JPS58223066A - Ｇｄ↓３ガングリオシドの存在を検出する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明者らは先にヒトの黒色腫細胞の培養物に対しマウ
スＩ＃Ｇｍ単りｐ−ン抗体（ＡｂＲ，）が血清に特異的
に高感度を有することを開示した（参照（１））。試験
された全ての黒色ｍ細胞系及び２種の星状細胞腫はこの
抗体によって検出された熱安定性細胞表面抗原に対して
陽性であった。しかしながら、脈絡膜の黒色細胞及び脳
は抗原のレベルは低かった、広い種類の他の細胞及び組
織は不反応性であった。同様な限られた特性を有する３
種の他の単クローン抗体（Ａｂｓｃ、　ｌ　１１４及び
ＫＯ）は同一の融合から導かれた。

これらの抗体は同様な黒色腫と強い反応性を示すそして
上皮細胞との反応性に乏しい、しかし僅かながら広い特
異性の範囲を有していたそれらロスＭＯＬＴ−４（Ｔ−
細胞系）、白血球及び或稙の胎児組織と弱く反応する。

Ａ　ｂ　Ｒｕにより検出された抗原は先に特性が明らか
になったジシアロ　ガングリオシド（ｄｉｓｉａｌｏｇ
ａｎｇｌｉｏｇｉｄ＊）　ＧＤＩ−としてその中に同定
される。他の細胞と組織との比較株、黒色細胞はＧＤ３
の高しくルを有している。かくして、これらの抗体は組
織試料が黒色庫かそうでないかの検出に使用される。こ
のことは特性か明らかな病巣に対し特に有用である。こ
れらの抗体はまた血清、血漿、尿又は他の体液中のＧｏ
ｓの検出液に用いることもできる。これは黒色腫及びグ
リコリポイドレ（ルが上昇している他の病気の可能性の
早期診断に役立つことができる゛。

マウス単クローン抗体ＡｂＲ２ａ　（Ｄｉｐｐｏｌｄ　
　ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｅａｄ　Ｓｅｔ　　７７
；６１１４−６１１８゜１９８０）はＰＡ−ＭＨＡ血清
学的検定を用いて生活し得る培養細胞で試験した場合、
ヒト黒色腫細胞に対し高度の特異性を有している。

この抗体により検出された抗原は黒色腫細胞から単離さ
れたそして組成的及び部分構造分析により及び薄層クロ
マトグラフ（ＴＬＣ）により′　　　標準ＧＤＩＩと比
較することによって（ｔｏｓガングリオシドであること
を示した。Ａ　ｂ　Ｒ，、は標準ＧＤ８と反応する。し
かし試験された他のどのガングリオシドとも反応しなか
った。ＴＬＣ及びＡｂＲ，４との反応性を用い、広範囲
の細胞及び組織についてＧｐｓの存在を試験した。グリ
コリポイド媒介免疫結合（ＧＮＩＡ）とよぶ新らしい血
清学的検出はガングリオシドとＡ　ｂ　Ｒ，、の反応性
を検出することにより行われる。黒色腫（培養細胞又は
腫瘍組織）は主ガングリオシドとしてＧＤ、及びＧＭＩ
Ｉを有することを示した。試験した他の細胞及び組織も
またＧＤＩを含むが、一般に僅かであった。黒色腫（及
びＭＯＬＴ−４、Ｔ−細胞系）は主成分としてＧＤＩ及
びＧＭｓｔ持つ単純化したガングリオシド輪郭により特
徴づけられた。黒色腫細胞に対するＧＤ、の偏在とＡｂ
Ｒ，、の血清学的特異性の明瞭な差異は異なる細胞中の
ＧＤＳの局部化と濃度の関係で説明することができる。

組織培養 黒色腫及び他の細胞の誘導及び培養について　　　　計
は参照文献１〜４を参照する。一般の悪性組織は外科的
又は死後の標本から得られた。

マウス単クローン抗体ＡｂＲ２４＋　ＡｂＣｌｌｖ　Ａ
ｂ　１１２及びＡ　ｂ　Ｎ、は先に参照（１）に記載さ
れている。

Ａ　ｂ　Ｒ，４及びＡｂＣ，はＩｐＧ、抗体でありそし
てＡｂＩ□及びＡｂＮ、はそれぞれＩ＃Ｇ、ｂ及びＩＩ
ＩＧ、抗体である。

グリコリポイド ＧＤＩはＤｒ、　Ｙ−Ｔ、Ｌｉ、　　）ウラン大学、ニ
ューオーリンズ（参照５）から得られた。０Ｍ８及びＧ
Ｍ！はＤｒｓ６８．Ｋｕｎｄｕ及びり、　Ｍ、　Ｍａｒ
ｅｕｓ、ベイラー大学、ヒュウストン、　ＴＸから得ら
れた。

’ＪＭＨ＋　ＧＤｌａ　＋　ＧＴＩはスペルコ（５ｕｐ
ｅｌｃｏ）　Ｉｎｓ、。

ペルホンテ。ＰＡから購入した。ラクトシル−セラミド
はグリコリポイド　／々イオケミカルＣＯａノ々−ミン
ガム、　ＡＪから購入した。

黒色腫表面細胞抗原の血清学的検出 黒色腫細胞の細胞表面抗原とＡ　ｂ　Ｒ，、及びＡｂＣ
。

の反応性はレッド　セル　ロゼツテイング法（ｒｅｄ　
ｃ＠ｌｌ　ｒｏｓｓｔｔｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ）（ｇ照
３）を用い標識セルはヒトＯレッド　セル（ＲＢＣ）を
、スタヒロコツ力ス　アウレウス（８ｔａｐｈｙｌｏｅ
ｏｅｅｕａａｕ’ｒｅｕｓ）プロティンＡは（ＰＡ−Ｍ
ＨＡ）と結合されているものを用いてミクロテスト（Ｍ
ｉｃｒｏｔｅｓｔ）プレートのウェルで生育した培養細
胞で測定した。ＡｂＩ、、及びＡ　ｂ　Ｎ、はウサギ抗
−マウス１９−結合標識セルを用いたこの方法の変形法
を用いて検出した。

酵案処理 上記の如く黒色腫細胞がミクロテスト　プレートのモル
レーヤーとして生育したら、バンク（Ｈａｎｋ）の平衡
塩溶液（ＨＢＳＳ、　　ミクロノ々イオ四ジカル　アソ
シエー）　（Ｒ（ｌａｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＡｓｓ
ｏｃｌａｔｅｓ　）　：］で洗い、そして後ビブｐ　コ
レアエ（Ｖｉｂｒｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ）ニウラミニダ
ーぞ〔力ルビオフェミ−（Ｃａ１ｂ（ｏｅｈ＠ｒｎ　）
　：）又はβ−ガラクトシターゼ〔シグマ（Ｓ１ｇｍ！
Ｌ）タイプＶｌｌ：］を１０μｌのＨＢＳＳ中　ＩＵ／
ウェルを用いて処理した。

後３７°で１時間培養し、この細胞をＰＢＳ−２％ガン
マ−グロブリン（ＧＧ）−フリーＦＢＳで４回洗いそし
てＰＡ−又社１ｇＧ−Ｍｌ（八を用いて抗体との反応性
を測った。

グリコリポイドの単離 グリコリポイドはＳｍ１ｔｏ及びＩ（ａｋｏｍｏｒｌの
方法（参照６）の変形法により始めの単離を行い、そし
てＤＥＡＥ−セファデックス　クロマトグラフィーによ
り中性及び酸性フラクションを分離した。酸性グリコリ
ポイド（ガングリオシド）は続いてＤＥＡＥ−セファデ
ックス　クロマトグラフィー及びアルカリ加水分解によ
りクロロ゛ホルムーメタノール（Ｃ−Ｍ）抽出物から直
接単離した（参照７）。簡単に細胞はＣ−Ｍ（２：１）
中へ均質化されそして後Ｃ−Ｍ（１：１）で再抽出され
た。Ｃ−Ｍ（１：２）の抽出物を蒸発及び再溶解した後
、濾過し、蒸発し、そして冷却しつつ２４時間蒸溜水水
に透析した。透析後、試料は蒸発され、Ｃ−Ｍ−Ｈ，Ｏ
（３０ｉ　６０：８）にとかし、そしてＤ’Ｅ’ＡＥ−
セファデックＸ　　カラム（Ｃ−Ｍ−０，８μＩ）’＃
＋）リウムで平衡にされた）に適用した。このカラムを
Ｃ−Ｍ−Ｈ，０（３０：６０：８　）で洗った後、酸性
リゾイドがＣ−Ｍ−０，８Ｍ酢酸ナトリウム（ａ。

