【発明の詳細な説明】
創傷治療の促進におけるヘモグロビンの治療的使用
発明の背景
多量の二次的血液流出を伴う創傷に関連する損傷は、適切な治療を促進するた
めの支持的介入および追跡処置を必要とする救急医療の一つのクラスを構成する
。代表的な救急介入には、血液または乳酸化リンゲル液のような血漿増量剤など
の輸血が含まれる。血液損失が多量の場合、循環虚脱および器官の損傷を防止す
るために血液容量を早急に回復させることは極めて重要である。
創傷の別の群は、手術的手順の間に故意に負わせられたものである。股関節部
置換、大動脈修復または臓器移植などのいくつかの手術は多量の血液損失を伴う
。他の液体の輸液に加えて、全血のいくつかの単位の輸血を必要とする液体置換
は一般的ではない。外科的切開の完治には数週間を要し得る。
創傷の治療または創傷の修復には細胞的、生化学的および生理学的事象の複雑
な系列が含まれる。多くの条件が修復プロセスを悪化させる。創傷そのものに頻
繁に関連する血液損失が重要な合併症であり、そして治療プロセスを延期するこ
とが注目されている。McGinn，Br．J．Surg.，63: 742（1976）は、臨床的ショ
ックを起こすには不十分な血液損失が、減損のある創傷治療を起こし得ることを
示した。その後、入念に制御されたラットの研究において、Taylorら、Br．J．S
urg.，74: 316（1987）は、腹壁手術の損傷の重大な減損が、循環血容積の約10
％の損欠後に起こることを示した。
従って、輸血によって完全に補償されない血液損失を生じる手術を受ける患者
、または損傷を負ったヒトが、創傷治療におけるいくつかの減損を経験すること
が予想される。実験モデルでは、修復された治療の完全性は創傷境界の裂傷に要
する物理的力量によって測定され得る。例として、Greenwaldら、Plast．and Re
const．Surg.，91: 1087(1993)を参照のこと。従って、血液損失から生じる創傷
治療の減損の程度を評価するための論文試験モデルおよび予想される減損の逆転
における置換液体の治療的価値が存在する。
創傷修復プロセスの理解には、Molecular and Cellular Biology of Wound Re pair
Clarkら編 Plenum Press: N．Y．(1987)および、臨床学的文脈ではZitelli
, J.，Adv．Dermatol.，2: 243(1987)に詳細に記載されている。このプロセスは
好中球の浸潤から始まり、そして一連の限定された、しかし重複している段階が
続く。細胞学的観点から、好中球は通常の治療に必要なマクロファージ、そして
最終的に線維芽細胞増殖(profileration)によって継続される。炎症、再上皮形
成、線維増殖（創傷収縮）、新血管新生、マトリックス形成および創傷の再モデ
ル化を含む修復の連続的段階の組織化は、分泌因子、血液および免疫成分、ホル
モン、ならびに構造的物質の複雑な配列によって介在される。
このプロセスの混乱した局面は、これら全ての段階が再現可能に観察される一
方で、それにもかかわらずいくつかの細胞成分もしくは可溶性の成分において遺
伝的に欠失した動物は正常な治療終点を示す。例えば、好中球減少動物は正常に
治療するが、多形核球を欠乏した動物は治療しない。フィブロネクチンのような
いくつかの物質は重要な細胞の漸増(recruitment)に必要とされるが、その他は
明確な役割を有さず、余分に放出され得る。
創傷の処置において、修復プロセスを促進もしくは増大させるために、いくつ
かの戦略が開発されてきた。これらの最古のものは、創面のデブリドマン、局所
消毒剤の使用、および創傷包帯である。より洗練された手段にはヒドロゲル包帯
、電気的刺激および超音波、ならびに高圧酸素の使用が含まれる。創傷処置の包
括的概説についてはKlothら、創傷医療：代替治療技術（Wound Healing: Altern
atives in Manegement），F.A．Davis: Philadelphia(1990)を参照のこと。
発明の要旨
創傷修復に対する血液損失の遅延効果を逆転させる医療的介入は、損傷または
手術からの回復時間を短縮し、そして合併症の数と重篤度を軽減する可能性を有
する。従って、本発明の目的は創傷治療の効率を回復させる、全身投与または静
脈投与された液体に基づく薬物を提供することである。この方法は、ストロマ非
含有、パイロジェン非含有のヘモグロビンを治療量で投与することが、顕著な血
液損失後の損傷修復を増大する観察に基づく。
創傷処置、創傷修復の促進、および創傷修復または治療を増大する方法は、薬
剤学的に適合性のヘモグロビン（ストロマおよびパイロジェン非含有）を、一定
