JPH11511034A - 人工的エピトープで標識されたタンパク質を発現するトランスジェニック動物 - Google Patents
人工的エピトープで標識されたタンパク質を発現するトランスジェニック動物Info
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Abstract
(57)【要約】
エピトープ標識されたプリオンタンパク質(PrP)など、免疫親和性クロマトグラフィで簡便に精製できる、エピトープ標識されたタンパク質またはタンパク質断片のDNA構築物を提供する。エピトープ標識されたPrPを発現するトランスジェニック動物を含む、エピトープ標識タンパク質を発現するトランスジェニック動物を提供する。タンパク質の立体構造を判別する方法、および免疫親和性クロマトグラフィ方法によって標識タンパク質を単離するための簡便な方法を提供する。
Description
【発明の詳細な説明】
人工的エピトープで標識されたタンパク質を発現するトランスジェニック動物
発明の分野
本発明は、一般に、エピトープ標識されたタンパク質および該タンパク質を発
現するトランスジェニック動物に関する。より具体的には、本発明は、エピトー
プ標識プリオンタンパク質(PrP)遺伝子、エピトープ標識PrP遺伝子を発現する
トランスジェニック動物、ならびに感染性および非感染性のプリオンタンパク質
を判別し単離するためのアッセイ法に関する。
発明の背景
プリオンは、ヒトおよび動物の中枢神経系に海綿状脳症を引き起こす、感染性
病原体である。プリオンは、細菌、ウイルスおよびウイロイドのいずれとも異な
る。現時点における支持的な仮説では、プリオンタンパク質が感染するには核酸
成分は不要とされている。さらに、一種の動物(例えばヒト)に感染するプリオ
ンは、その他の動物(例えばマウス)には感染しない。
プリオンおよびそれらが引き起こす疾患に関する研究は、プリオンタンパク質
(「PrP」)と命名されたタンパク質の発見および精製により、大きく進歩した
(Boltonら、(1982)Science 218:1309〜11;Prusinerら、(1982)Biochemistry 2
1:6942〜50;McKinleyら、(1983)Cell 35:57〜62)。その後プリオンタンパク質
をコードする完全長の遺伝子がクローニングされ、塩基配列が決定されて、トラ
ンスジェニック動物で発現された。PrPCは宿主の単一コピーの遺伝子によりコー
ドされ(Baslerら、(1986)Cell 46:417〜28)、正常な状態では神経繊維外表面
に認められる。PrPCが、翻訳後の過程でPrPScと呼ばれる修飾型のスクレイピー
異性体に変換されることによってプリオン病が起こるというのが、支持的な仮説
である(Borcheltら、(1990)J.Cell Biol.110:743〜752)。PrPCのαヘリック
ス構造が構造変移を起こしてPrPScに見られるβシート構造となることが、プリ
オンが増殖するということの基本現象である可能性がある(Panら、(1993)Proc
.Natl.Acad.Sci.90:10962〜10966)。トランスジェニックマウスを用いた研
究により、この構造変移にはXタンパク質と呼ばれるもう一つの成分が必要であ
ることが、遺伝学的に証明されている(Tellingら、(1995)Cell 83:79〜90)。
PrPScは、動物およびヒトの伝染性の神経変性疾患の、伝播および病原性の両
方に必要であるらしい(Prusiner(1991)Science 252:1515〜1522参照)。動物
のプリオン病として最も一般的なのは、ヒツジおよびヤギのスクレイピーならび
にウシの海綿状脳症(BSE)である(Wilesmith および Wells、(1991)Microbiol
.Immunol.172:21〜38)。ヒトのプリオン病としては、これまでに4種類同定
されている:それらは、(1)クルー病、(2)クロイツフェルト−ヤコブ病(
CJD)、(3)ゲルストマン−シュトラスラー−シャインカー病(GSS)、および
(4)家族性致死性不眠症(FFI)である(Gajdusek(1977)Science 197:943〜
960;Medoriら、(1992)N.Engl.J.Med.326:444〜449)。ヒトのプリオン病は
、単発的、遺伝的および伝染性の疾患として記載されたため、最初は難問とされ
ていたが、その後、PrPは細胞遺伝子由来のものであると報告された。
CJDの症例はほとんどが単発性であるが、約10〜15%は、ヒトPrP遺伝子内の突
然変異により引き起こされる、常染色体性優性疾患として遺伝する(Hsiaoら、(
1990)Neurology 40:1820〜1827;Goldfarbら、(1992)Science 258:806〜808;Ki
tamotoら、(1994)Proc .R.Soc.Lond. 343:391〜398)。硬膜移植や死体の下垂
体由来のヒト成長ホルモンにより、医原性のCJDが引き起こされてきた(Brown
ら、(1992)Lancet 340:24〜27)。スクレイピーに感染したヒツジの肉を摂取す
るというような感染源とCJDとを結びつけようという試みは、医原的に疾患が誘
発された症例以外には、これまで成功していない(Harries-Jonesら、(1988)J.N
eurol.Neurosurg.Psychiatry 51:1113〜1119)。一方、何十年もの間、ニュー
ギニア高地のフォア族および近隣種族を荒廃させてきたクルー病は、儀式として
の食人による感染で伝播してきたと信じられている(Alpers(1979)「神経系の
遅延性伝染病」(Slow Transmissible Diseases of the Nervous System)、第1
巻、S.B.PrusinerおよびW.J.Hadlow編(New York: Academic Press)、pp.66〜
90)。
CJDを実験的に霊長類に伝播させることに初めて成功するまでには、William H
adlowがクルー病とスクレイピーとの類似性に気づくことに始まる、長い歴史が
ある。1959年、Harlowは、クルー病で死亡した患者からの抽出物を、ヒト以
外の霊長類に接種すること、および、該動物が、長い潜伏期の後に、予想通りの
疾
患を発症することを示唆した(Hadlow(1959)Lancet 2:289〜290)。7年後、G
ajdusek、GibbsおよびAlpersにより、クルー病が、18〜21ヶ月にわたる潜伏
期の後に、チンパンジーに伝播されることが示された(Gajdsekら、(1966)Natur
e 209:794〜796)。クルー病の神経病理がCJDのものと類似していたため(Klatz
oら、(1959)Lab Invest.8:799〜847)、チンパンジーを使った類似の実験が行
われ、1968年には、疾患の伝播が報告された(Gibbs,Jr.ら、(1968)Scienc
e 161:388〜389)。その後の25年間に、約300例のCJD、クルー病およびGSS
が、様々な類人猿および猿に伝播された。
このような実験は、経費がかかり、まれにしかできず、また非人道的なものと
認識される場合が多かったため、なかなか行われず、蓄積される知識量は限られ
ていた。最も信頼できる伝播データはヒト以外の霊長類を使った研究から得られ
ると考えられてはいたが、なかには、ヒトのプリオン病を齧歯類に伝播させた例
もあった。とはいえ、これがあまり行われなかったことは、明らかである(Gibb
s,Jr.ら、(1979)「神経系の遅延性伝染病」(Slow Transmissible Diseases of
the Nervous System)、第2巻、S.B.PrusinerおよびW.J.Hadlow編(New York:
Academic Press)、pp.87〜110;Tateishiら、(1992)「ヒトおよび動物のプリオ
ン病」(Prion Diseases of Humans and Animals)、Prusinerら編(London: Ellis
Horwood)、pp.129〜134)。
ヒトのプリオン病が齧歯類に伝播しにくいという現象は、Pattisonにより、ヒ
ツジと齧歯類との間でスクレイピーの病原体を伝達する彼の研究の中で、「種間
障壁」の例として引用されている(Pattison(1965)NINDB Monograph 2、D.C.G
ajdusek、C.J.Gibbs Jr.およびM.P.Alpers編(Washington,D.C.: U.S.Governme
nt Printing)、pp.249〜257)。それらの研究では、プリオンをある種からその
他の種に継代すると、最初は潜伏期間が延長し、疾患を発症する動物はほんのわ
ずかに過ぎなかった。その後、同種内で継代を行うと、潜伏期が大幅に短縮され
、全ての動物が疾患を発症するようになった。
シリアンハムスター(SHa)とマウス(Mo)との間にある種間障壁は、分子的
基盤として、PrPの配列が種特異的に異なっているためであることが示された(S
cottら、(1989)Cell 59:847〜857)。マウスPrP(MoPrP)は、254個のアミノ
酸
残基のうち16カ所がシリアンハムスターPrP(SHaPrP)と異なっている(Basle
rら、(1986)Cell 前記 ;Lochtら、(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:6372
〜6376)。SHaPrPを発現するトランスジェニックマウス[Tg(SHaPrP)]にSHaのプ
リオンを接種すると、潜伏期間が短縮された。ヒトまたはヒツジのPrP導入遺伝
子を発現するマウスで同様の研究を行ったところ、種間障壁はなくならなかった
、すなわち、感染した動物の割合は、許容範囲より低く、潜伏期間は許容範囲よ
り長かった(Tellingら、(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91:9936〜9940;Telli
ngら、(1995)Cell 83:79〜90)。このため、マウスのようなヒト以外の動物にヒ
トのプリオンを感染させることは不可能と考えられた。
PrPScは、相対的にタンパク質分解に抵抗性および非変性性界面活性剤に不溶
性であることを利用して、精製された(Boltonら、(1982)前記;Prusinerら、(1
982)前記)。PrPCの精製は、より困難だった。免疫親和性クロマトグラフィーで
PrPCを精製しても、ごく少量のタンパク質しか回収できなかった。界面活性剤に
よる抽出および固定化Cu2+イオンによる親和性クロマトグラフィーを行った後に
陽イオン交換クロマトグラフィーおよびSDSゲル電気泳動(SDS-PAGE)を行うと
