JPS58202000A - セルラ−ゼ活性測定方法 - Google Patents
セルラ−ゼ活性測定方法Info
- Publication number
- JPS58202000A JPS58202000A JP8283182A JP8283182A JPS58202000A JP S58202000 A JPS58202000 A JP S58202000A JP 8283182 A JP8283182 A JP 8283182A JP 8283182 A JP8283182 A JP 8283182A JP S58202000 A JPS58202000 A JP S58202000A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cellulase
- cellulose
- cellulase activity
- microfibrillated cellulose
- activity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はセルラーゼ活性測定用基質としてマイクロフィ
ブリル化セルロースを用いる事を特徴とするセルラーゼ
活性測定方法に関するものである。
ブリル化セルロースを用いる事を特徴とするセルラーゼ
活性測定方法に関するものである。
セルラーゼはセルロース系物質を基質とし。
それらの加水分解を行う酵素であり、バイオマスからの
有用物生産などにおいて今後ますます重要性の増すこと
が期待されている酵素の一つである。
有用物生産などにおいて今後ますます重要性の増すこと
が期待されている酵素の一つである。
バイオマスからの有用物質生産における最大の問題点は
セルロースの加水分解率、加水分解速度の向上であり、
このために酸加水分屏法以外にセルラーゼによる効率的
な加水分解方法が期待されている。
セルロースの加水分解率、加水分解速度の向上であり、
このために酸加水分屏法以外にセルラーゼによる効率的
な加水分解方法が期待されている。
セルラーゼを用いる加水分解ではセルラーゼ活性の強弱
、安定性が最も重要であり強力かつ安定なセルラーゼの
開発及び高感度かつ簡易なセルラーゼ活性測定方法が望
まれている。
、安定性が最も重要であり強力かつ安定なセルラーゼの
開発及び高感度かつ簡易なセルラーゼ活性測定方法が望
まれている。
従来のセルラーゼ活性測定方法としてはセルロース鎖長
の減少、生成する還元末端の増加。
の減少、生成する還元末端の増加。
Ｆ紙崩壊法などが用いられている。
セルロース鎖長の減少はカルボキシメチルセルロースな
どの水溶性セルロース誘導体を基質とし、オストワルド
粘度計あるいはＢ里粘度計などを用いてその粘度低下を
測定し、酵素活性の指標とするものでありエンド型セル
ラーゼに対しては有効な方法であるがエキソ型セルラー
ゼには不適当である。また反応液量の微１化が困遍であ
り、しかも基質濃度にかなり高い濃度とする必要がある
。
どの水溶性セルロース誘導体を基質とし、オストワルド
粘度計あるいはＢ里粘度計などを用いてその粘度低下を
測定し、酵素活性の指標とするものでありエンド型セル
ラーゼに対しては有効な方法であるがエキソ型セルラー
ゼには不適当である。また反応液量の微１化が困遍であ
り、しかも基質濃度にかなり高い濃度とする必要がある
。
還元床層の測定法によれば生成するアルド−スジで対す
る定１法などのような方法も適用できるが、専らソモデ
ーネルソン法（でよるミクロ分析法がとられている現状
である、この場合にも反Ｅ 基質と゛して）１カルボキ
シメチルセルロースなどの水溶性セルロース誘導体が用
いられている。
る定１法などのような方法も適用できるが、専らソモデ
ーネルソン法（でよるミクロ分析法がとられている現状
である、この場合にも反Ｅ 基質と゛して）１カルボキ
シメチルセルロースなどの水溶性セルロース誘導体が用
いられている。
この方法はグルコース数μ？でも検出できる高感度の分
析法であるが測定時間は５０〜６０分も要し、しかも砒
素などの毒物の試薬を必要とする々どの実際的な問題点
を残している。しかもカルボキシメチルセルロースなど
の水溶性セルロース誘導体（Ｃセルラーゼにより高々３
０％程度しか加水分解されないためセルラーゼ活性の測
定用基質としては間頃が残る。更に実際セルロース系物
質を基質とし、それらの加水分解を行なう場合、基質の
セルロースは水に懸濁した状態での加水分解反応であり
、それゆえセルラーゼ活性測定法もカルボキシメチルセ
ルロースなどの水溶性セルロース誘導体を基質とする測
定法よりも水に懸濁したセルロース自身の分解を直接定
量できる方が実際の加水分解反応をより正しく反映して
いると考えられる。
析法であるが測定時間は５０〜６０分も要し、しかも砒
