JPH11509090A

JPH11509090A - イオンチャンネル

Info

Publication number: JPH11509090A
Application number: JP9504235A
Authority: JP
Inventors: ウッド，ジョン・ニコラス; アコピアン，アーメン・ノラコビッチ
Original assignee: ユニバーシティ・カレッジ・ロンドン
Priority date: 1995-06-28
Filing date: 1996-06-25
Publication date: 1999-08-17
Also published as: EP1281717A3; DE69626984D1; ATE235512T1; AU721798B2; US20050221394A1; US6451554B1; ES2196158T3; AU6234596A; DK0835261T3; PT835261E; EP0835261B1; US20030176648A1; US7112418B2; EP0835261A1; DE69626984T2; CA2221294A1; WO1997001577A1; GB9513180D0; EP1281717A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、哺乳動物感覚ニューロンに特異的に局在する、新規な１９５７アミノ酸のテトロドトキシン非感受性電圧ゲート化ナトリウムチャンネルに関する。この新規なナトリウムチャンネルをコードする核酸配列、ベクター、宿主細胞並びに苦痛の治療に使用するためのこの新規なナトリウムチャンネルの調節物質の同定方法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】イオンチャンネル電圧ゲート化（voltage-gated）ナトリウムチャンネルは、ナトリウム浸透性を高める膜通過タンパク質である。形質膜の脱分極により、ナトリウムチャンネルが開き、ナトリウムイオンが作用ポテンシャルを生み出す電気化学勾配に沿って入ってくることが可能になる。電圧ゲート化ナトリウムチャンネルは全ての電気的被刺激性細胞によって発現されており、作用ポテンシャル普及において本質的役割を担う。それらは、４個のドメイン（Ｄ１−Ｄ４）に分けられる約２０００アミノ酸の主要サブユニットを含み、その各々は６個の膜上通過領域（Ｓ１−Ｓ６）を含む。アルファサブユニットは通常、チャンネルのゲート動力学に影響する２個のより小さいサブユニット（ベータ−１及びベータ−２）に付随している。これらのチャンネルは顕著なイオン選択性を示し、他の一価または二価のカチオンに対する浸透性はほとんど有さない。パッチ−クランプ研究により、脱分極が約２０ｐＳの典型的コンダクタンスで活性化を導き、これは１０⁷イオン／秒／チャンネルの速度でのイオン移動を反映していることが示された。チャンネルはミリ秒以内に不活性化する（Caterall，W.A.，Physiol．Rev．72，S4-S47(1992); Omri 他、J．Membrane B iol 115，13-29; Hille，B，Ionic Channels in Excitable Membranes，Sinauer ，Sunderland，MA(1991)）。ナトリウムチャンネルは、ナトリウムチャンネル上の別個の部位に結合する毒素を使用して薬理学的に解明されている。ヘテロ環式グアニジンに基づいたチャンネルブロッカーであるテトロドトキシン（ＴＴＸ）及びサキシトキシン（ＳＴＸ）はＳ５−Ｓ６ループ中の部位に結合する一方、μ−コノトキシンは隣接するオーバーラップ領域に結合する。他の部位に結合するイソギンチャク及びサソリ由来の多数の毒素は、活性化又は不活性化の電圧依存性を変化させる。ナノモル濃度のテトロドトキシンでブロックされる電圧ゲート化ナトリウムチャンネルが、テトロドトキシン感受性ナトリウムチャンネルとして既知である一方 (Hille（1991）"Ionic Channels in Excitable Membranes"，Sinauer Sunderlan d，MA(1991))、１マイクロモル以上の濃度でブロックされるナトリウムチャンネルが、テトロドトキシン非感受性（ＴＴＸｉ）ナトリウムチャンネルとして既知である（Pearce及びDuchen Neuroscience 63，1041-1056(1994)）。背根神経節（ＤＲＧ）ニューロンは、ＴＴＸに対する動力学および感受性で相違する少なくとも３種類のナトリウムチャンネルを発現する。小さい直径の細胞体と非ミエリン化軸索（Ｃ−繊維）とを有するニューロンは、大部分の侵害受容体（nociceptor）（損傷−センシング）集団を含み、速いＴＴＸ感受性電流とより遅いＴＴＸ非感受性電流を発現する。背根神経節に存在することが知られている５個のクローン化されたナトリウムチャンネルαサブユニット転写物の内、どれもがＴＴＸ非感受性チャンネルの特性を示さない。ナトリウムチャンネルブロッカーは、苦痛緩和を提供するために臨床的に使用される。通常の臨床用途における３種類のナトリウムチャンネルブロッカーは、リドカインなどの局所麻酔剤；フェニトイン及びカルバマゼピン等のある種の抗痙攣剤、並びにメキシレチン等のある種の抗不整脈剤である。これらの各々は実験上の調製物において異所性末梢神経系の放電を抑制し、広範囲の臨床的神経病状の緩和を提供することが知られている。本出願人は、感覚ニューロン（又はニューロン）に存在するが、グリア、筋肉、あるいは交感神経系、副交感神経系、腸神経系または中枢神経系のニューロンには存在しない、新規な電圧ゲート化ナトリウムチャンネル（本明細書中以下においては、感覚ニューロンに特異的に局在するナトリウムチャンネルと称するか、またはＳＮＳナトリウムチャンネルとも称する）を今回見出した。好ましくは、本発明のナトリウムチャンネルは、背根神経節（ＤＲＧ）または頭蓋神経節のニューロンに見出される。より好ましくは、本発明のナトリウムチャンネルは、背根神経節のニューロンに見出される。好ましくは、ナトリウムチャンネルはラット感覚ニューロンまたはヒト感覚ニューロンに特異的に局在する。中枢神経系への幾つかの有害な入力はＴＴＸに対して非感受性であることが知られているので、本発明のナトリウムチャンネルは、侵害受容性伝達で役割を担うと考えられる。末梢の侵害受容体の持続的な活性化は慢性痛の確立に付随する背角での興奮性の変化を生じさせることが判明した。増加したナトリウムチャンネル活性はまた、ニューロマ誘導自発作用ポテンシャル生成の基礎になることも判明した。逆に言えば、慢性痛は、末梢神経活性化をブロックする外科的または薬理学的処理により成功的に治療できるかもしれない。従って、たとえ中枢神経系の適応性が慢性痛の確立において中枢的役割を担うとしても、侵害受容体入力のブロックは有用な治療効果を産むかもしれない。かくして、感覚ニューロン特異的電圧ゲート化ナトリウムチャンネル、特には本発明のナトリウムチャンネル等の侵害受容性な様式を有するサブタイプのものは、一定範囲の苦痛状態の治療的介在のための標的を提供する。発現したＳＮＳナトリウムチャンネルの電気生理的および薬理学的特性は、小直径感覚ニューロンテトロドトキシン耐性ナトリウムチャンネルにつき記載したものと同様である。脊髄への幾つかの有害な入力はテトロドトキシンに対して耐性であるので、そのようなＣ−繊維制限されたナトリウムチャンネルの機能の発現のブロックは選択的無痛性作用を有するかもしれない。もう一つ別の側面において、本発明は、ブタベスト条約に従って１９９５年６月２７日に23 St Machar Drive，Aberdeen AB2 1RY，スコットランド、英国のナショナル・コレクションズ・オブ・インダストリアル・アンド・マリンバクテリアに寄託された、ＮＣＩＭＢ受託番号４０７４４で寄託されたインサートによってコードされるラット感覚ニューロン中に特異的に局在するナトリウムチャンネルを含む単離タンパク質を提供する。本発明はまた、ＳＮＳナトリウムチャンネルをコードするヌクレオチド配列を提供する。好ましい態様では、ヌクレオチド配列は図１ａに記載するようなラット感覚ニューロン中に特異的に局在するナトリウムチャンネルまたはその相補鎖をコードする。本発明の新規なナトリウムチャンネルをコードするラット背根神経節中において選択的に発現した約６．５キロベース（ｋＢ）の転写物は、既知の電圧ゲート化ナトリウムチャンネルと配列類似性を示す。そのｃＤＮＡは１，９５７アミノ酸タンパク質をコードする。特に、本発明の新規なナトリウムチャンネルはラット心臓テトロドトキシン非感受性（ＴＴＸｉ）ナトリウムチャンネルとアミノ酸レベルで６５％の同一性を示す。ＴＴＸ感受性ナトリウムチャンネルのチャンネル中央部分に対するＴＴＸの高親和性結合に関与する芳香族残基は、ＳＮＳナトリウムチャンネルの推定タンパク質では親水性セリンに変化している一方、ナトリウム選択的浸透性に関係がある残基は保存されている。感覚ニューロンに特異的に局在する新規なナトリウムチャンネルはＴＴＸに対して相対的非感受性を示し（ＩＣ５０＞１マイクロモル）、従って背根神経節に存在することが知られている他のクローン化されたナトリウムチャンネル転写物とは異なる特性を示す。本発明はまた、本明細書中上記定義したヌクレオチド配列を含む発現およびクローニングベクターを提供する。形質転換を行うために、所望のコード配列と調節配列とを作動可能な連結で含む（その結果、これらの配列で形質転換した宿主はコードされたタンパク質を産生することができる）ＤＮＡ配列はベクター中に含まれていてもよいが、関連ＤＮＡはまた宿主染色体中に組み込まれていてもよい。本発明はまた、感覚ニューロン中に特異的に局在するナトリウムチャンネルの調節物質のスクリーニングアッセイであって、ＳＮＳナトリウムチャンネルを発現する細胞に潜在的な調節物質を添加し、ナトリウムチャンネルの活性の何らかの変化を検出することを含むアッセイを提供する。本発明はまた、本明細書中上記定義したスクリーニングアッセイにおいて活性を有する調節物質を提供する。本明細書中上記定義したナトリウムチャンネルの調節物質は苦痛の感覚を調節するのに有用である。ナトリウムチャンネルのブロッカーは感覚ニューロンに沿ったインパルスの伝達をブロックまたは阻害し、それによって急性、慢性または神経性の痛みの治療において有用である。本発明は従って、感覚ニューロンに特異的な新規な電圧ゲート化ナトリウムチャンネルタンパク質、これらのナトリウムチャンネルタンパク質をコードすることができるヌクレオチド配列、本発明のナトリウムチャンネルをコードするヌクレオチド配列を含むベクター、これらのベクターを含む宿主細胞、ナトリウムチャンネルをコードする核酸配列で形質転換された細胞、ナトリウムチャンネルタンパク質および／または宿主細胞を使用するスクリーニングアッセイ、ナトリウムチャンネルタンパク質をコードすることができるＤＮＡ配列の相補鎖、並びにナトリウムチャンネルタンパク質に特異的な抗体に関する。本発明のこれら並びに他の側面は以下の詳細な説明中において記載する。図面の簡単な説明：図１ａは、ラットＤＲＧに特異的ナトリウムチャンネル（ＳＮＳ−Ｂ）の核酸およびアミノ酸配列を示す（配列番号１および配列番号２）。