＣ１−同
化バクチリア群であり、その培養はメタンまたはメタノ
ールに依存し、ある場合にはジメチルエーテル中でも培
養できる。

適当なメチロコックス（ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
）属′ゝクチリアとしては、例えばメチロコックス・カ
プスラツス（ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｓｕ
ｌａｔｕｓ ）、例えばアメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ
１ｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ）にＡＴＣＣ１９
０６９として寄託されているメチロコックス・カプスラ
ツスの株等を含む。

この種のバクテリアとしてはメチロコックス・カプスラ
ツスのバス（Ｂａｔｈ）株、例えばナショナル・コレク
ション・オブ・インダストリアル・バクテリア（ｎａｔ
ｉｏｎａｌ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓ
ｔｒｉａｌＢａｃｔｅｒｉａ ） （アベルデーン（Ａ
ｂｅｒｄｅｅｎ ）、スコツトランド（５ｃｏｔｌａｎ
ｄ ） ）にＮ０ＩＢ１１１３２（国際寄託番号Ｎ０Ｉ
ＢＩ １７４０ ）として寄託されたもの等を含む。

メチロコックス・カプスラツスメタン酸化バクテリアの
適当な株はいずれも本発明方法に使用してもよい。

例えばメチロコックス・カプスラツスの適当な株はフォ
スターとデービスによる輪文（Ｊ 、 Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ−１１９６６年５月、第９１巻、第５号、第１９２
９頁）およびライラテンブリーらによる論文（「Ｃ３化
合物上での微生物培養」１９７５年、第７頁、Ｇ−Ｔｅ
ｒｕｉ編集、発酵工学会（Ｔｈｅ ５ｏｃｉｅｔｙ ｏ
ｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌ−ｏｇ
ｙ ）発行、東京）に記載された特性によって同種と認
めてもよい。

例えば、メチロコックス・カプスラツス細胞は典型的に
は非運動性のダラム陰性球菌（Ｇｒａｍ ｎｅｇａｔｉ
ｖｅ ｃｏｃｃｉ ）等であり、該球菌は墨検鏡板（Ｉ
ｎｄｉａ ｉｎｋ ｍｏｕｎｔｓ ）で観察すると普
通は双球菌状配列で、著しいカプセル化を示す。

無機塩類媒養基中メタンおよびメタノール上で培養でき
る好気性細菌である有機体は親熱性（ｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉ １ｉｃ）であり、昇温下、例えば約３゜〇−約５０
℃の範囲で培養できる。

メチロコックス・カプスラツスの株は２−オキソゲルタ
レ−ｔ［水素酵素に対して陰性である不完全なＴＯＡサ
イクルによって他のメタン酸化バクテリアから区別され
る。

メチルコックス・カプスラツスはＮＡＤ％異インタイン
クエン酸塩脱水素酵素こと、マレイン酸塩脱水素酵素活
性が比較的低いこと、およびＧ＋０含有量が６２．５％
であることによってさらにメチロモナスから区別される
。

本発明方法に使用してもよいメチロコックス・カプスラ
ツスの株の例にはメチロコックス・カプスラツスのテキ
サス株、例えばＡＴＯＯ１９０６９として寄託されたも
の等、または好ましくはメチロコックス・カプスラツス
のバス株、例えばＮ０ＩＢ１１１３２（国際寄託番号Ｎ
ＣｌＢ１１７４０）として寄託されたもの等が例示され
る。

本発明方法に使用する前に、メチロコックス・カプスラ
ツスの培養物は、培養物または培養物上の雰囲気が適当
な培養基質、例えばメタン等を含みかつ培養物を比較的
規則的な間隔で副培養する（ ｓｕｂ ｃｕｌｔｕｒｅ
）ならば培養基を含有する標準的無機物上に保存して
もよい。

例えば、メチロコックス・カプスラツスのバス株の培養
物はメタン含有雰囲気によって取り囲まれた寒天斜面（
ａｇａｒｓｌｏｐｅｓ）上に保存してもよく、該培養物
は規則的、好ましくは少なくとも１ケ月に一度副培養す
る。

