JPS5826318B2 - Ｌ−セリンの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は醗酵法によるＬ−セリンの製造法に関する。

Ｌ−セリンは医薬品等として重要なアミノ酸の一つであ
り、Ｎ−メチルセリン製造の中間体としても有用な物質
である。

従来、微生物を利用したＬ−セリンの製造法としては、
ＤＬ−グリセリン酸から得る方法（特公昭４２−１７７
２８）、ＤＬ−セリンよりＬ−セリンを得る方法（特公
昭４４−１４７８８）、グリシンからＬ−セリンを得る
方法（特公昭４４−１１１４、特公昭４６−３２７９３
、特公昭４７−３８９９４ ）ブレビバクテリウム属ま
たはコリネバクテリウム属に属する炭化水素資化性菌を
用いて、炭化水素よりＬ−セリンを蓄積せしめる方法（
特公昭４６−２９１９１）が知られている。

また、エタノールを炭素源とする方法では、ブレビバク
テリウム属、コリネバクテリウム属等に属するエタノー
ル資化性菌を用いる方法（特開昭４８−８７０８３、特
公昭４７−２９）が知られている。

しかしながら、本発明に使用されるアルカリ土類金属、
セラチア属またはアシネトバクタ−属に属するエタノー
ル資化性菌を用い、グリシンの共存下エタノールを主炭
素源としてＬ−セリンを生成蓄積させる方法は未だ報告
されていない。

醗酵工業においては、炭素源が重要な要因となっており
、低価格、醗酵管理の容易さ等が要求され、従来上とし
て利用されてきた炭水化物は天然物のため、今後、価格
的に不安定度が増し、かつ量的にも将来確保が困難とな
る場合も予測されている。

このため近年諸種の原料を求めて研究が行なわれ、醗酵
原料として種々の石油化学製品の実用化が考えられるよ
うになった。

エタノールは一般的には、その生育阻害性の印象が強く
、あまり醗酵原料として注目されていなかったが、最近
になりエタノールを強力に資化する菌種探索が行なわれ
、従来法に匹敵するＬ−グルタミン酸生産菌の報告がさ
れる等、有力な炭素源として、考えられるようになった
（ Ａｍ１ｎｏ Ａｃ１ｄ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ
ａｃｉｄ、Ｖｏｌ １９．７３〜８３頁１９６９年）
。

本発明者等も、エタノールを醗酵原料とし、有用な代謝
生産物の生産を目的とし探索を実施したところ、アルカ
リ土類金属、セラチア属またはアシネトバクタ−属に属
するエタノール資化性微生物がエタノールを主炭素源と
し、グリシンを添加した培地にて著量のＬ−セリンを生
成蓄積することを発見しここに発明を完成した。

本発明の目的に使用する微生物は自然界から得られる野
生株であっても、またそれらより公知の手法にて誘導さ
れる変異株であってもさしつかえない。

次に代表的菌株として０ アルカリゲネスエタノフィラ
スＭＡＹ−１０９（微工研菌寄第３５２０号） ０ セラチアマルセツセンスバラエテテイ−ＭＡＹ−１
１０（微工研菌寄第３５２１号） ０ アシネトバクタ−カルコアセティカスＭＡＹ−１１
１（微工研菌寄第３５２２号） の三株のそれぞれの菌学的性質を示す。