：６０：８）で溶離され、そして蒸発しそして前述のよ
うに透析した。この酸性プラクジョンは後メタノール中
０．１　Ｎ　Ｎａ０Ｈｒ３７　Ｕｒ３時間加水分解し、
冷水に４８時間透析し、蒸発しそしてＣ−Ｍ（４：１）
中にとがした。この溶液ヲ予めＣ−Ｍ（４：１）で洗っ
たビオシル（Ｂｌｏｓｉｌ　）　Ａカラムに適用した。

Ｃ−Ｍ（４：１）で不純物を溶離した後、ガングリオシ
ドがＣ−Ｍ（１：２）で溶離された。

薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ） シリカゲル　プレート〔レッドプレート、プイッシャー
　サイエンティフィックＣｏ（ＦＩ■ｈ＠ｒＳｅｉｅｎ
ｔｌｆ１ｃ　Ｃｏ、）　）を１２０ｃで１時間加熱し活
性化した。展開り四マドグラムに用いる溶媒はｎ−プｏ
　／’！　／　−ｋ　−ＮＨ４０Ｈ−Ｈ，０６０：　９
．５：１１．５（溶媒１）（参照８と同じ）、及びり四
ｐホルム：メタノール：　２．５　Ｎ　ＮＨ４０Ｈ１６
０：４（Ｍ９（溶媒２）であった。

溶媒を始めの所から１２ｃ１ｎ移したらすぐプレートを
除いてそして１１０〜１２ｏｃで１２〜１５分空気乾燥
し、室温に冷却し、そしてレゾルシノール−ＨＣｌ！（
参照９）を噴霧する。

予備分析のために、プレートを空気流フード中で室１１
１Ｋて２〜３時間乾燥した。ノ々ンドがヨード蒸気で現
視され、輪郭が明瞭になり、そしてシリカゲルをプレー
トがらかき取った。このゲルを後Ｃ−Ｍ−Ｈ，Ｏ（ｓｏ
：５ｏ：ｔ５）４０ｍ／及び少量のダウエックス５０　
（Ｎａ”）で゛２回抽出した。懸濁液を１５分間１ｏｏ
ｏｒ−で遠心分離しそして上記のビオシルＡカラムに適
用する。不純、物をＣ−Ｍ（４：１）で溶離しそして吸
着されたガングリオシドを後Ｃ−Ｍ（１：２）で溶離し
た。

炭化水素分析 セルペレット中のりボイド−結合シャル酸はワーレン（
Ｗｍｒｒｓｎ）により記載（参照１０）されているよう
に１時間ＳＯＣで０．ＩＮＨＣＪ中で加水分解後、Ｃ：
Ｍ（２：１および１：２）抽出物で決定した。砂糖は彼
等のＯ−）　ＩＪフルｔ”酢酸（参照１１）の如くメタ
／−リシスＣｌり／−ル性０．Ｉ　Ｎ　ＥＩＣＩ　テ１
００’　１６時間）後測定された；Ｎ−アセチル　ノイ
ラミンＭは１、０　Ｎ　　ＨＣＪ　テ８０’、１．０時
間メタ／−ＡｙシＸ後同−操作により同定した。

グリコリポイドの血清学的検定 （：）受身赤血球凝集検定（Ｐａ５ｓｉｖｅ　ｈｅｍｍ
ａｇｌｕ−ｔｉｎａｔｌｏｎ　　ｍｓｍａｙ　）　（参
照１２）グリコリポイド（６μＩ　シャル酸）全溶解し
、管（１０Ｘ７５ｗｏｗ）中に等分に分けて入れる。そ
して真空中でｐ、ｏ、のデシケータ−中で乾燥する。６
管にＰＢＨの２００μノを加え、管の横をこする。そし
て溶液を５０ｃで１５分音波を当てた。大きな管に移し
た後ＰＢＳの０．８　ｍｌを加えた。グリコリポイド溶
液にＰＢＳ中ヒ）Ｏ−ＲＢＣの２％懸濁液を徐々に滴下
した。３７Ｃで３０分後１度混合し１時間後、このセル
をＰＢｓ　（各１２ｍＪ）で２回洗った。反応性は処理
したＲＢＣの懸濁液とミク四タイター（ｍｌｅｒｏｔｌ
ｔ＠ｒ　）プレー゛ト中の適当に希釈したＡｂＲ，４（
５０μ！各）を混合することにより試験した。４Ｃで１
−２時間後、凝固反応は視的に測定された。

（１１）抗体阻害検定 Ｃ−Ｍ（１：２）に溶解したグリコリポイド（６μｙシ
ヤル酸）を管（６Ｘ５０１ｍ＋）に等分に入れそして前
分析として乾燥した。

ＡｂＲｕ（１ｉ　２Ｘ１０’）を３０μ！加えそして管
を旋回させた。室温で３０分そし、て後４′ｃで３０分
間培養した。管を２００Ｏｒ−で２０分間遠心しそして
表面浮遊物を除きそして連続的に、希釈した。これらの
試料は直ちにホルムアルデヒド固定ＳＫ−ＭＥＬ−２８
ターゲツトセルに移したしホルムアルデヒド固定はＰＢ
Ｓ中０．３３％ＨＣＨＯミクロテスト　プレート〔ファ
ルコン（Ｆａｌｃｏｎ　３０３４　）　）のウェルに中
に生育する細胞をＰＢＳ中０，３３％ＨＣＨＯで処理す
ることにより行なった。この処理はＡｂＲ，の反応性を
変えることはない。

ソシてターゲットセルのすぐに役立つ原料の貯蔵に提供
される〕。抗体反応性はＰＡ−ＭＨＡ検定法で検出され
た。非吸着抗体はポジティブコントソールとして使用さ
れる。

（ｌｉｉ）　　グリコリポイド−媒介免疫結合検出（Ｇ
ＭＩＡ）９５％エタノール中グリコリポイドの溶液をマ
イク四テスト　プレート〔ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ　
３０３４　；ウェル当り１０μｌ　））のウェルに加え
そしてこのプレートを４５分間Ｐ！偽で真空中デシケー
タ−で乾燥した。リポイド−結合シャル酸の約１００　
ｎＪｉｌは有効な吸収及び抗体と最高に反応性に対する
適当量であった。ウェルはＰＢＳ−２％ＧＧ−フリーＦ
ＢＳ（１０ｍＪ／洗滌）で３回洗い、そしてプレートを
ガーゼでじみをつけた。希釈した抗体（５％ＧＧ−フリ
ーＦＢＳ含有ＰＢＳ中）をウェルに加えた。そして室温
で４５分培養した。プレートをじみをつけ、ＰＢＳ−２
％ＧＧ−フリーＦＢ８で４回洗った。そして再びじみを
つけた。ゾｐティンＡ−結合０−ＲＢＣの０．２％懸濁
液の１０μノをウェルに加えた。プレートを室温で３０
分間培養した。

じみをつけた後、プレートをＰＢＳ−２％ＧＧ−フリー
ＦＢ８で２回洗い、再びじみをつけそして光顕微鏡の下
で読んだ。反応はレッド　セルにより被覆したウェルの
割合により測定された。試験はウェルが結合セルが見え
なかった時又はセルの周囲が薄い環であった場合は負と
して読んだ。

