JPS5811424B2 - 新規ポリペプチド - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、特定の酵素に対する基質として有用な新規ポ
リペプチド、さらに詳しくいえば７−（Ｎａ−置換又は
未置換−グリシルアルギニル）アミノ−４−メチルクマ
リン及びその酸付加塩に関するものである。

各種の酵素の作用や力価を調べるには、その酵素により
特異的な作用を受ける物質を準備し、酵素を作用させる
前及び作用させた後における状態を比較する方法が通常
行われている。

この際、使用される物質としては、天然に存在する物質
でもよいが、大量に供給可能なこと及び純粋な状態で得
られることを考慮して、合成物質を用いるのが有利であ
るため、種々の酵素に対する基質となりうる化合物への
要求が高まっている。

また、このような化合物は、生体内の代謝系におけるき
っ抗物質ともなるので、医薬としての利用も期待される
。

本発明は、このような要求にこたえ、トリプシン、ボバ
インスロンビシなどの酵素に対して特異性を示す合成基
質を提供するものである。

すなわち、本発明の化合物は、一般式 （式中のＲは水素原子又はアシル基、カルボベンジルオ
キシ基、第三アルキルオキシカルボニル基及びアリール
スルホニル基の中から選ばれた保護基であるか、あるい
はその中のアミノ基若しくはイミノ基が前記保護基で、
また水酸基又はカルボキシル基がアルキル基又はアラル
キル基でそれぞれ保護されていてもよいプロリル基、グ
ルタミル基、セリル基、ロイシル基、イソロイシルグル
タミル基、バリルセリル基又はバリルロイシル基であり
、Ｒ′は水素原子、ニトロ基、カルボベンジルオキシ基
又はアリールスルホニル基である）で示されるポリペプ
チド及びその酸付加塩であり、これらはいずれも文献未
載の新規化合物である。

前記一般式（Ｉ）において、Ｒが水素原子のものは、７
−（グリシルアルギニル）アミノ−４−メチルクマリン
であり、Ｒがプロリル基のものは７−（プロリルグリシ
ルアルギニル）アミノ−４−メチルクマリンであり、Ｒ
がグルタミル基のものは７−（グルタミルグリシルアル
ギニル）アミノ−４−メチルクマリンである６Ｒがセリ
ル基のものは７−（セリルグリシルアルギニル）アミノ
−４−メチルクマリンであり、Ｒがロイシル基のものは
７−（ロイシルグリシルアルギニル）アミノ−４−メチ
ルクマリンである。

ざらにＲがインロイシルグルタミル基のものは、７−（
イソロイシルグルタミルグリシルアルギニ／ｊ／）アミ
ノ−４−メチルクマリンであり、Ｒがバリルセリル基の
ものは、７−（バリルセリルグリシルアルギニル）アミ
ノ−４−メチルクマリンであり、そしてＲがバリルロイ
シル基のものは、７−（バリルロイシルグリシルアルギ
ニル）アミノ−４−メチルクマリンである。

本発明の化合物は、その中のα位のアミン基やイミノ基
が、アシル基例えばホルミル基、アセナル基、ベンゾイ
ル基、フタロイル基、クルタリル基など、カルボベンジ
ルオキシ基、第三アルキルオキシカルボニル基例えば第
三ブナルオキシカルボニル基、アリールスルホニル基例
えばトシル基、ｐ−メトキシベンゼンスルホニル基のよ
うなペプチド合成に際して保護基として慣用されている
置換基によって保護されていてもよい６またセリンが構
成成分となっている場合のように分子中に水酸基が存在
する場合や、グルタミン酸が構成成分となっている場合
のように分子中にカルボキシル基が存在する場合には、
これらの基はアルキル基、アラルキル基例えばベンジル
基のようなペプチド合成に際し、慣用されている保護基
によって保護されていてもよい。

さらに、本発明化合物の分子を構成しているアルギニン
のグアニジノ基は、ニトロ基、カルボベンジルオキシ基
、前言上したアリールスルホニル基のようなペプチド合
成に際して慣用されているグアニジノ基の保護基によっ
て保護されていてもよい。

本発明化合物は、酸付加塩の形で存在することもできる
が、これはα位のアミノ基又はイミノ基に付加する場合
のほか、グアニジノ基に付加する場合も包含される。

本発明の化合物は、７−アルギニルアミノ−４−メチル
クマリンを出発原料とし、ペプチド合成に慣用されてい
る方法に従って製造することができる。

例えばアミン基が保護されたグリシンと７−アルギニル
アミノ−４−メチルクマリンとを、ジシクロへキシルカ
ルボジイミドのような縮合剤の存在下で反応させるか、
あるいはアミン基が保護されたグリシンの活性エステル
と７−アルギニルアミノ−４−メチルクマリンとを反応
させたのち、アミン基の保護基を脱離させれば、７−（
グリシルアルギニル）アミノ−４−メチルクマリンが得
られるし、これにさらにアミノ基及びγ−カルボキシル
基が保護されたグルタミン酸を反応させアミノ基及びγ
−カルボキシル基の保護基を脱離させれば、７−（グル
タミルグリシルアルギニル）アミノ−４−メチルクマリ
ンが得られる。

７−（インロイシルグルタミルグリシルアルギニル）ア
ミノ−４−メチルクマリンは、前記のようにして得られ
た７−（グルタミルグリシルアルギニル）アミノ−４−
メチルクマリンにアミン基を保護したインロイシン活性
エステルを反応させ、前記と同様に処理することにより
製造することができる。