（１）アルカリゲネスエタノフィラスＭＡＹ−１０９の
菌学的性質 ■ 形態的性質 ０．８〜１．ＯＸｌ、Ｏ〜２．０μの短桿菌。

周毛が認められ運動性有。

無胞子。ダラム陰性。非抗酸性。

■ 培養的性質 １、肉汁寒天培地 コロニー表面は扁平もしくは、やや隆起。

コロニー周縁は、波状。

２６ 肉汁寒天斜面培地 糸状もしくは、弱圧状。

色調は、濁乳白色。

３、肉汁培地 皮膜を形成する。

液は濁り有。４、肉汁寒天穿刺 表面によく生育。

内部生育は糸状。■ 生育条件 １、生育温度：適温２７〜３５℃、範囲１０〜３９°Ｃ ２、生育ｐＨ： 最適ｐＨ５〜８、範囲ｐＨ４〜１０
３、酸素要求性：好気性 ４、アンモニウム塩の利用性：有 ５、尿素の利用性：微弱に有 ６、硝酸塩の利用性：無 ■ 生理学的性質、その他 １、ゼラチンを液化する ２、 リドマスミルク変化有 ３、硝酸塩の還元性：陽性 ４、インドールの生成：陰性 ５、硫化水素の生成：陰性 ６、でん粉の加水分解：陰性 ７、フォーゲルプロスカラエル反応：陰性８、メチルレ
ッド反応：陰性 ９、カタラーゼの生成：陽性 １０、ウレアーゼの生成：微弱 １１、炭水化物の醗酵性 キシロース、グルコース、マンノース、 ガラクトース、フラクトース、マルトース、サッカロー
ス、セロビオース、トレハロース、デンプン、イノジッ
ト、マンニット、ソルビット、グリセリン、エスクリン
、ザリシンから酸を生成するが、ガスの発生はない。

アラビノース、ラクトース、メレビオース、ラフィノー
スからは酸の生成もガスの発生もみられない。

１２、ビタミンの要求性：無 １３、酢酸の資化性二弱 １４、クコン酸の利用性：無 １５、脱窒素反応：陽性 以上の如く本菌は、ダラム陰性の桿菌で、胞子形成は認
められず周毛によりよく運動する。

コロニーの色調は、乳白色でエタノール、酢酸を資化す
るが、デンプンは資化しない。

リドマスミルクをペプトン化する特徴を有する。

従って、本菌はアルカリ土類金属に属する事は明白であ
るが、バージ−マニュアルの第８版に記載されている４
種との比較においてアルカリゲネス、アクアマリナス（
Ａｌｃａｌ ｉｇｅｎｅｓｓａｐｕａｍａｒ １ｎｕｓ
）とは、デンプンの資化性が無いことで異なり、アル
カリゲネス・オイトロハス（Ａｌｃａｌ ｉｇｅｎｅｓ
ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）とは、エタノールの資化性を有
する事で異なる。

また、アルカリゲネス・バラドクサス（Ａｌｃａｌ ｉ
ｇｅ−ｎｅｓ ｐａｒａｄｏｘｕｓ）とは、コロニーが
乳白色である点で異なる。

アルカリゲネス・フェカリス（Ａｌｃａｌ ｉｇｅｎｅ
ｓ ｆａｅｃａｌ ｉｓ ）とは、リドマスミルクがペ
プトン化する事で異なる。

従って、本菌はどの種にも属さないのでアルカリ土類金
属の新種と考えられ、アルカリゲネス・エタノフィラス
ＭＡ Ｙ−１０９（Ａｌｃａｌ ｉｇｅｎｅｓｅｔｈａ
ｎｏｐｈｉｌｕｓ ）と命名した。

（２＞ セラチアマルセルセシスバラエティーＭＡＹ
−１１０の菌学的性質 ■ 形態的性質 ０．８〜１．２Ｘ１．０〜２．０μの短桿菌。

周毛を有し、運動性有。

無胞子。ダラム陰性。非抗酸性。

■ 培養的性質 １．肉汁寒天培地 コロニー表面は、円錐状、色調ピンク、 コロニー周縁は波状。

２、肉汁寒天斜面培地 糸状もしくは弱症状。

３、肉汁培地 皮膜形成有。

液に濁り有。４、肉汁寒天穿刺 表面によく生育。

内部生育は糸状。■ 生育条件 １、生育温度：適温２７〜３５℃、範囲１２〜３８°Ｃ ２、生育ｐＨ：最適ｐＨ５〜８、範囲ｐＨ５〜１０３、
酸素要求性：好気的 ４、アンモニウム塩の利用性：有 ５、尿素の利用性：無 ６、硝酸塩の利用性：無 ７、耐塩性：肉汁培地試験 ３％にて良好な生育。

■ 生理学的性質、その他 １、ゼラチンを液化せず ２、 リドマスミルク変化無 ３、硝酸塩の還元性二弱 ４、インドールの生成：無 ５、硫化水素の生成：無 ６、でん粉の加水分解：無 ７、 フォーゲル・プロスカラエル反応：陰性８、メチ
ルレッド反応：陰性 ９、カタラーゼの生成：陽性 １０、ウレアーゼの生成：陰性 １１、炭水化物の醗酵性 アラビノース、キシロース、グリコース、マンノース、
ガラクトース、フラクトース、マルトース、サッカロー
ス、ラクトース、メレビオース、セロビオース、トレハ
ロース、ラフィノース、デンプン、イノジット、マンニ
ット、ソルビット、グリセリン、エスクリン、ザリシン
から酸の生成及びガスの発生は、いずれもみられない。