量（約50〜2500mg／kg体重の範囲）投与する工程を包含する。この量は動脈血圧
を基底値の80％以内かそれ以上に向上させる、もしくは低血圧症が基底値の少な
くとも105％量で生じない範囲にするために必要である。このヘモグロビンはジ
アスピリンと架橋した、もしくは他の構造的また形態的安定性を提供する方法で
架橋されている。
この方法によるヘモグロビンの投与は、好ましくは、損傷周囲的に(peritrau
matically)もしくは手術周囲的に（perioperatively）、損傷後もしくは手術後2
4時間以内に単回量で与えられるか、あるいは、24時間にわたり多回細分容量（m
ultiple subdose）を静脈注入によって与えられる。
創傷修復を含むこの方法は、ヘモグロビン（好ましくはジアスピリン架橋ヘモ
グロビン）を、ヘモグロビン、または他のいかなる蘇生液を有さない（つまり、
準臨床的血液損失を有する）患者に、手術周囲的に、または損傷周囲的に投与す
る工程をさらに包含する。
好ましい実施態様の詳細な説明
本発明において、ヘモグロビンは手術手順中に手術周囲的に、もしくは重大な
または準臨床的な血液損失後に損傷周囲的に、創傷治療プロセスを増大または促
進するための治療的有効量で投与される。準臨床的な血液損失は、全血または分
画血、血漿増量剤、合成化合物、およびヘモグロビンの投与によるような医療的
介入を必要とするほど重大ではない血液の損失を意味する。その利益的結果は、
創傷治療の減損が、無酸素症または虚血にともない、重篤な血液損失に続いて起
こる酸素送達における重篤な減退に関連することを示唆した論文報告からは予期
されない。比較的少用量で投与されたヘモグロビンによる最初の24時間における
酸素送達の一時的軽減は、全血輸血によって回復される酸素運搬用量の全量を置
換し得ない。そのヘモグロビンは、約72時間で血流から効果的に除去される。
Pryzbelski（米国特許第5,334,706号）は、ヘモグロビンの投与がそのヘモグ
ロビンによって付与される付加的な酸素運搬用量のレベルから予測される値より
高い範囲で、組織灌流を増加させることを開示する。Pryzbelskiによると、その
薬理学的効果は、軽減のためにヘモグロビンが投与される虚血事象に合わせて非
常に密接に発揮され、そして結果として組織損傷が回避される。しかし、本発明
において、創傷修復に対する利益的効果は、投与後１週間以降にのみ観察される
。細胞また生化学的事象は創傷治療の重複の種々の段階を含むため、この処置に
よって影響されるプロセスにおける段階を指摘することは出願人には不可能であ
る。
ヘモグロビンは、手術周囲的にまたは損傷周囲的に投与される。これは、全用
量が創傷が起きてから最初の24時間以内に与えられるべきであることを意味する
。ヘモグロビンの１回の用量において50〜2500mg／kg体重の範囲の量が与えられ
得る。あるいは、この用量は、その時間内にゆっくりと継続した注入、または一
連の小細分用量の連続によって投与され得る。投与の好ましい経路は静脈注入で
あるが、適切な医療的環境において動脈挿管が行われ得る。
組織損傷の情況において血液損失が起きたとき、本方法はいかなる環境でも利
用され得る。これは一次的血液損失の位置が処置されるべき外傷ではない事例を
含む。例えば、本方法は内傷由来の血液損失があり、しかし主な外傷が火傷であ
る場合に必要である。従って、本方法は実質的で同時に重大な、または準臨床的
な血液損失によって付随される外傷の処置において、50〜2500mg／kg体重の範囲
で哺乳動物へのヘモグロビンの投与を包含する。臨床的に有意な血液損失量は全
推定血容量の最低２〜３％ほどであり得、患者の全体的な医学的状態に依存する
。これ以下の量の血液損失は準臨床的と見なされる。
実際に与えられる用量は、特定の患者の包括的臨床様呈によって指示される。
血液損失に対する直接的な置換治療として、治療分野の当業者において公知の医
学的状況（急性血液損失の環境がヘモグロビンの置換的な大容量投与を示す）が
存在する。この場合、生命を脅かす状況を除去し患者が生存することが、増大し
た創傷修復の二次的利益よりも重要である。本方法の最も好ましい実施態様にお
いて、治療学的に安全な用量の範囲（50〜2500mg／kg体重）のヘモグロビンの注
入が手術手順に耐性えるか、または、血液の輸血または他の蘇生液の注入を必要
としない損傷を受けた患者に与えられ得る。
本発明において利用されるヘモグロビンは、ストロマ非含有で、そしてサブユ
ニットの解離を防ぎ、また酸素結合親和性に対するＰ50の範囲で、約20と45mm H