高級短鎖アルカリ類、アルケン類および環状化合物はメ
タン酸化バクテリアの生活細胞を例えば水性懸濁液等の
形で接触させて酸化してもよい。

例えば、前もってメタン上で培養した有機体の「休息細
胞」懸濁液を用いてもよく、好ましくは培養基質と酸化
基質を交互に酸化系に送り込んでもよい。

好ましい態様では、細胞は適当な支持体例えばガラスピ
ーズまたは適当なコンタクタ−（ｃｏｎｔａｃｔｏｒ
） 中に充填または流動性にしたベッドとして保持して
もよいゲルマトリックス（ｇｅｌｒｎａｔｒｉｘ）
等の上部または内部に固定してもよい。

酸化基質の他に付加的化合物、例えばメタン、メタノー
ルまたは好ましくはホルムアルデヒドまたは蟻酸塩等を
存在させ、メタン酸化系に対して環元力を付与してもよ
い。

完全な細胞（Ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌｓ ）の使用は細胞
膜を通して都合よく吸収される低分子量および／または
親脂肪基質の酸化には特に適している。

親熱性のメタン酸化バクテリア、例えばメチロコックス
・カプスラツス等の使用に関し、完全細胞の使用は高い
培ｔｉ槁度、例えばメチロコックス・カプスラツス（バ
ス）の最適培養温度４５℃等を考慮すると特に有利であ
り、このような温度は有機体に許容され、従って冷却の
必要性が少なくなるので都合がよい。

完全細胞を使用するかわりにメチロコックス属メタン酸
化バクテリアの酵素抽出物を用いてもよく、該抽出物は
会合膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）か
可尋性抽出物でよい。

好ましくは可溶性酵素抽出物、例えばメチロコックス・
カプスラツスのバス株から例えば粗細胞抽出物の遠心分
離等によって得られるもの等を用いてもよい。

基質は抽出物の溶液または懸濁液と直接作動させること
によって酸化してもよいが、より好ましくは抽出物をま
ず適当な固体、例えばガラス、セルロースまたは合成重
合体等に付着させることによって固定させ、これを基質
と接触させる。

抽出物の使用は本発明の範囲内に含まれる全ての基質の
酸化に対して一般に適用できるが、抽出物を使用すると
きに酸化を進行させるにはコファクター、例えばＮＡＤ
Ｈ等が通常必要なことが認められた。

従って、酵素抽出物を用いる本発明方法は本質的特徴と
して典型的には酵素反応を引き起すのに必要なコファク
ターの供給または好ましくは再生を含む。

これらの必要なコファクターの再生には適当な方法また
は手段ならいずれを用いてもよい。

例えば、粗酵素調整には蟻酸塩またはホルムアルデヒド
、または他の適当な電子供与体を触媒量のＮＡＤ＋と併
用して酵素反応を引き起こすのに必要なＮＡＤＨを再生
してもよい。

与えられた基質に対し、酸化速度と得られる生成物は使
用する酸化剤の型、例えば酵素抽出物または完全細胞等
、有機体の種および酸化反応条件を顧慮して変化させて
もよく、また酸化速度と生成物は所望のように適合させ
てもよい。

最適な有機体と条件は当業者にとって自明の簡単な実験
、例えば以下の実施例に記載される方法の類似方法等に
よって決定してもよい。

本発明を以下の非限定的実施例で説明するが、これらの
実施例はバクテリアの培養および高級短鎖アルカン類、
アルケン類および環状有機化合物の酸化に関するもので
ある。

実施例 ｌ バクテリアの培養と可溶性抽出物の調整 ライラテンブリらによって記載された（Ｊ。

Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ−１第６１巻、１９７０年
、第２０５−２１８頁）メチロコックス・カプスラツス
（バス株、（国際寄託番号１１７４０）ｒＭＯＪ ）を
１ＯＯｅ発酵器（ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ ） （Ｌ −Ｔ
−Ｔ −Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌｔｄ−１Ｓｔｏｋ
ｅ Ｐｏｇｅｓ−Ｂｕｃｋｓ 。

