JPS58147403A - 抗腫瘍物質およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規な抗腫瘍性物質であるＧ６６ム物質及び
その製造方法に関する。さらに詳しく述べれば、本発明
は歓生智によつて生産される抗總優性高分子多１１１ｍ
１ｉ１．　Ｇ６６ムー質、ま九アルカリ土類金属に属す
るＧ６６Ａ智質生産−を培養して、鋏培書物からＧ６６
Ａ物質を採取することからなる新規抗１ｍ１１Ｆ瘍性１
質、　Ｇ６６Ａ吻質の表造法に閑する〇本発ＩｊＩ者ら
は、アルカリ土類金属に属す一株を用いて倉抗膣緩性智
質の＊ｍを行りた所、該属に属するＡｌｃａｌｉｇ＠ｎ
＊ｓ　ｓｐ、　Ｇ−６６（値工研＠％６３４４号）の培
養物中に従来に紘ない高分子多ＩＩ＠を見い出し丸。咳
吻質をＧ６６Ａ物質と名づけ、これを単一し物塩的、化
学的、生物学的性状を調ぺ九結果、腋物質は新規で礁め
て彊い抗腫瘍効果を有することを明らかにし本発明を完
成させ友。

本発明にかかる新規抗腫瘍性物質Ｇ６６Ａ物策は次の吻
性値又は特徴を有する。

１、性　状：白色粉末、明確な融点、分解点は示さない ２、＃ｌｌ解性：水工エタノールクロロホルムニ不溶で
、ｐ　Ｈ１２，０以上のアルカリ水溶液に可溶 ３、分子量：平均分子量約２３０．０００　　（ゲル濾
過法）ｔｓ１図に示す ４、分子式：　（Ｃ−−１）ｔｓ　）Ｈ＆ＩＩＪｉ成：
？ムノース、マンノースおよびＮ−アセチルグルコサミ
ンよシなる。その比 は３：１：１ ６、呈色反応：フェノール硫酸反応　　陽性モーリッジ
、反応　　　陽性 アンスロン愼酸反応　　陽性 ７、比旋光度：　−１３（ｃ　＝　１　、０．１ＭＮａ
ＯＨ）８、　　ＩＲ：第２図に示す ３４００、２９００．１６５０．１５４０．１０００〜
１１０（ｍにおいて特異的吸収を示す０ ９、　　ＵＶ　　：末ｅｔａ収 ｓ １０、　Ｃ−ＮＭＲ：　ｆｉｇ　３図に示す本発明のＧ
６６Ａ物質社、マウスのザルコーマ（Ｓａｒｃｏｍａ　
）　１８０固臘膣優に対して抗腫瘍活性を有する。すな
わちずルコーマ（Ｓａｒｃｏｍａ　）　１８０　ｍ１１
１９Ｉ細胞を皮下に軽罹し九ｄｄＹマウスに対して、本
発明１ｌｌＩＩＪＩＬｔ膳瘍移罹後７日目から１日おき
に６−臘腔内投与し、４０日後に腫瘍重量を針側すると
、対ＭＷに対し、腫瘍の過秦率は０２　ｗＶｌｑ・ｄａ
ｙ　　投与では７１）　、　Ｉ　ＩＩＩＩ／Ｉ＃＊ｄａ
ｙ投与では９２％　、　５１Ｉｖ１１＃・ｄａｙ投与で
は９０１Ｇ　、　２５１ｖ１ｑ＊ｄａｙ投与では１００
−を示した。

尚、本発明のＧ６６Ａ愉質の急性壽性（ＬＤ、）はｄｄ
Ｙマウス（♂）の腹腔内投与で７５輪である。

次に本発明の抗膿瘍性物質Ｇ６６ＡＣ）製造法について
説明する。本発明のＧ６６Ａ物質を生成蓄積せしめる微
生物として紘アルカリ土類金属に属する１１Ａ　ｉｌ　
Ａｌｃａｌ　ｉｇ＠ｎ＊ｓ　Ｉｐ、　Ｇ−６６（Ｉｌｃ
工研曹寄第６３４４号）がある。この−株の麿学的性状
線下記の通シである。観察は主に駒形らによる［微生物
の分類と同定Ｊ　１９７５年　東大出版会に記載の方法
に従って行り九。

