JPS58111753A - β−トロンボグロブリンの高感度測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は検体中のβ−トロンボグロブリンの高感度測定
法に関する０β−トロンボグロブリン（以下［β−Ｔ　
Ｇ　ｊという。）は、血小板第四因子、血小板由来成長
因子などとともに、ａ顆粒中にある高分子の血小板特異
蛋白であるｏｔ９７５年、ムー（２） ル（Ｍｏｏｒｅ）らによって、その精製法が発表され、
同年ルドハム（Ｌｕｄｈａｍ　）らにより、β−ＴＧの
ラジオイムノアッセイ（以下ｒＲＩＡＩという。）が報
告されて以来、血漿中濃度の測定が可能とな、　リ、血
小板のｉｒＮ／ｉＶＯにおける凝集および放出反応を反
映する指標として、広く利用されるに至った。

しかし、β−ＴＧをＲＩＡにより測定することは使用す
るアイソトープ（Ｉ）の半減期が短いために安定した測
定系が維持できないこと及びアイソトープ使用のため取
り扱いが難しいことなどの問題がある。

そこで本発明者らはβ−ＴＧの微量測定における上記の
如き問題点を克服するために鋭意検討を試みたものであ
る。

近年ＲＩＡと同じ微量測定法としてラジオアイソトープ
の代わりに酵素を標識として使う酵素免疫測定法が開発
されてきた。

本発明者らはβ−ＴＧの微量測定に酵素免疫測定法を応
用したところ、意外にも検体中の１０ｐｆの微量のβ−
ＴＧが測定でき、従来報告されてい（３） るＲＩＡのｉ’ｌｌ！ｉ定感度としてｏ、７ｎｇが限度
であるのに比して７０倍の高感度でしかも安定したｎ（
す定が可能であることが判明した。

高感度測定のために血漿中のβ−ＴＧのみならず尿中の
β−ＴＧをも６（ＩＪ定できることを知り、本発明を完
成したものである。

即ち、本発明は抗β−ＴＧ抗体結合固相に検体中のβ−
ＴＧを反応せしめて得られる反応物に酵素標識抗β−Ｔ
Ｇ抗体を作用せしめるか又は検体中のβ−ＴＧと酵素標
識抗β−ＴＧ抗体を反応せしめて得られる反応物を抗β
−ＴＧ抗体結合固相に作用せしめることによって抗β−
ＴＧ抗体を介してβ−ＴＧ及び酵素標識抗β−ＴＧ抗体
を固相に固定化せしめた後、同相に結合した該標識酵素
活性を測定することにより検体中のβ−ＴＧ量を求める
ことを特徴とするβ−ＴＧの高感度測定法である。

本発明に使用される標識酵素としてはβ−Ｄ−ガラクト
シダーゼ、アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ
、グルコースオキシターゼ、リン（４） ゴ酸脱水素酵素等通常用いられる酵素であればいずれで
もよいが、特にβ−Ｄ−ガラクトシダーゼが測定感度が
高いので高感度測定のためには好ましい。

酵素標識抗β−ＴＧ抗体の調製に際して用いられる酵素
と抗β−ＴＧ抗体との結合法は、酵素、抗β−ＴＧ抗体
の各々の活性（触媒活性、抗体結合能）が失なわれない
ような方法であればどのような方法でもよい。

具体的にはグルタルアルデヒド、カルボジイミド、Ｎ、
Ｎ−０−フェニレンジマレイミド、ｍ−マレイミドベン
ゾイル−Ｎ−ハイドロキシサクシニミドエステル（ｍ−
Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌ　−Ｎ　−Ｈｙｄｒ
ｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｏ　Ｅｓｔｅｒ）等の既知
の二官能性試薬が使用できる。

同相（不溶性担体）としてはアガロース、デキストラン
、セルロースなどの多糖類、ポリスチレン等の合成樹脂
、あるいは、ガラス、ポリアクリルアミド等が用いられ
、形態としてはビーズ状、繊維状であることが好ましい
。

抗β−ＴＧ抗体と同相との結合は物理的吸着を利用して
もよいが、通常蛋白質あるいは酵素等を不溶化するのに
用いられる方法を利用してもよい。

例えば不溶性多糖を用いる場合があれば不溶性多糖ヲ臭
化シアン、過沃素酸ナトリウム、エピクロルヒドリン、
■、１′−カルボニルジイミダゾール、Ｐ−トルエンス
ルフォニルクロリド等で活性化シて結合反応を行なわせ
る。

また、固相に適当なスペーサーを導入した後、スペーサ
ーを介して抗β−ＴＧ抗体を結合させてもよい。

更に抗β−ＴＧ抗体と固相の結合を可逆的な結合、例え
ばＳ、−Ｓ結合にした場合には、測定径固相に結合した
免疫反応物を同相より切断、除去しく例えばＳ−Ｓ結合
の場合還元剤により切断される。）、固相をくり返し使
用することもできる。