図１ｂは、ｐＧＥＭ−３Ｚ中のＳＮＳ−Ｂ電圧ゲート化ナトリウムチャンネルの構造を示す。図１ｃは、既知の電圧ゲート化ナトリウムチャンネルの模式図を示す。図２は、ヒトクローンプローブの単離のためのＰＣＲプライマーの例の配列を示す。ＲＬＬＲＶＦＫＬＡＫＳＷＰＴＬ配列番号２１；５’gcttgctgcgggtctt caagc ３’配列番号２２；ＬＲＡＬＰＬＲＡＬＳＲＦＥＧ配列番号２３；５’ atcgagacagagcccgcagcg ３’配列番号２４；５’acgggtgccgcaaggacggcgtctccgt gtggaacggcgagaag３’配列番号２５；および５’ggctatccttcctcttccagctctcacc caggtatggagccaggt ３’配列番号２６。図３は、結合した転写／翻訳系での³⁵Ｓ放射標識したＳＮＳ−Ｂ電圧ゲート化ナトリウムチャンネルタンパク質のフィルムを示す。図４ａおよび図４ｂは、抗体産生のためのＳＮＳ−ＧＳＴ融合タンパク質構築物を示す。TCCCGTACGCTGCAGCTCTTT 配列番号２７；CCCGGGGAAGGCTAC 配列番号２８；GTCGACACCAGAAAT 配列番号２９；GGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGAAGGAA 配列番号３０。本発明の一つの側面によれば、感覚ニューロンに特異的に局在する哺乳動物ナトリウムチャンネルをコードする核酸配列またはその相補鎖を含む、単離および／または精製された核酸配列（またはポリヌクレオチドまたはヌクレオチド配列）が提供される。好ましくは、核酸配列は哺乳動物背根神経節中に特異的に局在するナトリウムチャンネルをコードする。より好ましくは、核酸配列は背根神経節中に特異的に局在するラットまたはヒトのナトリウムチャンネルをコードする。ラットの核酸配列は好ましくは、図１ａに示す核酸配列（配列番号１）のコード部分あるいはブタベスト条約に従って１９９５年６月２７日に23 St Machar D ri ve，Aberdeen AB2 1RY，スコットランド、英国のナショナル・コレクションズ・オブ・インダストリアル・アンド・マリンバクテリアに寄託された、ＮＣＩＭＢ受託番号４０７４４で寄託されたｃＤＮＡのコード部分の配列を含む。本発明のナトリウムチャンネルをコードする核酸配列は、哺乳動物感覚ニューロン、好ましくは背根神経節、三叉神経神経節または他の頭蓋神経節、より好ましくはラットまたはヒトの背根神経節に由来するｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。本明細書中に記載したヌクレオチド配列は、ラットの背根神経節細胞に由来するｃＤＮＡライブラリーから単離された。ＳＮＳナトリウムチャンネルをコードする核酸配列は、１，９５７アミノ酸タンパク質をコードする５，８７１ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを有する。本発明のナトリウムチャンネルをコードする核酸配列はまた、哺乳動物のゲノミックライブラリー、好ましくはヒトまたはラットのゲノミックライブラリーから得ることもできる。核酸配列は、実施例に記載したサブトラクションハイブリダイゼーション法によって、ラットのナトリウムチャンネル配列に由来するプローブでスクリーニングすることによって、あるいはラットのナトリウムチャンネル配列および／または既知の電圧ゲート化ナトリウムチャンネルの比較的保存された領域に由来する適当なプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの当分野で既知の他の方法によって、単離することができる。本発明の核酸配列は、ＲＮＡの形態でもＤＮＡの形態でもよく、ＤＮＡにはｃＤＮＡ、ゲノミックＤＮＡ、および合成ＤＮＡが含まれる。ＤＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖はコード鎖でも非コード（アンチセンス）鎖でもよい。ラットＳＮＳナトリウムチャンネルまたはその変異体をコードするコード配列は本明細書中に記載したコード配列または寄託されたクローンの配列と同一でもよく、または異なるコード配列でもよく、このコード配列は、遺伝コードの重剰性または縮重の結果として、本明細書中に記載した配列または寄託されたｃＤＮＡと同一のタンパク質をコードする。ＳＮＳナトリウムチャンネルをコードする核酸配列は以下のものを含むことができる；全長タンパク質またはその任意の変異体のコード配列のみ；全長タンパク質またはその任意の変異体のコード配列並びにリーダーまたは分泌配列またはプロタンパク質配列などの追加のコード配列；全長タンパク質またはその任意の変異体のコード配列（および所望により追加のコード配列）および、イントロンまたは全長タンパク質のコード配列の非コード配列５’および／または３’などの非コード配列。本発明はさらに、ＳＮＳナトリウムチャンネルのフラグメント、アナログ、誘導体およびスプライス変異体をコードする本明細書中上記した核酸配列の変異体に関する。ＳＮＳナトリウムチャンネルの変異体はＳＮＳナトリウムチャンネルの天然のアレル(allelic)変異体でもよい。当分野で既知のように、アレル変異体は、コードされるタンパク質の機能を実質的には変化させない、１またはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有するタンパク質配列の代替型である。本発明は、生理的に生じて、ナトリウムチャンネルの活性化閾値の変化において役割を担うかもしれない、ＳＮＳナトリウムチャンネルのスプライス変異体に関する。ラットＳＮＳナトリウムチャンネルをコードする配列の変異体は同定されており、以下に記載する：１）配列番号３に示す２５７３塩基対の核酸配列。この配列は図１ａ（配列番号１）のアミノ酸１４３７−１９５７に対応する５２１アミノ酸タンパク質をコードし、コード部分および３’非翻訳領域で図１ａの塩基４５１２〜６５２４と同一の配列を有する。２）配列番号５に示す７０５２塩基対の核酸配列。配列番号６は、図１ａまたは配列番号２のアミノ酸５８５の後に挿入された１７６アミノ酸反復（配列番号６のアミノ酸５８６−７６０）を含む２１３２アミノ酸タンパク質をコードする。ラットＳＮＳナトリウムチャンネルの好ましい配列は図１ａ（配列番号１）に示す。しかし、配列決定の変動が注目される。配列決定は以下を提供した。以下の変更：塩基１０９２ＧからＡ、塩基１０９６ＣからＴ、塩基２９８６ＧからＴ、塩基３５２５ＣからＧおよび塩基３５５６ＧからＴを有する以外は、図１ａまたは配列番号１の塩基１−６３２１と同一の塩基配列を有する１９５７アミノ酸タンパク質をコードする６，３２１塩基対の核酸配列。３’末端に追加の３塩基ＡＡＡを有し、以下の変更；塩基２９９ＣからＧ、塩基１０９２ＧからＡ、塩基１０９６ＣからＴ、塩基１９６４ＧからＣ、塩基１９６５ＣからＧ、塩基２４７２ＡからＴ、塩基２９８６ＧからＴ、塩基３０１９ＡからＧ、塩基３１５８ＣからＴ、塩基３５２５ＣからＧ、塩基３５５６ＧからＣおよび塩基５８９３ＴからＧを有する以外は、図１ａ（配列番号１）の塩基１− ６５２４と同一の塩基配列を有する、配列番号７に示した１９５７アミノ酸タンパク質をコードする６，５２７塩基対の核酸配列。配列番号７の配列はまた、ラットＳＮＳナトリウムチャンネルをコードする好ましい配列である。以下の塩基の変更；塩基１０９２ＧからＡ（その結果、配列番号２のアミノ酸２９７がＶａｌからＩｌｅに変化する）、塩基１０９６ＣからＴ（その結果、アミノ酸２９８がＳｅｒからＰｈｅに変化する）、塩基１４９８ＣからＡ（その結果、アミノ酸４３２がＡｌａからＧｌｕに変化する）、および塩基２９８６ＧからＴ（その結果、アミノ酸９２８がＳｅｒからＩｌｅに変化する）を有する以外は、図１ａ（配列番号１）と同一の塩基配列を有する６５２４塩基対の核酸配列。配列の可変性は異なる単離物で同定された。一つのそのような配列が同定されたが、それは８個の塩基の相違以外は直上に示した３番目の配列決定変動の配列を有し、その内５個は変更したアミノ酸配列Ｆ１６−Ｓ１６、Ｌ３９３−Ｐ３９３、Ｔ４７０−１４７０、Ｒ２７８−Ｈ２７８、および１１８７６−Ｍ１８７６を生じた。本発明はまた、本発明の核酸配列またはその一部から構築された核酸プローブに関する。そのようなプローブを利用して、背根神経節ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、本発明のナトリウムチャンネルをコードする核酸配列を単離することができるであろう。核酸プローブは、本明細書に記載したin situハイブリダイゼーションアッセイなどのような、ＳＮＳナトリウムチャンネルの発現を検出したり染色体上におけるその存在を局在化するためのアッセイで使用するための、ｍＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズさせるために有用な、ＳＮＳナトリウムチャンネルまたはその変異体の核酸配列の一部を含むことができる。保存的アナログは、ナトリウムチャンネルの実質的に同一の生物的特性を保持するが、１またはそれ以上の保存的アミノ酸置換によって配列が相違しているタンパク質配列である。この文書の目的のためには、保存的アミノ酸置換とは、天然で生じる可能性が偶然生じるその置換の可能性よりも１０倍以上大きい置換である（Dayhoff 他、Atlas of Proteins Sequence and Structure，1971，95-96 頁、及び図９−１０に記載されたコンピューター法により定義される通り）。スプライス変異体は、コード領域内に付加または欠失を含む、ｍＲＮＡの選択的スプライシングによって生成した、同一遺伝子のタンパク質産物である（Lewi n B.（1995）Genes V Oxford University Press，Oxford，England）。本発明の核酸配列はまた、ヘキサ−ヒスチジンタグまたは赤血球凝集素（ＨＡ）タグなどの本発明のタンパク質の精製を可能にするマーカー配列にフレームで融合したコード配列を有してもよい。本発明はさらに、配列間に少なくとも５０％、好ましくは７０％の同一性が存在する場合には、本明細書中上記した配列とハイブリダイズする核酸配列に関する。本発明は特には、ストリンジェント条件下で本明細書中上記した核酸配列にハイブリダイズする核酸配列に関する。本明細書中で使用する場合、「ストリンジェント条件」とは、配列間に少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％の同一性が存在する場合にのみハイブリダイゼーションが生じることを意味し、好ましくは、本明細書中上記した核酸配列にハイブリダイズする核酸配列は、ＳＮＳナトリウムチャンネルと実質的に同一の生物的機能または活性を保持するタンパク質をコードするが、異なる特性を有する核酸配列も本発明の範囲内である。そのような配列は、上記した核酸配列とハイブリダイズする一方、例えばテトロドトキシンに対する感受性などの異なる特性を有するタンパク質をコードしてもよく、その性質は本明細書中に記載した変化したＳＮＳナトリウムチャンネルタンパク質において見出される。