Ｕ、に、）中でアンモニウム無機塩培養基中のメタンま
たはメタノール上の一群の培養物内４５℃で培養する（
ダルトン、・ライラテンプリー、１９７６年、ｋｒｃｈ
−Ｍｉｃｒｂｉｏｌ、、第１０巻、第１４７−１５頂）
。

上記発酵器にコルバイ（Ｏｏｌｂｙ）とダルトンによっ
て記載された方法（Ｂ ｉｏｃｈｅｍ Ｊ−１１９７６
年、第１５７巻、第４９５−４９７頁）によって前もっ
て培養した連続培養物１０ｅを接種した後さらに１８時
間培養すると培養物のＥ５４０は約８−１５となる。

生成物をウニストンアリア（Ｗｅｓｔ−ｆａｌｉａ）連
続遠心分離機（Ｗｅｓｔｆａｌｉａ ５ｅｐａｒａｔｏ
ｒＬｉｄ、、Ｗｏｌｖｅｒｔｏｎ、 Ｂｕｃｋｓ、 Ｕ
−に−）を用いて採取する。

遠心分離機の流出液と発酵器は水浴中に浸したステンレ
ス鋼製冷却コイルによって連結する。

このようにして作った細胞ペレットを水冷した２０ｍＭ
リン酸ナトリウム容液で１回洗浄するか、ｐ Ｈ７，０
のトリスＨＣｅ緩衝液で１回洗浄し、５ｍＭＭｇ０ｅ２
を含有する同じ緩衝液５ｍｅ（培養物１ｅ当り）に再懸
濁させる。

細胞の可溶性抽出物はまず細胞懸濁液を圧力１３７ＭＰ
ａ（２００００ｅｂ／１ｎｃｈ２）の圧力でフランス圧
力セルに通してから、５０００Ｐの遠心分離に１０分間
かげ未破壊バクテリアを除去することによって調製する
。

次に粗抽出物５ｏｏｏｏｒで１時間遠心分離し、残った
可溶性抽出物を直ちに液体窒素を入れたジュワー瓶（Ｄ
ｅｗａｒ ｆｌａｓｋ） に滴下してゝレット形に凍
結し、該ペレットを一７０℃で保存する。

可溶性抽出物の蛋白質濃度はフオリンーシオカルトー試
薬（Ｆｏｌｉｎ ０ｉｏｃａｌｔａｕ ｒｅａｇｅｎ
ｔ ）で決定したところ４０−８０ ｍ？／ｍｅであっ
た。

実施例 ２ アルカン類の酸化 数種の反応混合物を７ｍｅコニカルフラスコ中で全晦液
が１ｍｅになるように調製する。

各反応混合物はｐＨ７のリン酸ナトリウム緩衝尋液５０
μｍｏｌ、 ＮＡＤＨ５μｍｏｌ、 ＫＯＮ Ｏ，５Ｉ
ｔ ｍｏｌ 。

および種々の量のアルカン基質、即ちヘキサン、ヘプタ
ン、またはオクタンを含有する。

液状基質は反応混合物に混ぜ、気体状基質はフラスコ内
の気相を部分置換して反応フラスコに加える。

栓をしたフラスコを４５℃の水浴中で４分間培養し、−
１分間あたり９０振動で往復運動させ、実施例１で調製
した可溶性抽出物を解凍してすぐ栓を通して各フラスコ
に注入して酸化を開始させる。