カラムを用いる場合には、同相に不溶化する抗体の量は
不ｍ性担体１ｍｅ当り０．５〜２．０　ｍ９が適当であ
るが、可能ならば更に多量の抗β−ＴＧ抗体を不溶化す
ることによって測定感度、測定精度を向−］〕させるこ
とが可能である。

ここで使用される抗β−ＴＧ抗体はそのままでもよいが
、測定感度の上昇及び生体体液成分による１ｉｊｌｌ定
系の干渉作用を軽減する目的で抗原結合部位のみを分離
したものでもよい。例えば、パパイン、ペプシンなどの
プロテアーゼで処理して得られるＦａｂ’部分、Ｆ（ａ
ｂ’）２部分などを使用することもできる。Ｆａｂ’部
分の調製法については、Ｅ、Ｉ−ｌ−５ｈｉｋａらの報
告がある〔スカンジナビアン、ジャーナル、オブ、ザ、
イムノロジー（Ｓｃ、ａｎｄ、　Ｊ　。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、）　８巻、４３頁、（１９７８）〕。

生体体液成分による干渉作用を抑制あるいは除去するた
めに用いる疎水性蛋白質としてはゼラチンなど、塩類と
しては、食塩などが用いられる。

本発明によれば、このように測定しようとするβ−ＴＧ
を生体体液成分による影響も受けず、高感度で精度の高
い測定が可能となり、更に自動測定系への応用も容易と
なるｔ吏Ｃと又、本発明において尿中β−ＴＧをも測定
できることは、血漿β−ＴＧの７１１１定が、時として
採血時の不注意により（７） 血小板がこわれたりして異常に高い値いとなるが、尿β
−ＴＧの測定においては、そのようなことはないので翁
゛用である。

以下実施例について述べる。

実施例１ （１）血小板からβ−ＴＧの精製法 ムール（Ｍｏｏｒｅ）の方法に沿って全血より血小板を
分離し、０．３５％（Ｗ／／Ｖ）のウシ血清アルブミン
と、４１１月ｖｍｌのアビラーゼ（シグマ社製）を含む
水溶液で血小板を２回洗滌した。最終的に、血小板を４
　Ｘ　１０９／ｍｇとなるように調整して、２里位厘の
ウシトロンビン（パークデービス社製）を加え、３７°
Ｃで１５分間インキュベートして、血小板を凝集させた
。凝集させた血小板を遠心分離によって沈澱後、その」
二清を５６°Ｃで３０分加熱して、フィブリノーゲンを
除いた。得られた血小板放出物質を限外ろ過にて濃縮後
、セファローズ４Ｂカラム＜　１．９　Ｘ　４ｏｃｍ）
にかけて、低分子物質と高分子物質は、再び限外ろ過に
より濃縮後、０．１５ＭＮａ　Ｃ６を含む０．１Ｍリン
酸緩衝Ｍ（ｐＥ−４７，５）で辺（８） 析シた。ヘパリン−セファロースカラム（ファルマシア
製）（０−９０−９Ｘ１０に低分子血小板放出物質（４
０ｍｌ、蛋白として４０〜５０ｍＮ？）をかけ、０−１
５　Ｍ　ＮａＣｌ、　０．１　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７
，５）でカラムを充分洗滌して、ヘパリンに吸着しない
物質を溶出させてから、０−１５〜１．０　Ｍ　ＮａＣ
ｌを含む０、１　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液でＮａ　Ｃｅの濃
度勾配を利用してβ−ＴＧを溶出した。

β−ＴＧは０，２Ｍ、０．２５ＭおよびＱ、　５　Ｍ　
ＮａＣｅで、それぞれ溶出された。４×１０　の血小板
から最終的に０．８〜１．０ｍｙのβ−ＴＧが得られた
。得られたβ−ＴＧは、５ＤＳ−ポリアクリルアミド電
気泳動にて、単一のバンドを形成した。

■抗β−ＴＧ血清の作成 抗β−ＴＧ血清をウサギにて作成するため、１００μｇ
のβ−Ｔ　Ｇと等量の完全フロインドアジュバントμ城
和して、ウサギの皮下に注射し、それを毎週７週間くり
返した。８週日にウサギから採血して血清を得た。精製
抗体を得るため、得られた抗血清１００ｍ１から硫安沈
澱法によってグロブリン（９）　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　リ＾ｒ分画を作成し、さらにβ−Ｔ
Ｇ績合セファローズ６Ｂのアフィニティークロマトグラ
フィーによって特異的抗β−ＴＧ抗体（蛋白として４０
〜９）を作成した。この抗体は精製β−ＴＧとまた血小
板放出物質と寒天ゲル内拡散法で単一の沈降線を形成し
た。

