JPS58168961A - プロコラーゲン―ペプチド類の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はプロコラーゲン−はプチド（ｍ型）およひノロ
コラーケ゛ンーベプチドｃｏｔ　１　（　ＩＩＩｍ）の
祷免疫学的測定法および抗プロコラーゲンーベゾチドＣ
ｏｌ１　（　［１型）血清の製法に関する。

プロコラーゲ／（Ｉｌｌ型｝は主として網状結合組織中
に存在する特殊なコラーゲン（凹型）の生合成上の前駆
物質形態である。このものは、コラ−ゲナーゼで処理す
ることによ９分子から除去されうる付加的にアミノ木端
に局在するペプ　　　。

チド分紛しプロコラーゲン−ペプチド（Ｍｌ型）〕によ
リこのコラーゲン（ＩＩＩ型ンとは相異する。

プロコラーゲン−ペプチド（凹型）自体はコラ−ゲナー
ゼを用いてさらに破片ＣＯ７　１、Ｃｏｌ　２およびＣ
ｏｌ　５に分解され、これらはそれ自体続知の蛋白化学
的方法により単離されうる［　｝｛、　Ｎｏｗａｃｋ氏
他ｒ　Ｅｕｒ，　Ｊ，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ　ｍ　７　
０巻第２０５〜２１６頁（１９７６年｝およびＰ，　Ｂ
ｒｕｃｋｎｅｒ氏他Ｉ　Ｅｕｒ。

Ｊ，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ第９０巻第５９５　〜６０３
簀（１９７８年）参照〕。

血清中におけるプロコ２−ゲンーペプチドｆＩｌｌ型）
の濃度についての研究では、この一度が肝臓の線維組織
増殖疾患で高まることを示している［Ｈ．Ｒｈｏｄｅ氏
他ｒ　Ｆｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ，　Ｊ第９
巻第４５１〜４５９貝（１９７９年）＃照］。この抗原
を検出するための放射線免疫学的方法ｔまヨーロッパ特
ｎ第４９４０号明細書に記載されている。家兎をプロコ
ラーゲン（ｍ型》またはツロコラｉゲンーにプチド【Ｉ
［ｌｉｉ》で免役賦与することにより、プロコラーゲン
−はプチド（凹型）に対して鍋い親和性を示す抗体が得
られることが知られている。しかしながらプロコ２−ゲ
ンーにブテトＣｏｔ　１　（　１！！Ｍ）に対して見出
される親和性はわずかであった（　Ｒｈｏｄａ氏他上記
文献一照）。

今や嶌くべきことに、プロコラーゲン−ペプチドＣＯＪ
！　１　（　ｉｌｌ型）で免疫賦与することによシ、プ
ロコラーゲン−ペプチドｃｏｔ　１　（　Ｉｎ　）およ
びプロコラーゲン−ペプチド（凹型）に対して（ロ」し
親和性を示す抗体が得られることが見出された。かかる
抗体はまたプロコ２−ゲンーペプチド（ＩｌＩ型）で免
疫賦与することＫよっても得られうる。

促米の副定汰で血清中のプロコラーゲン−はソチト（ｍ
型）を捕捉することがり耗でおった。

吟やこの新城な抗体の特別な性′Ｘは、体漱．中の両抗
原すなわちプロコラーケ′ンーペゾテド（ＬＩｌ型）お
よびプロコラーゲン−ペプチド（：Ｏｌ　１　（［１型
）の総量を免投字的方法により測だせしめうろことであ
る。崩賊産−Ｃｏ１１も同様にこの抗体に結合されるの
で、プロコラーゲン−ペプチド（ＩｍＷ）およびプロコ
ラーゲン−ペプチドＣｏ１１（Ｉ［ｌＷ）の総量の計測
は診断上の付加的な資料となりうる。このことは時に血
清または組織中の高められた蛋白分解＃素活性と結びつ
いた疾患における価値の増大を意味する。何故ならばか
かる場合血清中に崩壊産物Ｃｏｔ　１力・多量に見出さ
れ、これはしかしながら従来法では捕捉しえなかったも
のであったからである。

それゆえ本発鴫はゾロコラーゲンーベプテト（ｌ［ｌ型
）およびプロコラーゲンーペプチドＣｏｔ　１（Ｉｌｌ
型）の両抗涼會−柘に免役学的に飄１ｊ冗するに尚り、 ａ）　　ｓｆｌ記両抗原に類する抗体を有する検査され
る予定の試料に関して過剰である一定量の高特異的な血
清をこれら抗原を含有する試料および標識付けされた形
態をした前記両抗原の一定量と反応せしめ、形成された
抗原−抗体複合物を分離しそしてその複合物および／ま
たは上澄み液中のａｍの菫を測定するか、または ｂ）検査される予定の試料に関して過剰である一定量の
前記血清を検査される予定の試料と反応させ、抗体の未
反応量を担体に結合した限定された過剰蓋の両抗原で固
定しそして限定された過剰蓋の第２の標識付けされた抗
体と反応させそして次に結合されたおよび／ｌたは遊離
の第２の抗体のＩ１１繊量を測定する ことｆｔ特徴とする方法に関する。