ｎ−オクタンの場合は抽出物を４ｍＳ’加え、他の試験
したアルカンの場合は２ｍｔづつ加える。

アルカン類の酸化速度は生成物の出現を監視して（ｍｏ
ｎｉｔｏｒｉｎｇ ）測定する。

可溶性抽出物の添加直後および１２分間培養後の反応混
合物試料５μｅをガスクロマトグラフに注入する。

１２分間の生成物の形成（速度）は大体直線的である。

しかしながら、ｎ−オクタンの場合生成物は不溶性なの
で反応混合物をまずジクロロメタン１ｍｅで抽出してか
らジクロロメタン抽出物試料５μｅをガスクロマトグラ
フに注入する。

クロモソープ（Ｏｈｒｏｍｏｓｏｒｂ ） １０２ （
ジョンスマンビル、テンパー、コロラド、米国）に担持
したボラパック（Ｐ ｏｒａｐａｋ ） Ｑ （ウォー
ターズ・アソシエーツ、ミルフォルト、マサチューセッ
ツ、米国）または６０−８０メツシユのクロモソープＷ
に担持したカーボワックス（Ｏａｒｂｏｗａｘ ） ２
０Ｍ５重量％を充填した内径４朋、長さ２．１ｍのガラ
スカラムを備えたＰｙｅシリーズ１０４イオン化炎ガス
クロマトグラフを使用する。

生成物は各方略ラムについてのそれらの保持時間（ｒｅ
ｔｅｎｔｉｏｎｔｉｍｅ）と基準試料の保持時間を比較
して同定し、ピークの高さ、またはピーク面積から定量
する。

カラムは温度を５０−２３０℃、キャリヤーガス（窒素
ガス）の流速を１５１５−６Ｏ／分として使用する。

観測されたすべての揮発性生成物は明確に固定された。

種々のアルカン類に関する可溶性抽出物の比活性は１２
分間の培養後の全生成物量から計算し、その結果を表−
１に示す。

表−１には使用した基質および生成物の量も示す。

の不存在下、Ｎ２雰囲気下、ＫＯＮの不存在下、エチレ
ン０．２ｍ＃の存在下、または煮沸抽出物を用いた場合
の評価に関するもので、酸化の抽出物への依存性、ＮＡ
ＤＨへの依存性、酸素への依存性、ＫＣＮによる抑制に
対する抵抗、エチレンによる抑制に対する感度（エチレ
ンはメチロコックス・カプスラツスによるメタン酸化の
特殊な抑制剤として知られている）を示す。

１−および２−アルコール類は容易に生成されるが、よ
り高位のアルカンの場合３−または４アルコール類はほ
とんど生成されず、このことは酵素が１−および２−ア
ルキル炭素原子の酸化に対して特効があることを示す。

実施例 ３ アルケン類の酸化 実施例２と同様にアルケン類、即ちエデン、プロペン、
１−ブテン、ｃｉｓ ２−ブテン、ｔｒａｎｓ２−ブ
テンを実施例１で調製したメチロコックス・カプスラツ
ス（バス）の可溶性抽出物の存在下で酸化する。

また、実施例２のように、１２分間培養後の全生成物量
から比活性を計算する。

しかしながら、生成物の同定は、反応混合物をＨｅ ｅ
２０μｅまたは臭素５μｅを用い４５℃で５分間処理
後生成物がなお存在するかどうかガスクロマトグラフィ
ーによって決定することによりおこなう。

この方法はメイ（Ｍａｙ）とアボット（Ａｂｂｏｔｔ
）の方法に基づくものである（Ｊ−Ｂｉｏｌ。

Ｏｈｅ ｍ １．１９７３年、第２４８巻、第１７２５
−１７３０頁）。

このような条件下で臭素は不飽和化合物に付加し、一方
、希塩酸はエポキシドの加水分解に対し触媒作用をする
。

従って、エポキシエタン、１，２−エポキシプロパン、
１，２−エポキシブタン、ｃｉｓ−２，３−エポキシブ
タン、ｔｒａｎｓ ２ 、３−エポキシブタン生成物
はＨ（１処理後はガスクロマトグラムから消失するが臭
素処理後は残存する。