いうマルチ段階の精製過程を経ることにより、PrPCの精製は改善された(Panら
、(1992)Protein Sci.1:136〜144)。
PrPCおよびPrPScに対するモノクローナル抗体の作成は、ことのほか困難だっ
た。マウスPrPの場合、MoPrPは自己と認識されるため、MoPrPで免疫した動物は
、抗MoPrP抗体の産生過程を排除してしまうのである。
CJDのような、PrPScが仲介する疾患の診断法および治療法を開発することが、
急務である。PrPCが感染性のPrPSc異性体に変換されるという考え方を支持する
証拠は数多いが、PrPScの生成を阻害することのできる化合物を開発するために
は、デノボでスクレイピーの感染性が生じる条件をよりよく理解することが必要
である。インビトロでPrPCからPrPScへの変換を阻害できる化合物は、ハイリス
クの動物およびヒト個体でプリオンが仲介する疾患を治療し、発症を予防するた
めに有用である可能性がある。PrPCのαヘリックス構造から感染性のPrPSc異性
体のβシート構造へと、PrPが変換されるのを検出する方法が改善されれば、そ
のような化合物のアッセイ法を開発するのに有用と考えられる。
発明の概要
強力なエピトープ標識をコードする核酸を、通常は2つまたはそれ以上の立体
構造を有するタンパク質をコードする塩基配列に、人工的に組み入れる。発現さ
れたタンパク質がとる立体構造によって、標識が暴露されるか否かが異なり、こ
れに従って、エピトープに結合する抗体を介して、立体構造を判別することが可
能である。本発明の一つの局面は、異種性のエピトープ領域と、好ましくは直接
的に結合された、生物学的活性を持つタンパク質またはタンパク質断片を含む、
アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する組換え核酸構築物を示す。発現され
るアミノ酸配列(すなわちエピトープで標識されたタンパク質)は、好ましくは
、対応する天然の(すなわち標識していない)タンパク質またはタンパク質断片
の有する生物学的活性を保持している。標識を、2つまたはそれ以上の異なる立
体構造を有するタンパク質と結合させて、ある立体構造ではもう一つの立体構造
よりも、エピトープ標識が相対的により多く暴露されるように用いることが可能
である。
本発明の一つの局面は、発現すると2つまたはそれ以上の異なる立体構造をと
るタンパク質をコードする第1のDNA配列がゲノムに組み入れられたマウスのよ
うな、トランスジェニック動物である。第1のDNA配列は、エピトープ標識をコ
ードする第2のDNA配列と結合している。第2の配列は、第1の配列により発現
するタンパク質がとる立体構造が異なれば、発現した標識が暴露される程度が変
わるように、第1の配列に対して好ましい位置に配置される。第1のDNA配列は
、好ましくは、ある立体構造では疾患を引き起こすが別の構造では引き起こさな
い、PrPのようなタンパク質をコードする、外因性の配列である。このため、標
識をコードする第2の配列を、第1の配列に対して適切に配置することにより、
迅速かつ容易に、動物由来の検体を解析し、タンパク質がどの立体構造をとって
いるかを検出することが可能である。
標識された導入遺伝子を有するトランスジェニック哺乳動物は、好ましくは、
マウス、ラット、ウサギおよびハムスターから成る群より選択される。標識され
た導入遺伝子を高レベルで発現するトランスジェニック動物は、例えば、増強さ
れたプロモーターおよび/またはコピー数を増やした導入遺伝子を用いて導入遺
伝子を過剰発現させることにより製造できる。
特定の態様において、本発明は、エピトープ標識されたPrP遺伝子を有するト
ランスジェニック哺乳動物を特徴とする。PrP遺伝子は、天然、合成、またはキ
メラのPrP遺伝子でありうる。特定の態様において、トランスジェニック動物は
、該動物に、遺伝的に異なるかまたは特定の動物にしか通常は感染しないプリオ
ンに対する感染性を付与する、エピトープ標識されたキメラPrP遺伝子を有する
。キメラのPrP遺伝子は、遺伝的に異なる動物の遺伝子の一部を含む遺伝子であ
る。トランスジェニック動物がマウス、ラット、ウサギまたはハムスターのいず
れかである場合、遺伝的に異なるあるいは特定の動物は、ウシ、ヒツジ、ブタお
よびヒトからなる群より選択される。好ましいトランスジェニック動物は、マウ
ス(Mo)PrPの一部がヒト(Hu)PrPの配列の相当部分と置き換えられ、エピトー
プ標識されたキメラPrPを発現するマウスである。
トランスジェニック動物は、内因性のPrP遺伝子の一方または両方が、除去ま
たは破壊されている可能性がある;好ましい態様において、トランスジェニック
動物は、内因性のPrP遺伝子が、両方とも除去されている。
本発明の好ましい態様において、エピトープ標識されたタンパク質は、天然、
合成、またはキメラのプリオン蛋白質(PrP)である。PrPは、FLAG、Strep、ま
たはポリヒスチジンペプチドのような人工的なエピトープを含む、当技術分野で
は周知の様々な天然または人工のエピトープで標識できると考えられる。FLAGペ
プチドは、Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(配列番号:1)または、Asp-Tyr
-Lys-Asp-Glu-Asp-Asp-Lys(配列番号:2)の配列を含む。Strepエピトープは
、Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(配列番号:3)の配列を有する。一
般に用いられるもう一つの人工的なエピトープはポリヒスチジン配列で、これは
6個のヒスチジン残基を持つ(His-His-His-His-His-His)(配列番号:4)。
天然に存在するエピトープには、インフルエンザウイルス赤血球凝集素の配列で
、モノクローナル抗体12CA5で認識されるTyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala
-Ile-Glu-Gly-Argの配列(配列番号:11)(Murrayら、(1995)Anal.Biochem
.229: 170〜179)、および、ヒトc-myc由来で、モノクローナル抗体9E10により
認識される11アミノ酸の配列(Glu-Gln-Lys-Leu-Leu-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu-As
n)(配列
番号:12)(Mansteinら、(1995)Gene 162:129〜134)が含まれる。もう一つ
の有用なエピトープは、3アミノ酸からなるペプチド、Glu-Glu-Pheで、これは
αチューブリンに対するモノクローナル抗体 YL 1/2 で認識される。この3アミ
ノ酸からなるペプチドは、組換えタンパク質を精製する際の親和性標識として用
いられた(Stammersら、(1991)FEBS Lett.283:298〜302)。
特に好ましい態様において、エピトープ標識PrP分子は、人工的なFLAGエピト
ープを、FLAGが標識するPrPタンパク質をコードする塩基配列の、コドン22の
後に挿入したもの、すなわち、FLAGエピトープの最初のコドンが、23番目のコ
ドンから始まるものである。FLAGで標識したPrP分子は、天然のPrP分子が持つ生
物学的活性を全て保持している。特に、FLAGで標識したPrPタンパク質は、プリ
オンの増殖を支持する活性を保持している。
本発明はさらに、エピトープ標識タンパク質をコードする遺伝子を含むゲノム
を有するトランスジェニック動物とともに、細胞、すなわち、全能または多能な
細胞、およびエピトープ標識タンパク質構築物を発現する不死化細胞株を含む。
別の局面において、本発明は、第1および第2の立体構造を有するタンパク質
の立体構造を判別するための、以下の段階を含む方法を示す:a)異種性エピトー
プで標識されたタンパク質断片を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列を有す
る、組換え核酸構築物を作成する段階、b)該標識タンパク質構築物を細胞または
生体にトランスフェクトさせる段階、c)標識タンパク質を発現させる段階。エピ
トープ標識は、標識されたタンパク質の表面で、そのタンパク質が第1の立体構
造をとる時には、第2の立体構造をとる時よりも、エピトープが暴露する程度が
相対的に大きくなるよう、該タンパク質配列に対する相対的な位置をとる。ある
態様においては、そのタンパク質の立体構造は、エピトープの有無を検出するこ
とにより判別することができる。そのタンパク質が複数の立体構造をとる場合に
は、複数の異なる標識を用いて、一連の標識の有無を検出することによって立体
構造を判別することも可能である。別の態様においては、ある立体構造の方が他
の立体構造よりも、エピトープ標識がより暴露されることで、タンパク質の立体
構造を判別する。好ましくは、一つの立体構造におけるエピトープ標識への暴露
の程度が、第2の立体構造の場合と比べて20〜100%大きい;より好ましくは、
相
対的な暴露の程度が、50〜100%大きい;最も好ましくは、相対的な暴露の程度
が、75〜100%大きい。
ある態様において、エピトープ標識タンパク質はPrPであり、エピトープ標識
は、発現されたプリオンタンパク質が非感染性αヘリックスPrPC異性体である場
合、その表面には暴露されず、感染性βシートPrPSc異性体である場合はその表
面に暴露されるように配置される。
他の局面において、本発明は、以下の段階によりPrPを単離する方法を特徴と
する;a)異種性のエピトープ領域を有するプリオンタンパク質をコードする塩基
配列を含む組換え核酸構築物を作成する段階、b)該標識PrP構築物を、細胞また
は生体にトランスフェクトさせる段階、c)構築物を発現させて、望ましいPrP異
性体の表面に暴露されるエピトープ標識が施されたPrPを産生させる段階、およ
びd)抗エピトープ標識抗体を用いた免疫親和性クロマトグラフィーにより、PrP
を精製する段階。特定の態様においては、PrPを単離する方法として、精製に先
立ってPrPを濃縮するための別の段階が含まれる。この方法は、PrPCおよび/ま
たはPrPScのいずれかを単離、分離および同定するために用いることができる。
別の局面において、本発明は、以下の段階により感染性のプリオンを検出する
アッセイ法を特徴とする;a)PrP分子がPrPScの立体構造をとる場合には、PrPCの
構造をとる場合よりも、発現されたPrP分子表面のエピトープ標識が相対的によ
り暴露されるように、エピトープ標識PrP遺伝子を有するトランスジェニック動
物を作成する段階、b)感染性のプリオンを含むことが疑われる検体を、そのトラ