素などの毒物の試薬を必要とする々どの実際的な問題点
を残している。しかもカルボキシメチルセルロースなど
の水溶性セルロース誘導体（Ｃセルラーゼにより高々３
０％程度しか加水分解されないためセルラーゼ活性の測
定用基質としては間頃が残る。更に実際セルロース系物
質を基質とし、それらの加水分解を行なう場合、基質の
セルロースは水に懸濁した状態での加水分解反応であり
、それゆえセルラーゼ活性測定法もカルボキシメチルセ
ルロースなどの水溶性セルロース誘導体を基質とする測
定法よりも水に懸濁したセルロース自身の分解を直接定
量できる方が実際の加水分解反応をより正しく反映して
いると考えられる。
戸紙崩壊法あるいは結晶性セルロースの崩壊によってセ
ルラーゼ活性を測定する重責法は煩雑な操作を必要とし
微量化が困鼎であり、何よりも測定誤差が大きいという
欠点をもっている。
ルラーゼ活性を測定する重責法は煩雑な操作を必要とし
微量化が困鼎であり、何よりも測定誤差が大きいという
欠点をもっている。
この方法は一ルラーゼ活性保有微生物の探索など多量の
サンプルをテストする場合などは用いることができない
方法である。
サンプルをテストする場合などは用いることができない
方法である。
本発明者にかかる従来のセルラーゼ活性測定法の欠点を
改良すべく鋭意研究の結果、マイクロフィブリル化セル
ロースをセルラーゼ活性測定用の基質とすることにより
、セルラーゼ活性を微量で定量でき、しかも検出法とし
て比濁法を採用することによりｉｎ ｓｉ℃Ｕで測定で
きることを見い出し、本発明全完成したものである。
改良すべく鋭意研究の結果、マイクロフィブリル化セル
ロースをセルラーゼ活性測定用の基質とすることにより
、セルラーゼ活性を微量で定量でき、しかも検出法とし
て比濁法を採用することによりｉｎ ｓｉ℃Ｕで測定で
きることを見い出し、本発明全完成したものである。
本発明に云うマイクロフィブリル化セルロースはパルプ
礒維を特開昭５６−１００８０１号公報に開示された方
法で叩解する事により得られるものであり、同公報には
「微小繊維状セルローズ」として定義されているもので
ある。
礒維を特開昭５６−１００８０１号公報に開示された方
法で叩解する事により得られるものであり、同公報には
「微小繊維状セルローズ」として定義されているもので
ある。
このマイク０フイブリル化セルロースのセルラーゼによ
る加水分解率は８０チ以上で従来のカルボキシメチルセ
ルコースよりもげるかに高い分解率であ抄セルラーゼ活
性測定用基質として望ましい性質を示すものである（参
考例−１参照）。
る加水分解率は８０チ以上で従来のカルボキシメチルセ
ルコースよりもげるかに高い分解率であ抄セルラーゼ活
性測定用基質として望ましい性質を示すものである（参
考例−１参照）。
本発明の方法をさらに詳しく説明すると、まず前記マイ
クロフィブリル化セルロース濃度が固型分含−ｔｏ、２
ｓ＊以下になるように酢酸緩衝液あるいはリン酸緩衝液
などで希釈し、所定の温度に保つ。ここで用いる緩衝液
は各々使用する酵素の最適ｐＨ範囲をカバーするような
緩衝液が望ましい。この溶液にセルラーゼ浴液を添加し
攪拌後赤色フィルターを用いて濁度を測定する（ Ｄｏ
′直）、。
クロフィブリル化セルロース濃度が固型分含−ｔｏ、２
ｓ＊以下になるように酢酸緩衝液あるいはリン酸緩衝液
などで希釈し、所定の温度に保つ。ここで用いる緩衝液
は各々使用する酵素の最適ｐＨ範囲をカバーするような
緩衝液が望ましい。この溶液にセルラーゼ浴液を添加し
攪拌後赤色フィルターを用いて濁度を測定する（ Ｄｏ
′直）、。
反応は一定温度で実施し撹拌し々くてもよい。
なぜならばマイクロフィブリル化セルコースの水分散液
）惺非常に安定であり、２日間放１しても、その濁度す
実質的に変化しないためである（参考例−２参照）。
）惺非常に安定であり、２日間放１しても、その濁度す
実質的に変化しないためである（参考例−２参照）。
経時的に濁度を測定１〜、を仕儀の濁度全り、−、とす
ると、ΔＤ＝Ｔ）。−Ｄつ値が酵素活性に比例するため
セルラーゼ活性はΔＤ値で代表させることができる。同
様に反応速度はΔＤ／ｌ 、比活性なΔＤ／ｌ−タンパ
ク質でもって示すことうよできる。
ると、ΔＤ＝Ｔ）。−Ｄつ値が酵素活性に比例するため
セルラーゼ活性はΔＤ値で代表させることができる。同
様に反応速度はΔＤ／ｌ 、比活性なΔＤ／ｌ−タンパ
ク質でもって示すことうよできる。
マイクロフィブリル化セルロースのａ度ｒａ固型分０．
２５％以下が望ましく ０．０５ ％まで低下させても
ΔＤの値は変化しないっ実用上ぼ分光光度計の測定感度
のよい吸光度０．２〜０．６５の範囲で測定することが
望ましい。
２５％以下が望ましく ０．０５ ％まで低下させても
ΔＤの値は変化しないっ実用上ぼ分光光度計の測定感度