一方、ｃｉｓ−２−ブテン−１オールおよびｔｒａｎｓ
２−ブテン−１−オール生成物は臭素処理後は消失
するがＨＣｅ処理後は残存し、２−ブタノン生成物はど
ちらの処理をした後でも残存する。

得られた結果を表−２に示す。

右欄括弧内の数字は表−１の場合と同意義である。

両端および内部二重結合は酸化されてエポキシドとなる
。

ｔｒａｎｓ−２−ブテンはエポキシドとブテン−１オー
ルの両方を生じ、このことは内部アルケンの酵素攻撃が
内部二重結合と末端メチル基の両方で起こることを示す
。

ｔｒａｎｓ ２−ブテンはｔｒａｎｓ生戒物の生成生
じ、ｃｉｓ ２−ブテンはｃｉｓ生成物のみを生じる
ことは注目すべきで、このことは立体配置（ｃｏｎｆｉ
ｇｕｒａｔｉｏｎ ） を保持したまま反応が進行する
ことを示す。

実施例 ４ 環状化合物の酸化 可尋性抽出物の酸化活性をシクロヘキサン、幾つかの芳
香族化合物および複素環化合物を前記実施例による方法
で評価する。

使用する抽出蛋白質は全ての場合４ｍｆｔである。

比活性は１２分間培養後の全生成物量から計算するが、
ピリジンの場合は最初３μｍｏｌ 含まれていたピリ
ジンが反応フラスコから消失するのを監視することによ
って決定する。

ピリジン−Ｎ−オキシド生成物は１２分間培養後（最初
ピリジン９０μｍｏｌを含む）薄層クロマトグラフィー
によって同定する。

反応混合物を等容量のジクロロメタンで抽出後方離し、
蒸発乾燥する。

残留物をジクロロメタン０．１ ｍｅに再溶解させ、ピ
リジン−Ｎ−オキシドのジクロロメタン基準溶液と共に
クロマトグラム上にスポットする。

このクロマトグラムをメタノールまたはアセトンで展開
すると、各溶剤中の反応生成物のＲ値は基準のピリジン
−Ｎ−オキシドのＲｆ値と一致し、生成物が同定される
。

実施例３におけるように、他の生成物の同定は反応混合
物を臭素またはＨＣｅで処理後ガスクロマトグラフィー
によっておこなう。

シクロヘキサンの酸化生成物はＨＣｌまたは臭素で処理
しても残存し、ベンゼンまたはトルエンの酸化生成物は
臭素処理後は消失するがＨＣｅ処理後は残存し、スチレ
ンの酸化生成物はＨＯｇ処理後は消失するが臭素処理後
は残存するのでシクロヘキサノール、フェノール、ベン
ジルアルコール、およヒフレゾールとスチレンエポキシ
ドをそれぞれ同定できる。

得られた結果を表−３に示す。

割付けおよび内容は前記実施例の表の場合と同様である
。

シクロ※ぐヘキサンの脂肪族環およびベンゼンの芳香族
環は酸化されてそれぞれシクロヘキサノールおよびフェ
ノールになるが、トルエンは酸化されてベンジルアルコ
ールとクレゾールの混合物になり、このことは酵素攻撃
がメチル基と芳香族環の両方に起こることを示す。

一方、スチレンは酸化されて相当するエポキシドのみを
生じ、芳香族環は酸化されない。

前記実施例１−４は本発明におけるメチロコックス・カ
プスラツス（バス株）のメタン酸化酵素抽出物の調製と
使用に関するものである。

しかしながら、一般に他のメタン酸化バクテリアのメタ
ン酸化酵素抽出物を同様な方法で調製し利用しても同様
な結果が得られることが認められる。

使用する技術や手順の詳細は有機体とその酵素抽出物の
性質によって変えてもよく、このような変形は当業者に
は明白である。

実施例 ５ メチロコックス・カプスラツス（バス）の完全有機体に
よるプロペンの酸化 実施例２−４で用いた手順を変更し、メチロコックス・
カプスラツス（バス）の完全有機体によってプロペンを
酸化する。