また１、７−（プロリルグリシルアルギニル）アミノ−
４−メチルクマリンは、前記のようにして得た７−（グ
リシルアルギニル）アミン−４−メチルクマリンに、イ
ミノ基を保護したプロリンを反応させ、次いで保護基を
脱離することによって製造することができる。

これらの縮合反応は、いずれも適当な溶媒例えばジメチ
ルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、水あるいはこ
れらの混合物の中で行うのがよい。

アミノ基成分と反応させるカルボキシル基成分は活性エ
ステルの形で用いるのが有利であるが、この活性エステ
ルとしては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、
ｐ−ニトロフェニルエステルなどが好適である。

この活性エステルを用いた反応は室温でも十分ζこ進行
するが、所望に応じ加熱して反応を促進させることもで
きる。

反応終了後、反応混合物を濃縮乾固し、残留物をカラム
クロマトグラフィーにより精製し、次いで凍結乾燥する
。

このようにして得られる前記一般式（Ｉ）の化合物は、
通常白色粉末であり、１４０℃以上に加熱すると除々に
分解する。

これらの化合物の中で、アミノ基又はイミノ基に保護基
を有するものは、通常の保護基の脱離手段を用いこれを
除去することができる。

例えばカルボベンジルオキシ基は、アルコールのような
溶媒中で水素添加することにより、第三級ブナルオキシ
力ルボニル基はフッ化水素中にて室温３０分反応させる
ことにより又は酢酸等の溶媒中トルエンスルホン酸と９
０分反応させることにより除去しうる。

前記一般式（Ｉ）の化合物は、その製造条件Ｑこ応じ遊
離形もしくは酸付加塩として得られるが、所望に応じ遊
離形のものは酸付加塩に、また酸付加塩は遊離形のもの
にそれぞれ変換することができる。

この酸付加塩の例としては、塩酸塩、硫酸塩、硝酸基、
リン酸基などの無機酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、酒石酸
塩、コハク酸塩、クエン酸塩、トルエンスルホン酸塩な
どの有機酸塩がある。

前記のようにして製造された化合物が、前記一般式（Ｉ
）に相当する化学構造を有することは、元素分析、アミ
ノ酸分析、柴外線吸収スペクトル及びトリプシンにより
水解した後の柴外線吸収スペクトルを７−アミノ−４−
メチルクマリンと比較すること等により確認された。

本発明化合物は、いずれもヒトトロンビン、カブトガニ
血液凝固酵素、ヒトウロキナーゼ、血液凝固第■因子な
どの酵素により加水分解されるので、これらの酵素の合
成基質として好適である。

本発明のポリペプチドを構成するアミノ酸はＬ体、０体
、ＤＬ体のいずれであってもよいが、Ｌ体が好ましい。

次に実施例により本発明をさらに詳細に説明する。

参考例 Ｎα−カルボベンジルオキシ−Ｌ−アルギニン塩酸塩６
９．０ ｇ（０，２モル）と７−アミノ−４−メチルク
マリン１７．５ｇ（０，１モル）とをジメチルホルムア
ミド３００ｍ１に溶かし、室温でかきまぜながら、ジシ
クロヘキシルカルボジイミド２１ｇ（０，１モル）を加
えた。

この混合物を室温で１夜かきまぜたのち、生成したジシ
クロヘキシル尿素をろ去し、ろ液を減圧濃縮した。

次にその残留物Ｏこメチルアルコール５０ＴＬｌと酢酸
エチル５００Ｌｌを加え、析出してきた結晶をろ別する
ことにより粗結晶１９ｇを得た。

この結晶を熱ジメチルホルムアミド３０１１と熱メチル
アルコール１００１１１１との混合物に溶かし、不純物
をろ別したのち、ろ液に酢酸エチル４００ｒｒｌｌを加
え、析出してきた白色結晶をろ別することにより、融点
２１０〜２１１℃（分解）の７−（Ｎα−カルボベンジ
ルオキシ−Ｌ−アルギニル）アミノ−４−メチルクマリ
ン塩酸塩１４．５．９（収率２９％）を得た。

このものの旋光度〔α〕１５は−１７，０°（ジメチル
ホルムアミド中Ｃ＝２．３５）で、元素分析値は次のと
おりである。

０２４Ｈ２８Ｎ５０５Ｃ１として 計算値噛 Ｃ５７，４２、Ｈ５，６２、Ｎ １３．９６
実測値（＠ Ｃ５７，６１、Ｈ５，６９、Ｎ １３．
９４前記のようにして得た７−（Ｎ −カルボベンジル
オキシ−し−アルギニル）アミノ−４−メチルクマリン
塩酸塩２５１■（０，５ミリモル）を、メチルアルコー
ル５０ｄ１酢酸５ｍＡ及び水１０ｍの混合物中に溶かし
、５％パラジウム炭素触媒２５〜を加え水素ガスを通じ
なから室温で３時間かきまぜた。