（３）不溶化抗体結合同相の調整 精製抗β−ＴＧ抗体（ＩｇＧ）をペプシンにて処理して
Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを得て、それをポリスチレ
ン球（直径３．２１１１ｍ）、（プレシソンプラスチッ
ク（Ｐｒｅｃｉｓｏｎ　Ｐｌａｓｔｉｃ）社製）に結合
させた。

（４）β−Ｄ−カラクトシダーゼ標識−抗体Ｆａｂ’フ
ラグメント 」二連した抗体Ｆ（ａｂ’）２フラグメントをＮ　、Ｎ
’−０−Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉｍａｌｅｉｍｉｄｅを
架橋剤として大腸菌白米のβ−Ｄ−ガラクトシターゼと
結合させた。

（５翔（り定方性 第−反応として、不溶化抗体Ｆ（ａｂ’）２を結合させ
たポリスチレン球を、最終容積０．５ｍｌのＧ液（１０
） （Ｑ、　Ｑ　Ｉ　ＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７−０）
、０．３ＭＮａ（Ｊ’、０．１％牛血清アルブミン、０
．５％ゼラチン、ｌ　ｒｒＮｉＭｇ　ＣＩ！　２．０．
１％ＮａＮ５）の中で、２．５　μｌの血漿又は尿のサ
ンプルもしくは種々の量の標準β−ＴＧと３０’Ｃでイ
ンキュベートした。２時間後、反応液を吸引によって除
去し、ポリスチレン球を１ｍｌのＧ液で２回試験管内で
洗滌した。

第二反応は」１記のポリスチレン球をβ−Ｄ−ガラクト
シダーゼ標識抗体Ｆａｂ’フラグメント（１ｍｕｎ　ｉ
　ｔｌｏ−１ｍｌｌ’）と４°Ｃで１６時間インキュベ
ートした。第二反応終了後、前回と同様にポリスチレン
球をＧ液で２回洗滌した。

第三反応はポリスチレン球に結合したβ−Ｄ−ガラクト
シダーゼの活性を測定するため、ポリスチレン球をＱ、
　ｌ　ｍＭ　４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙ
ｌ　−β−Ｄ　−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅを含む１５０
μｌのＡ１１ｌｌ（０，０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，
０）、Ｑ、　ｌ　ＭＮａＣＪ？　１１　ｒｒｌＡＭｌｌ
ｃＪ！２．０．１％ウシ血清アルブミン、０，１％Ｎａ
Ｎ５）の中で３０°Ｃ１０分間反応させた。

反応は、２．５ｍｌの０．１ＭグリシンＮａＯＨ緩衝液
（ＰＨ１０，３）を加えて停止した。生成された４−ｍ
ｅｌｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅを標ｑｑ　４
−ｍｅｌｔｈｙｌ　−ｕｍｂｅ　ｌ　ｌ　ｉ　ｆ　ｅ　
ｒｏｎｅを基準として蛍光光度計で測定したところ第１
図に示す検量曲線を得た。

実施ＰＡ２ 検体として以下のものを用いた。

■正常対象者 それぞれ１２例の正常男子と女子（年令２０〜５０才）
から採血した。

■ＤＩＣ患者 ＤＩＣの生じるような基礎疾患を有し、ＦＤＰ（フィブ
リノーゲン分解産物）、プロトロンビン時間、部分トロ
ンボプラスチン時間、及びフィブリノーゲン値からＤＩ
Ｃと考えられる患者６例から採血した。

■骨髄増殖性疾患患者 Ｃｈｒｏｎｉｃ　Ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ　Ｌｅｕｋｅ
ｍｉａ（慢性骨髄性白血病）５例、Ｐｏｌｙｃｙｔｈｅ
ｍｉａ　Ｖｅｒａ　（真性多血球血症）４例、Ｅｓ５ｅ
ｎｔｉａｌ　Ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｈｅｍｉａ（真性血
小板血病）１例の計１０例から採血した。

各々の検体について実施例１に準じて血漿中のβ−ＴＧ
濃度を測定したところ、正常人２４例（男子１２例、女
子１２例）の血漿のβ−ＴＧ濃度及びＤＩＣ患者と慢性
骨髄増殖性疾患患者の血漿β−ＴＧ濃度はそれぞれ表１
に示す結果であった。即ち、ＤＩＣでは血小板が著減し
ているにかかわらず、血管的破壊のため、β−ＴＧ濃度
は著しく増加している。慢性骨髄増殖疾患でも正常の３
〜８倍の範囲でβ−ＴＧ濃度は増加していることがわか
った。