本発明のもう一つ別の側面によれば、精製された哺乳動物感覚ニューロンナトリウムチャンネルタンパク質が提供され、このナトリウムチャンネルはテトロドトキシンに対して非感受性である。好ましくは、本発明のナトリウムチャンネルは背根神経節または頭蓋神経節のニューロン、より好ましくは背根神経節のニューロンに見出される。ナトリウムチャンネルタンパク質は任意の哺乳動物種から由来することができるが、好ましくはラットまたはヒトのナトリウムチャンネルタンパク質である。ラットＳＮＳナトリウムチャンネルタンパク質は好ましくは、図１ａ（配列番号２）または配列番号８に示す推定アミノ酸配列、あるいは寄託されたｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を有する。感覚ニューロン中に特異的に局在するナトリウムチャンネルのフラグメント、アナログ、誘導体、およびスプライス変異体も本発明の範囲内である。「フラグメント」、「誘導体」、および「アナログ」という用語は、本発明のＤＲＧナトリウムチャンネルに関して引用する場合、そのようなタンパク質と実質的に同一の生物的機能または活性を保持するタンパク質のことを意味する。即ち、アナログには、プロタンパク質部分の切断によって活性化されて活性な成熟タンパク質を産生することができるプロタンパク質が含まれる。さらに、本発明にはまた、テトロドトキシンに対して感受性である誘導体を含む、タンパク質の生物的機能または活性が有意に変更した誘導体が含まれる。本発明のタンパク質は、組み換えタンパク質、天然タンパク質または合成タンパク質でもよく、好ましくは組み換えタンパク質である。ＳＮＳナトリウムチャンネルタンパク質のフラグメント、誘導体またはアナログには以下のものが含まれるがこれに限定されない：（ｉ）アミノ酸残基の１またはそれ以上が保存または非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換されており、そのような置換されたアミノ酸残基は遺伝コードによってコードされたものまたはコードされないものでもよいもの、あるいは（ii）アミノ酸残基の１またはそれ以上が置換された基を含むもの、あるいは（iii）成熟ポリペプチドがタンパク質の半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）などの別の化合物に融合しているもの、あるいは（iv）リーダー若しくは分泌配列または成熟タンパク質の精製のために使用する配列またはプロタンパク質配列などの、付加的アミノ酸が成熟タンパク質に融合しているもの、あるいは（ｖ）１またはそれ以上のアミノ酸が欠失してタンパク質が全長タンパク質より短いもの。ラットＳＮＳナトリウムチャンネルの変異体は上記されており、配列番号４および配列番号６に示される。本発明のタンパク質および核酸配列は好ましくは単離された形態で提供され、そして好ましくは少なくとも５０％の純度、より好ましくは約７５％の純度、最も好ましくは約９０％の純度まで精製される。「単離」および／または「精製」という用語は、物質が元の環境（例えば、それが天然由来のものであれば、天然環境）から除かれることを意味する。例えば、生きた動物に存在する天然由来の核酸配列またはタンパク質は単離または精製されていないが、天然系に同時に存在する物質の一部または全部から分離された同一の核酸配列またはＤＮＡまたはタンパク質は単離または精製されている。そのような核酸配列はベクターの一部になり得るであろうし、および／またはそのような核酸配列またはタンパク質は組成物の一部になり得るであろうし、そのようなベクターまたは組成物がその天然環境の一部ではないという点で単離または精製されていると言える。本発明はまた、本発明の核酸配列を含むベクター、並びに本発明の核酸で形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞を提供する。本発明の核酸配列は組み換え技術によってＳＮＳナトリウムチャンネルタンパク質またはその変異体を産生するために使用することができる。即ち、例えば、核酸配列を、多様な発現ビヒクルまたはクローニングビヒクル、特にはタンパク質を発現するためのベクターまたはプラスミドのいずれか１つに含ませることができる。そのようなベクターには、染色体、非染色体および合成のＤＮＡ配列が含まれる。好適なベクターの例には、ＳＶ４０の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージＤＮＡの組み合わせに由来するベクター、ウイルスＤＮＡ、例えば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびバキュロウイルスが含まれる。しかし、宿主中で複製可能で生存可能である限り、任意の他のプラスミドまたはベクターを使用することができる。さらに詳細には、本発明はまた、上記で広く記載した核酸配列の１またはそれ以上を含む組み換え構築物を提供する。構築物は、発現ベクター、例えばプラスミドまたはウイルスベクターを含み、その中に本発明の配列が前方方向または逆方向に挿入されている。この実施態様の好ましい側面では、構築物はさらに、配列に作動可能的に連結した、例えばプロモーターを含む、１以上の調節配列を含む。多数の好適なベクターおよびプロモーターが当業者に公知であり、商業上入手可能である。以下のベクターを例示として示す。細菌：ｐＱＥ７０，ｐＱＥ６０，ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）ｐＢＳ，ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ，ｐｓｉＸ１７４，ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ，ｐＢｓＫＳ，ｐＮＨ８ａ，ｐＮＨ１６ａ，ｐＮＨ１８ａ，ｐＮＨ４６１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＴｒｃ９９Ａ，ｐＫＫ２２３−３，ｐＫＫ２３３−３，ｐＤＲ５４０，ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、真核生物：ｐＷＬｎｅｏ，ｐＳＶ２ｃａｔ，ｐＯＧ４４，ｐＸＴ１，ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ），ｐＳＶＫ３，ｐＢＰＶ，ｐＭＳＧ，ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ），ｐＥＥ１４（ＷＯ８７／０４４６２）およびｐＲＥＰ８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。好ましいベクターには、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＥＥ１４およびｐＲＥＰ８が含まれる。しかし、宿主中で複製可能であり生存可能である限り、他の任意のプラスミドまたはベクターを使用することができる。本明細書中上記した通り、好適なＤＮＡ配列を多様な方法でベクター中に挿入することができる。一般的には、ＤＮＡ配列を当分野で公知の方法で好適な制限エンドヌクレアーゼ部位中に挿入する。そのような方法および他の方法は当業者の範囲内のものであると認められる。発現ベクター中のＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成を指令するための好適な発現調節配列（単数または複数）（プロモーター）に作動的に連結している。そのようなプロモーターの代表的例としては、ＬＴＲ又はＳＶ４０プロモーターおよび原核細胞又は真核細胞またはそれらのウイルス中において遺伝子の発現を調節することが知られている他のプロモーターが挙げられる。発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位と転写ターミネーターとを含むことができる。ベクターはまた発現を増幅するための好適な配列を含むことができる。プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクター又は選択マーカーを有する他のベクターを使用して任意の所望の遺伝子から選択することができる。２種の好適なベクターはｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。特定の名称を有する細菌プロモーターとしては、ＬａｃＩ、ＬａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰ_R、Ｐ_Lおよびｔｒｐが含まれる。真核細胞プロモーターとしては、ＣＭＶ直初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＴＴＲｓ、およびマウスメタロチオネイン− Ｉが含まれる。好適なベクターおよびプロモーターの選択は十分に当分野の通常の知識水準の範囲内である。使用される発現系に応じてさらに、発現ベクターは好ましくは、真核細胞培養物に対してはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、またはＥ．ｃｏｌｉではテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性などの形質転換した宿主細胞の選択のための表現型の特徴を提供するための遺伝子を含む。高等真核生物による本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列をベクター中に挿入することによって増大することができる。エンハンサーは、プロモーターに作用してその転写を増大させる、通常は約１０〜３００ｂｐのＤＮＡのシス作用要素である。例としては、複製起点の後側（ｂｐ１００から２７０）上のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後側上のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。細菌用途のための有用な発現ベクターは、好適な翻訳開始および終始シグナルを有する所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、機能的プロモーターと作動可能な読み取り相において挿入することによって構築することができる。ベクターは、ベクターの維持を確認し、所望により宿主内での増幅を提供するための１以上の表現型選択マーカーと複製起点を含むであろう。形質転換用の好適な原核生物宿主には、E.coli、Bacillus subtilis、Salmonella typhimurium並びにPseydomonas、StreptomycesおよびStaphylococcus 属内の多様な種が含まれるが、他のものも選択の問題として使用することができる。