次に反応混合物をろ過して触媒を除き、ろ液から減圧蒸
留して溶媒留去し、残留物にエーテル５０ｒｒＬｌを加
え、沈殿してきた粉末をろ取した。

このようにして、融点２７５°Ｃ（分解）の７−Ｌ−ア
ルギニルアミノ−４−メチルクマリン塩酸塩・１／２水
和物１８８ｍｇ（収率１００％）を得た。

このものは旋光度〔α）１５＋９１．９゜（２５％酢酸
水溶液中Ｃ＝１．０１）を有し、シリカゲル薄層クロマ
トグラフィー（ｎ−ブチルアルコール：酢酸：水＝４：
１：１）で単一スポットを与えた。

このものの元素分析値は次のとおりである。

Ｃ１６Ｈ２□Ｎ５０３Ｃ１・ ／Ｈ２０として計算値、
（％） Ｃ５０，９９、Ｈ６，１５、Ｎ １８．５９実
測値（イ）Ｃ５１，０２、Ｈ６，１１、Ｎ １８．４１
実施例 １ 参考例で得た７−Ｌ−アルギニルアミノ−４−メチルク
マリン・塩酸塩・１／２水和物１．５１ｇ（４ミリモル
）を、ジメチルホルムアミド１０７７１１と水１０ｍ１
．との混合物中に溶かし、この中にカルボベンジルオキ
シグリシンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル１
．５３ｇ（５ミリモル）を加える。

室温において１５時間かきまぜたのち、濃縮乾固する。

この残留物を、溶媒としてクロロホルム／メチルアルコ
ール／酢酸（９５：５：３）の混合物を用いてシリカゲ
ルカラムクロマトグラフィー（２×２０ＣｒｆＬ）で精
製し、主留分を濃縮乾固したのち、酢酸５０７ｒＬｌに
溶かし凍結乾燥することにより、７−（Ｎａ−カルボベ
ンジルオキシグリシル−Ｌ−アルギニル）アミノ−４−
メチルクマリンＵ酸塩１．６７ｇを得た。

このものは旋光度〔α）１５−３７．６°（ジメチルホ
ルムアミド中Ｃ＝０．５６）を示し、加熱すると１５０
℃から除々に分解する。

このものの元素分析値は次のとおりである。

Ｃ２６Ｈ３１Ｎ６Ｏ６ＣＩ・Ｈ２Ｏ−ＣＨ５ＣＯＯＨと
して 計算値（イ）Ｃ５２，７８、Ｈ５，７０、Ｎ １３．１
９実測値（イ）Ｃ５２，７２、Ｈ５，４９，Ｎ １３．
４８実施例 ２ 実施例１で得た７−（Ｎα−カルボベンジルオキシグリ
シル−Ｌ−アルギニル）アミノ−４−メチルクマリン塩
酸塩５５９■（１ミリモル）をメチルアルコール５ｏｒ
ｎｌに溶かし、パラジウム炭素触媒５０■を加え水素ガ
スを通じながら３時間かきまぜたのち、触媒をろ別し、
ろ液を濃縮乾固する。

この残留物にエーテル５０７１Ｌｌを加え生じる粉末を
ろ取すれば７−（グリシル−Ｌ−アルギニルアミノ−４
−メチルクマリン塩酸塩４００ｍ９が得られる。

このものは、旋光度〔α）１５−２８．５゜（ジメチル
ホルムアミド中、Ｃ＝０，４３）を有し、加熱すると１
４５℃から除々に分解しはじめる。

このものの元素分析値は次のとおりである。

Ｃ１３Ｈ２５Ｎ６Ｏ４ＣＩ・Ｈ２Ｏ・２ＣＨ３ＣＯＯＨ
として 計算値（％） Ｃ４６，９２、Ｈ６，２７、Ｎ １４．
９３実測値（％）Ｃ４７，１５、Ｈ６，２４、Ｎ １４
．５３実施例 ３ 実施例２で得た７−（Ｎα−グリシル−Ｌ−アルギニル
）アミノ−４−メチルクマリン塩酸塩４２５ｒｎ９（１
ミリモル）をジメチルホルムアミド１０ｍ１に溶かし、
この中ヘカルボベンジルオキシーし一プロリンのＮ−ヒ
ドロキシスクシンイミドエステル４５６■（１，３ミリ
モル）を加え、室温で１５時間かきまぜたのち、濃縮乾
固する。

この残留物を、クロロホルム／メチルアルコール／酢酸
（９５：５：３）の溶媒系を用いたシリカゲルカラムク
ロマトグラフィ（２ＸｌＯｃｒＩＬ）により処理して精
製し、その主留分を濃縮乾固する。

この残留物を酢酸２０ｍ１に溶かし、凍結乾燥すると、
７−（Ｎα−カルボベンジルオキシ−Ｌ−７０リルーグ
リシルーＬ−アルギニル）アミノ−４−メチルクマリン
塩酸塩の酢酸付加物４６０ｍｇを得る。

このものは、旋光度〔α）１５−４７．６°（ジメチル
ホルムアミド、Ｃ＝０．６６）を有し、加熱すると２０
０℃より除々に分解しはじめる。

このものの元素分析値は次のとおりである。

Ｃ３、Ｈ３８Ｎ７０７Ｃ１・Ｈ２Ｏ−ＣＨ５ＣＯＯＨと
して 計算値（％）Ｃ５３，９８、Ｈ６，０４、Ｎ １３．３
６実測値（％）Ｃ５３，４２、Ｈ５，６１、Ｎ １３．
５３実施例 ４ 実施例３で得た７−（Ｎ”−カルボベンジルオキシ−Ｌ
−プロリル−グリシル−Ｌ−アルギニル）アミノ−４−
メチルクマリン塩酸塩２００ｍｇ（０，２７ミリモル）
をメチルアルコール５０ｍ１に溶かし、ＩＮ−塩酸０．
２７７ｎｌとパラジウム炭素触媒２０ｍｇを加え、水素
ガスを通じながら３時間かきまぜたのち、触媒をろ別し
、濃縮乾固する。