この方法では既知放射線免疫検７　（ＲＩ人）方法　　
　　　、ならびに＃索免疫検定方法および他の標識付は
例えば螢光標識付け、色素標識付けなどなどを用する類
似の測定法が使用されうる。方法ａ）では放射性標識付
けが好ましく、また方法ｂ）では酵素標識付けが好まし
い。かかる方法は専門家には知られておりそしてここで
は詳細に記載する必要はない。この検出反応では標識付
けされたプロコ２−ゲンーベプチドはヨーロッパ特許第
４９４０号の記載からそれ自体既知の方法で抗体を競９
合うので、従って形成された抗原−抗体複合物中におけ
る標識付けされた抗原の菫は、標識付けされてない抗原
が測定すべき試料中に多く含有されればされるほどよシ
わずかとなる。

それゆえ複合物の標識例えば放射能または酵素活性、あ
るい−は抗原−抗体複合物を分離した後の上澄み液の標
識がプロコ２−ゲンーペブチド（ＩＩ型）またはプロコ
ラーゲン−ペプチドＣＯＺ１（Ｉｉｍ）の既知菫を含有
する試料により作成された検査曲線に基づき検査すべき
試料中に含有される抗原ｔを確認するのに使用されうる
。

方法ｂ）では方法ａ）におけると同様に複合物中の標識
が測定されるのが好ましい。

浴液からの抗原−抗体複合物の分離は濾過、吸引濾過、
遠心分離などのような当業者に知られたそのだめの慣用
方法によｐ遂行されうる。

抗血清を固体担体例えば試薬ガラス器具の内壁に結合さ
せて使用することも可能である。

好ましくは本方法は、高特異的な抗プ目コラーゲン−ペ
プチドＣａｌ　１　（Ｉ型）血清を用いて形成され九抗
原−抗体複合物をその高％異的な血清に対応する第２の
抗体を使用して未反応抗原から分離して実施される。こ
こで好ましいのはその抗血清の取得に使用された動物種
のｒ−グロブリンに対する抗体である。抗原すなわちプ
ロコラーゲン−ペプチド（１１またはプロコラーゲン−
ペプチドｃｏｔ　１　（ｍ型）の標緘付けは蛋白質の橡
識付けについて知らされた方法を用いて実施されうる。

放射線核種を用いる放射性標識付けの場合は１２５工を
使用するのが好ましい。この放射線核種を用いるａｍ付
けにはクロラミンＴ法ＣＰ、Ｊ１ＭｃＣｏｎａｈｅｙ氏
他ｒ　Ｉｎｔ。

Ａｒｃｈ、　Ａｌｌｅｒｇｙ　Ｊ第２９巻第１８５頁＜
１９６６年）参照〕が好ましい。

プロコラーゲン−ペプチド（ｍ型）およびプロコラーゲ
ンペプチドＣｏｌ　１　（ｍ型）を測定するための酵素
免疫検定方法はまた当該動物種例えば家兎のｒ−グロブ
リンに対する抗体が酵素標識付けされるようにも実施さ
れうる。この様式の＃菓免役検定では、抗原−抗体複合
物の形成後に残留する抗プロコラ、−ゲンーペプテド血
清部分を担体に結合したプロコラーゲン−はプチド（膳
聾）またはプロコラーゲン−ペプチドｃｏｔ　１　（Ｉ
Ｉ型）に結合させそして次に家兎のγ−グロブリンに対
する酵素標識付けされた抗体と反応させることによシ測
定する。

次に結合され九酵素標識付けされた抗体量を酵素反応を
測定することにより測定しそしてこれは試料中のプロコ
ラーゲン−はプチド（Ｉ瀝）およびプロコラーゲン−は
プチドＣｏ１１　（Ｉｌｌｌｌｌ）の禾知槍と直接比例
する。

本発明による測定法にとって、プロコラーゲン−ペプチ
ドｃｏｔ　１（Ｉ型）に対する適当な抗血清を入手する
ことが決定的である。このものはまたプロコ２−ゲンー
はプチド（夏型）に対しても類似する。