−）形　履 肉汁寒天上で生育した＃ｌｌｌ胞紘０．５〜０．７　Ｘ
　１．０〜２．０建クロンの桿菌であｐ活発に運動する
。多くの細胞は２−６本の周毛性べん毛を有し、壕れに
低唱様べん毛のａｍが認められる。胞子形成は認められ
ず、多形性も示さ構い。グラム染色性、抗酸Ｉｋ社とも
に陰性である。

（ｂ）培養的性質 １、　肉汁寒天培養二曹体は黄茶色を呈してクリーム様
に増殖し、培養が古くなると粘着性をおびる。拡散性色
素の生成紘−められない。

２、　肉汁液体培養二線しめ培養液全体が混濁し、遅れ
てｐ面に増殖リングと一体沈一物を形成する。

３、　肉汁ゼラチン穿刺培養；ａ化される。

４、　ミルク培養：凝固中液化などの纏着な変化は認め
られない。

（ｃ）生理的性質 １、硝酸塩の還元　　：陰性 ２　脱輩反応　　　　：陰性 ３、　　ＭＲテスト　　　　：陰性 ４、　　ＶＰテスト　　　　二階性 ５、　インドールの生成：陽性 ６、健化水素の生成　：陰性 ７、　鹸扮の加水分解　：陽性 ＆　クエン酸の利用　二ＭＩ性 ９．　アンモニウム塩を唯一のＮ源として生育する。

１０、　　水溶性および非水溶性色素の生成は認められ
ない。

１１、　　ウレアーイ・テスト　：擬陽性ｌλ　オキシ
ダーゼ・テスト：陽性 １：４．　　カタラー（・テスト　：陽性１４、　　生
育の範ｉ！ｌ　：　１５℃〜４１℃の範囲で生育し、生
育至適は３２℃〜３７℃である。５℃以下あるいは４５
℃以上での生育は−められない。

壕九ｐＨ６〜ｐＨ８のｐＨ範囲では、よく生育するが、
ｐＨ４，５以下あるいはｐＨ９，５以上での生育は、陽
性か、あるいは強＜ｔｉｌｌｖされる。

１＆　嫌気条件下での生育社線められない。

１６、　０−Ｆテスト（Ｈｕｇｈ−Ｌｅｌｆｓｏｎ法）
：パラフィン・シールした培地のｐＨ指示薬は変化しな
いが、他方の培地唸、アルカリ側となシ、指示薬社青色
を菫す。

１７、　　下記の糖から鐵およびガスの生成は認められ
ず、培地社アルカリ側に移動するＯ Ｌ−アツビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、
Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース。

麦芽糖、シｗｓｅ乳楯、トレノ１０−ス、Ｄ−ツルビッ
ト、Ｄ−マンニット、イノジット、ラムノース、メリビ
オース １８、　　耐塩性：２％ＮａＣＬ添加肉汁培地ではおく
れて生育し、３４　ＮａＣＡ添加肉汁培地では生育しな
い。

１９、　　ポリ・β・ハイドロキシブチレートの菌体内
蓄積：陽性 ２０、　　ＤＮＡ　ＧＣ含量＝６９モル−以上の１学的
性質を有するＧ−６６株をパーシーズ争！二為アル・オ
プ嗜デター電ネーティプ争バクテリオ四ジー８版１９７
４年に従って同定し、ダラム陰性桿−で胞子を作らす周
毛性べん毛で運動すること、また絶対好気性であること
などからフルカリゲネス（ムｌｃａｌｉｇ＠ｎ＊ｓ　）
　１ｇに所属すると判定した。