１２、ビタミンの要求性：無 １３、クコン酸の利用性：無 １４、脱窒素反応：陽性 本菌は、ダラム陰性の桿菌で胞子形成は認められず、周
毛により運動性を有する。

また本菌はピンク色のコロニーを形成する特徴を有する
。

従って本菌は、セラチア属に属することは、明白である
が、各種糖質からの酸の生成が認めラレない事より、セ
ラチアマルセツセンス（５ｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅ
ｓｃｅｎｓ）のバラエティート判断し、セラチア・マル
セツセンスバラエティーＭＡＹ−１１０と命名した。

（３）アシネトバクタ−カルコアセティカスＭＡＹ１１
１の菌学的性質 ■ 形態的性質 １．０〜１．２Ｘ１．５〜２．０μの短桿菌、運動性無
、無胞子、ダラム陰性、非抗酸性。

■ 培養的性質 １、肉汁寒天培地 コロニー表面は、台状隆起。

色調淡黄白色。

２、肉汁寒天斜面培地 糸状もしくは弱症状。

３、肉汁培地 皮膜形成布 ４、肉汁寒天穿刺 表面によく生育。

内部は糸状。■ 生育条件 １、生育温度：適温２７〜３５°Ｃ１範囲１１〜３７℃ ２、生育ｐＨ：最適ｐＨ７〜８、範囲ｐＨ６〜１０３、
酸素要求性：好気的 ４、アンモニウム塩の利用性：有 ５、尿素の利用性：無 ６、硝酸塩の利用性：無 ７、耐塩性：肉汁培地試験 ３％にて良好な生育 ■ 生理学的性質、その他 １、ゼラチンを液化せず ２、 リドマスミルク変化無 ３、硝酸塩の還元性：無 ４、インドールの生成：無 ５、硫化水素の生成：無 ６、でん粉の加水分解：無 ７、 フォーゲルプロスカラエル反応：陰性８、メチル
レッド反応：陰性 ９、カタナーゼの生成：陽性 １０、ウレアーゼの生成：陰性 １１、炭水化物の醗酵性 アラビノース、キシロース、グルコース、マンノース、
カラクトース、フラクトース、マルトース、サッカロー
ス、ラクトース、メレビオース、セロビオース、トレハ
ロース、ラフィノース、デンプン、イノジット、マンニ
ット、ソルビット、グリセリン、エスクリン、ザリシン
からの酸の生成及びガスの発生は、いずれもみられない
。

１２、ビタミンの要求性：無 １３、クコン酸の利用性：微弱 １４、脱窒素反応：陰性 １５、酢酸の利用性：弱 本菌は、ダラム陰性の胞子形成能及び運動性のない桿菌
であって、糖質からの酸の生成及びガスの発生は認めら
れないが、酢酸を資化する特徴を有する。

従って、本菌は、アシネトバクタ−属に属し、アシネト
バクタ−・カルコアセティカス（Ａｃ１ｎｅｔｏｂａｃ
ｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉ−ＣＵＳ）とよく一致し
たので、アシネトバククーカルコアセティカスＭＡＹ−
１１１と命名した。

本発明の実施に際し、培養に使用する培地組成は、エタ
ノールを主炭素源とし、グリシンを含有するものであれ
ば、窒素源無機塩は、特に限定されない。

窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等を単独もしく
は、混合して用いることが出来る。

無機塩としては、リン酸−水素カリ、リン酸二水素カリ
、硫酸マグネシウム等が用いられる。

この他に菌の生育及びＬ−セリン生成に必要であればペ
フトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイブリカー
、カザミノ酸、各種ビタミン類等の栄養素を培地に添加
することができる。

培養は、通気攪拌、振盪等の好気的条件下で行ない、培
養温度は２５°Ｃ〜３５°Ｃが適当である。

培養中のｐＨは、５〜９が好ましく、出来るならば、中
性付近にて行なうの、がよい。

培養液中のｐＨの調整には酸、アルカリを常法通り添加
して行なう。

グリシンの添加濃度は０．５〜５Ｗ／ｖ％好ましくは１
〜３Ｗ／ｖ％である。

培養開始時のエタノールの濃度は、１〜３Ｖ／Ｖ％が適
当である。

培養期間は、２〜８日間を要する。

培養液からのＬ −セリンの回収方法は、培養液より遠
心分離等により、菌体を除いた後、公知の手法すなわち
イオン交換樹脂処理法、沈澱法等により、容易に培養液
中よりＬ−セリンを回収することが出来る。