（１ｖ）　　薄層クロマトグラフィーにより分離した後
血清学的−反応性グリコリポイドの検出薄層りｐマドグ
ラフィーにより分離されたグリコ、リポイドの血清学的
反応性は１”ｌ−プロティンＡを結合抗体の検出に用い
るＭａｇｎａｎｌら（参照１３）の方法の変形によって
試験された。溶媒ｌ又は２中でタロマドグラフィーした
後、薄層は１％ポリビニル＆０リドンを含むＰＢ８緩衝
液中で洗われそして４Ｃで６時間ＡｂＲ，，（１：　１
５００　）で処理した。プレートは１！ｌ　１−プロテ
ィンＡ（１０μｃｌ／μＩｉ　７　Ｘ　１０’　ｃｐｍ
／　ｍｌ　）で処理され、Ｈｕｎｔ＠ｒ及びＧｒｏｎｗ
ｏｏｄ　（参照１４）の手順に従って調竪された。４Ｃ
で１２時間放置後、プレートはＰ　Ｂ　’Ｓで洗い、空
気で乾燥しそして２−６時間りｐネックス（ｅｒｏｎ＠
ｘ　）増感スクリーンを有するＸ−オマット（Ｏｍａｔ
）Ｒフィルムにさらした。

結　　　　　果 ノイラミニダーゼ〔ビゾロ　コレラエ（Ｖｉｂｒ。

ｃｈｏｌｅｒａｓ　）　）で処理後、ＳＫ−ＭＥＬ−２
８黒色腫細胞はもはやＰＡ−ＭＩ（Ａ検定においてＡ　
ｂ　Ｒ１４と反応しなかった（後記の表１）。ＡｂＣ。

（４ｂＲｕ　　と同様な血清学的特性を持った抗体（参
照１）〕との反応性もまた失なわれた。

８に−ＭＥＬ−２８のグリコプロティンに血清学上無関
係の決定子と確認されるＡ　ｂ　Ｎ、とＡｂＩｌ。

との反応性はノイラミニダーゼにより影響されなかった
。酵素−処理細胞はプロティンＡ又は抗−マウス　ＩＦ
−標識細胞と何れにも無特性反応性を示さなかった。β
−ガラクトシダーゼはＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞とＡｂＲ
２４又はＡｂＣ，との反応性において検出し得る効力は
持っていなかった（表１）。これらの結果はシャル酸は
抗体Ａ　ｂ　Ｒ，、及びＡｂＣ，によりｆａ詔された抗
原決定子の重要部全構成していることを示した。

ＳＫ−ＭＥＬ−２８とＡ　ｂ　Ｒ，４の血清学的反応性
はニウラミニダーゼを除去しそしてＭＥＭ−ＦＢ８″ｒ
ａき代えた後３０分間は不検出であった。この媒体で３
７ｔ、’に培養を続け、２時間後Ａ　ｂ　Ｒ，４反町芯
性の一部復元か生じそして２２時間後血清学的反応性が
完成に復元した（第１図）。

同定 グリコリポイドはり四ロホルムーメタノール（Ｃ−Ｍ）
抽出及び５ａｔｏ及びＨａｋｏｍｏ　ｒ　ｉの開示（参
照５）によりそれらのアセテートのフロリシル（Ｆｌｏ
ｒｉｓｉｌ　）クロマトグラフィーにより、培養した黒
色腫細胞（８に−ＭＥＬ−２８）から単離された、そし
てグリコリポイドの調整はＤｇＡＥ−セファデックス　
クロマトグラフィーにより中性及び酸性成分に分画され
た。ＡｂＲｕ抗体（ＰＡ−ＭＨＡで検出される）に対す
る阻害活性は酸性グリコリポイド　フラクション中に主
としであることが判った。

その後の実験罠おいて、８に−ＭＥＬ−２８細胞からの
酸性グリコリポイドはＤＥＡＥ−セファデックスのＣ−
Ｍ抽出の分画（参照６）及びアルカリ加水分解によって
不純物のホスホリポイドを除くことによって直接単離さ
れた。この混合物中の個々のガングリオシドは溶媒ｌ中
でプレノにラテイブ薄層クロマトグラフィーにより（参
照８）単離された。プレートからシリカゲルノフンドを
切り取りそしてグリコリポイドを抽出することにより、
抗原活性はＣＭ、及びＣＤ＋ａ上’に移転した主酸性グ
リコリゾイド　ノ々ンドの中にあった（第２ｖｚＪ）。

第２図中に表われたデータにおいて、フラクションの抗
原活性はＧＭＩＡ検出により測定された。四′様の結果
はＡ　ｂ　Ｒ，４と８に−ＭｗＬ−２８標本細胞とのＰ
Ａ−ＭＨＡ検出を用いて抗体阻害試験により得られた。

単離すれたＡ　ｂ　＆４−反応性グリコリポイドは下記
規準に従ってｃＤｓ　ＣＮＡＮＡ　（２→８）ＮＡＮＡ
（２−＋３）Ｇａ／β（１−＋４　）　Ｇｌ　ｃ　−ｃ
ａｒａｍｉｄｓ　）として同定した。（１）含有グリコ
ース、ガラクトース及びＮ−アセチルノイラミン酸が１
．０　：　１．０９：２．１１゜ヘキソサミンの痕跡（
＜０．１）の副台を示す純粋グリコリポイドのカルゼハ
イドレート分析、（ＩＩ）ビブリオコレラｘ　（Ｖｉｂ
ｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｓ）ニウラミニダーゼ（３７Ｃ
で３時間）でガングリオシドの部分加水分解はＣＭ、と
ラクトシルセラミドで薄層クロマトグラム上に２つの成
分を形成させる（第３図）。そして（ｔＶ）　Ａ　ｂ　
Ｒ２４は標準ＧＤｓと反応するが、他の標準ガングリオ
シド試験の何れにも反応しなかった（下記参照）。

（１）種々の原料からのガングリオシドの薄層クロマト
グラフーノ臂ターン全ガングリオシドフラクションは極
めて多種類の腫瘍細胞系、新鮮腫瘍及び正常組織から調
整した。これらノ抽出物がＴＬＣにより分画されそして
ガングリオシドをレゾルシノール試薬を用い検出した時
、黒色腫はガングリオシドの特有パターンを持つことが
明らかになった。全ての黒、　　色原細胞系の実験にお
いて、ＣＤｓとＣＭｓと弁移動するグリコリポイドは主
として酸性グリコリポイドであった。これらの細胞系の
多くの主要成分はＧＤｓと反応した（第３図及び第４図
）。ＣＤ８はまたマウスの目及びウシの脈絡膜の抽出物
中の主にガングリオシドであった。

ＭＯＬＴ−４（Ｔ−細胞系）を除いては、他の細胞又は
組織は主要成分としてＣＤ８を持っていなかった。

新鮮黒色腫瘍の抽出物はＧＤｍ及び（３ＨＢが優位性を
もちＳＫ−ＭＥＬ−２８と似たガングリオシドパターン
を有していた（第３図）。

殆どの黒色腫細胞系はこの単純化したノソターンを持っ
た。しかしながら幾つかは高ガングリレボイドがかなり
の量検出でき一層複雑なプロフィルを示した（第３図及
び第４図）。

ＧＤＳは実験した黒色腫細胞系の全ガングリオシド画分
の１８−６３％を構成していた（第４図）。殆どの黒色
腫細胞系及び組織標本は３０−５０％範囲の値であった
。この値は成人制において７％、腎臓楠細胞系（８に−
Ｒｅ−７）におい１９％、ＲＡＪＩ細胞（）々−キ゛ツ
）　（Ｂｕｒｋｉ　ｔｔ　）リンパ様組織腫）において
１１％、ＭＯＬＴ−４細胞において３３％と対比された
（、第４図）。ＡｂＲｕの血清学的反応性の見地から、
それらのグリコリポイド画分中のＧＤｍの割合が高いこ
と、また全ガングリオシドのレベルが高いことは重要な
ことである。

このことは、細胞糸の数においてリポイド−結合シャル
酸のレベルの測定から明らかである。黒色腫において、
その値は０．０３９−０．０６３μｍｏ　１／　０．１
　ｍｌ細胞の範囲であった（９系で測定した）。ＲＡＪ
Ｉ、ＭＯＬＴ−４及び腎臓癌±０．００６及び０．０２
５−０．０２９　μｍｏｌ／　０．１　ｍｌ細胞のりボ
イド−結合シャル酸値を持った。