代表的ではあるが非限定的な例としては、細菌用途のための有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝要素を含む商業上入手可能なプラスミドから誘導された選択マーカーおよび細菌複製起点を含むことができる。そのような市販のベクターには、例えばＰＫＫ２２３−３（Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden）およびＧＥＭ１（Pro mega Biotec，Madison，Wis.，U.S.A．）が含まれる。これらのｐＢＲ３２２「バックボン」セクションを好適なプロモーターおよび発現すべき構造配列と組み合わせる。ナトリウムチャンネルは、オートグラファカリフォルニカ核多角体病（Autogr apha Californica nuclear polyhydrosis）ウイルス（ＡｃＮＰＶ）などのバキュロウイルスを使用して、Spodoptera frugiperda 細胞由来のＳｆ９または２１クローナル株などの昆虫細胞中で大量のタンパク質を産生する、バキュロウイルス発現系を使用して昆虫細胞中で発現させることができる。例えば、O'Reilly他（1992）Baculovirus Expression Vectors;A Laboratory Manual，Oxford Unive rsity Pressを参照。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、好適なプロモーターとエンハンサー、そして任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終始配列、および５’フランキング非転写配列を含むであろう。ＳＶ４０ウイルスゲノムに由来するＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０起点、初期プロモーター、エンハンサー、スプライス、およびポリアデニル化部位を使用して必要な非転写遺伝要素を提供することができる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、好適なプロモーターとエンハンサー、そして任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終始配列、および５’フランキング非転写配列を含むであろう。ＳＶ４０ウイルスゲノムに由来するＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０起点、初期プロモーター、エンハンサー、スプライス、およびポリアデニル化部位を使用して必要な非転写遺伝要素を提供することができる。さらに別の態様において、本発明は本発明の核酸配列を発現することができる宿主細胞を提供する。宿主細胞は、例えば、哺乳動物細胞などの高等真核細胞、酵母細胞などの下等真核細胞、細菌細胞などの原核細胞である。宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介トランスフェクション、エレクトロポレーション（Davis，L.，Dibner，M .，Battey，I.，Basic Methods in Molecular Biology，1986）または当分野で公知の任意の他の方法によって行うことができる。宿主細胞は、例えばクローニングベクターまたは発現ベクターである本発明のベクターによって遺伝的に加工（トランデュース、形質転換またはトランスフェクト）される。ベクターは例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージ等の形態が可能である。加工された宿主細胞は、プロモーターの活性化、形質転換体の選択またはＳＮＳナトリウムチャンネル遺伝子の増幅のために適宜改変された慣用の栄養培地中で培養することができる。温度、ｐＨ等の培養条件は、発現に関して選択された宿主細胞で以前に使用したものであり、当業者に自明である。本明細書中上記したような好適なＤＮＡ配列、並びに好適なプロモーターまたは調節配列を含むベクターを使用して、好適な宿主を形質転換し、その宿主にタンパク質を発現させることができる。好適な宿主の代表例としては、E.coliおよびSalmonella typhimuriumなどの細菌細胞；Streptomyces；酵母などの菌類細胞；ショウジョウバエおよびSpodoptera fugiperda Sf9などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳまたはBowes メラノーマＬｔｋ^-−およびＹ１副腎カルシノーマなどの動物細胞；植物細胞などを挙げることができる。好適な宿主の選択は本明細書中の教示に基づいて当業者の範囲内であると考えられる。好ましい宿主細胞には、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＯＳ−７；Ｙ１副腎；カルシノーマ細胞などの哺乳動物細胞株が含まれる。より好ましくは、宿主細胞はＣＨＯ−Ｋ１細胞である。ＳＮＳナトリウムチャンネルの一時的発現のための好ましい宿主細胞には、Xenopus laevis卵母細胞が含まれる。ナトリウムチャンネルはXenopus laevis卵母細胞中で一時的に発現させることができる。無細胞翻訳系を使用して、本発明のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを使用してそのようなタンパク質を産生することもできる。原核および真核宿主と一緒に使用するための好適なクローニングおよび発現ベクターは、Sambrook他、 Molecular Cloning; A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harb or，N.Y.，(1989)に記載されている。様々な哺乳動物細胞培養系を使用して組み換えタンパク質を発現させることもできる。哺乳動物発現系の例には、Gluzman，Cell，23:175(1981)に記載されたサル腎臓繊維芽細胞のＣＯＳ−７株、および適合可能なベクターを発現することができる他の細胞株、例えばＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＮＩＨ３Ｔ３およびＢＨＫ細胞株が含まれる。宿主細胞中の構築物を慣用な方法で使用して組み換え配列によってコードされる遺伝子産物を産生することができる。あるいは、本発明のタンパク質は慣用のペプチド合成機によって合成的に産生することができる。細胞は典型的には遠心によって採取され、物理的または化学的手段によって粉砕し、得られた粗抽出物をさらなる精製のために保持する。タンパク質の発現で使用した微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音波、機械的粉砕、または細胞溶解剤の使用を含む任意の便宜的方法によって粉砕することができ、そのような方法は当業者に周知である。ＳＮＳナトリウムチャンネルタンパク質は、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む当分野で公知の方法によって組み換え細胞培養物から回収および精製される。タンパク質再折り畳み工程を必要に応じて使用して、成熟タンパク質の立体配置を完成させることができる。最後に、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製工程のために使用することができる。本発明のＳＮＳナトリウムチャンネルタンパク質は、高発現細胞株から発現した天然精製した産物でもよく、化学合成法の産物でもよく、または原核または真核宿主（例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物の培養細胞）から組み換え技術によって産生してもよい。本発明はまた、本明細書中上記定義したＳＮＳナトリウムチャンネルに特異的な抗体を提供する。抗体という用語は本明細書中で使用する場合、本発明のタンパク質の抗原決定基のための認識部位を含む、全ての免疫グロブリンおよびそのフラグメントを包含する。本発明の抗体はポリクローナル抗体または好ましくはモノクローナル抗体でもよく、無傷な抗体分子あるいは抗体の活性結合領域を含むフラグメント、例えばＦａｂまたはＦ（ａｂ）₂でもよく、当分野で十分に確立した技術を使用して作製することができる（例えば、R.A De Weger他; Immuno logical Rev.，62 p29-45(1982)を参照）。タンパク質、そのフラグメントまたは他の誘導体、またはそのアナログ、またはそれらを発現する細胞を免疫原として使用してそれに対する抗体を作製することができる。これらの抗体は例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。本発明はまたキメラ、一本鎖またはヒト化抗体、並びにＦａｂフラグメント、またはＦａｂ発現ライブラリーの産物を包含する。当分野で公知の多様な方法をそのような抗体およびフラグメントの作製のために使用することができる。ＳＮＳナトリウムチャンネルに対して生成した抗体は、動物へのポリペプチドの直接注入によって、またはタンパク質を動物、好ましくは非ヒトに投与することによって得ることができる。そのように得られた抗体は次いでタンパク質自体に結合するであろう。この方法では、タンパク質のフラグメントのみをコードする配列でもそれを使用して全ネイティブタンパク質に結合する抗体を作成できる。次いで、このような抗体を使用して、タンパク質をそのポリペプチドを発現する組織中に局在化することができる。モノクローナル抗体の作製のためには、連続細胞株培養物によって作製した抗体を提供する任意の技術を使用することができる。例としてはハイブリドーマ技術（KohlerおよびMilstein，1975，Nature 2 56:495-497）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor他、19 83、Immunology Today 4:72）、およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Cole，35 al.，1985，in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss.，pp77-96）が挙げられる。一本鎖抗体の作製のために記載された技術（米国特許第４，９４６，７７８号）を採用して本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する一本鎖抗体を作製することができる。本発明の抗体はまた本発明のタンパク質の精製においても興味深く、従って、本明細書中上記定義した本発明のタンパク質またはその任意の部分またはその代謝または分解産物を精製する方法であって、本発明の抗体の使用を含む方法が提供される。本発明の精製方法は、例えば、支持体上に抗体を供給し、タンパク質を含有する溶液と抗体を接触させ、それによって抗体が本発明のタンパク質に結合するような当分野で公知の任意の便宜的技術によって行うことができる。