ンスジェニック動物に接種する段階、およびc)エピトープで標識したPrPが増加
したかどうかを検出する段階。エピトープ標識PrPのレベルの増加が検出される
ということは、感染性のPrPScの立体構造をとるPrPのレベルが増加するためであ
り、このことは、接種される検体中に感染性のPrP粒子が存在することを示す。
ある好ましい態様において、トランスジェニック動物は、ウシ−マウスのMBov2M
キメラPrP遺伝子を発現しており、感染したウシの検体を、このマウスに接種す
る。もう一つの好ましい態様において、トランスジェニック動物は、ヒト−マウ
スのキメラMHu2M PrP分子を発現しており、感染したヒトの検体を、この動物に
接種する。
本発明の一つの目的は、エピトープ特異的抗体を用いた免疫親和性クロマトグ
ラフィーにより容易に精製できるような、エピトープ標識されたタンパク質また
はタンパク質断片を、大量に産生するトランスジェニック動物を提供することで
ある。そのタンパク質を十分量精製することが困難な場合および/または、たと
えばPrPCおよびPrPScのように、タンパク質およびその立体構造異性体に特異的
な抗体を産生することができなかった場合には、これは特に有用である。さらに
、本発明により、一段階で簡単にPrPCおよび/またはPrPScを濃縮することがで
き、それを、免疫学的な検出を含む様々な過程に用いることができる。
もう一つの目的は、増強したプロモーターまたは標識された導入遺伝子の多コ
ピー数を用いて得られた、標識されたタンパク質またはタンパク質断片の発現レ
ベルを高めたトランスジェニック動物を提供することである。
もう一つの目的は、例えばPrPCおよびPrPScの各異性体を判別するような、一
つのタンパク質の立体構造の変化を検出する方法を提供することである。
もう一つの目的は、異種性のエピトープで標識された遺伝子を提供することで
ある。
本発明のもう一つの目的は、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ネコまたはイヌのよ
うな、(成体が2kg以上で、維持に経費がかさむ、大きな)別の動物に由来する
PrP遺伝子の全てまたはその一部を含む、外因性またはキメラのPrP遺伝子および
、人工的なエピトープ標識の領域をあわせ持つ、マウス、ラットまたはハムスタ
ーのような、(たとえば成体が1kg未満で、維持にあまりコストがかからない、
小さな)トランスジェニックの宿主動物を提供することである。
本発明のもう一つの目的は、遺伝学的に異なる動物に由来するPrP遺伝子に標
識を施したものを、高レベルで発現する、トランスジェニック宿主動物を提供す
ることである。この場合、遺伝学的に異なる哺乳動物の標識されたPrP遺伝子を
多コピー数含有させること、および/または遺伝学的に異なる動物のPrP遺伝子
に増強されたプロモーターを融合することにより、発現レベルを増強させること
ができる。
本発明の方法の利点の一つは、容易に単離できるPrPCおよびPrPScを高いレベ
ルで産生できることである。
もう一つの目的は、接種を受けてPrPCと識別されるエピトープ標識により検出
可能なPrPScを生じるトランスジェニック動物のアッセイ法を提供することであ
る。
以下に記載した本発明の構成、構成要素、方法および方法の各段階についての
詳細を読むことにより、当業者には、本発明に関する上記およびその他の目的、
利点、および特徴が、明らかとなると思われる。
図面の簡単な説明
図1は、マウスPrPのアミノ酸配列を、マウスPrPとヒトPrP(配列番号:8)
との特異的な相違とともに示したものである。
図2は、マウスPrPのアミノ酸配列(配列番号:7)を、マウスPrPとウシPrP
(配列番号:9)との特異的な相違とともに示したものである。
図3は、マウスPrPのアミノ酸配列(配列番号:7)を、マウスPrPとヒツジPr
P(配列番号:10)との特異的な相違とともに示したものである。
図4は、第22番目のアミノ酸に位置する、シグナルペプチダーゼの切断部位
の上流にStuI認識部位を挿入した、PrPアミノ酸配列を示す。
図5は、第22番目のアミノ酸の位置に挿入したFLAGエピトープを有する、標
識されたPrPのアミノ酸配列である。
図6は、非トランスジェニックのマウス(「Non-Tg mice」)、およびマウスR
MLプリオン接種後にマウスの正常型PrPを過剰発現しているトランスジェニック
マウスの系列(「Tg(MoPrP-A)」)に対する、Tg(FLAG-MoPrP)の相対的な生存
曲線を示したチャートである。
詳細な説明
本発明による人工的にエピトープで標識した遺伝子、アッセイ方法およびアッ
セイで用いられるトランスジェニック動物について記述する前に、本発明が、記
載した特定のアッセイ法、エピトープ標識された人工的遺伝子、またはトランス
ジェニック動物は当然変更可能であり、それらに制限されないことを理解された
い。また、本発明の範囲は添付した請求の範囲によってのみ限定されることから
、本明細書中で用いられている用語は、特定の態様を記述する目的のためだけで
あり、限定するものではないことも理解される必要がある。
特に定義しない限り、本明細書中で用いられている全ての技術的および科学的
用語は、本発明が属する技術分野において標準的な技能を持った者に通常理解さ
れているものと同様の意味を有する。本明細書中で記載されたものと同様または
等価な、いかなる方法および材料も、本発明の実施または試験に用いることが可
能であるが、好ましい方法および材料はここに記載されている。本明細書中で記
述した全ての出版物は、引用した出版物に関連した方法および/または材料を開
示し記載するために、参照として本明細書に組み入れられる。前述の出版物は、
本出願の出願日以前にそれらを開示するためにのみ、提供されている。
本明細書のいかなる開示も、先行発明に基づいて、本開示が成された日付を早
める権利が本発明者にはないと自認したと解釈されるべきではない。定義
「人工的遺伝子」または「人工的エピトープ」などとして用いられる、「人工
的」という用語は、天然には生じない物質、例えば天然の配列を融合すること、
または単離されている配列を化学的に合成することといった人の手により製造さ
れた塩基配列などを指す。さらに、この用語は、例えば「人工的遺伝子」により
発現された、天然PrP配列に直接的に結合された天然HIVウイルスエピトープなど
、天然のゲノムから単離され、次いで天然では結合しない配列(天然の配列また
は人工的配列のいずれか)と人為的に連結されうる天然の配列をも包含するもの
とする。
「導入遺伝子」または「トランスジェニックエレメント」という用語は、その
核酸配列が存在する宿主動物のゲノムに対して異種性である、人工的に導入され
染色体に組み込まれた核酸配列を意味する。
「トランスジェニック動物」という用語は、そのゲノム中に組み込まれたトラ
ンスジェニックエレメントを有する、ヒト以外の哺乳動物を意味する。
「プリオン」という用語は、ヒトおよび動物において病害(海面状脳症)を引
き起こすことが知られている感染性粒子を意味する。「プリオン(prion)」と
いう用語は、「タンパク質(protein)」および「感染(infection)」という二
語を短縮したものであり、該粒子は、全部ではないにせよ大部分はPrP遺伝子に
よってコードされるPrPSc分子からなる。プリオンは、細菌、ウイルス、および
ウイロイドとは異なる。既知のプリオンには、ウシ海綿状脳症(BSE)または狂
牛病およ
びネコのネコ海綿状脳症と並んで、ヒツジおよびヤギの中枢神経の伝染性変性性
疾患であるスクレイピーを感染動物に引き起こすものが含まれる。ヒトでの発症
が知られている4つのプリオン病は、(1)クルー病、(2)クロイツフェルト−ヤコ
ブ病(CJD)、(3)ゲルシュトマン−シュトラスラー−シャインカー病(GSS)お
よび(4)致死性家族性不眠症(FFI)である。本明細書で用いられるプリオンには
、使用されるあらゆる動物において、特にヒトおよび家畜動物において、こうし
た病害またはその他の病害の全てもしくはいくつかを引き起こす全ての形態のプ
リオンが含まれる。
「PrP遺伝子」「プリオンタンパク質遺伝子」または「PrP配列」とは、本明細
書中で互換可能に用いられ、例えば図1〜3に示すような、PrPタンパク質のい
ずれかを発現する遺伝物質を表わす。ヒトPrP遺伝子には、数多くの変異体が知
られている。さらに、ヒト、ヒツジ、およびウシPrP遺伝子には、多型性が知ら
れている。以下は、これらの変異体の一覧である:
PrP遺伝子は、本明細書中に記載したいかなる動物に由来する天然のPrP遺伝子、
およびまだ発見されていない他のPrP遺伝子を含む用語として認められる全ての
遺伝子およびそれらに由来する多型および変異のいずれかまたは全てでありうる
。「PrP遺伝子」という用語は、一般的にあらゆる型のプリオンタンパク質をコ
ードするあらゆる動物種のあらゆる遺伝子をも包含する。よく知られているPrP
配列の例は、Gabrielら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:9097〜9101(1992)に
記載されており、この文献は、こうした配列を開示し記載する目的で、参照とし
て本明細書に組み入れられる。天然のPrP遺伝子に加えて、「PrP遺伝子」という
用語はさらに、人工的、合成およびキメラのPrP遺伝子を包含する。
本明細書中で用いられている「キメラPrP遺伝子」という用語は、宿主動物(
例
えばマウス)のゲノム中に含まれた場合、その哺乳動物に、例えばヒト、ウシ、
またはヒツジのような、遺伝的に異なる種の被験哺乳動物にしか、天然では感染
しないプリオンに感染するような感受性を付与する、組換えにより構築された遺
伝子を包含する。キメラPrPは、操作された内因性PrP遺伝子を含む動物において
この効果を発揮し、接種後200±50日以内にこの動物に症候を生じる。一般に、
キメラ遺伝子は、天然の配列の1つまたはそれ以上(しかし全てではなく、通常
40未満)のコドンを、異なるコドン−好ましくは(例えばヒトのような)遺伝
的に別種の哺乳動物の対応するコドン−に置換した、哺乳動物のPrP遺伝子のコ
ドン配列を含んでいる。遺伝的に別種の哺乳動物にのみ感染するプリオンの検体
をアッセイするために、遺伝的に変化させた哺乳動物を用いる。人工的な遺伝子
の例としては、図1、2および3で示したような配列をコードする、マウスのPr
P遺伝子があげられる。これらの図中に示した配列は、ヒト、ウシ、およびヒツ
ジとは異なるマウスのコドンのすべてをそれらには置換しないことを条件に、ヒ
ト、ウシ、およびヒツジのコドンから選択された1つまたはそれ以上の異なるコ