（ｌｉ）　　Ａ　ｂ　Ｒ，４抗体を用いて細胞系及び組
織のＧＤ。

の検出、多種の細胞及び組織の（）Ｄ、レベルはＲ２４
抗体を用いて測定された。４種の検出法が使用された；
（ａ）受身赤血球凝集、（ｂ）抗体阻害、（ｅ）新方法
、ＭＨＡ法の平易化とグリコリポイドのプラスチックス
に吸収する能力との併合により考案したＧＭＩＡ、（ｄ
）”’Ｉ−プロティンＡを用いＴＬＣクロマトダラム上
でＧｏｓと反応したＡｂＲｕを検出する方法。検出値の
感度は受身赤血球凝集検定は最も感度が低くそしてＩ”
Ｉ−ＰＡ法は最も感度が高い（表１）。

最も感度が低い検定法（受身赤面＃Ｃ凝集）の使用にお
いて、ＧＤＩは黒色腫細胞系及び黒色腫組織の抽出物は
検出できたか、他の原料　　　　゛からは検出できなか
った（表１１）。比較的感度の高い検出（ＰＡ−ＭＨＡ
の阻害及びＧＭＩＡ法）はＧＤａは広い範囲の細胞（ウ
シの脈絡膜、マウスの目、胎児及び成人肺、ＲＡＪＩＢ
−細胞系、ＭＯＬＴ−４Ｔ−細胞系、ＲＴ−４膀胱癌細
胞系及びＡＪ星状細胞腫細胞系）が検出でたことを示し
た。代表的な阻害実験は第５図に示され、そしてデータ
は表■に集約されている。ＧＭＩＡ法の使用において、
黒色鹿からのＲ３４−反応性グリコリボイド又は標準Ｇ
Ｄ３で被覆したウェルは強い反応性を持つことが判った
；この反応の幾つかの定鍛的データを第７図に示した。

他の純粋なグリコリポ、イド（ＧＭ、　ｓ　ＧＤＩ　ａ
、ＧＭ＋及び（牙Ｍ２）はこの検出では不反応であった
（表■及び第６Ｄ図）。Ａ　ｂ　Ｒ，、のみ加えてもま
た不反応であった（第６Ｃ図）。

この方法を他の細胞から抽出した酸性グリコリポイドに
適用すると阻害検出として大体同様な結果が得られた（
表Ｉｔ）。これらの方法により測定されたＧＤ、の限定
された分配の比較において、″５Ｉ−プロティンＡ法は
実験した全ての細胞及び組織のＧＤＳを検出した（表Ｉ
）。これらの組織及び細胞の検出されたＡｂＲｕ−反応
性成分は正真のＧＤＩであることは標準ＧＩ）ｇと共に
混合（２溶媒システムにおいて）することにより、また
関係のないグリコゾロティン特性を検出した他のプロテ
ィンＡ−結合重クローナル抗体（Ａｂｉｔｔ）が不反応
性であったことを検知することによって示された。

表１　ｉ　８に−ＭＥＬ−２８黒色鹿細胞と単クローン
抗体の反応性に おけるニウラミニダーゼ及びβ 一グルコシダーゼの彰璧 Ｃ１１１，１ｉＩＧ３　　　　安定　　　１００　　　
＜１０　　　　　ｔｏ。

Ｎ、ＩｇＧ、　　　感受性　　１００　　１００’　　
　　１００”１！　　　１ｇＧ１　　　感受性　　１０
０　　　１００　　　　１００（１）　　Ｄｉｐｐｏｌ
ｄらから、（１）　ＡｂＮ、１５０，０００の分子量の
グリコペプチド抗原沈澱及びＡｂＩ、。

９５．０００の分子量のグリコペプチド沈澱。

（２）　　ＰＡ−又は１．９−ＭＦＩＡ検定で酵素処理
した細胞を試験したＡｂＲｍａ（１７５０００）で直接
試験の結果。

ＭＦＬ−ＭＵ　　　　　　　　　＋　　　　　　　＋　
　　　　　十　　　　　　　＋ＭＥＬ−ＪＩ’　　　　
＋　　　　＋　　　＋　　　　＋ＭＥＬ−ＬＯ＋＋十 黒色腫細胞系 ８に−ＭＥＬ−１３＋　　　　　十 ８に−ＭＥＬ−２１＋　　　　＋ ８に−ＭＫＬ−２８＋　　　　　　　十　　　　＋　　
　　　　　＋ＳＫ−ＭＥＬ−３１　　　＋　十 ８に−ＭＥＬ−３７＋　　　　　　　十　　　　　＋８
に−ＭＥＬ−６４　　　　　　　　　　　　　　　　　
　＋８に−ＭＥＬ−９３＋　　　　　＋ Ｎ　ｅ　Ｗ　ｏ　　　　　　　　　　　＋　　　　　　
　十＋　　　　　　　　十癌細胞系： 腎臓（ＲＥＮＡＩ、） ８に−Ｒｅ−７−−−十 ８に−ＲＣ−１１− 膀　　胱 ２５３Ｊ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　−
−Ｔ−２４−−＋ ＲＴ−４−士　　　　　　　士 肺 ８に−ＬＣ−ＬＬ　　　　　　−−＋ 頚 ＭＥ−１８０−−−＋ 結　　腸 ＨＴ−２９−− ＡＪ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　＋Ａ　Ｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　−Ｍｏｔ、Ｔ−４（白槓醋諷朋孫）＋＋＋ＲＡＪ　
Ｉ　（リンペ削ＩＩ胞系）−十）論 ウシ　　　　　　−−一＋ マウス　　　　　−−一十 魚　　　　　　　　　　　　　　　　　　　−−ヒト（
成人）　　　　−−−＋ ヒト（胎児１０週）＋＋ ヒト（胎児１２及び２２週）−一＋ 脈絡膜（ウシ）−十＋ 目 マウス　　　　　−　　　＋＋＋ 魚　　　　　　　　　　　　　　　　　　−−＋肝　　
臓 マウス　　　　　　　　　−−＋ ヒト（胎児）−ｍ− ヒト（成人）−一 膵臓 マウス　　　　　　　　　−− ヒト（胎児）−一 ヒト（成人）　　　　−−−＋ 筋（胎児）−十＋ 腎　　臓（ＫｘｐＮｇｙ） マウス　　　　　　　　　−−＋ ヒト（成人）　　　　−−−＋ 心　臓（マウス）−十 胸　腺（マウス）−ｍ− 肺 マウス　　　　　−−− ヒ　ト（胎児及び成人）−＋＋＋ 騰　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　十赤血
球 ヒト（Ａ及びＢ）　　　　　　　　　＋ヒ　ト　（０）
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
−ウマ　　　　　　−−−十 ヒツジ　　　　　　　　　−　　− ネコ　　　　　　　　　　−　　＋ 胎盤（ヒト）＋。

――■−■■−■−φ１．■― ガングリオシド： ＧＤ、　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋　
　　　　　＋Ｇ　ＭＩ　　　　　　　　　　−−−−（
ＪＩＭｔ　　　　　　　　　　　−ｍ−−（３Ｍｍ　　
　　　　　　　　−−−−Ｇ　Ｄ　ｔ　ａ　　　　　　
　　　−一−−ＧＴ１　　　　　　　　　−　　　　　
−　　　−　　　　　−（１）　　細胞及び組織で原体
を表示しないのはヒトである。

（２）　　グリコリポイド−被８ｔＲＢＣの受身赤血球
凝縮。Ａ　ｂ　Ｒ，、は１：１００の希釈で用い；ＧＤ
ｌｍの５ｔＪの最小は検出できなかった。

（３）　　ＳＫ−ＭＥＬ−２８ターゲツト細胞とＲ８４
抗体（１：８０，０００）のＰＡ−ＭＨＡ反応性の阻害
。ロゼッ）　（ｒｏｉ＋ｅｔｔ　）の程度が２０％より
小である場合はポジティブ（ト）として数えた。この希
釈において、ＡｂＲ，、はＧＤＩＩの２μｍ！により完
全に阻害された。

（４）　　グリコリポイド−媒介免疫結合（ＧＭＩＡ）
検定。プロティンＡ結合赤血球のローンによりおおわれ
たウェルの表面積が５０％以上の場合、反応はポジティ
ブと考えた。