タンパク質は、例えば、タンパク質／抗体の複合体に接触する溶液のイオン強度を変化させることによって、既知の方法によって抗体との結合から放出させることができる。本発明はまた、感覚ニューロンに特異的に局在するナトリウムチャンネルの調節物質を同定する方法であって、試験化合物をナトリウムチャンネルと接触させ、ナトリウムチャンネルの活性を検出することを含む方法を提供する。好ましくは、調節物資の同定方法またはスクリーニングアッセイ方法はナトリウムチャンネルを発現する形質転換した宿主細胞を使用する。典型的には、そのようなアッセイは、試験化合物に起因するナトリウムチャンネルの活性の変化を検出し、それによってナトリウムチャンネルの調節物質を同定するであろう。ナトリウムチャンネルの調節物質は、苦痛の感覚を調節するのに有用である。ナトリウムチャンネルのブロッカーは感覚ニューロンに沿ったインパルスの伝達を妨げるので、急性、慢性または神経性の苦痛の治療において有用である。ナトリウムチャンネルはパッチクランプまたは他の形式のアッセイ、例えば本明細書中の実施例に開示したアッセイなどで使用して、ナトリウムチャンネルを阻害、ブロック、またはさもなければそれと相互作用する小分子、抗体、ペプチド、タンパク質、または他の型の化合物を同定することができる。スクリーニングアッセイで同定されたそのような調節物質は次いで、哺乳動物の苦痛の治療のために使用することができる。例えば、ＳＮＳナトリウムチャンネルを発現する宿主細胞は、実施例および当分野で記載されているような²²Ｎａ＋イオン流量および¹⁴Ｃグアニジニウムイオンアッセイなどのイオン流量アッセイ、並びにLevi他(1994)J．Cardiovascular Electrophysiology 5:241-257に記載されているようなＳＦＢＩ蛍光ナトリウム指示剤アッセイにおいて使用することができる。ＳＮＳナトリウムチャンネルを発現する宿主細胞はまた、Sheldon 他、(1986)Molecular Pharmacology 30: 617 -623 に記載される３Ｈ−バトラコトキシン結合アッセイなどの結合アッセイ；R ogart他、(1983)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 80:1106-1110に記載された３Ｈ− サキシトキシンアッセイ；およびWest他、(1992)Neuron 8:59-70 に記載されたサソリトキシンアッセイで使用することができる。さらに、ＳＮＳナトリウムチャンネルを発現する宿主細胞は、パッチクランプまたは２種の電極技術を使用する電気生理的アッセイで使用することができる。一般に、試験化合物をアッセイに添加し、ナトリウム流量に対するその効果を測定するか、ナトリウムチャンネルに競合的に結合する試験化合物の能力を評価する。次いで、ＳＮＳナトリウムチャンネルに対して所望の効果を有する試験化合物を選択する。そのように選択された調節物質は上記のように苦痛を治療するために使用できる。本明細書中上記定義したヌクレオチド配列の相補鎖は、米国特許５，３９９，３４６号に開示されているように遺伝子治療に使用することができる。例えば、ｃＤＮＡ配列またはそのフラグメントをナトリウムチャンネルをダウン制御するための遺伝子治療戦略で使用できるであろう。アンチセンス技術を使用して、三重らせん形成またはアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを通じて遺伝子発現を調節することができ、この方法は共にＤＮＡまたはＲＮＡへの核酸配列の結合に基づいている。例えば、ナトリウムチャンネルをコードする核酸配列の５’コード部分を使用して、約１０から約４０塩基対の長さのアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは転写に関与する遺伝子の領域に相補的になるように設計され（三重らせん−Lee 他、Nucl,Acids Res.6:3073( 1979); Cooney他、Science 241:456(1988); およびDeruau他、Science 251:1360 （1991）を参照）、それによって転写およびナトリウムチャンネルの産物を妨げる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、in vivo でｍＲＮＡにハイブリダイズし、ｍＲＮＡのナトリウムチャンネルへの翻訳をブロックする。標的感覚ニューロン中で発現した強力な構成性プロモーターによって駆動されたアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンス構築物は末梢的にまたは脊髄まで送達されるであろう。ナトリウムチャンネル遺伝子の発現を調節する制御領域を遺伝子治療に使用してナトリウムチャンネルを発現する細胞内での治療的構築物の発現を調節することができる。そのような領域は、ｃＤＮＡをプローブとして使用して遺伝子とフランキング配列を有するゲノミッククローン、例えばコスミドを同定することによって単離できるであろう。イントロンまたはフランキング配列を含むコスミドのフラグメントは、例えばＤＲＧ培養物またはトランスジェニック動物中でのリポーター遺伝子アッセイで使用でき、例えばプロモーター、エンハンサーまたはＬＣＲ活性を有するゲノムフラグメントを同定できる。本発明を以下の実施例を参照してさらに説明する。実施例１；サブトラクションハイブリダイゼーション法によるラット背根神経節（ＤＲＧ）ナトリウムチャンネルｃＤＮＡの配列の誘導１．１ＤＲＧ由来ポリＡ＋ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成新生Sprague-Dawley雄および雌のラットの全背骨レベルからの背根神経節（ＤＲＧ）を液体窒素中に凍結した。ＲＮＡをグアニジンイソチオシアネートおよびフェノール／クロロホルム抽出を使用して抽出する（Chomczynski およびSacchi 1987 およびAnal Biochem 162，156-159）。全ＲＮＡ単離 − 神経組織を１ｍｌの抽出緩衝液（２３．６ｇのグアニジニウムイソチオシアネート、５ｍｌの２５０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、蒸留水で５０ｍｌに調整。これに、２．５ｍｌの１０％サルコシルおよび０．３６ｍｌのβ−メルカプトエタノールを添加する。）中でPolytronホモジナイザーを使用してホモジナイズする。０．１ｍｌの２Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）を添加した後、１ｍｌのフェノールを添加する。混合後、０．２ｍｌのクロロホルムを添加し、これを激しく振盪して氷上に５分間置く。次いで、これを４℃で３０分間１２，０００回転／分（ｒｐｍ）で遠心する。水相を新しいチューブに移し、１ｍｌのイソプロパノールを添加し、これを−２０℃で１時間放置し、その後、４℃で３０分間１２，０００ｒｐｍで遠心する。ペレットを０．１ｍｌの抽出緩衝液に溶解し、再度イソプロパノールで抽出する。得られたペレットを７０％のエタノールで洗浄し、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理水に再懸濁する。０．３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）および２容量のエタノールを添加し、混合物を−２０℃で１時間放置する。ＲＮＡを沈殿し、７０％エタノールで再度洗浄し、ＤＥＰＣ処理水に再懸濁する。光学密度を２６０ナノメートル（ｎｍ）で測定し、全ＲＮＡの収量を計算する。ポリＡ＋ＲＮＡを、オリゴｄＴセルロースクロマトグラフィーによって全ＲＮＡから単離する（Aviv およびLeder 1972 Proc Natl Acad Sci 69，1408-1411）。以下の操作を出来るかぎり４℃で行う。オリゴｄＴセルロース（Sigma）を０．１Ｍの水酸化ナトリウムで５分間処理することにより調製する。オリゴｄＴ樹脂をカラムに注ぎ、中和化緩衝液（０．５Ｍの塩化カリウム、０．０１ＭのＴｒｉｓ（Trizma塩基、Si gma、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）（ｐＨ７．５）で洗浄して中和する。ＲＮＡ溶液を０．５Ｍの塩化カリウム、０．０１Ｍのトリス（ｐＨ７．５）に調整し、カラムの上部に付与する。最初のカラム溶出物をカラムに再度付与し、カラム中のオリゴｄＴへのｍＲＮＡの付着を確実にする。次いで、カラムを７０ｍｌの中和化緩衝液で洗浄し、ポリＡ＋ＲＮＡを６ｍｌの０．０１Ｍのトリス（ｐＨ７．５）で溶出し、１ｍｌずつの画分を回収する。ポリＡ＋ＲＮＡは通常２〜５番目の画分に存在し、これを２６０ｎｍで光学密度を測定することにより確認する。これらの画分をプールし、−７０℃で一晩エタノールで沈殿し、７０％エタノール中で洗浄し、１ｍｇ／ｍｌの濃度で脱イオン水に再溶解する。第１鎖ｃＤＮＡを、実施例２に記載した方法を使用して、０．５ｍｇのＤＲＧポリＡ＋ｍＲＮＡ、オリゴｄＴ／ＮｏｔＩプライマーアダプター、およびSuperS cript 逆転写酵素(Gibco-BRL)を使用して生成した。ｃＤＮＡの半分は、逆転写酵素反応に２ＭＢｑの³²ＰｄＣＴＰ（Amersham）を含めることによって標識した。標識したｃＤＮＡをNickカラム（Sephadex G50- Pharmacia）上で取り込まれなかったヌクレオチドから分離する。１．２サブトラクションハイブリダイゼーションを使用するＤＲＧ特異的ｃＤＮＡの富裕化各種組織からのポリＡ＋ＲＮＡ（１０μｇ）を１０μｇの光活性化可能なビオチン（Clontech）とともに全容量１５μｌでインキュベートし、２５０ワット太陽灯で４℃で３０分間照射する。フォトビオチンをブタノールでの抽出により除去し、ｃＤＮＡをキャリアＲＮＡなしでビオチン化ＲＮＡと同時沈殿する（Sive およびSt.John 1988 Nuc Ac Res 16，10937）。ハイブリダイゼーションを、２０％のホルムアミド、５０ｍＭの３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）（ｐＨ７．６）、０．２％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍの塩化ナトリウム、５ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ、Sigma）中で４０時間５８℃で行う。全反応容量は５μｌであり、反応は、９５℃で２分間の最初の変性工程後にミネラル油の下で行う。次いで、２０ユニットのストレプトアビジン（ＢＲＬ）を含む１００μ ｌの５０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．４）、０．５Ｍの塩化ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡを室温で反応混合物に添加し、２回のフェノール／クロロホルム抽出工程後に水相を保持する。実施例１．