有機体の培養物をケモスタツ） （ｃｈｅｍｏｓｔａｔ
）中で希釈速度０．０７／ｈｒで培養し、遠心分離で
採取後、ｐＨ７の２０ｍＭ！Ｊン酸塩緩衝液中に再懸濁
する。

バクテリアｏ、ｓｍＰ（乾燥重量）を含有する懸濁液１
ｍｅを電子供与体としてのホルムアルデヒド４μｍｏｌ
と共に７ｍｇのコニカルフラスコに移し、プロペンガス
２ｍｅを各フラスコ内に注入する。

メチロコックス・カプスラツス（バス）の完全有機体に
よるプロペンの１，２−エポキシプロパンへの酸化に対
する比活性は前記実施例のようにして決定した。

セル蛋白質１ｍＰ当り４５ｍ単位であった。

実施例 ６ 電子供与体としてのＮＡＤＨに対する基質としての蟻酸
塩の使用 実施例２−４の変形として、酵素抽出物の反応を進める
のに必要なＮＡＤＨに対する基質として蟻酸塩を触媒量
のＮＡＤ十と共に使用する。

ＮＡＤＨの代りにＮＡＤ ＋０．ｌ μｍｏｌと蟻酸カ
リウム５μｍｏｌを用いる以外は実施例２−４と同様に
してフラスコ内に試料を調製する。

＠酸塩脱水素酵素の内生的準位（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ
１ｅｖｅｌｓ） （Ｅ Ｃ１，２，１２，；抽出蛋白
質１ｍｆ当り２８０ｍ単位）はＮＡＤ十からのＮＡＤＨ
の生成に対して触媒作用をする。

この系は実施例２−４の基質の触媒的酸化にＮＡＤＨだ
げを使用するように効果的である。

別の態様として触媒量の必要なＮＡＤ十を支持体、例え
ばセファロース（Ｓ ｅｐｈａｒｏｓｅ ）、アガロー
ス（Ａｇａｒｏｓｅ ）またはデキストラン（Ｄｅｘｔ
ｒａｎ）等に固定し、固定物は使用後回収する。

蟻酸カリウムの代りに使用する他の電子供与体としては
ホルムアルデヒド、クルコース−６−ホスフェート、６
−ホスホグルコネート、インクエン酸ナトリウム、ある
いはエタノール等が例示される。

エタノールの場合、酵素抽出物を適当なアルコール脱水
素酵素、例えば酵母菌の粗抽出物等で強化してもよい。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ メチロコックス属のメタン酸化バクテリア培養物ま
   たはメタン酸化系を含有するその抽出物を酸化剤として
   使用するアルケン、環状有機化合物または０．−０．ア
   ルカンの酸化物の製造法。 ２ アルケンを酸化する第１項記載の方法。 ３ アルケンがエチレン、プロペンおよびブテンからな
   る群から選ばれた第１項記載の方法。 ４ アルケンがプロペンである第１項記載の方法。 ５ シクロヘキサンまたはベンゼン環化合物を酸化する
   第１項記載の方法。 ６ バクテリアがメチロコックス・カプスラツス種であ
   る第１項から第５項記載の方法。 ７ バクテリアがメチロコックス・カプスラツスのバス
   株ＮＣｌＢ１１１３２（国際寄託番号ＮＣｌＢ１１７４
   ０）である第６項記載の方法。 ８ 酸化剤がメタン酸化系含有バクテリア抽出物であり
   、これを酸素反応を誘発するに必要なコファクターと共
   に用いる第１項から第７項いずれかに記載の方法。 ９ 酵素コファクターを蟻酸塩、ホルムアルデヒドまた
   は他の適当な電子共与体と触媒量のＮＡＤ＋と併用して
   酸素反応を引き起こすに必要なＮＡＤＨを再生する第１
   項から第８項いずれかに記載の方法。