残留物ζこエーテル６０ＴＬｌを加え、生成した粉末を
ろ増することにより、７−（Ｌ−プロリル−グリシル−
し−アルギニル）アミノ−４−メチルクマリン塩酸塩４
５０ｍｇを得る。

このものは、旋光度〔α）１５−４７．７°（Ｃ二１．
７３．８０％ＤＭＦ ）を有し、加熱すると１８５℃よ
り除々に分解する。

このものの元素分析値は次のとおりである。

Ｃ２３Ｈ３３Ｎ７０５Ｃ１２・ＣＨ３ＣＯ０Ｈ・３Ｈ２
０として 計算値（％）Ｃ４４，６４、Ｈ６，４４、Ｎ １４．５
８実測値（％）Ｃ４４，９’３ 、 Ｈ５，９７、Ｎ
１４．７２実施例 ５ Ｎ −カルボベンジルオキシ−Ｎ −トシル−Ｌ−ア
ルキ三ン（Ｊ、Ａ、Ｃ，Ｓ、 ８２，４５７６参照）６
．０．９（１３ミリモル）をジメチルホルムアミド２０
ｍ１に溶かし、４−メチル−７−アミノクマリン１．７
５ｇ（１０ミリモル）を加え、さらに氷冷しながらシン
クロへキシルカルボジイミド２．４７．９（１２ミＩＪ
モル）を加えた。

混合物を室温で１夜かきまぜた後、析出したシンクロヘ
キシル尿素をろ別した。

反応混合物からジメチルホルムアミドを減圧留去し、残
留物にクロロホルム２００ＴｒＬｌを加えて抽出し、ク
ロロホルム抽出液を１規定頃酸、５％炭酸水素ナトリウ
ム水溶液及び水で順次洗浄したのち、無水芒硝で乾燥し
た。

次いてクロロホルムを減圧留去後、残寵物をシリカゲル
カラムクロマトグラフィークロロホルム：酢酸エチル−
２：１）で精製する。

主なフラクションを集めて濃縮し、クロロホルム１０７
ｒＬｌに溶かし、エーテルを加えて沈殿させることによ
り、７−（Ｎ“−カルボベンジルオキシ−Ｎｏ−トシル
−Ｌ−アルギニル）アミノ−４−メチルクマリン２．３
１ｇ（収率３７．０％）を得た。

このものの融点は１５５．０〜１６２．５°Ｃ（分解）
、旋光度〔α〕１８は＋１１．２°（Ｃ＝０．５．ジメ
チルホルムアミド中であった。

この化合物は、シリカゲル薄層クロマトグラフィー（ク
ロロホルム：メタノール：酢酸＝９５：５：３）で単一
スポット（Ｒｆ＝０．４）を与えた。

元素分析値は次のとおりである。

Ｃ３１Ｈ３３Ｎ、Ｏ７Ｓ・１／２Ｈ２０として計算値（
％） Ｃ５９，２２、Ｈ５，４５、Ｎ １１．１４実測
値（％）Ｃ５９，１５、Ｈ５，２９、Ｎ １１．２７こ
のようにして得た７−（Ｎ −カルボベンジルオキシ
−Ｎｏ−トシル−Ｌ−アルギニル）アミノ−４−メチル
クマリン５００Ｔｍｇをメタノール５０ｍ１ｉに溶かし
５％パラジウム炭素触媒５０■を加えて室温で水素ガス
を５時間通じた。

反応混合物より触媒をろ別しメタノールを減圧留去した
後、残留物をメタノール５ｒｒｔｌに溶かしエーテルを
加えることにより７−（Ｎ −１−シルーＬ−アルギ
ニル）アミノ−４−メチルクマリンの沈殿３４０１ｒｕ
？（収率８７．１％）を得た。

この化合物は、融点１７４．５〜１８２．５°Ｃ（分解
）及び旋光度〔α）１８−１１．４°（Ｃ＝０．５．ジ
メチルホルムアミド中）を有し、シリカゲル薄層クロマ
トグラフィー（ｎ−ブナルアルコール：酢酸：水＝４：
１：１）で単一スポット（Ｒｆ＝０．６）を与えた。

このものの元素分析値は次のとおりである。

元素分析値Ｃ２３Ｈ２７Ｎ５ ｏ５Ｓ・１／２Ｈ２０と
して 計算値（イ）Ｃ５４，８６、Ｈ５，８０、Ｎ １３．９
１実測値（（至）Ｃ５４，４１、Ｈ５，７２、Ｎ １３
．６０このようにして得た７−（Ｎｏ−トシル−Ｌ−ア
ルギニル）アミノ−４−メチルクマリン４９０ｍｇ（１
ミリモル）をジメチルホルムアミド５ｒｕｌｌに溶かし
、カルボベンジルオキシグリシンのＮ−ヒドロキシスク
シンイミドエステル４５９ｒｎＩ？（１，５ミリモル）
を加える。