免疫賦与するには合目的々にはプロコ２−ゲンーペプテ
ドＣｏｊ　１　（Ｉ型）が使用される。免τ 疫賦与は複合フロイント氏アジュバントの存在下にヤギ
のような実験動物、好ましくは家兎にプロコラーゲン−
ペプチドＣｏ１１　（０１型）を皮下注射することによ
り遂行される。この場合抗原蓋は１動物当シ０．２〜α
５岬である。

以下の例により本発明をさらに説明する。

例　　１ プロコラーゲン−ペプチドＣｏｊ　１　（ｉｉ型）の調
製プロコ２−ゲンーはプチド（ｍ型）６０１１ｖを必ｇ
７！童の緩衝液（緩衝液１：α０５Ｍ）リス／）（ＣＩ
、ｐ）１　ｓ、　ｏ、　Ｑ、　Ｄ　２　Ｍ　ＣａＣｌ２
　）中に溶解させセして５５゛Ｃに加温する。４２０単
位のコラ−ゲナーゼを添加後この混合物を５５℃で１５
分間培養する。′５７℃に冷却しそして４２０単位のコ
ラ−ゲナーゼを添加した後培養をさらに５時間続行する
。次にこの混合物を２８Ｉの緩衝液（緩衝液２：１００
５ｖト　リ　ス／　ＨＣｔ　、　　　ｐＨ８，６、２Ｍ
ｂば、累、　緩噛晩；盲虻　６　：０．００５Ｍ）すｘ
／Ｈｃｚ、ｐＨａ＜Ｓ、８Ｍ腋索）で透析しそして緩衝
液６で平衡化されたＤＥＡＥ−セルロースカラム（ｔｓ
ｘｓｍ）に加える。

カラム上に結合された蛋白質をＮａＣ１勾配（０〜０６
Ｍ）を用いて＃離する。溶出液を２３０ｎｍでの吸収に
ついておよびプロコラーゲン−はプチド（ＩＩ型）に対
して特異的である抗体を使用して抗原活性について再検
査する。カラムから浴出する最後のピークは通常プロコ
ラーゲン−ペプチドＣｏｔ　１　（Ｉ型）を含有する。

このペプチドをα０１　Ｍ　（ＮＨ４）　２Ｃ’０３で
透析して脱塩しそして凍結乾燥する。

免疫学的測定（ＲＩＡ）の実施 ２５μｇのプロコラーゲン−ペプチド（Ｉ型）を１ミリ
キユリーの沃素１２５を用いクロラミンＴ法により標臓
付けしそして結合しなかった沃素を透析により除去する
。放射線免疫試験を実施するに際してそれ以上の段階は
好ましくは［１０４−の非イオン系洗浄剤例えばツイー
ン＠２０の存布下に実施される。結合曲線はそれぞれ２
りの標識付けされたプロコラーゲン−ペプチド（凹型）
またはプロコラーゲン−ペプチドＣｏｊ　１　（１皺）
を用いて測定される。血清または他の体液の未知試料中
におけるプロコラーゲン−ペプチド（凹型）およびプロ
コラーゲ／−ペプチドＣｏ１１（Ｉｌｌ型）の総量の濃
度は以下の抑制試験で沖；定される。

一定量の抗体を未知試料と４℃で１６時間予備培養しそ
して標識付けされたはプチド２Ｂｙを添加した後、さら
に８時間４℃で培養する。次に過剰の家兎免疫グロブリ
ンに対する抗体を加えそして免疫複合物中に結合された
抗原を浴液から分離する。未知試料の抑制活性を標識付
けされてないプロコラーゲン−はプチド（ｉ型）または
プロコラーゲン−ペプチドＣｏｊ１（ｎｌ型）の標準濃
度の活性と比較する。

いるならば、ＲＩＡを用いてプロコ２−ゲンーペブチド
（Ｉｎ型）について見出されたよシも典型的にはおよそ
３倍高いプロコラーゲン−ペプチドＣｏｊ　１　（Ｉｎ
型）＋プロコラーゲンーペプチド（ＩＩＩ型）の値が見
出される。