ドンを、同じ位置のマウスのコドンに置換したものである。本発明のキメラPrP
遺伝子は、遺伝的に別種の動物のコドンだけでなく、動物に挿入されると、通常
はある遺伝的に別種の動物にのみ感染するプリオンに感染しうる動物にする、天
然のPrP遺伝子に関連したあらゆるコドンおよびコドン配列をも含みうる。キメ
ラPrP遺伝子はまた、宿主動物ゲノムの天然の遺伝子中に生じるコドンの欠失を
も含みうる。
「異種性エピトープ領域」または「異種性エピトープ標識」という用語は、タ
ンパク質またはタンパク質断片の部分として天然には生じないペプチドを意味す
るものとして互換可能に用いられる。異種エピトープは、天然に生じるペプチド
であっても人工的ペプチドであってもよい。異種性エピトープ標識は、3F4また
は13ASのようなモノクローナル抗体の免疫原となった天然の抗原性を持つPrP配
列とは異なるものである。異種性エピトープ標識は、必ずしも、例えば特異抗体
を生じるような抗原性を有する必要はない。エピトープ標識は、特定のリガンド
によって結合されるペプチドを含む。たとえば、Arg-Gly-Asp配列は、PrPタンパ
ク質に挿入されるとインテグリンに結合する(RouslahtiおよびEierschbacher(
1987)Science 238:491〜497)。
「異種性エピトープで標識された遺伝子」または「標識遺伝子」という用語は
、対象となる生物学的活性を持つタンパク質またはタンパク質断片を構成するア
ミノ酸配列をコードする遺伝子(すなわち、第1の塩基配列)、および該タンパ
ク質またはタンパク質断片の部分としては天然に生じない、たとえば異種性エピ
トープ標識をコードする第2の塩基配列で構成される、人工的に構築された塩基
配列を意味するために用いられる。標識をコードする配列は、対象となるタンパ
ク質をコードする配列の、5'側、3'側および/または内部に位置する。標識遺伝
子が発現すると、1つまたはそれ以上の異種性エピトープ領域を有するタンパク
質またはタンパク質断片が産生される。
「エピトープで標識されたPrP遺伝子」または「標識されたPrP遺伝子」などの
用語は、本明細書では互換可能なものとして、マウス、ヒト、ウシまたはヒツジ
のような動物のPrPタンパク質をコードする塩基配列および、PrP遺伝子に挿入さ
れた1つまたはそれ以上のエピトープ標識をコードする塩基配列をさらに含む、
人工的に構築された遺伝子を意味する。標識されたPrP遺伝子が発現すると、1
つまたはそれ以上の人工的なエピトープ領域を有するPrP分子が産生される。あ
る特別な例では、標識されたPrP遺伝子は、コドン22の位置に人工的なFLAGエ
ピトープをコードする塩基配列が挿入されたマウスPrPをコードする塩基配列を
含む。別の特定の態様においては、標識されたPrP遺伝子は、マウス−ハムスタ
ー−PrP(MHM2)遺伝子のコドン22の位置にFLAGエピトープをコードする塩基
配列が挿入されたキメラMHM2PrPをコードする塩基配列を含む。この塩基配列は
また、モノクローナル抗体3F4(Scottら、(1992)Protein Sci.1:986〜997)に
よって認識されるハムスターPrP由来のエピトープをも含んでいる。これから生
じる標識されたPrP分子は、エピトープ標識に対する抗体を用いた免疫親和性方
法によって、容易に精製できる。
「エピトープで標識されたキメラPrP遺伝子」または「標識されたキメラPrP遺
伝子」などの用語は、本明細書中で互換可能に用いられ、例えばヒト、ウシ、ま
たはヒツジのような遺伝的に別種の被験動物に由来する対応したコドンで、1つ
またはそれ以上のコドンを置換し、標識されたPrP遺伝子の発現によって、1つ
またはそれ以上の異種性エピトープ領域を有するPrPタンパク質を産生するよう
な異
種性エピトープ標識をコードする塩基配列が、PrP遺伝子に挿入されているマウ
スなどの宿主動物のPrPタンパク質をコードする塩基配列を含む、人工的に構築
されたPrP遺伝子を意味する。1つの特別な例では、標識されたPrP遺伝子は、宿
主となる哺乳動物種(例えばマウス)のPrP遺伝子の開始および終止配列(すな
わちN末端およびC末端コドン)、被験哺乳動物である第2の種(例えばヒト)の
PrP遺伝子の対応する部分の塩基配列、およびコドン22に位置するFLAGエピト
ープをコードする塩基配列からなる(図5)。宿主となる種の哺乳動物のゲノム
に挿入されると、標識されたPrP遺伝子は、第2の遺伝的に別種の哺乳動物に対
してのみ通常は感染するプリオンに対して、その哺乳類を感受性にする。すなわ
ち、接種後200±50日以内に、宿主動物はプリオン病の症状を示すようになる。
好ましく標識されたPrP遺伝子はMHu2Mであり、これは、マウスPrP遺伝子の開始
および終止配列、および発現するタンパク質が9つのアミノ酸残基で異なってい
るように、マウスPrP遺伝子と異なる、対応するヒト配列で置き換えた、末端配
列以外の領域を含む(MHu2M)。
「プリオンに関連した遺伝物質」という用語は、ある動物がプリオンに感染す
るという能力に影響を及ぼす全ての遺伝物質をも包含する。このため、この用語
は、本明細書中では、動物がプリオンに感染する能力に影響を及ぼすような、「
PrP遺伝子」、「キメラPrP遺伝子」、または「欠失をもつPrP遺伝子」およびそ
れらの修飾型によって定義されるすべてを含む用語である。
「宿主動物」、「ヒト以外の宿主となる哺乳動物」およびその同類の用語は、
天然にはその動物には存在しない遺伝物質を含むように、遺伝的および人工的に
操作されたゲノムを有する動物を指すのに用いる。たとえば、他の動物由来の標
識された人工的PrP遺伝子の挿入によって、または遺伝的に別種の被験動物に由
来する標識された天然PrP遺伝子の挿入によって、そのPrP遺伝子が破壊されたり
変化しているような、マウス、ハムスターおよびラットが、宿主動物に含まれる
。
「欠失を有するプリオン蛋白質遺伝子」「破壊されたPrP遺伝子」などの用語
は、本明細書中で互換可能に用いられ、内因性のプリオンタンパク質遺伝子で、
その遺伝子が機能を持たないように改変(例えば塩基を加えるおよび/または除
去するといったような)されたものを意味するために用いられる。機能をもたな
い
プリオンタンパク質遺伝子およびこうした遺伝子の製造法の例は、Buelerら、(1
992)Nature 356:577〜582において開示されており、これは参照として本明細書
中に組み入れられる。これらの遺伝子は、1つ(ヘテロ接合型)または望ましく
は両方(ホモ接合型)の遺伝子座が破壊されている。
「生物学的活性の保持」、「天然に生じるタンパク質またはタンパク質断片の
生物学的活性」などの用語は、標識されたタンパク質または標識されたタンパク
質断片が、改変されていない、すなわちたとえば標識されていないタンパク質ま
たはタンパク質断片の持つ特徴的な生物学的活性および特性の少なくとも一部分
、好ましくは全てを保持していることを意味する。たとえば、FLAGで標識したキ
メラのシリアンハムスター−マウスPrP(FLAG-MHM2PrP)は、シリアンハムスタ
ープリオンに感染したトランスジェニックマウスで発現されると、インビボでプ
リオンの増殖を支持する能力を保持している。
「遺伝的に別種の動物」および「遺伝的に別種の哺乳動物」という用語は、遺
伝的に異なる種の被験動物と、17個以上のコドンが異なる、好ましくは20個以
上、最も好ましくは28〜40個のコドンが異なる宿主動物の天然のPrPコドン配列
を有する動物を指すのに用いられる。このため、マウスPrP遺伝子は、ヒト、ウ
シまたはヒツジのPrP遺伝子に関しては、遺伝的に異なっているが、ハムスター
のPrP遺伝子に関しては、遺伝的に異なってはいない。
「感染感受性がある」および「プリオンに感染感受性がある」などの用語は、
本明細書中で、互換可能に用いられ、本発明に係るトランスジェニック動物が、
通常遺伝的に異なる動物には感染しないプリオンを接種されたときに、80%以上
、好ましくは98%以上、最も好ましくは100%の確率で、疾患を発症することを
意味するのに用いられる。さらに、「感染感受性がある」動物は、それらの動物
が感染する感受性のあるプリオンを接種後、200±50日以下で、プリオン病の症
状を起こす。
トランスジェニックマウスTg(MHu2M)というような用語が用いられるが、これ
は、キメラPrP遺伝子のない場合には、ヒトまたはウシプリオンの感染を生じる
ことは希であるが(20%以下の感染率)、キメラ遺伝子がある場合には、ヒトま
たはウシプリオンに対して感染感受性を生じ(80〜100%の感染率)、接種後200
±50
日以下の日数で症状を示す、本発明のトランスジェニック動物を記載するために
用いられる用語である。
「潜伏期間」という用語は、動物にプリオンを接種した時から、その動物が感
染によって生じる疾患の症状を最初に検出できた時までの時間を意味する。潜伏
期間は短縮した場合、1年以内、好ましくは約200±50日以下、さらに好ましく
は50±20日以下である。一般的に言って、本発明に関して「潜伏期間」は、動物
に、天然のタンパク質に構造変化を引き起こすような何らかの物質を接種してか
ら、たとえば暴露した標識が検出できるまでのように、立体構造が検出可能な量
生じるまでの時間を意味する。エピトープ標識
本発明は、アミノ酸配列をコードするような組換え核酸構築物である、エピト
ープ標識された導入遺伝子を含んでいる。この構築物は、生物学的活性を持つタ
ンパク質または生物学的活性を持つ断片をコードする第1の配列と、異種性のエ
ピトープ領域による標識をコードする第2の配列とを含んでいる。本発明は、エ
ピトープで標識された導入遺伝子を発現しているトランスジェニック動物をも含
む。そのエピトープが、(1)天然に生じるタンパク質に対して異種性であり、か
つ(2)エピトープ標識されたタンパク質が、改変されていないタンパク質の生物
学的活性の、少なくとも一部、好ましくは全てを保持している限りは、タンパク
質を標識するために様々なエピトープを用いることが可能である。こうしたエピ
トープは、天然に生じるアミノ酸配列、人工的に構築された配列、または天然の
配列を改変した配列であり得る。近年になって、様々な人工的なエピトープ配列
が記載され、それらが組換えタンパク質の標識および検出に有用なことが示され
てきた。このような標識の一つに、8つのアミノ酸からなるFLAGマーカーペプチ
ド(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)(配列番号:1)があり、これは組換
えタンパク質の検出のみならず親和性による精製にも特に有用な、様々な特徴を
有している(Brewer(1991)Bioprocess Technol.2:239〜266;Kunz(1992)J.