室温で２日間かきまぜたのち、反応液に過剰のエチルエ
ーテルを加え、析出した沈殿をろ惚し、乾燥後シリカゲ
ルカラムクロマトグラフィー（２Ｘ 、１０ＣｒｒＬ）
に、クロロホルム／酢酸エチル／エチルアルコール（５
：５：２）の溶媒系を用いて通して精製し、主留分を濃
縮乾固する、残留物をメチルアルコール５ｍｌとエーテ
ル３０ｍ１の混合物中から析出させると、融点１３０．
５〜１３５．５℃の７−（Ｎ −カルボベンジルオキシ
クリシル−Ｌ＝Ｎ −トシルアルギニル）アミノ−４
−メチルクマリン６１１７ｍｇ（収量９０．１％）が得
られる。

このものは旋光度〔α）１５−３０．１°（Ｃ二１．Ｄ
ＭＦ）を有し、その元素分析値は次のとおりである。

■ Ｃ３３Ｈ２ＯＮ６ ｏ８Ｓ・ ／２Ｈ２０として計算値
俯 Ｃ５７，８０、Ｈ５，４４、Ｎ １２．２６実測値
ｆｙＡＣ５７，６９、Ｈ５，３０、Ｎ １２．１０実施
例 ６ 実施例５で得た７−（Ｎ −カルボベンジルオキシク
リシル−Ｎ ＝トシル−Ｌ−フルギニル）アミノ−４−
メチルクマリン６７８１ｍｇ（１ミリモル）を、メチル
アルコール５０ｍ１と酢酸１０１１１１の混合物中に溶
かし、５％パラジウム炭素５０ｍｇを加え、水素ガスを
４時間通じる。

触媒をろ去したのち、ろ液かう溶媒を減圧留去し、残留
物をメチルアルコール１０１ｎｌに溶かし、過剰のエー
テルを加えて沈殿を析出させる。

この沈殿をろ過して分離し、乾燥後ジメチルホルムアミ
ド８ｗＬｌに溶かし、この中へ第三ブチルオキシカルボ
ニル−γ−ベンジルーＬ−グルタミン酸のＮ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステル４７８ｍｇ＋（１，１ミＩＪ
モル）を加える。

室温で２日間反応させたのち、反応液に過剰量のエチル
エーテルを加え、析出してきた沈殿をろ取する。

この沈殿をクロロホルム／酢酸エチル／エチルアルコー
ル（５：５：２）の溶媒系を用いたシリカゲルカラムク
ロマトグラフィー（２×１０ＣＩｒＬ）により精製し、
主留分を濃縮乾固し、残留分をメチルアルコール１０ｍ
１とエチルエーテル５０ｍ１から再沈殿させると融点１
１８５〜１２３．５°Ｃの７−（Ｎ −第三−ｊナル
オキシカルボニル−γ−ベンジルーＬ−クルタミルクリ
シルーＮ −４シル−Ｌ−７’ルギニル）アミノ−４
−メチルクマリン７０５■（収率８２．０％）を得る。

このものの旋光度〔α〕１５は−１２，７°（Ｃ二１．
ジメチルホルムアミド中）であり、元素分析値は次のと
おりである。

Ｃ４２Ｎ５１ Ｎ７０１□Ｓ・ ／２Ｈ２０として計算
値、（＠ ＣＦ１７．９２ 、 Ｈ６，０２、Ｎ １
１．２６実測値チ Ｃ５７，８５、Ｈ６，３０、Ｎ １
１．４２実施例 ７ 実施例６で得た７−（Ｎ −第三ブチルオキシカルポニ
ｌレーγ−ペンシル−Ｌ−グルタミルクリシル−Ｎ −
トシル−Ｌ−アルギニル）アミノ−４−メチルクマリン
４３２７ｒ１９（０，５ミリモル）ニアニソールｏ、５
ｍｌを加え、さらに−７０℃において無水フッ化水素１
０ＷＬｌを加え、水浴中で冷却しながら６０分間反応さ
せる。

過剰の無水フッ化水素を減圧下に留去し、残留物に水５
ｒｒｔｌを加え、水層をエチルエーテル２０１ｎＡで洗
浄後、酢酸基型イオン交換樹脂（ダウエックス１Ｘ２）
５７ｄめ層に通し、水１０ｍＡで溶離させ、凍結乾燥す
ると７−（Ｌ−グルタミルクリシル−Ｌ−アルギニル）
アミノ−４−メチルクマリン２２５〜（収率７４係を得
る。

このものの旋光度〔α〕１５は、＋２９．５゜（Ｃ＝０
．５．ジメチルホルムアミド中）であり、元素分析値は
次のとおりであった。

Ｃ２３Ｈ３１０□Ｎ７・ＣＨ３ＣＯ０Ｈ・２Ｈ２０とし
で 計算値輪 Ｃ４８，９３、Ｈ６，４１、Ｎ １５．９８
実測値φ） Ｃ４８，７５、Ｈ６，２０、Ｎ １６．
１１実施例 ８ 実施例７で得た７−（Ｌ−グルタミルグリルシル−Ｌ−
アルギニル）アミノ−４−メチルクマリン１００ｍＩ？
（０，１８ミリモル）をジメチルホルムアミド２ｒｕｌ
に溶かし、冷却下かきまぜながらトリエチルアミン０．
０３ｍ１を加え、ＰＨを７付近に調整後、酢酸のＰ−ニ
トロフェニルエステル３６．１７Ｑ（０，２３ミｌＪモ
ル）を加え、室温で２日間反応させる。