Ａ　ｂ　Ｒ，、は１　：　１０００の希釈で用いた。Ｇ
Ｄ。

の２５れｙ抗体の墓以上は検出できた。

（５）”’Ｉ　　Ｐ　Ａ　　Ｔ　Ｌ　Ｃｏ　コ（Ｄ方法
ニオイテリポイドー結合ＮＡＮＡの６μＩはＴＬＣ／ で分離されそしてプレー）　’ｒ：　ＡｂＲ，４（ｔ　
：１５００　）及びＩｎ　Ｉ−プロティンＡで処理した
。反応性成分はオートラジオグラフィーにより検出した
。この方法はＧＤ、（４）１ｏ−２５ｎＪｉ’検出でき
る。

検　　　　　討 黒色腫細胞の細胞表面抗原に対し血清学的に特異の高感
度を示Ｔマウス単クローナル抗体Ｒ１４はジシアローガ
ングリオシドーＵＤｓと紹められた。従来の研％ｉはガ
ングリオシドに対する抗体を得るのは困齢であった（参
照１５）。口のことは大部分のガングリオシドは免疫を
与えた種の成分であり、そしてまた、本来シラリダーセ
活性であるため、免疫学的にガングリオシドが分解する
（参照１６）事実に基いて行わなけれはならない。０の
観点により、非常に高いＧＤＩ含ｊｉｔ１を持つ黒色肺
細胞（ＳＫ−ＭＥＬ−２８）で６ケ月間以上免疫して生
成したマウスＲｕは重要なこ、とである。ガングリオシ
ドと認められる二つの他の単クローナル抗体は最近開示
された（＃照ｘ７．ｔｓ）。一つはニワトリのノイロン
細胞と特異に反応しそしてＧＱ画分中に存在する高ガン
グリオシドの一つに影響される（参照１７）。第２のも
のはヒト結腸癌に対して影響されそして未だ性質未知の
モノシアロガングリオシドとして認められた（参照１８
）。

本発明者らはＣＤｓは黒色腫細胞培養物及び黒色腫組織
中に顕著に存在するガングリオシドであることを知った
。他の細胞と比べた場合、黒色腫細胞はまた全ガングリ
オシドレベルが高い。

他にも示されるように、ＧＤＳは大部分の唾乳類組織中
に少量存在する。しかし、それはガングリオシドの３０
−４０％より成る網膜中の主要ガングリオシドである。

成人胸中、Ｇｏｓは全ガングリオシド含量の約８−１０
％を示す（参照１９）。ＧＤｓのレベルは胎児脳中が高
い、胎児ラット膳（懐妊１５−１７日）のＧＤｓは全ガ
ングリオシド含量の約５０％を示す、２０日により約１
０％に急激に低下する（参照２０）。

Ｐｏｒｔｏｕｋａｌｉａｎ及び共同研究者（参照２１）
はＴＬＣ及びカルボハイドレート分析により固定したＧ
Ｄｍは黒色腫の主構成であることも発表した（参照２１
）。彼らは実験した４ｍの異なった黒色肺橡本のＣＤ８
の割合はガングリオシドの３１．０％から５７．２％に
変化した。これらの結果から、発明者ら自身の分析と同
様、ＧＤｓガングリオシドは悪性黒色腫の主な成分であ
ると結論することができる。正常な黒色細胞がＧｏｓの
レベルが高いかどうかは現在不明である。正常の脈絡膜
黒色細胞は直接血清学試験におけるＡ　ｂ　ｇ、４との
反応性は弱い（力価ｓ　：　ｔｏｏ）、それに比べ黒色
腫細胞のＡ　ｂ　Ｒ，、との反応性は高イ（−１：　５
　Ｘ　１０’−１０”（７）力１ｉ）（参照１）ｊ’ｔ
ｌ養皮膚黒色細胞の方法の最近の発展（参照２２）をも
って、今は黒色細胞及び黒色ｊ沌のＧＤＩ含量の直接的
比較をすることは可能であろう。ＧＤＩの正確な生物学
的要因は明確には判らないが、Ｇｏｓはセロトニン結合
の役割を有していると示唆された、（参照２３．２４）
。

実験において、ガングリオシドのＴＬＣパターンは異な
る黒色腫細胞系から単離した。本発明者らは種々のガン
グリオシドの割合の変化を注目した。大部分の細胞系Ｇ
Ｄｓ及びＧＭ、は主としてガングリオシドであつ“た□
′（第３図及び第４図）。幾つかの黒色腫細胞系はＧＭ
、と−Ｎ複合したパターンを示した。そして幾つかの高
ガングリオシドは一層よく表われる。これらのガングリ
オシド輪郭の相違は癌の生物的特性（例えは、区別状態
）に関係するかどうかは明らかにする必要かある。一般
的に黒色腫は特有のガングリオシド輪郭を表わす。実験
した他の細胞及び組織のＴ−セル系ＭＯＬＴ−４のみ同
様な輪郭を示した。そしてこれはおそら（Ｔ−細胞及び
神経−外胚葉性細胞原例えばＴｈｙ　−１による抗原の
他の標本であろう（、参照２５）。ウシ脈絡膜及びマウ
ス目から導いたガングリオシドは３又は４の顕著な成分
のただ一つのＧＤＩと一層複雑なパターンを持つ。

ＧＤ、ガングリオシドの存在が黒色腫細胞を決して制限
するものではない、−それは遍在である。細胞表面抗原
に対する直接血清学検出を用い、黒色腫のみ、脈絡膜黒
色細胞、及び星状細胞腫はＡｂ島、と反応性があった（
参照１）。敏感な吸収試験を用いてきえ、試験した他の
細胞　　　１及び組織の正常用のみＡ　ｂ　Ｒ，４を吸
収した。ここに表われた血清学的知見と生化学的データ
の間の明らかな矛盾に対して多くの説明が示される。

第１ｔよＧＤ８は大部分の非−黒色腫細胞の細胞表面成
分ではないことの可能性である。ＯＤＡが他のガングリ
オシドの生合成的ｍＪ駆物であるそしてそれ放生として
細腕中に存在する、ゴオル・ギ（Ｇｏｌｇｌ　）装置中
で、グリコリポイド合成に関与するグリフシル　トラン
スフェラーゼが見い出される（参照齢）、（２））こと
がＮ１Ｅ−明されるであろう。本発明者らの生化学的研
究は全体の細胞又は組織に対し行われ、その結果はこの
説明とｉかに適合する。他の可能性はＧＤ３がＲｕ−ネ
ガティブ細胞の細胞表面に存在する。しかし抗体との反
応は、しないということである。この現象は他の細胞膜
グリコリポイドで見い出した。例えはグロボシドは赤血
球膜の主要グリコペプチドであるが、赤血球反応は抗−
グロゼシト抗体と微弱に反応する（参照（至））。勿論
、ＧＤ３は血清学試験に用いて検出される虚で大部分の
非−黒色腫細胞の表面に表れない可能性もある。直接及
び吸収試験の両方でＡ　ｂ　Ｒ１４と反応する細胞型は
高すポイドー結合シャ／Ｉ／ｌ！＃含量及び顕著ガング
リオシドとしてＧＤＩの両者を持つことは車装なことと
して注目することである。

黒色腫細胞のＧＤＩ及び０Ｍ３の集積の＠構どうである
かぐ一つの可能性の説明は黒色肺細胞はＮ−アセチルガ
ラクトサミン　トランスフェラーゼの低レベルを有して
いる。その結果酵素（・こ対する一般の基質例えばＧＭ
、及びａＤｓの集積が生ずる（第９図）。ウシの甲状）
県におい王、一つのＮ−アセチルガラクトサミン−トラ
ンスフェラーゼはＧＤｓ及びＧＭＩに作用しく）Ｄ！及
びＧＭｔになる（参照面）。そして黒色ｌ１Ｉｊ］にお
けるこの酵素のレベルは低いことは本発明者か得られた
ガングリオシド　パターンを明らかにＪるであろう。他
の可能性の説明は黒色腫はβ−Ｎ−アセチルガラクトサ
ミニターゼの高レベルを有している。その結Ｍ：　ＧＭ
、及び＋ｊＤｔの生成を減少させるか又は黒色腫が或梱
のシアリルトランスフェラーゼのレベルを上げ、その結
果ＧＤｓ及びＧＭ、の合成を増加させることである。黒
色腫患者ハ血清シアリルトランスフェラーゼレベルを上
げることはこの見地からして重要なことである（参照２
９）。癌組織の酵素レベルは未だ研究されていない。し
かしながら、ヒト黒色肺細胞系のグリコプロティンは他
の細胞型のグリコプロティンに比ベシアリル化を増進す
る（参照３０）事実は黒色腫中のこの酵素の活性の増加
を示唆する。