本１ｉｌｌ）Ｇ６６ム物質の生産■の培養は通常の培養
法が用いられる。すなわち鼓物質生童曹株を適幽な卑天
培地に＄植し、適温で好ましくは２５℃〜３７℃で数日
間培養し、これを母菌として、液体培地あるいは一雛培
地にＩｉｋ柚して、培養を行う０培地としては通常ａｍ
の培養に使用するすべての培地が使用できるが炭素源と
しては、例えばグルコース、フックドース、ｌｉラクト
ースなどのヘキソース、キシロースなどのペントースや
シェークロースなどの炭水化−が利用し易い０１１票源
としては、例えばペグトン、肉エキス、麦芽エキス、コ
ーンステイープリカー、＃母エキス、アミノ酸類などの
有機窒素源やアンモニウム塩、Ｍｌｌ塩類などＯｍ嶺化
合−などが単独または組合せて用いられる。その外必豐
に応じて少量の無機塩類、例えば４１１ｍ１マグネクク
ムやリン戚カリクムなどを造画に添加することができる
。

培養法として社、液体培養法が好適である。培養の初発
ｐＨは中性付近好ましくは６．５〜７．５、培養温度唸
３０〜４０℃が望ましい。培養時間は培養条件によりて
異なるが、液体培養で通常１〜２日間培養を行うとＧ６
６人物質が培養液中に生成蓄積される。培養液中の生成
量が最大に達し九時に培養を停止し、培養Ｆ１［中より
目的物を単−ｎｌｌする０ 培養Ｆ液からＧ６６Ａ物質を単離ｆｌ製するには、まず
培養液を一過法等により一体を除去した後、培養Ｆ液か
らおもにエタノール沈澱とゲルー過法の組み合わせによ
シ単魅することができる。培憤ＦＷｋを活性炭で脱色し
、好ましくは１１５〜１／１Ｇ量に１＆ｍし、約３倍量
のエタノールを加え、攪拌後−夜装置する。生じ九沈象
を遠心分離によりて集め、少量の蒸留水ｔｃｌｉ濁し再
び遠心分−によ）不溶−を除去するＯＪ！に沈澱にエタ
ノールを加え、攪拌後−夜装置する０沈厳を遠心分−で
集め少量０ＩＩ奮水に分散し、４０１）リクロル酢酸ｖ
３容を加えて一夜放置する。生じた沈澱を一過で除き、
透析後、クロロホルム：ブタノール（５：　１）をＶ５
容加えて激しく攪拌する。タンパク質量、変性してゲル
状とな夛、遠心分離すると水とクロロホルムの境界に層
をなすので上層の水相を分取する。この操作をゲルが生
じなくなるまで繰）返し九後、２倍量のエタノールを加
え、沈澱をとる。

この沈蒙を（ゲル濾過クロｉトグツフイー用分離担体、
東洋曹這社製）トヨパールＨＷ　６５のカラムクロマト
グラフィーで好ましくは１／ＩＯＭリン酸水嵩二カリウ
ムー水酸化ナトリウム緩衝液で溶出する。活性画分を透
析後、凍結乾燥すると白色粉末として本物質が得られる
。

以下に実施町をあげて本発明を説明するが、本発明はこ
れによって何ら拘束されるもので社ない。

実施例 （１）生産■の培養 ３０１のジャーファーメンタ−を用い、ｌｓｔ中にブド
ウ糖３０Ｏｆ　、肉エキス１５Ｇ　？　、ペプトンｉｓ
。

ｔを含む生産培地で本１の培養を行った。培養初期のｐ
Ｈは７．０とし、発１ＩＩｌｌ＆は３７℃、発酵中の通
気は１ｔのプロスあ九り０．５Ｌである。生産量線約３
０時間後にピークに達した。