のよい吸光度０．２〜０．６５の範囲で測定することが
望ましい。
本方法によれば濁度変化（ΔＤ） ０，００５ （１３
立分光光度計１０１型、使用セル１０ツ、測定波長６１
０ｎｍ）Ｕグルコース換算にして約５〜１０μ２鷹の増
加に相当するーこれば従来のソモギーネルノン法の感度
ンてンミぼ匹敵するものである。しかも本方法ではサン
プリングあるいは発色のだめの化学反応なども不要であ
り、酵素反応を１ｎ３ｉｔｕで測定できる利点も持つ。
立分光光度計１０１型、使用セル１０ツ、測定波長６１
０ｎｍ）Ｕグルコース換算にして約５〜１０μ２鷹の増
加に相当するーこれば従来のソモギーネルノン法の感度
ンてンミぼ匹敵するものである。しかも本方法ではサン
プリングあるいは発色のだめの化学反応なども不要であ
り、酵素反応を１ｎ３ｉｔｕで測定できる利点も持つ。
さらに必要に応じて記録計と連結させることによりセル
ラーゼ活性の経時変化などを追跡できるという利点も持
ち、セルラーゼの酵素化学的な研究に対して非常に有益
な方法を提供できる。
ラーゼ活性の経時変化などを追跡できるという利点も持
ち、セルラーゼの酵素化学的な研究に対して非常に有益
な方法を提供できる。
以下実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
参 考 例 −１
２壬マイクロフイブリル化セルロース６．２５ Ｆに対
し０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０） ５０−を加え
攪拌後でルラーゼ「オノズカ」（ヤクルト生化学社５）
ｓｏ′Ｉｑを添加し３０℃で加水分解反応を実施した。
し０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０） ５０−を加え
攪拌後でルラーゼ「オノズカ」（ヤクルト生化学社５）
ｓｏ′Ｉｑを添加し３０℃で加水分解反応を実施した。
反応汀ソモメーネルソン法により生成還元糖をグルコー
ス換算でもって表示した。
ス換算でもって表示した。
対照としてカルボキシメチルセルロース１２５ηに対す
る同セルラーゼの加水分解反応を実施した。
る同セルラーゼの加水分解反応を実施した。
結果を表１に示した。
表１ マイクロフィブリル化セルロースのマイクロフィ
ブリル化セルロースはカルボキシメチルセルロースに比
較し非常に高い反応率を示す。
ブリル化セルロースはカルボキシメチルセルロースに比
較し非常に高い反応率を示す。
参考例−２
２％マイクロフィブリル化セルロース２．１８ Ｐに対
し０．０５Ｍ酢酸緩衝液ｆｐＨ５，０１２５−を添加後
、日立分光光度計１０１型、１０罵セルを用いて６１０
ｎｍの吸光度を経時的に測定した。測定時間中はサン
プルは静置状態とした。
し０．０５Ｍ酢酸緩衝液ｆｐＨ５，０１２５−を添加後
、日立分光光度計１０１型、１０罵セルを用いて６１０
ｎｍの吸光度を経時的に測定した。測定時間中はサン
プルは静置状態とした。
結果を表２に示した。
表２ マイクロフィブリル化セル
ロースの安定性
一フイクロフイブリル化セルロースに高い安定性を示す
っ 実 施 例 −１ 参考例−２で作成したマイクロフィブリル化セルロース
溶液５ゴに対しセルラーゼ「オノズカ」２０３Ｐ／ゴ０
，０５ Ｍ酢酸瑳衝液（ｐＨ５，０＋ ５０μを全添加
Ｌ、３７℃で加水分解反応を実施した。
っ 実 施 例 −１ 参考例−２で作成したマイクロフィブリル化セルロース
溶液５ゴに対しセルラーゼ「オノズカ」２０３Ｐ／ゴ０
，０５ Ｍ酢酸瑳衝液（ｐＨ５，０＋ ５０μを全添加
Ｌ、３７℃で加水分解反応を実施した。
ソモギーネルソン法による還元糖の定量（グルコース換
Ｘ表示）、及び日立１０１型分元光度３″ｔによる６１
０ｎｍの吸光度を経時的に測定した。
Ｘ表示）、及び日立１０１型分元光度３″ｔによる６１
０ｎｍの吸光度を経時的に測定した。
結果を第１図に示した。（ΔＤ／Δグルコース） Ｘ
１０００は０，４８１〜０．４８５でありグルコース生
成に比例して吸光度の低下が認められる。
１０００は０，４８１〜０．４８５でありグルコース生
成に比例して吸光度の低下が認められる。
実施例−２
参考例−２で作成したマイクロフィブリル化セルロース
溶液０．６ｄに０．０５ Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０１
１，４ｍを添加後セルラーゼ［オノズカ」２０１Ｍ？／
−酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）を４μｔ、２０μｔ。
溶液０．６ｄに０．０５ Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０１
１，４ｍを添加後セルラーゼ［オノズカ」２０１Ｍ？／
−酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）を４μｔ、２０μｔ。
４０μｔ、８０μを各々添加し３７℃で反応を実施した
。日立分光光度計１０１型で６１’ｏｎｍの吸光度を測
定し反応を追跡した。結果を第２図に示した。（ΔＤ／
Ｈｒ ） １９素量に比例することが認められる。
。日立分光光度計１０１型で６１’ｏｎｍの吸光度を測
定し反応を追跡した。結果を第２図に示した。（ΔＤ／
Ｈｒ ） １９素量に比例することが認められる。
第１図は実施例１で測定した反応時間に対する還元糖の
量及び６１０ｎｍの吸光度の変化を示すグラフであり、
第２図は実施例２で測定した酵素量とΔＤ／Ｈｒ値との
関係を示すグラフである。 出願人代理人 古 谷 暮 １ 事件の表示 特願昭５７−８２８３１号 ２ 発明の名称 セルラーゼ活性測定方法 ３ 補＋Ｅをする者 事件との関係 特許出願人 ＋２９０１ダイセル化学工業株式会社 ４代理人 図 面 ６ 補正の内容 別紙のとおり
量及び６１０ｎｍの吸光度の変化を示すグラフであり、
第２図は実施例２で測定した酵素量とΔＤ／Ｈｒ値との
関係を示すグラフである。 出願人代理人 古 谷 暮 １ 事件の表示 特願昭５７−８２８３１号 ２ 発明の名称 セルラーゼ活性測定方法 ３ 補＋Ｅをする者 事件との関係 特許出願人 ＋２９０１ダイセル化学工業株式会社 ４代理人 図 面 ６ 補正の内容 別紙のとおり
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、 セルラーゼ活性測定用基質としてマイクロフィブ
リル化セルロースを用いる事を特徴とするセルラーゼ活
性測定方法。 ２、 セルラーゼ活性の検出法として比濁法を用いる特
許請求の範囲第１項記載のセルラーゼ活性測定方法。 ３、 固型分含量０．２５％以下のマイクロフィブリル
化セルロースを用いる特許請求の範囲第１項記載のセル
ラーゼ活性測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8283182A JPS58202000A (ja) | 1982-05-17 | 1982-05-17 | セルラ−ゼ活性測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8283182A JPS58202000A (ja) | 1982-05-17 | 1982-05-17 | セルラ−ゼ活性測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58202000A true JPS58202000A (ja) | 1983-11-25 |
Family
ID=13785344
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8283182A Pending JPS58202000A (ja) | 1982-05-17 | 1982-05-17 | セルラ−ゼ活性測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58202000A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106461550A (zh) * | 2014-06-30 | 2017-02-22 | 芬欧汇川集团 | 监测纳米原纤纤维素的品质的方法和设备 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56100801A (en) * | 1979-12-26 | 1981-08-13 | Itt | Microfibrous cellulose and its manufacture |
-
1982
- 1982-05-17 JP JP8283182A patent/JPS58202000A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56100801A (en) * | 1979-12-26 | 1981-08-13 | Itt | Microfibrous cellulose and its manufacture |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106461550A (zh) * | 2014-06-30 | 2017-02-22 | 芬欧汇川集团 | 监测纳米原纤纤维素的品质的方法和设备 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Eveleigh et al. | Measurement of saccharifying cellulase | |