次いで反応液に過剰のエチルエーテルを加え、析出した
沈殿をろ取し、乾燥後８０％メチルアルコールｚｒｎ１
．ｃこ溶かし、酢酸エチル３ ’Ｏｍｌ、を加えて再沈
殿させると、融点２１４．０〜２１７５°Ｃ（分解）の
７−（Ｎ −アセナル−Ｌ−グルタミルグリシル−Ｌ
−アルギニル）アミノ−４−メチ・ルクマリン９９ｍＩ
？（収率８４．９％）を得る。

このものの旋光度〔α〕２０は−１３，８°（Ｃ二１゜
ジメチルホルムアミド中）、元素分析値は次のとおりで
ある。

Ｃ２５Ｈ３３０８Ｎ７・ＣＨ３ＣＯ０Ｈ・／２Ｈ２０と
して 計算値（イ）Ｃ５１，５８、Ｈ６，０９、Ｎ１５．６０
実測値（循 ＣＦ＋１．２１ 、 Ｈ６，１８、Ｎ １
６．１２実施例 ９ ゛ 実施例７で得た７−（Ｌ−グルタミルグリシル−Ｌ−ア
ルギニル）アミノ−４−メチルクマリン１００■（０，
１８ミリモル）をジメチルホルムアミド２ｍｌに溶かし
、冷却下かきまぜながらトリエチルアミン００３ｍ１を
加え、ＰＨを７付近（こ調整後、第三ブチルオキシカル
ボニル−Ｌ−インロイシルのＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミドエステル７５．４１ｎ？（０，２３ミリモル）を加
え、室温で３日間反応させる。

次いで反応液（こ過剰のエチルエーテルを加え、析出し
た沈殿をろ取し、乾燥後メチルアルコール２ｍｌに溶か
しエチルエーテル２０ｍ１を加えて再沈殿させると、融
点２０８．０〜２１２．０００（分解）の７−（Ｎ −
第三ブチルオキシカルボニル−し−インロイシル−Ｌ−
グルタミルグリシル−Ｉ、−フルギニル）アミノ−４−
；ｌｆ−ルクマリン１２０ｍｇ（収率８６．３％）を得
る。

このものの旋光度〔α〕２０は−１６，７°（Ｃ＝１．
ジメチルホルムアミド中）であり、元素分析値は次のと
おりである。

Ｃ３４Ｈ５ｏＯ１ｏＮ８・２Ｈ２０として計算値（イ）
ＣＦ＋３．２５ 、 Ｈ７，１０、Ｎ １４．６１実測
値（イ）Ｃ５３，５７、Ｈ６，８８、Ｎ １４．４０実
施例 １０ 実施例２で得た７−（Ｎ −クリシル−Ｌ−アルギニル
）アミノ−４−メチルクマリン塩酸塩２５５ｍｇ（０，
６ミリモル）をＤＭＦｌｍｌと水１ｍｌの混合物に溶解
し、これにグルタル酸無水物７ｓ、ｚｍ９（０，６６ミ
リモル）を加えた。

室温において１５時間かきまぜた後反応液にエーテル５
０ｍ１を加えて析出した沈殿をろ集乾燥後溶媒としてク
ロロホルム／メタノール（１／２）の混合物ヲ用いてシ
リカゲルカラムクロマトグラフィー（２儂×１５ｃｒｒ
Ｌ）で精製し、主留分を濃縮乾固したのち、ジメチルホ
ルムアミド５ｗＬｌとエーテル５０ＴＬｌで再沈殿を行
い、７−（Ｎ −グルタリル−グリシル−Ｌ−アルギニ
ル）７ミ／−４−メチ／Ｉ／す”リン塩酸塩２５０〜（
７７，４％）を得た。

このものは融点２３４．５〜２３８．０°Ｃ（分解）、
旋光度〔α〕１５−＋２３°３°（ｏ＝ｉ、ジメチルス
ルホキサイド中）をもち、その元素分析値は次のとおり
である。

元素分析値：Ｃ２３Ｈ３１０７Ｎ６Ｃ１・１／４Ｈ２０
として 計算値（％） Ｃ５０，８２、Ｈ５，８４、Ｎ １５．
４６実測値（％） Ｃ５１，２５、Ｈ５，８０、Ｎ １
５．６０実施例 １１ ７−Ｌ−アルギニルアミノ−４−メチルクマリン塩酸塩
・１／２水和物３７７ｍｇ（１ミリモル）をジメチルホ
ルムアミド１０ｍ１と水１０ｍ１の混合物に溶解し、こ
れにＮα第三ブチルオキシカルボニル−し−バリル−Ｌ
−セリルグリシン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエス
テル４５８■（１ミリモル）を加えた。

室温において１５時間かきまぜたのち、濃縮乾固し、残
留物を溶媒としてクロロホルム／メタノール／酢酸（９
５１５／３〜８５／２０１５）の混合物を用いてシリカ
ゲルカラムクロマトグラフィー（２ｃｍ×１５ｃｍ）で
精製し、主留分を濃縮乾固した。

残留物を、酢酸５０ｍ１に溶解後凍結乾燥することによ
り７−（Ｎα−第三ブナルオキシカルボニルーＬ−バリ
ル−Ｌ −セリルグリシル−Ｌ−アルギニル）アミノ−
４−メチルクマリン塩酸塩３２０■を得た。