（２）ｎ　　製 プロス５ｏｔｔｐ過して１体を除去した後、１９１の活
性炭で脱色する。活性炭を除いてから、減圧下で約７ｔ
ｔでｌｌ＆縮し、３倍重のエタノールを加え攪拌後−夜
装置する。沈ｗ（約５０ｆ）を遠心で集めて３０〇−蒸
留水に分散し、遠心で不ＷＩＩ愉を除去する。溶液に２
倍量のエタノールを加え、攪拌後−夜装置する。遠心で
集めた沈威約３２　Ｆを少量の蒸留水（約４５０ｗＩｔ
）に分散し、４０１１１）リクロル酢＠！　１／３容を
加えて一夜放置する。沈澱を一過で除色透析後、クロロ
ホルム：ブタノール（Ｓ：１　）　Ｙｋ１１５容加えて
激しく攪拌する。タンパク質量変性してゲル状となシ、
遠心分離すると水とクロロホルムの境界に層をなすので
、上層の水相を分は龜る。この操作をゲルが生じなくな
るまでく〉返した後、約４＠ｏｗｔに績細し、２倍量の
エタノールを加え沈澱をとる。この沈澱約１１　ｔを　
ト冒バー　＃　ＨＷ　６５のカラムにかけ０．１Ｍ　Ｋ
１ＨＰＯ４−ＮａＯＨｌ＆衝ｉ［（ｐＨ１２，０）で溶
出する０活性−分を透析後、凍結乾燥すると白色粉末と
して本物質２ｆが得られる。比旋光度−１３°　（ｃ　
＝　１　、０．１ＭＮａＯＨ）楯の定量 得られ九白色粉末を加水分解し、得られる楯をトリメチ
ルシリル化試薬（ＴＭ８−ＰＺ　、東京化成ＩＩ）によ
）トリメチルシリル化（ＴＭＳ化）シ、ガスクロマドグ
ツフィーで分析した。カラムａ　１．５＊　０Ｖ−１（
１６５℃）を用−標準サング／−（単機のトリメチルシ
リル化物）と比較して糖を同定し、ピークの百横よシ定
食した。その結果本発明物質拡ラムノース、マンノース
およびＮ−アセチルグルコサミンよシ構成され、その比
ｄ３：１：１であつ九。

Ｇ６６Ａ物質の構造 Ｇ６６Ａを箱守法により完全メチル化し、加水分解後、
生成した単糖のメチルエーテルをアルジトールアセテー
ト誘導体に変換してガスクロマドグツフィー−質量スペ
クト、ルで分析を行ったところ、＼ ２．３−ジー０−メチル−１，４，５−トリー〇−アセ
チルーラムニトール　２モル、３−モノ−ローメチル−
１，２，４，５−テトラ−０−アセチルーツム二トール
　１モル、３．４．６−）ジ−０−メチル−１゜２．５
−）ジ−０−アセチル−マンニトール　１４ル、３，４
．６−）ソー０−メチル−１，５−ジー０−アセチル−
２−Ｎ−メチルアセチル−グルコｔｔ二トール　１モル
を得九。従ってＧ６６ムの各単糖の結合位置は、→４）
−Ｒｈａ−（１→Ｘ２　、　→２　、４）　−Ｒｈａ−
（１−ｔ　Ｘｉ　、→２）　−Ｍａｎ−（１−４ＸＩ　
、　ＧｌｅＭＡｃ　−（１→×１である０ Ｇ６６Ａを４３％ｍ１ｍ敵でｉｏｏ℃　２時間加水分解
すると、Ａ、Ｂ、０３種のオリゴ糖が得られる０オリゴ
纏ムのメチル化物を加水分解すると、３．４−ジー０−
メチルツムノース、２，３．４．６−チトラー〇−メチ
ルｉンノース各１モルが得られるので、オリゴＩＩＡの
構造はＭａｎ−（１−９２）−Ｒｈａである０オリゴ１
ｍ１Ｂ、ｃはともに０．ＩＮ炭酸ナトリクムで１００℃
　１時間加水分解するとオリゴ糖Ａを与え、メチル化後
の加水分解物はそれぞれ２．３−ジ−ローメチルラムノ
ース　１４ル、３，４−ジー０−メチル２ムノース　１
モル、２，３．４．６−チトラーＯ−メチル！ンノース
　１モルおよび２，３−ジ−ローメチルツムノース　２
モル、３．４−ジーＯ−メチＡ／ツムノース　１モル、
２，３．４．６−テトラ−０−メチルマンノース　１モ
ルである。従ってオリゴ糖Ｂの構造はＭａｎ−（１→２
）　−Ｒｈａ−（１−＋４）　−Ｒｈａ　、オリゴＳＣ
の構造はＭａｎ−（１４２）　−Ｒｈａ−（１４４）　
−Ｒｈａ−（１−＋４）−ＲｈａであゐＯ ま九Ｇ６６Ａ　ｔ−Ｉ　Ｎ硫酸で１００℃１２時間加水
分解すると塩基性のオリゴ着りが得られる。メチル化後
、加水分解すると、２．３−ジー０−メチルラムノース
、３，４．６−　）ジ−０−メチル−２−Ｎ−メチルゲ
ルコサ建ン各１モルを与えゐことから、その構造はＧｌ
　ｅＮ−（１→４）　−Ｒｈａである。