Biol.Chem.267:9101〜9106)。組換えタンパク質にFLAGエピトープが含まれて
いれば、タンパク質を精製するために特別な計画や機能解析方法を開発する必要
性がなく、この配列の最初の4つのアミノ酸が抗FLAG M1およびM2モノクローナ
ル抗体の
抗原部位となっているため、標識されたタンパク質に対する抗体を作成する必要
性が回避できる。この小さな8アミノ酸のペプチドは、親水性が高いため、抗-F
LAG M1およびM2モノクローナル抗体の接近を最大限にする。特に有用な特徴は、
FLAGペプチドを含む組換えタンパク質に対して、抗FLAG M1モノクローナル抗体
がカルシウム依存的に結合することである。EDTAでキレートしてCa2+を除去する
ことにより変性することなく免疫親和性による効率のよい精製が行える。FLAGシ
ステムのさらなる利点は、このシステムでは、標識がエンテロキナーゼの認識配
列である希な5つのアミノ酸配列を含んでいるので、精製したタンパク質からFL
AGペプチドを切断できることである。抗FLAG M1抗体は、FLAG配列のアミノ末端
を必要とする。第2の抗FLAGモノクローナル抗体(抗FLAG M2)は、アミノ末端M
et-FLAGおよびカルボキシル末端FLAGの融合タンパク質を免疫親和性により精製
する際に用いられる(Brizzardら、(1994)Biotechniques 16:730〜735)。し
かしながら、この抗体は、このFLAGペプチドと8アミノ酸残基のうち5つのアミ
ノ酸残基が同一な配列モチーフを持つ、Mg2+依存性タンパク質脱リン酸化酵素ベ
ータ(MPPベータ)のスプライシングによる異性体、と交差反応することが知ら
れている(Schafer(1995)Biochem.Biophys.Res.Commun.207:708〜714)。
FLAGエピトープに対する抗FLAG M2モノクローナル抗体の結合はカルシウム依存
的ではないが、結合した融合タンパク質は、FLAGペプチドとの競合によって抽出
することができる。
その他の人工的なエピトープ標識として、Asp-Tyr-Lys-Asp-Glu-Asp-Asp-Lys
配列を持つ改良型FLAG標識(配列番号:2)、「Strep標識」と呼ばれるAla-Trp
-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Glyの9アミノ酸配列(配列番号:3)(Schmidt(1
994)J.Chromatography 676:337〜345)、IMACビーズに結合するのに十分な6
残基からなるポリヒスチジンのようなポリヒスチジン配列、モノクローナル抗体
9E10で認識されるヒトc-myc由来の11アミノ酸配列、または、モノクローナル
抗体12CA5で認識されるインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)サブタイプ由
来のTyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala-Ile-Glu-Gly-Arg配列(配列番号:1
1)で表されるエピトープが含まれる。抗α-チューブリンモノクローナル抗体YL
1/2で認識されるGlu-Glu-Phe配列もまた、組換えタンパク質を精製するための親
和性標識
として用いられてきた(Stammersら、(1991)FEBS Lett.283:298〜302 )。
本発明は、標識されたタンパク質またはタンパク質断片をコードする導入遺伝
子をもつトランスジェニック動物を特徴とする。それによってコードされるタン
パク質の生物学的活性を完全に妨げないように遺伝子構築物に挿入することで、
様々な天然の、改変された、または人工的なエピトープ標識を用いることが可能
である。天然およびキメラのPrP遺伝子
本発明は、エピトープ標識された、天然に生じるまたはキメラのPrP遺伝子を
コードするDNA構築物を持つトランスジェニック動物を作成するために、用いる
ことができる。天然に生じるPrPタンパク質の例を図1〜3に示した。対象とな
る全ての動物に由来するPrP遺伝子は、たとえば標識されたPrPCがPrPScに変換さ
れてプリオンを増殖させるように、標識されたPrP分子が、天然のタンパク質の
生物学的活性を保持している限り、エピトープ標識される可能性を持つ。
キメラPrP導入遺伝子は、同時係属中の米国特許出願第08/242,188号、第08/50
9,621号、第08/521,922号に記載されており、これらの出願の全ては、本明細書
中で参照として特に組み込まれており、これには、SHaPrPでコドン94〜188
の間に存在することが発見された5つのアミノ酸の置換を持つ、シリアンハムス
ター/マウス(SHa/Mo)キメラ導入遺伝子MH2M(Scottら、(1993)Cell 73:979〜
988)、およびマウスPrPと9つのコドンが異なる対応するヒト配列で、マウス遺
伝子の同じ領域を置き換えた、ヒト/マウスキメラPrP遺伝子、MHu2Mが含まれて
いる。
MHu2MキメラPrP導入遺伝子を発現しているマウスは、潜伏期間が短縮され、ヒ
トプリオンに対して感受性を示すようになった。すなわち、MHu2M遺伝子を有す
るトランスジェニックマウス[Tg(MHu2M)]は、ヒトプリオンを接種後約180日以内
に、プリオンに起因する疾患の症状を呈する。さらに、ヒトプリオンを接種した
トランスジェニックマウスの80%またはそれ以上が、疾患の症状を呈する。この
ように、PrPトランスジェニック動物は、プリオン感染を評価する優れたシステ
ムを提供する。トランスジェニック動物
本発明は、生物学的活性を有するタンパク質断片および異種性のエピトープ領
域を含むアミノ酸配列をコードする導入遺伝子を持つトランスジェニック動物を
特徴とする。標識されたタンパク質の導入遺伝子を有するトランスジェニック動
物は、宿主動物の生殖細胞のDNAに、所望の標識を施されたタンパク質をコード
するDNA構築物を導入することによって製造される。当技術分野において、トラ
ンスジェニック動物を製造するための方法がいくつか知られており、参照として
、例えばGordonら、(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.77:7380〜7384があげられ、
DNAのマイクロインジェクションよって、胎児を遺伝学的に形質転換させる方法
の参照として本明細書に組み入れられる。所望の標識を施されたタンパク質配列
を導入するには、宿主動物の受精卵にマイクロインジェクションすること、所望
のDNAで胎児性幹(ES)細胞を形質転換し、宿主動物の胚盤胞に形質転換されたE
S細胞を導入すること;または、所望の導入遺伝子を含むレトロウイルスベクタ
ーで胎児に形質を発現させることによって達成される。トランスジェニック動物
を製造するためのもう一つの方法は、米国特許第5,487,992号に記載されており
、これにおいては、宿主動物ゲノムの標的部位に、相同組換えによってDNA配列
を挿入するために、ポジティブ−ネガティブ選択因子(PNS)を持つベクターを
用いている。
トランスジェニック動物をマイクロインジェクション技術によって製造するの
は、当技術分野においては既知のことである。たとえば、標識されたタンパク質
のトランスジェニック動物を製造するためには、エピトープ標識が挿入された対
象となるタンパク質をコードするDNA断片を準備し、マウスの受精卵にマイクロ
インジェクションした後、擬妊娠状態のマウスの卵管の中へ、生きている卵を移
植する。(Hoganら、(1986)「マウス胎児の操作:実験室マニュアル」(Manipul
ation of Mouse Embryos: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laborato
ry,NY、トランスジェニック動物の製造方法の参照として、本明細書に特に組み
込まれる)。
好ましい態様においては、標識されたPrP導入遺伝子を有するトランスジェニ
ック動物が製造される。特定の態様においては、標識されたPrP導入遺伝子は、
コドン22の位置でFLAGエピトープによって標識されたPrP配列である(図5)
。好ましくは、トランスジェニック動物は、内因性のPrP遺伝子を発現していな
い動物で
ある。トランスジェニックマウスは、1つまたは2つの遺伝子座において改変さ
れた、ヘテロ接合またはホモ接合であり、その結果内因性PrP遺伝子を有効に欠
失している(ΔPrP)。好ましくは、その遺伝子の両方の遺伝子座が破壊されて
いる。内因性のプリオンタンパク質遺伝子は、この遺伝子の機能を失わせるため
のあらゆる手段(たとえば、核酸を加えるおよび/または除去する)によって改
変されている可能性がある。機能しないプリオンタンパク質遺伝子の例およびこ
うしたものを作成する方法は、Buelerら、(1992)Nature 356:577〜582で開示さ
れており、参照として本明細書に組み込まれる。生物学的活性を持つ標識されたPrPタンパク質の発現
MoPrPC特異的な抗体を作成するこれまでの試みは成功しなかったが、それは免
疫した動物でMoPrPが自己として認識されることによると考えられる。この限界
は、FLAGエピトープの標識でPrPを標識することによって、今や克服できる。FLA
Gシステムは、FLAGペプチドを含むタンパク質に対し、カルシウム依存的に結合
する抗FLAG M1モノクローナル抗体を用いることで、変性することなく、効率の
よい一段階の免疫親和性による精製を行える利点がある。抗FLAG M1モノクロー
ナル抗体によるFLAG融合タンパク質の認識は、タンパク質のN末端におけるFLAG
配列の位置に依存する。PrPは細胞内でプロセッシングを受けてN末端のシグナル
ペプチドを除去されるため、FLAG配列はPrPの22番目のアミノ酸残基にあるシ
グナルペプチダーゼ切断部位の遠位に挿入されている。
FLAGで標識されたPrPを構築するために、第22番目のアミノ酸の後ろでPrPを
切断するシグナルペプチダーゼ切断部位の上流に、新たに制限酵素StuIの認識配
列を作成した。実施例1に記載のPCRによる変異誘発によってMoPrP遺伝子の57位
のヌクレオチドをTをAに変更することによりユニークなStuI部位を作製した(図
4)。このヌクレオチド部位での変異は、PrPの推定一次構造を変化させない。
相補的なオリゴヌクレオチド配列[TTGGCCGCTTCTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGCAGA(
配列番号:5)およびCCTCTGCGACTACAAGGACGACGATGACAAGAAGAAGCGGCCAAAGC(配
列番号:6)]を合成し、シグナルペプチダーゼ切断部位に接するStuIとPflMI部
位との間の塩基配列を置換するために用いた。これによりシグナルペプチドのカ
ルボキシ末端部分を再構築し、新たにこの部位以降に8アミノ酸のFLAG配列が挿
入さ
れた(図5)。FLAGで標識された成熟MoPrPは、FLAGの8アミノ酸を含んでいる
点で野生型MoPrPと異なっており、FLAG配列の第1番目のアミノ酸であるアスパ
ラギン酸が、FLAGで標識された成熟PrPのアミノ末端の、第23番目のアミノ酸
に位置する。第2の標識されたPrP構築物、FLAG-MHM2PrPは、SHaPrP由来のモノ
クローナル抗体3F4に対するエピトープを挿入したものとして、作成された(Kas
csakら、(1987)J.Virol. 61:3688〜3693)。
FLAG-MHM2PrP構築物を、以前にScottら、(1992)Protein Sci.1:986〜997によ
って記載されたMHM2PrP発現カセットに挿入し、SPOX.II neo発現ベクターにクロ