１からのｃＤＮＡを、肝臓および腎臓、次いで皮質および小脳由来のビオチン化ｍＲＮＡに順次ハイブリダイゼーションした後、ＤＲＧ特異的転写物の８０倍の濃縮が達成される。次いで、１〜２ｎｇの残存ｃＤＮＡの１／３を３７℃で３０分間ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼでＧ末端化する。ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、オリゴｄＴ−ＮｏｔＩプライマーアダプターおよび配列ＡＡＴＴＣＣＧＡ（Ｃ）₁₀で始まるオリゴｄＣプライマーを使用してｃＤＮＡを増幅する。増幅は９５℃で１分間、４５℃で１分間、７２℃で５分間の２サイクル、その後の９５℃で１分間、５８℃で１分間および７２℃で５分間の２サイクルを使用して行う。次いで得られた生成物を２％のＮｕシーブアガロースゲル上で分離し、０．５キロベース対（ｋｂ）以上の大きさで泳動する物質を溶出させ、さらに、９５℃で１分間、５８℃で１分間および７２℃で５分間の６サイクルで増幅する。この物質をさらに２％のＮｕシーブアガロースゲル上で分離し、ゲル上で６ｋｂから泳動する物質を溶出させ、さらに、同一のＰＣＲ条件を使用して２７サイクルで増幅させた。この高分子量領域に由来する増幅したＤＮＡを次いで、２％のＮｕシーブゲル上でさらに分画し、０．５から１．５ｋｂおよび１．５から５ｋｂのｃＤＮＡをプールする。１．３．ライブラリー構築１０μｇのバクテリオファージベクターラムダｚａｐＩＩ（Stratagene）を３７℃で一晩高塩緩衝液中でＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩで制限消化し、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１ｍＭのスペルミジン、０．１ｍＭのＥＤＴＡ中で３７℃で３０分間１ユニットの子ウシ腸ホスファターゼ（Promega）を使用して脱リン酸化した。ＤＲＧｃＤＮＡをｄＧＴＰおよびｄＣＴＰの存在下でKlen ow酵素で消化し、ｃＤＮＡの５’末端にオリゴｄＣプライマー（上記参照）からＥｃｏＲＩ部位を構築し、方向的クローニング用にＮｏｔＩで切断した。ｃＤＮＡを１２℃で１６時間クローニングベクターバクテリオファージラムダｚａｐＩＩに連結する。次いで、組み換えファージＤＮＡをGigapack gold（Stratagene ）と製造業者によって特定された方法を使用して感染性ファージにパッケージする。０．１％のパーッケージされたＤＮＡを使用してE.coli BB4細胞を感染し、これを取り出し、生成した独立クローンの数を計算する。１．４示差スクリーニングライブラリーを低密度（１０³クローン／１２×１２ｃｍ²皿）でプレートし、３セットの³²Ｐ標識ｃＤＮＡプローブおよび多重フィルターリフトを使用してスクリーニングする。レプリカフィルターをそれらをプレートされたライブラリープレート上に載せ、それらを簡単に乾燥し、次いで新しい寒天プレート上に載せることによって作製し、ファージの量と、その後のそれらから取ったリフトのハイブリダイゼーションシグナルを増大させる。プローブは、ａ）皮質および小脳ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ、ｂ）ＤＲＧポリ（Ａ）＋ＲＮＡ、およびｃ）ＤＲＧ由来のサブトラクトされたｃＤＮＡに由来する。２種のｍＲＮＡプローブを、最終容量２５０μｌで、２〜５μｇのＲＮＡ、５０μｌの５×ＲＴ緩衝液、２５μｌの０．１Ｍのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１２．５μｌの１０ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、３０ｐＭのオリゴｄＴ、７５μｌの³²Ｐ−ｄＣＴＰ（３０ＭＢｑ；Amersham）、２５μｌの１００μＭのｄＣＴＰ、２μｌのＲＮａｓｉｎ（２ユニット／μｌ）、および２μｌのSuperScript 逆転写酵素（GibcoBRL）を含む反応混合物を使用して³²ＰｄＣＴＰで標識する。反応を３９℃で６０分間インキュベートし、続いてＲＮＡを、２５０μｌの水、５５μｌの１ＭのＮａＯＨを添加して７０℃で２分間インキュベートすることによって分解する。反応混合物を酸性化したTris塩基（ｐＨ２．０）で中和し、イソプロパノールによりキャリアｔＲＮＡ（Boehringer）と共に沈殿させる。サブトラクトされ増幅された二本鎖ＤＲＧｃＤＮＡを³²ＰｄＡＴＰ（Gibcoマルチプライムキット）でランダムプライム標識する。次いでレプリカフィルターをハイブリダイゼーション緩衝液中で６８℃で４時間プレハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションを４× ＳＳＣ（２０×ＳＳＣは８００ｍｌの蒸留水中の１７５．３ｇの塩化ナトリウムと８８．２ｇのクエン酸ナトリウムとから成る。ｐＨを１０Ｎの水酸化ナトリウムで７．０に調整し、これを蒸留水で１リットルに調整する）、１５０μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡを含む５×デンハルト（Denhardts）溶液、２０μｇ／ｍｌのポリＵ、２０μｇ／ｍｌのポリＣ、０．５％のＳＤＳ（Sigma）、５ｍＭのＥＤＴＡ中で６８℃で２０時間行った。フィルターを室温で２×ＳＳＣで簡単に洗浄し、次いで６８℃で１５分間０．５％のＳＤＳを含む２×ＳＳＣで二回洗浄し、その後６８℃で０．５％ＳＤＳ、０．２×ＳＳＣ中で２０分間洗浄する。フィルターをコダックＸ−ｏｍａｔフィルム上で最大１週間までオートラジオグラフする。ＤＲＧプローブにハイブリダイズするが、皮質および小脳プローブとはハイブリダイズしないプラークを採取し、ファージＤＮＡを調製し、クローン化したインサートを放出させてpBluescript(Stratagene)中にサブクローニングする。陽性プラークを、オリエンテーションマークを使用してプレートでオーラジオクラムを整列させて、陽性のハイブリダイゼーションシグナルに対応するプレートからプラグを取ることによって採取する。ファージをプラグから０．５ｍｌのファージ希釈緩衝液（１０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．５）１０ｍＭの硫酸マグネシウム）中に溶出させ、ファージをE.coli BB4中に再感染させ、二次精製工程として２００〜１０００プラーク／１５０ｍｍプレートの密度で再プレートし、クローンの純度を確認する。陽性の二次プラークを次いで前記のように採取する。陽性組み換えファージからのインサートＤＮＡをサブクローン化するためには、増幅する必要がある。これはプレート溶解によって達成され、ファージはE.co li BB4 を完全に溶解させる。０．２ｍｌのファージ懸濁物をE.coliの一晩培養物０．１ｍｌと混合する。これを２．５ｍｌのトップアガー（１６ｇのバクトトリプトン、１０ｇのバクト酵母エキス、５ｇの塩化ナトリウム、７ｇのバクトアガー、９００ｍｌの蒸留水中）に添加し、９ｃｍ²の寒天プレート上にプレートする。これを３７℃で一晩インキュベートする。５ｍｌのファージ希釈緩衝液を次いでプレートに添加し、４℃で一晩あるいは室温で穏やかに擦りながら４時間インキュベートする。次いでファージ含有緩衝液を回収し、０．１ｍｌのクロロホルムを添加し、このファージストックを上記のように滴定し、４℃で保存する。ファージＤＮＡを、最初に１０¹⁰のE.coli BB4を、３ｍｌのファージ希釈緩衝液中の１０⁹プラーク形成単位（ｐｆｕ）のファージで感染させ、３７℃で２０分間振盪することによって調製する。感染した細菌を、３７℃で９時間激しく振盪しながら４００ｍｌのＬブロス（１．６％のバクトトリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）のバクト酵母エキス、０．５％（ｗ／ｖ）の硫酸マグネシウム）に添加する。溶解が生じた時、１０ｍｌのクロロホルムを添加し、振盪をさらに３０分間続ける。次いで、培養物を室温まで冷却し、膵臓ＲＮＡａｓｅおよびＤＮＡａｓｅを１ｕｇ／ｍｌまで４０分間添加する。次いで、塩化ナトリウムを１Ｍまで添加し、氷上で回転することによって溶解する。８０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、上清を回収する。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）を１０％ｗ／ｖまで添加し、氷上で２時間攪拌することによって溶解する。４℃で８０００ｒｐｍで１０分間遠心した後、ペレットを８ｍｌのファージ希釈緩衝液中に再懸濁する。これを等量のフェノール／クロロホルムで抽出した後、塩化セシウム勾配（０．６７５ｇ／ｍｌ塩化セシウウ−４℃で３８０００ｒｐｍで２４時間）で精製する。不透明なプラークバンドを遠心管から取り出し、１０ｍＭの塩化ナトリウム、５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１０ｍＭの塩化マグネシウムに対して２時間透析する。次いでＥＤＴＡを２０ｍＭまで添加し、プロテイナーゼＫを５０μｇ／ｍｌまで、ＳＤＳを０．５％まで添加し、６５℃で１時間インキュベートする。ＴＥに対して一晩透析した後、純粋なファージＤＮＡが得られる。クローン化したインサートを精製したファージＤＮＡから先に記載した制限酵素を使用して消化する。次いで、各ファージインサートを、先に記載したようなライゲーション反応を使用して、プラスミドベクター、例えばpBluescript(Clontech)中にライゲーションする。クローンの特徴付けプラスミドを互いにクロスハイブリダイズさせる。ユニークなクローンをさらにノザンブロットおよび配列決定によって分析する。次いで、ナトリウムチャンネルに匹敵する転写物サイズおよび配列を示すクローンをハイブリダイゼーションプローブとして使用して、新生ラットＤＲＧのオリゴｄＴプライムした全長ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、上記および実施例２に記載するような方法を使用して全長ｃＤＮＡクローンを得る。ラットＤＲＧナトリウムチャンネルの生物活性を以下の実施例４および７と同様に確認する。実施例２；ラットＤＲＧナトリウムチャンネルｃＤＮＡ（ＳＮＳ−Ｂ）に相同なヒトｃＤＮＡのホモロジークローニング２．１．ヒト神経節全ＲＮＡの単離ラットＤＲＧナトリウムチャンネルｃＤＮＡのヒトｃＤＮＡ相同体の誘導のための出発材料を、死後のヒト材料または胎児由来のヒト背根神経節または三叉神経神経節あたは他の頭蓋神経節から単離する。全リボ核酸（ＲＮＡ）を、実施例１に記載されているようにヒト神経組織からグアニジニウムイソチオシアネート中での抽出によって単離する（Chomczynski およびSacchi 1987 Anal Biochem 1 62，156-159）。２．