ＴＬＣｊ薄層クロマトグラフィー；ＭＨＡ：混合血球凝
集検出；Ｃ−Ｍ：クロロホルム−メタノール；ＦＢｓ：
胎児ウシ血清；　ＮＡＮＡ　：Ｎ−ア七、チルノイラミ
ン酸：　Ｇａｌ　：　Ｄ−ガラクトース：Ｇｌａ：Ｄ−
グルコースｒ　ＧａＡ’　ＮＡｅ　：Ｎ−アセチル−Ｄ
−ガラクトサミン；Ｃ＠ｒ；セ＝ ラマイド；　ＧＭ、　：βＧａ１ｌ　−３Ｇａｌ　ＮＡ
ｃ　１−＋４βＧｍｌ　（３←２ＮＡＮＡ）１−＋４　
Ｇｌｃ−Ｃｓｒ；ＣＭｓ；　ＮＡＮＡ　２→３　βＧａ
ｌ　１→４　Ｇｌｅ→Ｃ＠ｙ　；　（３Ｄ、；　ＮＡＮ
Ａ　　２４８　　ＮＡＮＡ　　２−＋３βＧａ１ｌ−＋
４　ＧＩＣ−Ｃｅｒ　；　ＧＤＩＩＩＬ　；　ＮＡＮＡ
　　２−＋３βＧａ１１→３　Ｇａ７ＮＡｃβ１−＋４
　Ｇａ１ｔ（３←２ＮＡＮＡ）Ｇｌａ　−Ｃａｒ　；　
　０Ｍ２　’　　βＧｅｌ　ＮＡｅ　　１−＋４βＧａ
／［３４２ＮＡＮＡ　）Ｇｌａ　　　Ｃａｒ、Ｇ７１ａ
　　；　ＮＡＮＡ２−＋８　　ＮＡＮＡ　　２−＋３　
　βＧａｌ　ｌ−＋３　Ｇａ７ＮＡｃβ１−＋４　Ｇａ
ｌ　（３←２　　ＮＡＮＡ″］ＧＪｃ−Ｃｅｒ。

ＣＳｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍの命名法（参照Ｇｌ＋　）参
　　照　　文　　献 １、　Ｄｉｐｐｏｌｄ＋　Ｗ、　Ｇ＊＋　Ｌｌｏｙｄ、
　Ｋ、　０−＋　Ｌｌ＋Ｌ、　Ｔ＠　’Ｃａｌ　Ｉｋ６
ｄａ、　ａ、＊　Ｏ＠ｔｔｇ＠ｎ、　Ｈ，Ｆ、及びＯｌ
ｄ、　Ｌ、　Ｊ、　（１９８０）　　ヒト悪性黒色腫の
細胞表面抗原：単クローン抗体で６個の抗原システムの
解明、Ｐｒｏｓ　−Ｎａｔｌ　　Ａａａｄ　：　Ｓａｌ
。

ＵＳＡ　　７７：６１１４゜ ２、　　ＣａｒｅＦｙ　’ｒ、　Ｅ、、　Ｔａｋａｈａ
ｓｈｉ、　Ｔ、、　Ｒ＠５ｎｉｅｋ。

Ｌ、、Ａ、ｔ　Ｏｓｔｔｇｅｎｙ　Ｈｅ　Ｆａ及びＯｉ
ｄ、　Ｌ、　Ｊ。

（１９７６）ヒト悪性黒色腫の細胞表面抗原：培養した
自然発生黒色腫細胞の体液免疫に対３、　　Ｐｆｒｅｕ
ｎｄｓｅｈｕｈ、　Ｍ、、　５ｈｉｋｕ、　Ｈ，、Ｔａ
ｋａｈａ＠ｈｉ。

Ｔ、、　Ｕｅｄａ、　Ｒ，Ｒａｎ５ｏｈｏｆｆ、　Ｊａ
ｒ　Ｏｓｔｔｇｅｎ、　Ｈ。

Ｆ、及びＯｌｄ、　Ｌ、　Ｊ、　（１９７８）悪性膿肺
瘍のＳｃｉ、　ｉＬＡ、７５　：　５１２２゜４、　　
　Ｕｅｄａ、Ｒｏｔ　　５ｈｉｋｕ、Ｈｅ、Ｐｆｒｅｕ
ｎｄｓｃｈｕｈ、ＭａｒＴａｋａｈａｓｈｉｒ　Ｔ、、
Ｌｉ、Ｌ、ＴＩＩ　Ｃ，、Ｗｈｉｔｍｏｒｅ。

Ｗ、Ｆａ、Ｏｅｔｔｇｓｎｔ　ｔ（、、Ｆｓ及びＯｌｄ
、　Ｌ、　Ｊ。

５、　１　ｔｏｈ、’ｒ、＋　Ｌｌｔ　Ｙ　　Ｔ　ａｔ
　Ｌｌｔ　８　　Ｃ及びＹｕ。

Ｒ，Ｋ。（１９８１）チー、ザックス膿がら新規なモノ
シアロシルペンタへキソシル　セラミドの単離とその性
質。Ｊ、　Ｂｉｏｌ。Ｃｈ＠ｍ　　２５０：１０５゜ ６、　８ａｌｔ、ｏ、　Ｔ、及びＨａｋｏｍｏｒｉ。８
．（１９７１）動物細胞から全グリコリポイドの定量的
単離。

Ｊ、　　Ｌ、１ｐｌｄ　　Ｒｏｓ、　　　１　２　　：
　　２　５　７゜７、　　Ｙｕｇ　Ｒｅ　Ｋａ及びＬａ
ｄ＠ｏｎ、　Ｒ，、Ｗ、　（１９７２）ヒト、ウシ及び
ウサギの血漿のガング、リオシド　　Ｊ、　　Ｌｉｐｉ
ｄ　　Ｒａｍ、　　１　３　　：　　６　８　０゜８、
　　Ｗａｔａｎａｂｓ、　Ｋ、、　ＰＯＷ＠１１．　Ｍ
、　Ｅ及びＨａｋｏｍｏｒｉ　、　Ｓ、　　（１９７９
）新シアロシル結合及び核構造を持つ′ガングリオシド
の単離とその性１１ｉ（、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ＠ｍ
、　２５４　：　８２２３゜９、　　Ｓｖｅｎｎｅｒｈ
ｏｌｍ、　Ｌ、　（１９５７）サイアリン酸の定置的価
格、■、比色計によるレゾルシノール−塩酸法６　Ｂｉ
ｏａｈｉｍ＊　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｅｔａ　２４１６０
４゜ １０、　　Ｗａｒｒｎ、Ｌ、　（１９６３）シャル酸の
チオ、ｚルビツール酸検定法Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｌｎ　Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ、　６＝４６３゜ １１、　　Ｚａｎｓｔｔａ＋　Ｊ、　Ｐ＋＋＊　Ｂｒｅ
ｅｋ＠ｎｒｉｄｇｅ、　Ｗ、　Ｃ及びＶｉｎａｅｎｄｏ
ｎ、　Ｇ　（１９７２）　　）リフルオロアセテート誘
導体として０−メチルグリコシドのモノサッカライドの
分析。Ｊ、　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ。

６９ｉ２９１゜ １２、　　Ｙｏｋｏｙａｍ＠ｗ　Ｍ、、　Ｔｒａｍｓ、
　Ｅ、　Ｇ及びＢｒａｄｙ＋Ｒ００，（１９６３）ガン
グリオシドによる免疫化学的研究ｏ　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ、　９０　：　３７２゜１３、Ｍａｇｎａｎｉ　Ｈ
Ｊｅ　Ｌｓ　＃　ｂｒｎｉ　ｔｈｙ　Ｄｓ　Ｆａ及びＧ
ｉｎｓｂｕｒｇ、　Ｖ、　（１９８０）　　結合コレラ
毒素：Ｑ８１−ラベル毒素を直接薄層クトマトグラムに
結合によるガングリオシドの検出。Ａｎ　ａ　１　ａＢ
ｌｏｏｈｓｍ、１０９　：　３９９゜１４．　　Ｈｕｎ
ｔｅｒｓ　Ｗ、　Ｍｅ及びＧｒｅｓｎｗｏｏｄ、　Ｆ、
　Ｃ。