| Fox et al. | Miniaturization of three carbohydrate analyses using a microsample plate reader | |
| Xiao et al. | Microplate‐based filter paper assay to measure total cellulase activity | |
| Carder | Detection and quantitation of cellulase by Congo red staining of substrates in a cup-plate diffusion assay | |
| Nilsson et al. | Determination of glucose, urea and penicillin using enzyme-pH-electrodes | |
| Szijártó et al. | Liquefaction of hydrothermally pretreated wheat straw at high-solids content by purified Trichoderma enzymes | |
| Soldatkin et al. | Development of conductometric biosensor array for simultaneous determination of maltose, lactose, sucrose and glucose | |
| GARCIA et al. | Assessment of endo‐1, 4‐beta‐D‐glucanase activity by a rapid colorimetric assay using disodium 2, 2′‐bicinchoninate | |
| CN101676719A (zh) | 用分光光度计测定糖化酶活力的方法 | |
| Johnson et al. | An enzymic method for the quantitative determination of glycogen | |
| Makela et al. | Nonchromatographic cyclodextrin assays: evaluation of sensitivity, specificity, and conversion mixture applications | |
| CN102288559B (zh) | 一种检测淀粉酶的方法和试剂盒 | |
| Leisola et al. | Determination of the solubilizing activity of a cellulase complex with dyed substrates | |
| CN112014336A (zh) | 一种基于级联反应检测α-葡萄糖苷酶活性的普适性方法 | |
| Peris-Tortajada | Measuring starch in food | |
| CN105296595B (zh) | 一种基于纳米金生长的生物酶活性检测方法 | |
| JPS58202000A (ja) | セルラ−ゼ活性測定方法 | |
| Nero et al. | Amperometric method for the determination of cellulase activity and its optimization using response surface method | |
| Holm | Automated colorimetric determination of cellulase activity in fermentation samples using a ferricyanide-molybdoarsenic acid reagent | |
| CN104807764A (zh) | 碱性木聚糖酶活力测定的方法 | |
| JPS634661B2 (ja) | ||
| Kuan et al. | An alternative method for the determination of uric acid in serum | |
| Matthews et al. | Modified automated saccharogenic determination of serum and urinary amylase activity | |
| JPS6131954A (ja) | マルト−スセンサ | |
| CN114441758B (zh) | 一种基于铜离子响应焦磷酸根的碱性磷酸酶或甲胎蛋白检测方法 |