ーニングして、ScN2A細胞にトランスフェクトさせた(実施例2)。マウス神経
芽細胞腫のScN2A細胞は、以前に記載されたように、マウスプリオンに持続感染
している(Butlerら、(1988)J.Virol.62:1558〜1564)。
組換えPrPを発現しているネオマイシン耐性コロニーは、G418含有培地で選択
した。マウスPrPはモノクローナル抗体3F4では認識されず、このため抗FLAG M1
モノクローナル抗体によってFLAG-MHM2PrPが認識されない場合、3F4エピトープ
を含むことで、異所性発現したPrPと内因性PrPとを判別することができる。
FLAG-MHM2を発現しているScN2A細胞の細胞溶解液を、モノクローナル抗体3F4
をプローブとしたウエスタンブロット法で解析すると、第23番目のアミノ酸の
位置にFLAGエピトープが含まれていても、本来のプロセッシングを受けてPrPの
発現が阻害されないことが示された。FLAG-MHM2PrPは、正しくグリコシル化され
ていると考えられるが、グリコシル化されたFLAG-MHM2PrPは、見かけの分子量が
MhHM2PrPより1〜2kDa大きい。MHM2PrPに比べてシフトしている大きさが、FLAG
-PrP融合タンパク質の推定分子量に一致していることから、この分子量の増加は
、シグナルペプチダーゼの切断部位における異常なプロセッシングというよりは
、むしろ成熟したPrPC中にFLAGペプチドを含むことによるものと考えられる。
PrPの第22番目と23番目の間へのFLAG配列の挿入は、標識タンパク質のプ
ロセッシングまたは生物学的活性を妨げない。FLAGエピトープの存在は、シグナ
ルペプチダーゼ切断部位での、または正常なプロセッシングによるタンパク質分
解的なPrPの成熟、および細胞表面でのPrPのGPI接着を阻害しなかった。シグナ
ルペプチドがFLAG-MHM2PrPから有効に除去されることは、3F4モノクローナル抗
体だけ
でなく、N末端にFLAG標識を有する融合タンパク質のみを認識する抗FLAG M1モノ
クローナル抗体に対し、異所性発現したPrPの免疫反応性があることで証明され
る。抗FLAG M2モノクローナル抗体を用いて、トランスフェクトされたScN2A細胞
のFLAG-MHM2PrPを検出しようという試みは失敗した。ホスファチジルイノシトー
ル特異的ホスホリパーゼ(PIPLC)により細胞表面からFLAG-MHM2PrPが放出され
ることで示されるように、FLAG標識を含んでいることは、C末端でのタンパク質
分解的な切断、または細胞の外側表面へのGPI接着によるPrPの付着を阻害しない
。
抗FLAG M1モノクローナル抗体によって認識されるFLAGエピトープには、成熟
したPrPのN末端に位置することが必要なため、FLAG-MHM2PrPが十分に発現され、
プロセッシングを受けていても、この親水性配列の配置が、おそらくはPrPCが感
染性プリオンの産生に必須の立体構造をとる能力に影響を与えることによって、
組換えPrPがプリオンの増殖を支持する能力を阻害するかどうかは不明である。P
rPScの特徴は、界面活性剤に不溶性で、蛋白質分解酵素に相対的に抵抗性をもつ
ことである。
感染したScN2A細胞においてPrPがプロテイナーゼKにより消化されると、主に
第90〜231番目のアミノ酸残基より構成されるPrP 27-30として参照される
、コア分子が持続的に存在するようになる。抗FLAG M1モノクローナル抗体によ
る免疫ブロットでは、プロテイナーゼKによる処理によって、第23番目のアミ
ノ酸に位置するFLAGエピトープが失われているため、FLAG-MHM2PrP由来のPrP27-
30を検出できなかった。プロテイナーゼK抵抗性のFLAG-MHM2PrPを検出するため
に3F4モノクローナル抗体を用いると、MHM2PrPを発現しているScN2A細胞のよう
に、FLAG-MHM2PrPを発現しているScN2A細胞は、効率よくPrP 27-30を産生してい
ることが見出された。この現象はまた、同じ位置に挿入された際に同様の挙動を
示す「Strep標識」と呼ばれるAla-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(配列番号
:3)からなる9アミノ酸のペプチド配列(Schmidtら、(1994)前記)で示され
る。これらの結果から、PrPにこの位置でアミノ酸を付加することは、その正常
なプロセッシングを阻害せず、さらに重要なことに、PrPSc異性体へ変換される
能力をも阻害しないことが確認される。
トランスジェニックマウスで発現したFLAG-MoPrPがプリオンの感染性を支持す
る能力について検討した(実施例4)。FLAG-PrP配列を、MoPrP発現カセットに
組み込み、cosSHa.tetコスミド発現ベクター(Scottら、(1992)Protein Sci.1:
986〜997)にクローニングして、トランスジェニックマウスを作成した。5匹の
トランスジェニック始祖マウスが製造された:3匹はFVBマウスであり、2匹はF
VB/Prn p0/0マウスであった。FVBマウスは内因性のMoPrPを発現している;一方
、FVB/Prn p0/0マウスは、MoPrP遺伝子が破壊された個体をFBVに反復戻し交配し
て、内因性のMoPrPを発現しなくなったマウスの系統である。解析を単純化する
ために、今回は、導入遺伝子由来のFLAG-MoPrPのみ発現されて内因性の野生型Mo
PrPは発現されないようにするため、多コピー数を含む始祖マウスのうち、FVB/P
rn p0/0の胎児にマイクロインジェクションして得たものだけを選択して交配に
用いた。他の実験では、内因性の野生型MoPrPが、導入遺伝子がプリオンの増殖
を起こすのを妨げることが認められている(Tellingら、(1994)Proc.Natl.Aca
d.Sci.91:9936〜9940;Tellingら、(1995)前記)。ハムスター由来の精製され
たPrP27-30に対して作成され、MoPrPとも反応するウサギのポリクローナル抗体
である、ポリクローナル抗体RO73を用いて、階段希釈の後免疫ブロットを行うと
、Tg(FLAG-MoPrP)FVB/Abl 7755という1つの系統の脳抽出液では、野生型のMoPr
Pの発現レベルより約100倍高いレベルで、FLAG-MoPrPの発現が認められた。この
ようにFLAG-MoPrPCの発現レベルが極端に高いのは、FLAG-MHM2PrPを発現するScN
2A細胞での場合よりも、Tg(FLAG-MoPrP)FVB/Abl 7755マウスの脳ホモジネートの
方が、抗FLAG M1モノクローナル抗体を用いると、FLAGで標識したPrPを検出しや
すいことを意味する。
Tg(FLAG-MoPrP)マウスがマウスプリオンの複製を支持しているかどうかを検討
するため、多コピー数をもつTg(FLAG-MoPrP)FVB/Abl 7755マウスに、マウスのRM
Lプリオンを脳内接種した(実施例5)。RMLは、チャンドラー(Chandler)系マ
ウス(Rocky Mountain Laboratory、Hamilton、MT)に由来する特異的なマウス
プリオン単離株である。接種を受けたマウスは、潜伏期間の平均日数約52日で
、スクレイピーの臨床症状を呈した(図6)。これは、MoPrPを野生型の約8倍
高く過剰発現する、多コピー数をもつTg(MoPrP)4053マウス(Carlsonら、(1994)
Proc.Natl.Acad.Sci.91:5690〜5694)の潜伏期間と同程度で、平均の潜伏期
間が
約130日となる野生型の非トランスジェニックマウスより、遙かに短い。
臨床症状の見られる脳の神経病理学的な特徴としては、反応性の星状神経膠症
を伴う広汎な空胞化が、特に白質に顕著に認められた。ポリクローナル抗体RO73
を用いて加水分解、加圧滅菌を行うと、PrPを含むプラークが、主に脳梁内に認
められた。
マウスのRMLプリオンを接種して臨床症状を示したTg(FLAG-MoPrP)FVB/Abl 775
5マウスの脳には、RO73抗体で検出できる、プロテイナーゼK抵抗性のPrP 27-30
が含まれていた。プロテイナーゼK処理により、第23残基にある抗FLAG M1モノク
ローナル抗体のエピトープが失われるため、この抗体ではFLAG-MoPrPScを検出す
ることができない。これらのトランスジェニックマウスは、内因性のMoPrPを発
現しないFVB/Prn-p0/0マウス由来のため、RO73に反応するPrPScはすべて、FLAG-
MoPrPを発現する導入遺伝子に由来する。FLAG-MoPrPScのレベルは、接種を受け
た野生型マウスのMoPrPScの、約半分ほど低い。MoPrPScレベルが低下する現象は
、MoPrPを過剰発現する、潜伏期間の短いTg(MoPrP)4045マウスでも同様に観察さ
れる。
MoPrPにFLAGエピトープを組み込むことにより、組織のブロットによる解析で
、インサイチューにPrPCを検出できるようになった。FLAGエピトープはプロテイ
ナーゼKでPrPを消化すると失われてしまうため、抗FLAG M1モノクローナル抗体
を用いると、FLAG-MoPrPCは検出できるが、FLAG-MoPrPScは検出されなかった。P
rPCは、抗FLAG M1モノクローナル抗体またはポリクローナルのRPO73抗体のいず
れを用いた場合でも、同じ分布を示した。マウスのRMLプリオンを接種したTg(FL
AG-MoPrP)マウスのFLAG-MoPrPScは、RMLを接種した野生型マウスにおけるMoPrPS c
と同様の分布を示した。
抗FLAG M1モノクローナル抗体は、Tg(FLAG-MoPrP)マウスで異所性発現したMoP
rPを効率よく認識し、FLAG-MoPrPの発現レベルは野生型MoPrPの発現よりおよそ1
00倍高いことが検出されたため、Tg(FLAG-MoPrP)FVB/Abl 7755は、大量のFLAG-M
oPrPCを供給する優れた供給源であることが期待される。エピトープ標識が存在
すると、一段階の免疫親和性クロマトグラフィーにより、非変性条件のもとで、
標識されたPrP分子を高い純度で得ることができる。最近、FLAG配列の第5番目
のアミノ酸をアスパラギン酸残基からグルタミン酸残基へと変換した、改良型の
FLAG
標識が作成された。M1抗体の結合親和性は、ウエスタンブロットで見て、もとの
FLAG配列の6倍増加した(Knappik、(1994)Biotechniques 17:754〜761)。この
ことから、改良型のFLAG標識を持つPrPを発現するトランスジェニックマウスは
、将来、組換え素材の供給源としてよりよいものとなる可能性がある。タンパク質異性体を判別するためのエピトープの配置の使用
エピトープ標識のシステムは、単一のタンパク質の異なる立体構造を判別する
ために用いることも可能である。例えば、一つの立体構造ではエピトープが露出
され、他方の場合には内部に埋もれてしまうように、タンパク質に対するエピト
ープ標識の位置を決定することができる。
MoPrP、HuPrPおよびMHuM2PrPの、エピトープ標識された両方の異性体でのエピ
トープの位置を比較して、PrPSc型の立体構造ではエピトープが露出され、PrPC
型の立体構造ではエピトープが内部に埋もれるように、エピトープの位置を決定
する(実施例6)。こういった標識法を用いる手法は、PrPの感染性および非感
染性の異性体を判別するアッセイとして有用である。例えば、第109〜141残基の
中にある特定の領域が、ヘリックス−ループ−ヘリックス構造からβシート構造
へと変化する可能性がある。このことにより、これらのアミノ酸残基の側鎖の表
出パターンが変化し、αヘリックス型のPrPC異性体では露出されていたエピトー