（１９６２）高特異活性のヨウ素−１３１ラベルされた
ヒト生長ホルモンの調Ｗｏ　Ｎａｔｕｒ＠ｘ９４：４ｇ
５゜ １５、　　Ｒａｐｐｏｒｔ、　Ｍ、　Ｍ及びＧｒｏｆ＊
　Ｌ、　（１９６９）リポイドの免疫化学反応。Ｐｒｏ
ｇ、　Ａｌｌ・ｒｇｙす：２７３−３３１　（１９６９
） １６、　　Ｋｕｎｄｕ、　Ｓ、　Ｋ、、　Ｍａｒｃｕｓ
、　ＤｏＭ及びＶ＠ｈ。

Ｒ，Ｗ、（１９８０）Ｇｏｓ及びＧＭＩガングリオシド
に対する抗体の調製及び性質。

Ｊ、　Ｎｓｕｒｏｅｈｅｍ、　３４　：　１８４０１７
、　　Ｅ（＠＠ｎｂａｒｔｈ、　Ｇ、　５１Ｗａｌｓｈ
、　Ｆ、　Ｓ、及びＮｌｒｅｎｂｓｒｇ、　Ｍ、　（１
９７９）　＝つ四ンの血漿膜抗原に対する単クローン抗
体。

Ｐｒｏａ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　５ｃｉ０．、、
ＵＳＡ　　７６　：　４９１３゜１８、　　Ｍａｇｎａ
ｎｌ、　Ｊ、　Ｌ。、　Ｂｒｏｅｌ：ｈａｕｓ、　Ｍ、
、　Ｓｍ１ｔｈ。

Ｄ、　Ｆ、、　Ｇｌｎａｂｕｒｇ、　Ｖ、、　Ｂ１ａｓ
ｚ＠ｙｇｕｋｅ　ｇ、。

Ｍｌｔｃｈｅｌｌ、　Ｋ、　Ｆ、、　Ｓｔｅｐｌｅｗｓ
ｋｌ、　２、及びＫｏｐｒｏｗ＠ｋｌ、　）Ｉ、　（１
９’８１　）モノシアロ方ングローン抗体であるｏ　ｓ
ｅｔ・ｎｅ＠２１２　：　５５゜１９、　　Ｕｒｂａｎ
、Ｐａ　Ｆａｔ　Ｈａｒｔｈ、　Ｓ、ｗ　Ｆｒ＠ｙｓｚ
ｔ　Ｌａ及びＤｒａｙｆｕｓ、　Ｈｅ　ＴＬＣ及びＨＰ
　Ｔ　Ｌ　Ｃによる異なる種からの膳及び網膜のガング
リオシド。ガングリオシドの構造及び機能。Ａｄｖ、　
Ｅｘｐ＊Ｍ＠ｄ、　Ｂｌｏｔ、、　　ａｄ、　　Ｌ、　
　８ｖｅｎｎ＠ｒｈｏ１ｍ　　（Ｐｌ＠ｎｕｍ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）、　Ｖｏｌ、　１２５　、　Ｐ、　
　１４９−１５７　ｔ１９８０゜ ２０、　　Ｉｒ１ｖｉｎ＠　Ｌ＠Ｎ、、ｌ　Ｍｉａ、ｈ
ａｅｌ、　Ｄｏ　Ｂ、及びＩ　ｒｗｉ　ｎ　。

Ｃ，Ｃ，（１９８０）胎児ラット及びマウス族のガング
リオシド／ぞターン、Ｊ、Ｎａｕｒｏｃｈｅｍ３４：１
５２７゜ ２１、　　Ｐｏｒｔｏｕｋａｌｉａｎ、　Ｊ、、　Ｚｗ
ｌｎｇｓｌｓｔｏｉｎ、　Ｇ＠及びＤｏｒｅ、Ｊ、　（
１９７９）ヒト悪性黒色ｕｎｉの悪性生長価の高い時の
リポイド組成。

Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｓｍ、　９４　：’　１９
゜２２、　　ｇｉｓｌｎｇｅｒ、　Ｍ、及びＭａｒｋｏ
、　ｏ、ホルＩ−ル及びコレラの存在下生体外正常ヒト
黒色細胞の選択増殖。Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　Ａａａｄ
、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ（速報） ２３、　　Ｗｏｏｌｅｙ＋　Ｄｏ　Ｗｅ及びＧｏｍｍｉ
　、　Ｂ、Ｗ、　（１９６５）。

セロトニン受容体■１１．受容体として種々の純粋ガン
グリオシドの活性。

Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓａｔ、　ＵＳＡ
　　５３　ｉ　９５９゜２４、　Ｔａｍｔｒ、　Ｉ（ａ
、　Ｂｒｕｎｎｅｒ、　Ｗ、ｔ　Ｃａ５ｐｅｒ、　Ｄａ
及びＲａｐｐｏｒｔ、　Ｍ、　Ｍ６（１９８０）セｔｚ
）ニン（７）結合のガングリオシドによりプ四ティン結
合セロトニンの増強。Ｊ、　Ｎ＠ｕｒ６ｅｈｓｍ。

３４１７１９゜ ２５、　　Ｒ＠ｉｆ、　Ａｅ　Ｅａ及びＡｌｌ＠ｎ＠　
Ｊ、　Ｍ、　Ｖ、　（１９６４）ＡＫＲＪｌ腺抗原及び
その白血病及び神経組織中の、分布。Ｊ、　Ｅｘｐ、　
Ｍａｄ、　１２０　：　４１’３゜２６、　　Ｋｓｓｎ
ａｎ、　Ｔ、　Ｗ、ｌ　Ｍｏｒｒｅ、　Ｄ、　Ｊ、及び
Ｂａ５ｕ。

Ｓ、（１９７５）ガングリオシド生合成６　Ｇｏ１ｇｉ
装置におけるラット肝臓からグリコフィンゴリ屑イド　
グリコジル　トランスフェラーゼの濃縮。Ｊ、　Ｂｉｏ
ｌ、　Ｃｈｅｍ　　２４９：３１０゜２７、　Ｐｕｃｕ
口ｋａ、　Ｔａ、Ｄｕｆｆａｒｄ、　Ｒｅ　Ｏ，ｔ　Ｎ
ｉｓｈＮ１５ｈ１゜Ｒｅ　Ｎ、ｙ　Ｂｒａｄｙ　Ｉ　Ｒ
ａ　Ｐ　ｅ及びＦｌｓｈｍａｎ、　Ｐ、　Ｈ。

（１９７９）ウシ甲状腺π−ングリオシドの牛舎成。Ｊ
＊　Ｂｌｏｌ、　Ｃｈ＠ｎ、　２５３：５１３３９゜２
８、　　Ｈａｋｏｍｏｒ５　Ｓ。（１９７３）　　腫瘍
細胞膜ツクリフリポイドｏ　Ａｄｖ＊　Ｃａｎｃｅｒ　
Ｒｅｓ、　　Ｉ８：２６５゜２９、　　　８１１ｖｅｒ
、　　Ｈｏ　Ｋｓ　　ｎ、、　　Ｋａｒｉｍ＊　　Ｋｍ
　　Ａｓ５Ａｒｃｈｌｂａｌｄ、　Ｅｅ　Ｌ、及び５ａ
ｌｉｎａｓ＊　Ｆｓ　Ａｓ（１９７９）血清シアリ？酸
及び悪性黒色腫患者の腫瘍負荷の監視としてのシアリル
トランスフェラーゼ。Ｃ１ｎｅｓｒ　Ｂｅｓ、　　３９
　：　５０３６゜３０、　　Ｌｌｏｙｄ、　Ｋｍ　Ｏｍ
ｅ　Ｔｒａｖａｓｓｏｓ、　Ｌ、　Ｒａ＠Ｔａｋａｈａ
ｓｈｌ、　Ｔ、及びＯｌｄ、　Ｔ、、Ｊ、　（１９７９
）ヒト腫瘍細胞系の細胞表面グリコプロティンＩｎ＠ｔ
、６３　：　６２３゜ ３１、　　Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ、　Ｌ。（１９６３
）ヒト膿ガングリオシドのクロマトグラフィー分離。

Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｅｈｓｍ、　　１０　：　６１３゜３
２、　　ｙｕ、　Ｒｏに、及びＡｎｄｏ、　Ｓ、　（１
９８０）　　ガングリオシドの構造及び機能の新鮮胴の
新ガングリオシドの構造。（ｓｄ、　Ｌ、　Ｓｖｓｎｎ
ｅｒｈｏｌｍ）Ａｄｖａｎｃｅｓ　　ｉｎ　Ｅｘｐｅｒ
ｉｍｅｎｔａｌ　Ｍ＠ｄｉｅｌｎ＠　ａｎｄ旧ｏｌｏｇ
ｙ　１２５　！　３３　　（Ｐｌｅｒａｕｍ　Ｐｒ５ｉ
ｓ　）　Ｎ＠Ｗｏｒｋ　Ｏ

【図面の簡単な説明】

第１図はニウラミニダーゼ処理後ＳＫ−ＭＥＬ−２８細
胞のＡ　ｂ　ｎ、４−反応性抗原の時間の進行に伴う再
表示である。 第２図はグリコリポイド−媒介免疫結合（ＧＭＩＡ）検
定を用いて薄層クロマトグラフィー上のＡｂ　Ｒ，、−
反応性グリコリポイドの分配を示す。８に−ＭＥＬ−２
８細胞からの酸性グリコリボイ、ドは溶媒ｌのＴＬＣＩ
Ｃより分離したＯシリカゲルバンド（１ｃｒｎ巾）はプ
レートからかきとり、Ｃ：Ｍ（１，２）で抽出しそして
明細書記載のようにＧＭＩＡにより抗原を検定した０第
３図は多くの細胞系及び組織から酸性グリコリポイド画
分の薄層クロマ−トゲラフイーを示す。レーン１　：　
ＧｙｉＢ　：　２　’　ＧＤａ　；　３　：　ＧＭＩ　
；　４：ＳＫ−ＭＥＬ−２８黒色腫細胞系；５：ＳＫ−
ＭＥＬ−２８から単離されたＡｂＲ，−反応性抗原；　
６　：　ＳＫ−ＭＥＬ−３７黒色腫細胞系；７　：　Ｓ
Ｋ−ＭＥＬ−ｅ　４黒色腫細胞系；８：ＭｅＷｏ　：　
９　：　Ｓ　Ｋ−ＭＥ　Ｌ　−１３黒色肺細胞系；１０
：黒色腫（外科的標本）　；　１１　：ＭＯＬＴ−４Ｔ
−細胞系；１２：マウス目；１３：８に−ＲＣ−７腎臓
細胞系；１４：成人膳。ガングリオシドは溶媒ｌで分離
しそしルーゾルシノール−ＨＣ７１で現視した。 第４図は黒色腫及び他の細胞からガングリオシドの薄層
クロマトグラムの濃度計によるトレースである。ＡｉＳ
Ｋ−ＭＥＬ−２８黒色腫細胞系；Ｂ：ＳＫ−ＭＥＬ−３
７黒色腫細胞系；Ｃ：　ＳＫ−ＭＥＬ−１３黒色腫細胞
系；Ｄ＝黒色腫（外科的標本）；Ｅ：成人層；Ｆ＋Ｒａ
ｊｌＢ−細胞系；Ｇ：ＭＯＬＴ−４細胞系；Ｈ：５Ｋ−
ＲＣ−７腎臓細胞系。全ガングリオシド画分の％とじて
ＧＤｓの量はピークの面積からｄＩ算した。そして各パ
ネルで示す。 第５図は多種の細胞系及び組織からの酸性グリコリポイ
ドによりＳＫ−ＭＥＬ−２８黒色腫細胞のＡ　ｂ　Ｒ，
、の反応性の阻害を示す。検定：ＰＡ−Ｍ　ＨＡ　；＋
　’　ＡｂＲｍ４対照；＋：成人牌膵臓・：成人肝臓；
０：硬骨魚類口；■：８に−ＲＣ−７腎臓癌細胞系；ム
：成人脂；　Ｑ　ＭｅＷｏ黒色腫細胞系；◆：　ＳＫ−
ＭＥＬ−２９黒色腫細胞系；：　ＳＫ−ＭＥＬ−３７黒
色腫細胞系；マ：マウスの目：ロ？ＭＯＬＴ−４Ｔ−細
胞系；Δ：黒色腫（外科的標本）　；　０　：　ＳＫ−
ＭＥＬ−２８黒色腫細胞系。 第６図はＡｂＲ，４を用いたグリコリポイド−媒介免疫
結合（ＧＭＩＡ）検定を示す。ウェルＡ：Ｓ　Ｋ−Ｍ、
、Ｅ　Ｌ　−２８黒色腫細胞系力）ら単離したＡｂＲｕ
−反応性グリコリポイド。ウェルＢ：ＧＤｓガングリオ
シド；ウェルＣ：非ガンク”リオシド；ウェルＤ　：　
ＧＭ、及びＧＭＳガングリオシド混合物。抗体：　Ａｂ
Ｒｕ（１１０００）。 第７図はＧＭＩＡ検定においてＡ　ｂ　Ｒ，、によりＧ
Ｄ８ガングリオシドの検出を示す。Ａ　ｂ　Ｒ１４の希
釈は本図で示した０ 第８図はＡｂＲｕ及びｌ！１ｌＩ−プロティンＡの反応
性によりＴＬＣプレート上のＧＩ）ｓガングリオシドの
検出。右側：ガングリオシドがレゾルシノール−ＨＣｌ
試曇で現視された。左側：ＡｂＲ，。 及びＩ！ｌ　１−プロティンＡと反応したガングリオシ
ド。ライン１　：　ＡｂＲ，、−反応性ガングリオシド
；ライン２：成人膳から抽出したガングリオシド。溶媒
２゜ 第９図はガングリオシドの生合成の提案された経路図（
Ｙｕ及びＡｎｄＯ（参照３２）後変更〕である。 特許出願人　　ス四−ンーケツタリングインステイテユ
ート　７オー キヤンサー　リサーチ ＦＩＧ、１ 六 ＦＩＧ　２ ＴＬＣＧＭＩＡ　＃定 坑原存駅 １２５１−ＰＡ　　　　　　レゾｊレジノーＪし１　　
　２　　　１　　　２ Ｇｌｃ−Ｃｅｒ ＮＡＩＪＡ ／　　　　　　ゝ クソコリホ゛イト（ｎ９／ウエル） 第１頁の続き ０発　明　者　ウォルフギャング・ジー・ディボルド ドイツ連邦共和国メインッ・フ イチェトプラッ（番地無し） ０発　明　者　バーバート・エフ・オツティゲン アメリカ合衆国コネチカット・ ニュー・カナン・オーヴアール ツク・ドライブ４８番地 ０発　明　者　ロイド・ジエー・オールドアメリカ合衆
国ニュー・ヨーク ・ニュー・ヨーク・ウェスト・ エンドｅアヴエニュー６００番地 １１′１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　抗体Ｒ５４（Ａ　ｂ　Ｒ１４）と試験試料とを反
   応させ、そしてこの反応の程度を測定することからなる
   試験試料中のＧＤｍジシア四　ガングリオシドの存在を
   測定する方法。 ２　反応段階が試験試料の懸濁液とＡ　ｂ　Ｒ，、の混
   合を含み、この反応の程度を凝集体を視力的に勘定する
   ことにより測定する受身赤血球凝集検寓法を使用する特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、　抗体阻害検定法を使用する特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 ４、　グリコリポイド媒介免疫結合検定法を使用する特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ５、　薄層り四マドグラフィーにより分離後血清学的反
   応性グリコリポイドの検出よりなる方法を用いる特許請
   求の範囲第１項記載の方法。