このものは、融点１６０°Ｃ（除々に分解）、旋光度〔
α〕２１＝−２１，１°（Ｃ＝１．１５．８０％ジメチ
ルホルムアミド中）をもち、その元素分析値は次のとお
りである。

元素分析値：Ｃ３、Ｈ４７０９Ｎ８Ｃ１・ＣＨ３ＣＯ０
Ｈ・２Ｈ２０として 計算値（％）Ｃ４９，０９、Ｈ６，８７、Ｎ １３．８
８実測値（％）Ｃ４８，６５、Ｈ６，８２、Ｎ １４．
Ｑ７７実施 １２ ７−（Ｎ −第三ブチルオキシカルボニル−０−ベンジ
ル−Ｌ−セリルグリシル）アミノ−４−メチルクマリン
塩酸塩１２０■（０，２８ミＩＪモル）をメチルアルコ
ール５ｏｒｎｌに溶解しパラジウム炭素触媒２０ｍ９を
加えて水素ガスを４時間通じながらかきまぜたのち、触
媒をろ別しろ液を濃縮乾固した。

残留物に酢酸１０ｄを加えて凍結乾燥することにより７
−（Ｎα−第三ブチルオキシカルボニル−Ｌ−セリルグ
リシル）アミノ−４−メチルクマリン塩酸塩７０■を得
た。

このものは、融点１８０℃（除々に分解）、旋光度〔α
） ２１−２８．４゜（Ｃ＝０．４４、、８０％ジメチ
ルホルムアミド中）をもち、その元素分析値は次のとお
りである。

元素分析値Ｃ２６Ｈ３８Ｎ７０８Ｃ１・ΣＣＨ３ＣＯ０
Ｈとして 計算値（イ）Ｃ４９，６０、Ｈ６，３２、、Ｎ １３．
９６実測値罐 Ｃ５０，１１、Ｈ６，４７、Ｎ １３．
６５実施例 １３ ７−（Ｎ −１シル−Ｌ−’７’ルギニル）アミノ−
４−メチルクマリン塩酸塩２３０〜（０，５４ミリモル
）をジメチルホルムアミド５属に溶解し、Ｎ”−第三ブ
チルオキシカルボニル−０−ベンジル−し−セリン−Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミドエステル２５３１ｎ９（０
，６５ミリモル）を加えた。

室温において１５時間かきまぜた後濃縮乾固した。

残留物を溶媒としてクロロホルム／メタノール／酢酸（
９５１５／３〜８５／２０１５ ）の混合物を用いてシ
リカゲルカラムクロマトグラフィー（２ＣＩｒＬ× １
５ｃＴＬ）で精製し、主留分を濃縮乾固したのち、酢酸
２０ｍ１に溶解し凍結乾燥することにより、７−（Ｎ
−第三ブチルオキシカルボニル−０−ベンジル−Ｌ−
セリルグリシル−し−アルギニル）アミノ−４−メチル
クマリン塩酸塩１８０■を得た。

このものは融点１．６０°Ｃ（除々に分解）旋光度〔α
）２１−２９．６°（Ｃ＝０．４６．．８０係ジメナル
ホルムアミド中）をもち、その元素分析値は次のとおり
である。

元素分析値Ｃ３３Ｈ４２Ｎ７０８Ｃ１・ＣＨ３ＣＯ０Ｈ
・Ｈ２０として 計算値（（至）Ｃ５３，８７、Ｈ６，４６、Ｎ １２．
５７実測値チ Ｃ５４，１０、Ｈ６，２８、Ｎ １２．
３６実施例 １４ ７−Ｌ−アルギニルアミノ−４−メチルクマリン頃酸塩
・１／２水和物３７７■（１ミリモル）をジメチルホル
ムアミド５ｍｌと水５ｍｌの混合物に溶解し、これにＮ
−第三ブチルオキシカルボニル−Ｌ−バリル−Ｌ−ロ
イクルクリシン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ル４８４ｍｌ？（１ミリモル）を加えた。

室温において１５時間かきまぜた後濃縮乾固した。

残留物を溶媒としてクロロホルム／メタノール／酢酸（
９５１５／３〜８５／２０１５ ）の混合物を用いてシ
リカゲルカラムクロマトグラフィー（２ｃｒｆＬ×１５
ｃｒＩＬ）で精製し、主留分を濃縮乾固したのち、酢酸
２”６ｙｎｌに溶解し凍結乾燥することにより７−（Ｎ
−第三ブチルオキシカルボニル−Ｌ−バリル−Ｌ−
ロイシルグリシル−Ｌ−アルギニル）アミノ−４−メチ
ルクマリン塩酸塩３’５０１ｎ９を得た。

このものは、融点１５０℃（除々に分解）、旋光度〔α
）２１−３５．９（（Ｃ＝２．１６．８０％ジメチルホ
ルムアミド中）をもち、その元素分析値は次のとおりで
ある。

元素分析値Ｃ３４Ｈ６３Ｎ８０８Ｃ１・ＣＨ３ＣＯ０Ｈ
・３Ｈ２０として 計算値（％）Ｃ５０，７８、Ｈ７，４６、Ｎ １３．１
６実測値（％）ＣＦｌ、０２ 、Ｈ８，ＯＦｌ 、Ｎ
１３．２０実施例 １５ ７−（Ｎ −’７リシルーＬ−７’ルギニル）アミノ
−４−メチルクマリン塩酸塩９１．４■（０，２１Ｆ１
ミリモル）をジメチルホルムアミド５ＴＬｌに溶解し、
これにＮａ−第三ブナルオキシカルボニルーＬ−ロイシ
ン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル８５ｍｇ（
０，２６ミリモル）を加えた。