例　　２ 酵素免疫検定による免疫学的測定 血清または他の体液の未知試料中におけるプロコラーゲ
ンーペプチド（夏型）濃度を下記酵素免疫試験を用いて
測定する。

一定量の抗プロコ２−ゲンーペプ？トＣＯＣ０１１（ｆ
ｉ１血清を未知試料と４℃で２時間半予備培養する。次
にこの混合物をミクロ力価プレートのプルコラーゲン−
ペプチド２０　ｎｙを積層させた凹部にピペットで加え
そして４℃で１８時間培誉する。上澄み液を注ぎ出しそ
して凹部を生理食塩溶液で洗ったのち家兎のｒ−免疫グ
ロブリンに対する酵素標識付けされた抗体（例えばペル
オキシダーゼ標識付け）の一定量を加えそして室温で５
時間培養する。上澄み液を注ぎ出しそして生理食塩溶液
で洗った後酵素基５！Ｌ（はルオキシダーゼ標識付けＨ
２Ｏ２の場合）および色原体（例えば０−フェニレンジ
アミン）の添加により酵素反応を開始させる。室温で３
０分間培養し九後、６Ｍ　ＨＣ！５０μノの添加により
反応を停止させる。適当な測光計を用い５０分後に溶液
の着色強度を測定する。この着色強度は結合された酵素
標識付けされた抗体の量と直接比例し従って試料中のプ
ロコラーゲン−ペプチドの未知量と比例する。プロコラ
ーゲン−はブチド（トしまたはプロコラーゲン−ペプチ
ドＣｏ１１（厘皺）の既知蓋を含有する溶液を用いて作
成された検定曲線を用いて試料中のプロコラーゲン−ペ
プチド（ｎｌ）＋プロコラーゲンーペプチドＣｏ１１（
Ｎ型）の菫が調査されうる。

特許出願人　ヘキスト・アクチェンゲゼルシャフト 第１頁の続き ＠発明者　　へルムート・シュトレツケルドイツ連邦共
和国デー−６１０２プ フングシユタト・オーデンヴア　　− ルトシュトラーセ５６ ■出　願　人　マックス−ブランク−ゲゼルシャフト・
ツール・フエルデルン グ・デル・ヴイッセンシャフテ ン・ニー・ファウ ドイツ連邦共和国デー−３４００ゲ ツチンゲン・ブンゼンシュトラ ーセ１０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）プロコラーゲン−ペプチド（ｎｌ型）およびプロコ
   ラーゲン−ペプチドｃｏ、１１　（Ｉｎｌ型）の両抗原
   を一緒に免疫学的に測定するに当り、ａ）検査される予
   定の試料に関して過剰である一定量の前記両抗原に類す
   る抗体を有する高特異的な血清をこれら抗原を含有する
   試料およびＩＩ繊付けされた形態にある前記両抗原の一
   定量と反応せしめ、形成された抗原−抗体複合物を分離
   しそしてその複合物および／または上澄み液中のｌ５Ｉ
   ＩＩｔの皺を測定するか、または ｂ）検査される予定の試料に関して過剰でめる一足量の
   ＠６己血清を検査される予定の試料と反応させ、抗体の
   未反応量を担体に結合した限定された過剰箪の両抗原で
   固定しそＬ７て限にされた過５１１８Ｉｔｒｉの第２の
   欅識付けされた抗体と反応させそして次に結合されたお
   よび／または遊離の第２の抗体の標識量′５１：測定す
   る こと′？ｒ：待倣とする方法。 ２）両抗原に対する抗体を有する高特異的な血清が抗プ
   ロコラーゲンーペプチドＣｏｊ　１（ｎｌ型）血清であ
   ることを特徴とする特許 求の範曲第１項配載の方法。 ６）＠繊付けが放射性、酸素性または螢光性標繊付けで
   るることを％倣とする前記特Ｗ！ｆ＃＃求の範囲第１項
   または２項Ｍ己載の方法。 ４）前記方法ａ）にお・いて抗原一抗体複合物の仕組が
   その抗体に類する弟２の抗体を用いて遂行されることを
   特徴とする特許 囲第１〜６項のいずれか一つに記載の方法。 ５）前記方法ａ）において放射性標識付けが用いられる
   ことを特徴とする前記特許請求の範囲第１〜４項のいず
   れか一つに記載の方法。 ６）樟誠付けが沃素１２５を用いて遂行されることを特
   徴とする前記特許請求の範囲第１〜５項のいずれか一つ
   に記載の方法。 ７）前記方法ｂ）において酵素免疫検冗が徐陳付けに用
   いられることを特徴とする前記特許請求の範囲第１〜６
   項のいずれか一つに記載の方法。 ８）複合物中における標識が測定されることを特徴とす
   る前記特許請求の範囲第１〜７墳のいずれか一つに記載
   の方法。 ９）実験動物をプロコラーゲンーペプチドＣａｌ　ｌ（
   ｌｌｍ）で免役賦与しそしてその血清を取得ーゲンーペ
   プチドｃｏｚ１（ト１血清の製法。 １０）削ｉ己待針請求の範囲第９項記載の方法により得
   られる高特異的な抗プロコラーゲンーベプナドリＯｊ１
   （ＩＩＩ型）血清。