２ラットＤＲＧナトリウムチャンネルｃＤＮＡ（ＳＮＳ−Ｂ）のヒト相同体の転写物サイズの測定ヒト背根神経節全ＲＮＡを、適当な変性剤、例えばホルムアルデヒド（Lehrac h 他 1977 Biochemistry 16，4743; Goldberg 1980 Proc Natl Acad Sci 77,579 4; Seed 1982 in Genetic engineering; principles and methods（JK SetlowおよびA Hollaender編）vol 4 p91 Plenum Publishing New York）またはグリオキサール／ＤＭＳＯ（McMaster GK および Carmichael GG 1977 Proc Natl Acad S ci 74，4835）を含む１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル中で電気泳動により分離し、ＲＮＡを好適な膜（例えば、ニトロセルロース）に転写する。次いで、固定化したＲＮＡを、ラットナトリウムチャンネルｃＤＮＡ配列（以下を参照）の部分から成る放射活性（または他の好適な検出標識）プローブにハイブリダイズさせる。膜を洗浄してハイブリダイズしないプローブを除去した後、ハイブリダイズしたプローブを好適な検出システム（例えば、³²Ｐ標識プローブについてはオートラジオグラフィー）を使用して可視化し、ヒト相同ｍＲＮＡ分子の大きさを明らかにする。具体的には、新生ラット組織からの２０〜３０μｇの全ＲＮＡを１．２％アガロース−ホルムアルデヒドゲル上で分離し、Hybond-N（Amersham）上にキャピラリーブロットする（Ninkina 他 Nuc Ac Res 21．3175-3182）。ブロット上のＲＮＡの量は、リボソームＲＮＡのエチジウムブロミド染色により、または偏在的に発現したＬ−２７リボソームタンパク質転写物とのハイブリダイゼーションにより判断した場合で、ほぼ均等であった（Le Beau 他、1991 Nuc A c Res 19，1337）。各ノザンブロットはヒトＤＲＧ、皮質、小脳、肝臓、腎臓、脾臓および心臓ＲＮＡを含む。プローブ（５０ｎｇ）をランダムプライミングによって³²Ｐ−ｄＡＴＰ（Amersham）で標識する。フィルターを、５０％ホルムアルデヒド、０．５％ＳＤＳを含む５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液（５０×デンハルトは５ｇのＦｉｃｏｌｌ(タイプ４００、Pharmasia)、５ｇのポリビニルピロリドン、５ｇのウシ血清アルブミン（フラクションＶ、Sigma）を含み水で５００ｍｌにする）、１００μｇ／ｍｌの煮沸サケ精子ＤＮＡ、１０μｇ／ｍｌのポリＵおよび１０μｇ／ｍｌのポリＣ中で、４５℃で６時間プレハイブリダイズさせる。同一条件下で３６時間のハイブリダイゼーション後に、フィルターを室温の２×ＳＳＣで簡単に洗浄し、次いで６８℃の０．５％のＳＤＳを含む２×ＳＳＣで１５分間で２回洗浄し、その後、６８℃の０．５％ＳＤＳ、０．２×ＳＳＣ中で２０分間洗浄する。フィルターをコダックＸ−ｏｍａｔフィルム上で最大１週間オートラジオグラフする。転写物サイズを、ゲル分子量標準マーカーと比較してゲルからのシグナルから計算する。２．３ヒトＤＲＧｃＤＮＡライブラリーの作製ヒト背根神経節由来の代表的ｃＤＮＡライブラリーを作製するために、メッセンジャーＲＮＡ（ポリＡ＋ｍＲＮＡ）を最初に、実施例１に記載した方法を使用してオリゴｄＴセルロースクロマトグラフィー（AvivおよびLeder 1972 Proc Na tl Acad Sci 69，1408-1411）を使用して全ＲＮＡプールから単離する。ポリＡ＋ＲＮＡからのｃＤＮＡの第１鎖の合成は、反応を触媒するための酵素ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）を使用する。第２鎖ｃＤＮＡ合成の最もよく使用される方法は、第１鎖合成の産物、ｃＤＮＡ：ｍＲＮＡハイブリッドを、第２鎖合成をプライムするための鋳型として使用する（GublerおよびHoffman 19 83 Gene 25，263）。２．３．１．第１鎖ｃＤＮＡ合成２０μｇのヒトＤＲＧポリＡ＋ＲＮＡを前処理して、第１鎖ｃＤＮＡ合成を阻害するかもしれない二次構造を破壊する。２０μｇのポリＡ＋ＲＮＡ、１μｌの１Ｍのトリス（ｐＨ７．５）を蒸留水で１００μｌの容量に調整する。これを９０℃で２分間インキュベートした後、氷上で冷却する。次いで、４．８μｌの１００ｍＭのメチル水銀を室温で１０分間添加する。次いで、１０μｌの０．７Ｍのβ−メルカプトエタノールおよび１００ユニットのヒト胎盤ＲＮＡａｓｅ阻害剤を室温で５分間添加する。第１鎖合成反応は、８μｌの２０ｍＭのｄＡＴＰ、５μｌの２０ｍＭのｄＣＴＰ、８μｌの２０ｍＭのｄＧＴＰ、８μｌの２０ｍＭのｄＴＴＰ、１０μｌの１ｍｇ／ｍｌのオリゴｄＴ（１２−１８）、２０μｌの１Ｍのトリス（ｐＨ８．３）（４５℃で）、８μｌの３Ｍの塩化カリウム、３．３μｌの０．５Ｍの塩化マグネシウム、３μｌの³²ＰｄＣＴＰ、１００ユニットのSuperscript II逆転写酵素（Gibco BRL）から成り蒸留水で２００μｌに調整される。この反応混合物を４５℃で４５分間インキュベートし、その後さらに５０ユニットのSuperscript 逆転写酵素を添加し、４５℃でさらに３０分間インキュベートする。次いで、ＥＤＴＡを１０ｍＭまで添加し、反応を終結させ、フェノール／クロロホルム抽出を行う。次いで、ＤＮＡを酢酸アンモニウムを使用して沈殿させ（遠心前に乾燥氷／エタノール中で凍結）、７０％エタノールで洗浄し、５０ｍｌの蒸留水中に再懸濁する。一本鎖ＤＮＡのサイズを、アガロースゲル（１％ｗ／ｖ）上でそれを電気泳動により分離し、結果をマーカーに対してオートラジオグラフすることによって評価する。２．３．２第２鎖合成第２鎖合成反応混合物は、０．５μｇのヒトＤＲＧ一本鎖ＤＮＡ、２μｌの１Ｍのトリス（ｐＨ７．５）、１μｌの０．５Ｍの塩化マグネシウム、３．３３μ ｌの３Ｍの塩化カリウム、２μｌの０．５Ｍの硫酸アンモニウム、１．５μｌの１０ｍＭのβニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、４μｌの各１ｍＭのｄＮＴＰｓ、５μｌの１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１ユニットのＲＮＡａｓｅ−Ｈ、２５ユニットのKlenowポリメラーゼから成り、これは蒸留水で１００μｌに調整される。これを１２℃で１時間、次いで２０℃で１時間インキュベートする。反応をＥＤＴＡを１０ｍＭまで添加することによって停止させ、その後にフェノール／クロロホルム抽出する。ＤＮＡをエタノール沈殿し（−７０℃で一晩）、次いで、７０％エタノールで洗浄した後、２０μｌの蒸留水中に再懸濁する。サイズを、ゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーによって確認する。２．３．３．二本鎖ｃＤＮＡ末端修復次のクローニングのためにｃＤＮＡ分子の末端にリンカーを付加するためには、末端を最初に修復しなければならない。ヒトＤＲＧｃＤＮＡを０．２５Ｍの塩化ナトリウム、１ｍＭの硫酸亜鉛、５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中の５００ユニット／ｍｌのＳ１ヌクレアーゼで処理する。インキュベーションを３０℃で４０分間行い、その後トリス（ｐＨ８．０）で０．２Ｍまで中和する。ＤＮＡを再度エタノール沈殿し、７０％エタノールで洗浄し、２０μｌの蒸留水に再懸濁する。サイズを再度確認し、Ｓ１ヌクレアーゼ消化が平均ＤＮＡフラグメントサイズを全然減少させてないことを確認する。修復反応は、１９μｌのｃＤＮＡ、３μｌの１０×Ｔ４ポリメラーゼ緩衝液（０．３３Ｍのトリス酢酸（ｐＨ７．９）、０．６６Ｍの酢酸カリウム、０．１Ｍの酢酸マグネシウム、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡおよび５ｍＭのＤＴＴ）、２μｌの各ｄＮＴＰｓ（２ｍＭで）、２μｌのＴ４ポリメラーゼおよび４μｌの蒸留水から成る。これを３７℃で３０分間インキュベートした後、１μｌのKlenowポリメラーゼを添加して室温で１時間置く。次いで、ＤＮＡをエタノール沈殿し、７０％エタノールで洗浄し、５μ ｌの蒸留水に再懸濁する。ｃＤＮＡ内の天然由来の制限部位を切断から保護するために、ｃＤＮＡをリンカーの添加前にメチラーゼで処理する。反応混合物は、５μｌのヒトＤＲＧ二本鎖ＤＮＡ、１μｌのＳ−アデノシルメチオニン、２μｌの１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、２μｌの５×メチラーゼ緩衝液（０．５Ｍのトリス（ｐＨ８．０）、５ｍＭのＥＤＴＡ）、０．２μｌのＥｃｏＲＩメチラーゼ（ＮＥＢ）から成る。これを３７℃で２０分間インキュベートした後、フェノール抽出、エタノール沈殿し、７０％エタノールで洗浄し、２０μｌの蒸留水に再懸濁する。２．３．４．ｃＤＮＡへのリンカーの付加ＥｃｏＲＩリンカーをｃＤＮＡ分子に連結して、ラムダベクターへのクローニングを容易にする。ライゲーション反応混合物は、１μｌの１０×ライゲーション緩衝液（０．５Ｍのトリス塩化物（ｐＨ７．５）、０．１Ｍの塩化マグネシウムおよび０．０５ＭのＤＴＴ）、１μｌの１０ｍＭのＡＴＰ、１００ｎｇのｃＤＮＡ、５μｇのＥｃｏＲＩリンカー、１ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ、蒸留水（１０μｌに調整）から成る。反応を３７℃で１時間インキュベートした後、さらに６ユニットのＴ４リガーゼを添加し、さらに１５℃で一晩インキュベートする。連結した試料をエタノール沈殿し、７０％エタノールで洗浄し、１０μｌの蒸留水に再懸濁する。ｃＤＮＡを次いでＥｃｏＲＩで消化し、ライゲーション過程で形成したリンカー連鎖物を切断する。この制限消化反応は、１０μｌのｃＤＮＡ、２μｌの高塩緩衝液（１０ｍＭの塩化マグネシウム、５０ｍＭのトリス塩化物（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭの塩化ナトリウム）、２μｌのＥｃｏＲＩ（１０ユニット／μｌ−ＮＥＢ）、および蒸留水（２０μｌに調整）を含む。消化を３時間行う。ライゲーションおよび消化工程をゲル電気泳動を使用してモニターして生成物のサイズをモニターする。２．３．５ｃＤＮＡのサイズ分画ライブラリーが短いｃＤＮＡ分子で埋まっていないことを確認し、リンカー分子を除去するために、カラム精製を行う。１ｍｌのSepharose 4Bカラムをガラスウールの小片を詰めた１ｍｌのプラスチックピペット中に作る。これをＴＥ中の０．１Ｍの塩化ナトリウムで平衡化する。ｃＤＮＡをカラム上に載せ、１滴の画分を回収する。各画分の２μｌのアリコートをゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーで分析して、各画分中のｃＤＮＡのサイズを決定する。約８００塩基対以上のｃＤＮＡを含有する画分をプールしエタノール沈殿によって精製し、１０μｌの蒸留水に再懸濁する。２．３．