得られたＬ−セリンの確認及び定量は、ペーパークロマ
トグラフィーによるニンヒドリン発色法、さらに、ロイ
コノストックメセンテロイデスＡＴＣＣ８０４２による
バイオアッセイによった。

以下本発明の実施例について説明するが、本実施例は、
単なる一例示であって、何等本発明を制限するものでは
ない。

なお実施例中のＬ−セリンの蓄積量は、培地中のＬ−セ
リン含量を差し引いた値である。

実施例−１ 尿素２．０ｇ、硫安７．０ ｇ、ＫＨ２ＰＯ，０，５ｇ
、Ｋ２ＨＰＯ４０，５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，５
ｇ、酵母エキス１．０ｇ、カザミノ酸１．０ｇ、ＦｅＣ
ｌ３・６Ｈ２０２■、ＭｎＳＯ４４〜６Ｈ２０２１ｎ９
、ＮａＣ１１２ｍ９、ＣａＣｌ２・２Ｈ２０２■、ビオ
チン４μｇ、チアミン１００μｇ水道水１１を成分とす
る前培養用醗酵培地１０ｒｆＬｌを２４〆試験管に分注
し、１２０℃、１０分間殺菌する。

Ｌ−セリン生産菌アルカリゲネスエタノフィラスＭＡＹ
−１０９のブイヨン寒天上の生育菌体をこれに接種し、
エタノール０．２−を無菌的に添加し、３０℃にて２日
間振盪培養を行なう。

次に尿素２．０ｇ、硫安７．０．９． ＫＨ２Ｐ０゜０
．５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４０，５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０
０，５ｇ、酵母エキス５．０ｇ、カザミノ酸２．０ｇ、
ＦｅＣｌ３・６Ｈ２０２Ｔｎ９、Ｍｎ Ｓ ０４４〜６
Ｈ２０２Ｔｎ９、ＮａＣ１２Ｔｎ９、ＣａＣ１１２・
２Ｈ２０２７７１＆、 ビオチン４μｇ、チアミンｉｏ
ｏμｇ、グリシン２（Ｂｉ’、水道水１１を成分とする
本培養用醗酵培地５０ｍ１を５００−容三角フラスコに
分注し、１２０℃、１０分間殺菌する。

次に前記前培養醗酵液１０ＴＬｌを無菌的に接種し、同
時にエタノール１．０１１Ｌｌを無菌的に加え、３０℃
にて振盪培養を行なう。

エタノールは、消費にともない培養３日目、５日目にそ
れぞれ１．０ｍｌ無菌的に加え、培養を継続すると、培
養７日目に培養液中にＬ−セリンが１２０ ｍｌ／／１
生成蓄積された。

醗酵終了液１１から、遠心分離により菌体を除き、上澄
液を塩酸にてｐＨ４にし、強酸性イオン交換樹脂ダウエ
ックス５０（Ｈ＋タイプ）に貫流し、Ｌ−セリンを吸着
させた。

次によく樹脂を水洗後、１．５Ｎアンモニア水で溶出し
、溶出液を減圧濃縮し、濃縮液に、冷アルコールを加え
、沈澱を分別、乾燥してＬ−セリンの粗結晶７０ｒｎＩ
ｌを得た。

実施例−２ 実施例−１と同様の方法にてセラチアマルセツセンスバ
ラエティーＭＡＹ−１１０を培養したところ８０■／ｌ
のＬ−セリンが生成蓄積された。

実施例−３ 実施例−１と同様の方法にてアシネトバクタ−カルコア
セティカスＭＡＹ−１１１を培養したところ９０■／ｌ
のＬ−セリンが生成蓄積された。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ アルカリ土類金属、セラチア属またはアシネトバク
   タ−属に属し、エタノールを資化し且つグリシンよりＬ
   −セリンを生成する能力を有する微生物を、エタノール
   を主炭素源としグリシンを含有する液体培地中に培養し
   て培地中にＬ−セリンを生成蓄積せしめ、これを採取す
   ることを特徴とするＬ−セリフの製造法。