以上の実験結果を総会してＧ６６Ａのく〕返し構造は次
のように決定された。

＋２）　−Ｍａｎ−（１−＋ｚ）　−Ｒｈａ−Ｑ−ｎ）
　−Ｒｈａ　−Ｑ−ｎ）　−Ｒｈａ−（ＩＪ會 １ｃＮＡｃ よって、Ｇ６６Ａ物質の分子式は（偽声−〇〇入となる
。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明によるＧ６６Ａのゲルー過り四マドグツ
フィー用カツム（２，５φ×６−）分離担体ト曹パー＃
　ＭＷ　６５　Ｋより　、　０．１Ｍ　Ｋ１肝０４　・
ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１１！、０　）　２０　ｌｂ　、
　１　ｆｒ　＝　５−で溶出したゲルｆ過分布を示す。 第２図社本発１ｉＫよるＧ６６ＡＯＡ化力リウム錠中で
測定した赤外部徴収−１１０ 第３ａｌｌは本１１ＷｓＫよるＧ６６Ａの重水中での嶽
素ｌ１ｌＩ核碑気共鳴スペクトルを示すＯ脣許出願人　
　Ｍｍａｌ果株式金社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記に示す物性で４Ｉ愼づけられる多楯体Ｇ６６Ａ
   曽質 ■性　　状：白色粉末 ■溶解性：水、エタノール、クロロホルＡ　Ｋ不溶でｐ
   Ｈ１２，０以上のアルカリ水 溶液に可溶 ■平均分子′ｊｌ：約２３０，０００　（グル濾過法）
   ■分子式’　（ｃ−−ｏ、）ｎ （りＩＩ　ｍｌ成：２ムノース、ｉンノースおよびＮ−
   アセチルグルコサミンよシなる。 その比はａ：ｔ：ｉ ■呈色反応ニアエノール硫酸反応　　陽性モーリッジ為
   反応　　　陽性 アンスロン懺鐵反応　　＃性 ■比１ｉ！ｊｔ７１ニー１３　　（ｅ＝１．０．１ＭＮ
   ａ０Ｈ）■　ＩＲ：第２図に示す ０　ＵＶ：末端吸収 ＠　”Ｃ−ＮＭＲ：　ＩＩＩ　３図に示す２、　Ｇ６６
   Ａ物質生童能を有するアルカリ土類金属に属する−を培
   養して、その場ＩＩ吻よｆｉ　　Ｇ６６人物質を採取す
   ることを特徴とする　Ｇ６６Ａ物質の製造方法。