gとの間の値へ増加させるために化学的に修飾された任意の型であり得る。修飾
されたヘモグロビンは接合ヘモグロビン、架橋ヘモグロビン、または重合ヘモグ
ロビンであり得る。
ヘモグロビン修飾技術のいくつかの例は科学的論文に説明されており、本発明
の実施において利点を与えるために使用され得る。例えば、Winslow，R.M.，Hem oglobin-based Red Cell Substitutes
，The John Hopkins U．Press(1992)に含
まれる概説を参照のこと。より詳細には、化学修飾されたヘモグロビンの作製方
法は本明細書中で以下に示す。
接合ヘモグロビンは、非タンパク質の巨大分子がヘモグロビンと共有結合した
ものである。一つの例は、ポリアルキレングリコールによって化学的に修飾され
たヘモグロビンであり、それはその調製プロセスと共にWO 9107190（Enzon）に
説明されている。ポリ（アルキレンオキシド）に接合したヘモグロビンの実施例
およびその調製プロセスは米国特許第4,301,144号、同第4,412,989号、および同
第4,670,417号、ならびに日本国特許第J59,104,323号、および同第J61,053,223
号（Ajinomoto）において提供される。ヘモグロビンは、米国特許第4,377,512号
（Ajinomoto）に開示されたプロセスにおいてイヌリンと接合され得る。特許WO9
107190、米国特許第4,301,144号、同第4,670,412号、同第4,377,512号、ならび
に日本国特許第J59,104,323号および同第J61,053,223号は本明細書中で参考とし
て援用される。
架橋ヘモグロビンは、分子内化学結合を含む。架橋ヘモグロビンの実施例およ
びその調製方法は、米国特許第4,001,401号および同第4,053,590号に述べられて
いる。これらはハロゲン化シクロアルカン、ジエポキシド、ジアゾベンジジンの
ような化合物を利用するヘモグロビン４量体のαとβサブユニットの間の分子内
架橋を開示している。本方法では、好ましい修飾ヘモグロビンは２つのαサブユ
ニットの間でフマル酸塩架橋を作製するために、ビス（3,5-ジブロモサリチル）
フマル酸塩と架橋している。この架橋ヘモグロビンは、米国特許第4,598,064号
、同第4,600,531号、再発行第34,271号により完全にその調製方法（クロマトグ
ラフィー工程を省略している）とともに記載されている。これはβと鎖との間の
架橋を防ぐため、米国特許第5,128,452号(Hai)に開示された条件下で製造される
ことが好ましい。米国特許第4,598,064号、同第4,600,531号、再発行第34,271号
、
同第5,128,452号は本明細書中で参考として援用される。WO 9013309(Staat Der
Nederlanden De Minister Van Defeuric)は、β−β架橋を介してヘモグロビン
を架橋するための方法を開示している。この好ましいジアスピリン架橋のヘモグ
ロビンを以下「DCLHb」という。
重合したヘモグロビンは、ヘモグロビン４量体の分子内架橋が、修飾ヘモグロ
ビンの分子量を増加させるために用いられたヘモグロビンである。重合ヘモグロ
ビンの実施例およびその調製方法は継続中の米国出願番号第8/149,679号、同第8
/173,882号、同第8/480,593号、および同第8/473,459号に記載されている。米国
特許第4,777,244号は脂肪族ジアルデヒドとの架橋および重合させる方法を開示
している。前述の特許は本明細書中で参考として援用される。
本方法の組合せによって修飾されるヘモグロビンは、以下に例示される。酸素
親和性を調節するためにピリドキサル-5'-リン酸塩により、およびポリエチレン
グリコール接合により修飾されたヘモグロビンならびにその調製方法は日本国特
許第J59,089,629号、同第J59,103,322号、および同第J59,104,323号(Ajinomoto)
に開示されている。米国特許第5,248,766号は架橋重合戦略およびオキシランと
４量体単位を共有的相互連結し、120,000ダルトンを超える分子量を有するポリ
ヘモグロビンを形成するプロセスを開示する。重合ヘモグロビンを開示する前記
の特許である米国特許第5,194,590号、同第5,248,766号、日本国特許J59,089,62
9号、同第J59,103,322号、および同第J59,104,323号を本明細書中で参考として
援用する。
ヘモグロビンは位置特異的変異として修飾され、微生物またはトランスジェニ
ック動物中で発現し得る。組換え変異体および人工ヘモグロビン、ならびにその