プが、βシートに富むPrPSc異性体では隠されてしまう、またはその逆のことが
起こる可能性がある。この領域内に位置する標識が露出されるかどうかは、PrPC
とPrPScとの間の立体構造の変化に影響される。複製中間体を単離するためのエピトープ標識の利用
エピトープ標識の技術は、ScN2A細胞またはスクレイピーに感染したマウスの
脳から、PrPC、PrPScおよびタンパク質X(単数または複数)で構成される「複
製中間体」を単離するために用いることも可能である。非特異的結合を最低限に
抑えるために、低レベルの界面活性剤を含む緩衝液存在下で、抗FLAG抗体を用い
てFLAGで標識された複合体を免疫沈降させ、遠心して免疫沈降物を回収する。金
属イオンをキレート化してこれらの標識された複合体からタンパク質を解離させ
、SDS-PAGEおよびウエスタンブロットで解析する。PrP以外の分子はN末端の配列
を決定し、それらのタンパク質をコードする分子クローンを同定する。
PrPC、PrPScおよびタンパク質X(単数または複数)の複合体を単離するため
のこの方法は、これら3つのタンパク質の三次元の複合体を検出することになる
という、際だった利点を持っている。PrPCまたはPrPScと、他のタンパク質との
複合体も、検出できる可能性がある。これは、PrPの複製に関するエクスビボ/
インビトロのアッセイ法を再構成するために、重要なことである。
実施例
以下の実施例は、当業者に対して、本発明の様々な構築物の作製および使用法
ならびに本発明の様々な方法の実施の仕方を完全に開示し記載することにより提
供されるよう列挙するものであり、本発明者らが本発明と見なすものの範囲を制
限するものではない。特に記載のない限り、成分は重量成分、温度は摂氏温度、
圧力は大気圧またはその近傍圧である。使用した数値に関しては正確を期するよ
う配慮したが(たとえば、DNA配列の長さ、分子量、分量、特定成分、その他)
、多少の偏差はある。
実施例1
エピトープで標識したPrP発現カセットの構築
FLAGで標識したPrP発現カセットを構築するために、シグナルペプチド配列の
上流の第22アミノ酸の位置に、制限酵素StuIの認識部位を新しく作成した(図
4)。StuI部位は、MoPrP遺伝子のオープンリーディングフレームの、開始部位
から核酸で第277番目の位置にあるKpnI部位までを含むサブクローンの、第5
7番目の位置の核酸を、TからAに変えることにより、作成した。これは、反応に
用いたプライマーの一つ(配列番号:13):5'-CCCTCCAGGCTTTGGCCGCTTCTTGCA
GAGGCCTACATCAGT-3'にミスマッチを含ませたPCRで仲介した、突然変異誘発法に
より作成した。相補的な42および47オリゴヌクレオチドの配列を合成し、ア
ニールさせた[(配列番号:5)(配列番号:6)]。この塩基配列は、8アミ
ノ酸のFLAG配列および成熟型PrPの近位部分の配列に続く、シグナルペプチドの
遠位部分およびシグナルペプチダーゼ切断部位を再構築した(図5)。このFLAG
標識の配列を、2つの異なるPrP発現カセットにサブクローニングした:トラン
スジェニックマウスを作成するためのFLAG-MoPrPカセットを産生するMoPrP、お
よび培養細胞で発現させるためのFLAG-MHM2PrPである。
実施例2
FLAG で標識したPrPを確実に発現させる、
およびそれは培養細胞ScN2AにおいてPrPScを産生する基質となる
FLAG-MHM2PrP発現カセットを、G418を含む培地中で細胞を増殖させてネオマイ
シン耐性のトランスフェクトされた細胞を直接選択できる、SPOX.II neoの発現
ベクター(Scottら、(1992)Protein Sci.1:986〜997)にクローニングした。マ
ウスの神経芽細胞腫の細胞N2Aにマウスのプリオンを持続感染させ(ScN2A細胞)
、6ウェルの培養プレートで増殖させた後、SPOXベースのFLAG-MHM2PrPまたは対
照のMHM2PrP構築物を、DOTAP仲介性の形質転換法(Boehringer Mannheim Bioch
emicals)でトランスフェクトし、G418を含む培地中で増殖させて、ネオマイシ
ン耐性へと形質転換させた。ネオマイシン耐性コロニーは、トランスフェクショ
ン後2週間程度で明確に検出され、それらのコロニーをプールして、継代した。
安定な培養株が樹立できた後、FLAG-MHM2PrPまたは対照のMHM2PrPの発現細胞
のいずれかから、NP-40界面活性剤を用いた溶解液を調整して、イムノブロット
による解析に用いた。実験によっては、培養液にPIPLCが含まれ、この処理によ
って細胞膜から切断されたPrPを、メタノール沈澱および遠心により、精製した
。
安定細胞株中に存在するプロテアーゼ耐性のFLAG-MHM2PrPまたはMHM2PrPは、
コンフルエントの100mm培養ディッシュから得られた細胞抽出液の1mlを、20μg
/mlの濃度のプロテイナーゼKで、37℃で1時間消化して、解析した。界面活性剤
に耐性で、プロテイナーゼK耐性のタンパク質を、40,000 x gで1時間遠心し、
沈渣を20μlの溶解緩衝液(150 mM NaCl、10 mM Tris,pH7.5、0.5% NP-40、0.5
% デオキシコール酸塩)に再懸濁し精製した。消化または未消化の細胞抽出液を
、等容量の2 x SDS-PAGE検体緩衝液に加え、SDS-PAGEで解析した。全てのケース
について、ハムスターのPrPScに対する抗PrPモノクローナル抗体3F4(Kascsakら
、(1987)J.Virol.61:3688〜3693)を用いて、イムノブロットを行った。
実施例3
FLAG で標識したPrPを発現するトランスジェニックマウス
FLAG-MoPrP ORF(オープンリーディングフレーム)発現カセットは、PrP ORF
の開始および終止コドンの各々に隣接する位置で切断する、SalIおよびXhoI部位
に
挟まれている。このため、容易にcos.SHaTet発現ベクター(Scottら、(1992)Pro
tein Sci.1:986〜997)にサブクローニングして、cos.SHaTet FLAG-MoPrPクロ
ーンを作成することができる。組換えコスミドクローンの単離およびスクリーニ
ングについては、すでに記載されている(Scottら、(1993)Cell 73:979〜988、
組換えコスミドクローンの単離およびスクリーニングに関する手順についての参
照として、特に本明細書に組み入れられる)。FLAG-MoPrP ORFから予想される塩
基配列を確認した後、大量のDNAを回収して得られたコスミドのNotI断片を、既
述のごとく、FVB/NまたはFVB/Prn p0/0マウスの受精卵前核に、マイクロインジ
ェクションした(Scottら、(1989)Cell 59:847〜857;Scottら、(1992)前記、ど
ちらも、トランスジェニック動物の作成手順に関する参照として、本明細書に特
に組み入れられる)。
5匹のトランスジェニックの始祖が作成された:FVBマウスで3匹、およびFVB
/Prn p0/0マウスで2匹である。離乳直後の動物の尾の組織から単離したゲノムD
NAについて、cosSHa.Tetベクター(Scottら、(1992)前記)に含まれるSHaPrP遺
伝子の3'非翻訳領域とハイブリダイズするプローブを用いて、取り込まれた導入
遺伝子が存在するかどうかをスクリーニングした。離乳直後のマウスから得たDN
Aのハイブリダイゼーション・シグナルを、標準のDNA検体と比較すると、一つの
ライン、Tg(FLAG-MoPrP)FVB/Abl 7755は、1細胞当たり約60コピー以上の数の導
入遺伝子を有すると推定された。ポリクローナル抗体RO73を用いて、段階希釈の
後イムノブロットを行うと、Tg(FLAG-MoPrP)FVB/Abl 7755系の脳抽出液における
FLAG-MoPrPの発現レベルは、野生型のMoPrP発現レベルと比べて、約100倍高かっ
た。
実施例4
Tg(FLAG-MoPrP) マウスはマウスプリオンの複製を支持する
Swissマウスに由来するRML株(Chandler(1961)Lancet 1:1378〜1379)は、
ロッキーマウンテンラボラトリー(Rocky Mountain Laboratory(Hamilton、MT
))にある閉鎖コロニーのSwissマウス、またはCharles River Laboratories(W
ilmington、MA)のSwiss CD-1マウスで継代した。27ゲージの注射針を用いて、
マウスの右側頭葉に30μlの脳抽出液を脳内接種した。接種後30日から、3日ご
とに、マウスの神経学的機能不全を検査した。中枢神経系の機能不全を示す臨床
症状が現
れた後は、毎日マウスを検査した。臨床診断を確定するため、明らかに死期の迫
った数匹の動物から脳を摘出し、組織病理学的に検討した。
動物を屠殺後直ちに脳を摘出し、10%の緩衝ホルマリンに浸して固定した。組
織をパラフィン包埋して厚さ8μmの組織切片を作成し、グリア原繊維酸性タンパ
ク質およびPrPについて、ヘマトキシリン・エオジン法、および過酸化酵素によ
る免疫組織化学法で、既述(DeArmondら、(1987)Neurology 37:1271〜1280;Sco
ttら、(1989)前記)に従い、染色した。PrPCまたはプロテアーゼ耐性のPrPの局
在を検討するための組織のブロットは、クリオスタットで作成した厚さ16mmの脳
の未固定の切片を、既述に従って(Taraboulos(1992)Proc.Natl.Acad.Sci
.89:7620〜7624)ニトロセルロース紙に圧着して作成した。PrPScの局在を検出
するために、組織のブロットを400μg/mlのプロテイナーゼKに37℃で18時間処理
してPrPCを除去し、3 Mのチオシアン酸グアニジンで処理して、残存するPrPScを
変性させた後、PrP特異的抗体RO73または抗FLAG M1モノクローナル抗体を用いて
免疫染色した。
実施例5
Tg(FLAG-MoPrP) マウスからのFLAG-MoPrPの免疫学的精製
接種されていないTg(FLAG-MoPrP)FVB/Abl 7755マウスの脳を、TBS/10 mM CaCl
中でホモジナイズし、NP-40界面活性剤を0.1%まで加えた。抗FLAG M1モノクロ
ーナル抗体を結合させたアガロース・ビーズからなる5 mlのカラム・ベッドに、
検体を乗せた。フロー・スルーを繰り返し乗せて、結合を最適にするようにした
。カラム・ベッドを15 mlのTBS/Caで3回洗浄した。結合したFLAG-MoPrPを、2 m
M EDTAを含むTBSを10分ごとに1 mlずつ8回乗せて溶出した。
実施例6
タンパク質の立体構造を判別するためのエピトープ標識の使用
エピトープをコードするDNA配列を様々な位置に含む組換えPrP遺伝子配列を作
成し、プリオン蛋白質の様々な位置にエピトープ標識を組み込んだ。PrPCの作動
モデルは、Huangら、(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91:7139〜7143.により提
唱された、四重螺旋束モデルである。エピトープは、プリオンが複製する際に構
造変化を起こすと考えられる、αヘリックス構造をとると推定される領域、また
は、αヘリックス同志を結合するループ領域に、組み込まれている。エピトープ
で標識した配列は、標準的な組換え技術を用いて作成する。宿主のPrP分子であ
るMHM2PrPは、モノクローナル抗体3F4が認識するハムスター由来のエピトープを
含んでいるため、3F4を用いて検出することができる(Kascsakら、(1987)J.Vir
ol.61:3688〜3693)。これらの組換えPrP構築物を、マウスプリオンが持続感染