表−１ 備考、表−１中のＣＭＬは慢性骨髄性白血病（Ｃｈｒｏ
ｎｉｃ　Ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　
）、ＥＴは、真性血小板血症（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｔ
ｈｒｏｍｂｏｃｙｊｈｅ　−ｍｉａ）、ＰＶは、真性多
血球面症（Ｐｏ　ｌ　ｙｃｙ　ｔｈｅ　−ｍｉａ　Ｖｅ
ｒａ　）の略である。

実施例３ 検体として以下のものを用いた。

■正常対象者 それぞれ１２例の正常男子と女子（年令２０〜５０才）
から採血及び採尿した。

■骨髄増殖性疾患々者 慢性骨髄性白面病（ＣＭＬ）７例、真性血小板血症（Ｅ
ｓ５ｅｎｔｉａｌ　Ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｈｅｍｉａ）
１例、真性多血球面症（ＰＶ）８例、骨髄線維症（Ｍｙ
ｅｌ−ｏｆｉｂｒｏｓｉｓ）　３例、の計１９例から採
血及び採尿した。

各々の検体について実施例１に準じて血漿中及び尿中の
β−ＴＧａ度を測定したところ、正常人２４例（男子１
２例、女子１２例）の血、、ＷＴＧ濃度及び慢性骨髄増
殖性疾患患者の血漿及び尿中β−ＴＧ濃度はそれぞれ表
２に示す結果であった。即ち、慢性骨髄増殖疾患におい
て血漿及び尿中のいずれにおいてもβ−ＴＧ濃度が著し
く増加していることがわかり、かつ又、血漿中のβ−Ｔ
Ｇ量と尿中のβ−ＴＧ量との間に比例関係がみられるこ
とがわかる。

表−２ 備考：表−２中のＣＭＬは慢性骨髄性白血病、ＥＴは真
性血小板血症（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｔｈｒｏ　−ｍｂ
ｏｃｙｔｈｅｍｉａ）、ｐｖは真性多血球面症、ＭＦは
骨髄線維症（Ｍｙｅｌｏｆ　１ｂｒｏｓｉｓ）の略であ
る。

実施例４ ２４例の正常男女と１２例のＤＩＣ患者【二ついて血漿
β−ＴＧ濃度を実施例１に準し測定し、かつＲＩＡにて
も測定し両者の相関を調べた。

ＲＩＡは、アマジャム（Ａｍｅ　ｒ　ｓ　ｈ　ａｍ２ジ
ャパン社製のキットを用いた。その結果は第２図に示さ
れるが、両者の相関係数０．９４　（ｎ　＝　３０、Ｙ
　＝　０．８３ｘ十１４．６　’）とよく一致した。図
中白丸は正常人の場合であり、黒丸はＤＩＣ患者の場合
を示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は血漿及び尿中β−ＴＧの標準曲線であり、第２
図は血漿β−ＴＧの酵素免疫測定法（ＥＩＡ）及びＲＩ
Ａとの相関を示す図である。 特許出願人　　天野製薬株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　抗β−トロンボグロブリン抗体結合同相に検体中の
   β−トロンボグロブリンを反応せしめて得られる反応物
   に酵素標識抗β−トロンボグロブリン抗体を作用せしめ
   るか又は検体中のβ−トロンボグロブリンと酵素標識抗
   β−トロンボグロブリン抗体を反応せしめて得られる反
   応物を抗β−トロンボグロブリン抗体結合同相に作用せ
   しめることによって抗β−トロンボグロブリン抗体を介
   してβ−トロンボグロブリン及び酵素標識抗β−トロン
   ボグロブリン抗体を固相に固定化せしめた後、同相に結
   合した該標識酵素活性を測定することにより検体中のβ
   −トロンボグロブリン量を求めることを特徴とするβ−
   トロンボグロブリンの高感度測定法。 ２　抗β−トロンボグロブリン抗体結合固相が微粒状ま
   たは繊維状であり、カラムに充填されて使用され、免疫
   反応終了後、カラム内をこて酵素活性を測定することを
   特徴とする特許請求の範囲第１項記載のβ−トロンボグ
   ロブリンの高感度測定法。 ３　抗β−トロンボグロブリン抗体をプロテアーゼ処理
   して得られるＦ　（ａｂ’）２フラグメントまたはＦａ
   ｂ’フラグメントを使用することを特徴とする特許請求
   の範囲第１項又は第２項記載のβ−トロンボグロブリン
   の高感度測定法。 ４　反応時に高濃度の塩類と疎水性蛋白質を添加するこ
   とにより検体中の干渉物質の影響を除去することを特徴
   とする特許請求の範囲第１項、第２項又は第３項記載の
   β−トロンボグロブリンの高感度測定法。