細胞培養または液中での産生は、米国特許第5,028,588号(Somatogen)に記載され
ている。細菌および酵母中でのヘモグロビンの産生に用いられる２αまたは２β
グロビン様のポリペプチドは、WO 9013645号(Somatogen)に記載されている。非
天然の多量体ヘモグロビン様タンパク質は、WO 9309143号(Somatogen)に記載さ
れている。一般に、20〜45 mmHgの操作におけるＰ50を有する４量体塩基を生じ
る架橋、重合、もしくは遺伝的改変、またはそれらの組合せのいかなる方法によ
っても、本方法において効力がある。条件は、不適当な実験を用いない架橋４量
体
またはそれらに由来するポリマーについて、それぞれ調整され得る。本発明のさ
らなる利点は以下の実施例から明らかである。
実施例
雄性Sprague-Dawlyラットを、腹膜内でペントバルビタール(35〜45 mg/1kg)を
用いて、そして筋肉内でケタミン(60〜90％ mg/kg)を用いて麻酔した。各々の動
物の首および背中を剃り、そしてクロルヘキシデンス溶液を用いて準備(prep)し
た。横方向の切開を首に施し、そして内頸静脈および頸動脈に、ポリエチレンカ
テーテルを用いて挿管した。次いで、完全厚皮膚創傷（肉様層(panniculus carn
usus)を含む）を、外科用メスを用いて、背面（背中）正中線において肩甲骨間
領域から骨盤中央レベルまで作製した。創傷を濡れたガーゼで覆い、次いで動物
を、平均動脈圧、心拍数、脈圧をモニターするためにBuxco physiographに接続
した。動物を１ml/分の速度で、15 ml/kg出血させた。45分後に、動物を、15 ml
/kgの10 g％ DCLHbもしくは流出した血液のいずれかを用いて蘇生させるか、ま
たは蘇生させなかった。第４の群の動物(シャム（SHAM）)は創傷したが、出血さ
せず、そしてコントロールとした。１：１の流出血液(15 ml/kg)、蘇生させず(N
R)、またはシャム処置（創傷したが出血させず）。次いで、カテーテルを除去し
、そしていかなるさらなる出血をも防止するために、頸動脈および頸静脈の両方
を結縛した。首の切開を、創傷60分後に3.0ナイロンランニングステッチで閉じ
た。次いで、ラットの背面における６cmの切開を、0.5の間隔での6.0ナイロンの
断続単純縫合(interrupted simple suture)で閉じた。動物を麻酔および手術か
ら回復させ、そして観察のためにそのケージに戻した。
表1Aおよび1Bは、それぞれ１週間目および３週間目に屠殺した動物についての
、DCLHb、シャム、および血液回復群の各々についての血圧データを与える。以
前の研究において示されるように、DCLHb処置群は、一様に上昇した平均動脈血
圧を示した。
各々の群からの動物の半数を１週間後に屠殺し、残りを３週間後に屠殺した。
屠殺直後に、背面皮膚（完全厚、肉様層を含む）を創傷全体を含むように取り出
した。皮膚を成形し、そして創傷の長軸に対して垂直方向のストリップ(0.5×2.
0 cm)に切断した。試験前に、縫合糸を各ストリップから除去した。標本をTensi
ometer(John Chatillon and Sons，New York，N.Y.)中に置き、ノンスリップジ
ョー(nonslip jaws)に取り付け、そして破裂するまで一定の速度(50 mm/分)で引
き延ばした。破裂力または創傷破壊力(WBS)を記録し、そして創傷治療の率を決
定するために群間で比較した。
マン-ホィットニー階級和検定(Mann-Whitney Rank Sum Test)またはｔ検定を
、
ｐ＜0.05レベルの有意性での統計解析のために用いた。データを平均±SEMで示
す。シャムは創傷したが出血していないことを意味する。結果を表２に示す。
P<0.05 ＊他の全てと、$血液と、および#NR（蘇生させず）と比較して。
WBSは、１週間目では群間で有意には差がなかった。結論として、このラット
モデルにおいては、中程度の血液損失が創傷治癒を減損した。創傷破壊力は、血
液処置ラットにおいてよりDCLHb処置ラットにおいて大きかった。このことは、D
CLHbが、手術中出血後の輸血を必要とする患者における創傷治癒の改善において
、血液よりも優れ得ることを示唆する。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 マルコム，ダイアナ エス.
アメリカ合衆国 ジョージア 30907，マ
ーティネズ，インバーネス ウェイ 3694
(72)発明者 ソルテロ，ラルアン
アメリカ合衆国 カリフォルニア 92037,
ラ ホヤ，パール ストリート 410