室温において１５時間かきまぜたのち、濃縮乾固した。

残留物を溶媒としてクロロホルム／メタノール／酢酸（
９５１５／３〜３５／２０１５）の混合物を用いてシリ
カゲルカラムクロマトグラフィー（１ｃｍ×１５ｃｍ）
で精製し、主寵分を濃縮乾固した後酢酸２０ｍ１に溶解
し凍結乾燥することにより７−（Ｎ“−第三ブチルオキ
シカルボニル−Ｌ−ロイシルグリシル−Ｌ−アルギニル
）アミノ−４−メチルクマリン塩酸塩１２０■を得た。

このものは、融点１６０°Ｃ（除々に分解）旋光度〔α
〕２１−３７．８°（Ｃ＝０．６３．８０％ジメチルホ
ルムアミド中）をもち、その元素分析値は次のとおりで
ある。

元素分析値Ｃ２９Ｈ４４Ｎ７０７Ｃ１・２ＣＨ３ＣＯＯ
Ｈ・Ｈ２０として 計算値（イ）Ｃ４７，５８、Ｈ７，０１、Ｎ １２．６
３実測値（イ）Ｃ４７，９２、Ｈ６，５３、Ｎ １２．
１３実施例 １６ ７−（Ｎα−リｌＪシルーＬ−アルギニル）アミノ−４
−メチルクマリン塩酸塩１３６■（０，３２ミリモル）
をジメチルホルムアミド５ｒＩｌｌｃこ溶解し、これに
Ｎ −カルボベンジルオキシ−Ｌ−ロイシン−Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミドエステル１４０■（０，３８ミリ
モル）を加えた。

室温において１５時間かきまぜたのち濃縮乾固した。

残留物を溶媒としてクロロホルム／メタノール／酢酸（
９５＋１５／３〜８５／２０１５）の混合物を用いてシ
リカゲルカラムクロマトグラフィー（１ｃｍ×１５ｃｍ
）で精製し主留分を濃縮乾固したのち、酢酸２０ｍ１に
溶解し凍結乾燥することにより７−（Ｎα−カルボベン
ジルオキシ−Ｌ−ロイシル−グリシル−Ｌ−アルギニル
）アミノ−４−メチルクマリン塩酸塩１５０ｍｇを得た
。

このものは、融点１５０℃（除々に分解）、旋光度〔α
〕２１−３５．１°（ｃ＝１．２１，８０％ジメチルホ
ルムアミド中）をもち、その元素分析値は次のとおりで
ある。

元素分析値Ｃ３２Ｈ４２Ｎ７０７Ｃ１・ＣＨ３ＣＯ０Ｈ
・ＨＯとして 計算値（イ）Ｃ５４，，４３、Ｈ６，４５、Ｎ １３．
０７実測値（イ）Ｃ５４，３５、Ｈ５，９５、Ｎ １２
．８３次に、本発明のペプチド誘導体が酵素のけい光性
基質となることを示す実験を行った。

前記実施例１〜４．７〜１６で製造したペプチド誘導体
０．１〜０．２ミリモルをジメチルスルホキシド５ｒｎ
ｌと水５ｍｌの混合物に溶解し、緩衝液（０，０５Ｍト
リス−塩酸（ＰＨ８１０）（０，１ＭＮａＣ１と１０ｍ
Ｍｃａｃ１２を含む））で全量を５００７ＩＬｌに希釈
し、基質溶液を調製した。

各基質溶液２ｍｌを試験管に採り、３７℃に５分間静置
後、各酵素溶液２０μｍを加えた。

３７℃で２０分間ふりまぜたのち、１００％酢酸ｏ、５
ｍｌを加え反応を停止せしめた。

このようにして得た各試料について、けい光スペクトル
のＥｘ３８０ｎｍ、Ｅｍ４６０ｎｍの波長を用いてけい
光の増大を測定し、加水分解の程度を求め、その結果を
次表に示した。

各値はけい光強度比であり、７−アミノ−４−メチルク
マリンの４０μＭ（４０μｍｏ１ｅ／ｌ）溶液のけい光
度を１００として示した。

なお、＊印の値については７−アミノ−４−メチルクマ
リンの２００μＭ（２００μｍｏｌｅ／ｚ）溶液のけい
光度を１００として示した。

この実験において各酵素は上記緩衝液に適当に溶解して
使用した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式 （式中のＲは水素原子又はアシル基、カルボベンジルオ
   キシ基、第三アルキルオキシカルボニル基及びアリール
   スルホニル基の中から選ばれた保護基であるか、あるい
   はその中のアミノ基若しくはイミノ基が前記保護基で、
   また水酸基又はカルボキシル基がアルキル基又はアラル
   キル基でそれぞれ保護されていてもよいプロリル基、グ
   ルタミル基、セリル基、ロイシル基、イソロイシルグル
   タミル基、バリルセリル基又はバリルロイシル基であり
   、Ｒ′は水素原子、ニトロ基、カルボベンジルオキシ基
   又はアリールスルホニル基である）で示される新規ポリ
   ペプチド及びその酸付加臨