しているScN2A細胞(Butlerら、(1988)J.Virol.62:1558〜1564)にトランスフ
ェクトする。異所的に発現した構築物は、3F4または異種由来のエピトープに対
する抗体で、検出する。PrPScは、プロテイナーゼKで消化後、3F4で検出される
。3F4を用いてPrPScを検出すると、特定部位にエピトープ標識が包含されていて
も、PrPCが構造変化を起こす妨げにはならないことがわかる。理想的には、エピ
トープ標識に対する抗体はPrPScのみを検出して、PrPCの立体構造では、エピト
ープが内部に埋もれて抗体が結合できず、PrPCを検出しないことが望ましい。理
想的なエピトープ標識の配置を決定した後、望ましい位置にエピトープで標識し
たPrPを発現するトランスジェニックマウスを作成し、プリオンを感染させる。
エピトープで標識したPrPScおよびPrPCを、標準的な技術を用いて、トランスジ
ェニックマウスの脳から単離する。円偏光二色性および赤外分光のような、解像
度の低い解析技術を用いて、抗エピトープ抗体で検出したPrPSc異性体がβシー
ト構造をもち、PrPC異性体がαヘリックス構造を持つことを確認する。
本発明は、最も実践的かつ好ましい態様と考えられる形で、本明細書中に示し
、既述されている。しかしながら、それを基に変更を行うことが可能であり、そ
うした変更は本発明の範囲内であり、当業者は本開示を読むことにより改変を想
起することが、認識される。
【手続補正書】
【提出日】1998年11月13日
【補正内容】
請求の範囲
1.エピトープ領域をコードする異種性配列を含む、第一および第二の三次元 構造を有するタンパク質をコードする核酸配列を有する、組換え核酸構築物であ って、 該エピトープ領域が、該タンパク質が第二の三次元構造をとる場合と比べて、 第一の三次元構造をとる場合により暴露されるよう、該タンパク質のアミノ酸の 配列において、特異的に配置されている、組換え核酸構築物。 2.核酸配列が、天然、合成、または化学的PrPタンパク質をコードしている 、請求項1記載の構築物。 3.第二の核酸配列が、FLAG、Strep、ポリ-ヒスチジン、モノクローナル抗体 9E10で認識されるヒトc-mycペプチド、モノクローナル抗体12CA5で認識されるペ 赤血球凝集素ペプチド、およびGlu-Glu-Pheからなる群より選択されるエピトー プ領域をコードしている、請求項1または2記載の構築物。
4.FLAGペプチドが、Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(配列番号:1)ま
たはAsp-Tyr-Lys-Asp-Glu-Asp-Asp-Lys(配列番号:2)の配列を有し、
Strepペプチドが、Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(配列番号:3)の
配列を有し、
ポリ-ヒスチジンペプチドが、His-His-His-His-His-His(配列番号:4)の配
列を有し、
c-mycペプチドが、Glu-Gln-Lys-Leu-Leu-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu-Asn(配列番号
:12)の配列を有し、
赤血球凝集素ペプチドが、Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala-Ile-Glu-Gl
y-Arg(配列番号:11)の配列を有する、請求項3記載の構築物。
5.請求項1〜4のいずれか一項記載の組換え核酸構築物を含むゲノムを有す る、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
6.その核酸構築物がPrPタンパク質をコードしており、マウスである請求項
5記載のトランスジェニック哺乳動物であって、該マウスが、ヒト、ウシ、およ
びヒツジからなる群より選択される哺乳動物に感染するプリオンを接種されてか
ら200日以内にプリオン疾患の症状を呈する、トランスジェニック哺乳動物。
7.以下の段階を含む、第一および第二の立体構造を有するタンパク質の立体
構造を判別するための方法:
(a)請求頂1〜4のいずれか一項記載の構築物でトランスフェクトさせた細 胞または生体を提供する段階、 (b)該構築物を発現させて該構築物にコードされるエピトープ標識タンパク 質を産生させる段階、および
(c)該タンパク質の表面に該エピトープが存在するか否かを検出することに
より、該第一および第二の立体構造を判別する段階。
8.タンパク質がエピトープ標識PrPであり、該エピトープがPrPCの表面には
暴露されずPrPScの表面には暴露されるものである、請求項7記載の方法。
9.以下の段階を含む、感染性プリオン物質を検出するためのアッセイ法:
(a)PrPタンパク質をコードする組換え核酸配列を有するトランスジェニック 非ヒト動物を提供する段階であって、該核酸配列がエピトープ領域をコードする 異種性配列を含むものであり、該エピトープが、PrPタンパク質のアミノ酸の配 列において、該PrPタンパク質がPrPC構造をとる場合と比較してPrPSc構造をとる 場合により暴露されるよう、特異的に配置されている、段階;
(b)プリオンタンパク質を含む物質を、該トランスジェニック動物に接種す
る段階;および
(c)エピトープ標識PrPScタンパク質が存在するか否かを検出する段階。
10.PrPタンパク質がウシ/マウスのキメラタンパク質であり、かつ接種さ
れる物質がウシ由来であるか、
PrPタンパク質がヒト/マウスのキメラタンパク質であり、かつ接種される物
質がヒト由来であるか、または
PrPタンパク質がヒツジ/マウスのキメラタンパク質であり、かつ接種される
物質がヒツジ由来である、請求項9記載のアッセイ法。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L
U,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF
,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,
SN,TD,TG),AP(GH,KE,LS,MW,S
D,SZ,UG),UA(AM,AZ,BY,KG,KZ
,MD,RU,TJ,TM),AL,AM,AT,AU
,AZ,BA,BB,BG,BR,BY,CA,CH,
CN,CU,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,G
B,GE,HU,IL,IS,JP,KE,KG,KP
,KR,KZ,LC,LK,LR,LS,LT,LU,
LV,MD,MG,MK,MN,MW,MX,NO,N
Z,PL,PT,RO,RU,SD,SE,SG,SI
,SK,TJ,TM,TR,TT,UA,UG,UZ,
VN,YU
(72)発明者 コヘン フレッド イー.
アメリカ合衆国 カリフォルニア州 サン
フランシスコ ロード アイランド スト
リート 767
(72)発明者 スコット マイケル アール.
アメリカ合衆国 カリフォルニア州 サン
フランシスコ クライトン ストリート
1200 #9
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.生物学的活性を有するタンパク質断片のアミノ酸配列をコードする第1の核 酸配列と、異種性のエピトープ領域をコードする第2の核酸配列とを含む、組換 え核酸構築物。 2.タンパク質が二つの異なる三次元構造を有し、エピトープ領域が、第二の立 体構造に比べて第一の立体構造の場合により暴露されるよう、該タンパク質に対 して空間的に配置され、かつ 異種性のエピトープ領域が、FLAG、Strep、ポリヒスチジン、モノクローナル 抗体9E10で認識されるヒトc-mycペプチド、モノクローナル抗体12CA5で認識され る血球凝集素ペプチド、およびGlu-Glu-Pheからなるペプチド群より選択される ペプチドである、請求項2記載の構築物。 3.タンパク質が、天然、合成またはキメラのPrP分子である、請求項3記載の 構築物。 4.FLAGペプチドが、Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(配列番号:1)また はAsp-Tyr-Lys-Asp-Glu-Asp-Asp-Lys(配列番号:2)の配列を有し、 Strepペプチドが、Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(配列番号:3)の 配列を有し、 ポリヒスチジンペプチドが、His-His-His-His-His-His(配列番号:4)の配 列を有し、 c-mycペプチドが、(Glu-Gln-Lys-Leu-Leu-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu-Asn)(配列 番号:12)の配列を有し、 赤血球凝集素ペプチドが、Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala-Ile-Glu-Gl y-Arg(配列番号:11)の配列を有する、請求項2記載の構築物。 5.生物学的活性を有するタンパク質断片のアミノ酸配列をコードする第1の核 酸配列と異種性のエピトープ領域をコードする第2の核酸配列とを含む組換え核 酸構築物を含むゲノムを有する、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。 6.第1の核酸配列がPrPタンパク質をコードし、哺乳動物がマウスであり、か つ該マウスが、通常はヒト、ウシおよびヒツジからなる群より選択される哺乳動 物にのみ感染するプリオンを接種後200日以内で、プリオン病の症状を示す、請 求項5記載のトランスジェニック哺乳動物。 7.以下の段階を含む、第1および第2の立体構造を有するタンパク質の立体構 造を判別するための方法: a) 生物学的活性を有するタンパク質断片および異種性のエピトープ領域を含 むアミノ酸配列をコードする核酸配列を有する組換え核酸構築物を作成する段階 、 b) a)の構築物を、細胞または生体にトランスフェクトさせる段階、 c) 該構築物を発現させてエピトープ標識されたタンパク質を産生させる段階 であって、該エピトープが、第一の立体構造を有するタンパク質の表面には暴露 されず、第二の立体構造を有するタンパク質の表面には暴露される段階、ならび に d) 該タンパク質の表面に該エピトープが存在するか否かを検出することによ り、該第1の立体構造と第2の立体構造とを判別する段階。 8.タンパク質が、エピトープで標識したPrPであり、かつ該エピトープが、PrPC の表面には暴露されず、PrPScの表面には暴露される、請求項7記載の方法。 9.以下の段階を含む、感染性のプリオン素材を検出するためのアッセイ法: a) エピトープで標識したPrPタンパク質を含むアミノ酸配列をコードする導 入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック動物を作成する段階、 b) 該トランスジェニック動物に、プリオン蛋白質を含む検体を接種する段階 、および c) エピトープで標識したPrPScが存在するか否かを検出する段階。 10.PrPタンパク質がウシ/マウスのキメラタンパク質であり、接種する検体が ウシ由来のものであるか;または PrPタンパク質がヒト/マウスのキメラタンパク質であり、接種する検体がヒ ト由来のものであるか;または PrPタンパク質がヒツジ/マウスのキメラタンパク質であり、接種する検体が ヒツジ由来のものである、請求項9記載のアッセイ法。
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