６バクテリオファージベクターへのｃＤＮＡのクローニングｃＤＮＡのクローニングおよび増殖のために設計したバクテリオファージベクターは、市販品からＥｃｏＲＩで消化することができ、ホスファターゼ処理した末端を有する状態で供給される（例えば、Stratageneからラムダｇｔ１０）。調製したサブトラクトしたｃＤＮＡを、この文献の他の箇所で記載したように、リガーゼ緩衝液とＴ４ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs）から成るライゲーション反応を使用してラムダｇｔ１０中にライゲーションする。２．４ライブラリースクリーニングのためのｃＤＮＡフラグメント（プローブ）の標識ラットＤＲＧナトリウムチャンネルｃＤＮＡクローン（ＳＮＳ−Ｂ）の３’非翻訳領域を、好適な制限酵素を使用してプラスミドベクター、例えばpBluescrip t（Stratagene）中にサブクローニングする。標識プローブを形成すべきｃＤＮＡインサートを好適な制限酵素による消化を介してベクターから放出させ、インサートを１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル中での電気泳動を介してベクターから分離する。分離されたインサートをアガロースゲルから取り出して精製した後、ランダムオプライミングおよび重合化（FeinbergおよびVogelstein 1983 Anal Bio chem 132,6）またはニックトランスレーション（Rigby 他 1977 J Mol Biol 113 ，237）などの標準法によって、³²ＰまたはＤＩＧで標識されたヌクレオチドで標識する。あるいは、プローブｃＤＮＡインサートを、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ（ＳＰ６、Ｔ３またはＴ７ポリメラーゼ）が結合する強力なバクテリオファージプロモーターを含むベクター中にクローニングする場合には、合成ｃＤＮＡを、³²Ｐまたはジゴキシゲニンヌクレオチドを取り込むインビトロ転写によって作製する。ラットＤＲＧナトリウムチャンネルｃＤＮＡの他の領域もｃＤＮＡライブラリースクリーニングまたはノザンブロット分析のために同様の方法でプローブとして使用できる。具体的には、プローブを、Pharmaciaオリゴ標識キットなどのキットを使用して作製する。これは、ラットＤＲＧナトリウムチャンネルｃＤＮＡフラグメントを放射活性標識する。５０ｎｇの変性ＤＮＡ（沸騰した水浴中に５分間置く）、３μｌの³²ＰｄＣＴＰ（Amersham）および１０μｌの試薬混合物を蒸留水で４９μｌに調整する。１μｌのKlenowフラグメントを添加し、混合物を３７℃で１時間インキュベートする。取り込まれなかったヌクレオチドを除去するために、反応混合物をNickカラム（Sephadex G50 Pharmacia）に適用し、４００μｌのＴＥ（１０ｍＭのトリス塩化物（ｐＨ７．４）、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））を添加する。さらに４００μｌのＴＥを添加して溶出物を回収する。この中にハイブリダイゼーションプローブとして使用するための標識ＤＮＡが含まれる。２．５ｃＤＮＡライブラリースクリーニングラットＤＲＧナトリウムチャンネルのヒト相同体を含む組み換え体を検出するために、ヒトＤＲＧｃＤＮＡライブラリーを、中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション洗浄（５０〜６０℃、５×ＳＳＣ、３０分）を使用して、上記したような３’非翻訳領域に由来する放射標識または他の標識をしたＤＮＡまたはｃＲＮＡプローブを使用して、スクリーニングする。ライブラリーを、寒天プレート上に形成した組み換えプラークからのＤＮＡのニトロセルロースまたはナイロン膜レプリカの作製を含む標準法を使用してスクリーニングする（Benton 他 1977 Science 196:180）。次いで、これらを一本鎖核酸プローブにハイブリダイズさせる（上記参照）。中程度のストリンジェンシー洗浄を行う（セクション２．２のノザン分析についての洗浄条件を参照）。次いで、二重のフィルター上で陽性のプラーク（即ち、人工物またはバックグラウンドでない）を、コロニーを分離するために希釈した後に１回以上のラウンドで再プレーティングして、さらにハイブリダイゼーションスクリーニングを行うことによって精製する。得られた陽性プラークを精製する。ＤＮＡを抽出し、これらのクローンのインサートサイズを調べる。クローンを標準法を使用して互いにクロスハイブリダイズさせ（Sambrook他 1989 Molecular Cloning Second Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York）、別個の陽性クローンを同定する。ｃＤＮＡライブラリースクリーニングのための詳細な手順は実施例１に記載される。２．６ラットＤＲＧナトリウムチャンネルｃＤＮＡのヒト相同体の全長クローンの誘導上記からのオーバーラップする陽性クローンをクロスハイブリダイゼーションにより同定する。次いで、それらの制限地図を作製し、それらの共通部分を同定し、オーバーラップするクローンからの別個の部分を表す制限フラグメントを標準的クローニング法を使用して一緒にライゲートする（Sambrook他、1989 Molec ular Cloning Second Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press）。例えば、最大の５’フラグメントは５’非翻訳配列、開始コドンＡＴＧおよび５’コード配列を含むであろう。最大の３’配列は、最大の３’コード配列、停止コドンおよび３’非翻訳配列、ポリＡコンセンサス配列並びに多分ポリＡランを含むであろう。かくして、ラットＤＲＧナトリウムチャンネルｃＤＮＡのヒト相同体の全長ｃＤＮＡ配列を含む組み換え分子が生成される。オーバーラップするクローンが全長ｃＤＮＡクローンを組み立てるのに十分なフラグメントを産生しない場合には、全長オリゴｄＴプライムヒトＤＲＧライブラリーを再度スクリーニングして全長クローンを単離する。あるいは、全長クローンはライブラリーのスクリーニングから直接誘導される。２．７ヒト相同体全長クローンの解明全長クローンからのｃＤＮＡ配列をノザンブロット分析でプローブとして使用してラットメッセンジャーＲＮＡサイズとの比較のためにヒト組織中のメッセンジャーＲＮＡサイズを検出する（方法についてはセクション１．１および２．２を参照）。クローン化ｃＤＮＡの生物活性の確認を、実施例４および７に記載したようなラットＤＲＧ特異的ＴＴＸｉ耐性ナトリウムチャンネルについての方法と同様の方法で、ヒトナトリウムチャンネルｍＲＮＡのインビトロ翻訳およびXenopus 卵母細胞中でのその発現を介して行う。上記定義した活性を有することが示されるｃＤＮＡ配列をジデオキシ仲介鎖末端配列決定法を使用して完全に配列決定する（Sanger他 1977 Proc Natl Acad S ci 74，5463）。実施例３：ラットＤＲＧナトリウムチャンネルｃＤＮＡクローン由来のＤＮＡ配列を使用する、ヒトＤＲＧナトリウムチャンネルをクローニングするためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アプローチ全ＲＮＡおよびポリＡ＋ＲＮＡを、上記実施例２に記載したように死後のヒト材料または胎児からのヒト背根神経節または三叉神経神経節または他の頭蓋神経節から単離する。ランダムプライマーをＲＮＡにハイブリダイズさせ、ＭＭＬＶ逆転写酵素により重合化して、抽出したヒトＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡを生成する。既知の電圧ゲート化ナトリウムチャンネルの比較的保存された領域（図２）から誘導された縮重ＰＣＲプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応を使用してｃＤＮＡを増幅する（Saiki 他、1985 Science 230，1350）。ＰＣＲ反応で操作して必要な相同配列を誘導することができる多くの変法が存在することは当業者に理解される。これらには、サイクルおよび工程温度、サイクルおよび工程時間、サイクルの数、熱安定性ポリメラーゼ、Ｍｇ２＋濃度を変更することが含まれるがこれらに限定されない。ナトリウムチャンネルからのさらに保存された配列に由来する１以上の一組のプライマーを利用する第２ラウンドの増幅によってより大きな特異性が得られることも理解される。具体的には、上記は以下の方法で達成できる。第１鎖ｃＤＮＡ反応は、１μｇの全ＲＮＡ（ＤＥＰＣ処理水で１３μｌに調整）、および１μｌの０．５μｇ／ μｌのオリゴ（ｄＴ）から成る。これを７０℃に１０分間加熱し、氷上で１分間インキュベートする。次いで以下のものを添加する：２μｌの１０×合成緩衝液（２００ｍＭのトリス塩酸、５００ｍＭの塩化カリウム、２５ｍＭの塩化マグネシウム、１μｇ／ｍｌのＢＳＡ）、２μｌの０．１ＭのＤＴＴ、１μｌの２００Ｕ／μｌのSuperscript 逆転写酵素（Gibco BRL）。これを室温で１０分間、次いで４２℃で５０分間インキュベートする。次いで、反応を７０℃で１５分間インキュベートすることによって終結させる。１μｌのE.coliＲＮａｓｅＨ（２Ｕ／μｌ）をチューブに添加し、これを３７℃で２０分間インキュベートする。ＰＣＲ反応は、０．５ｍｌの薄壁のEppendorfチューブ中にセットアップする。以下の試薬を添加する：１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、１μｌのｃＤＮＡ、１６μｌのｄＮＴＰｓ（２５μｌの１００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰを９００μｌの滅菌蒸留水に）、７μｌの２５ｍＭの塩化マグネシウム、１μｌのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Amplitaq Perkin-Elmer）、プラス滅菌蒸留水で９４μｌに調整。各反応チューブにワックスＰＣＲビーズを添加し（Perkin-Elmer）、チューブを７０℃のホットブロック中に１分間置く。チューブを放冷し、ワックスを固化し、３μｌの各プライマー（３３ｐＭ／μｌ）を上記ワックスに添加する。チューブを温度サイクラー（Perkin-Elmer）中に置き、最初の９４℃での５分間の後に、以下の３工程のプログラムを使用した：９２℃で２分間、５５℃で２分間、７２℃で２分間を３５サイクル。最後の重合工程は７２℃で１０分間添加する。反応生成物を次いで、１％アガロースゲル上で泳動し、生成物のサイズを評価する。さらに、コントロール反応を試料の横で行う。これらは、１）ｃＤＮＡを含まない全成分（陰性コントロール）および２）構成的に発現した生成物、例えば α−アクチンまたはＨＰＲＴについてのプライマーを使用して全反応成分、であるべきである。ＰＣＲ反応の生成物を０．８％〜１．２％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上で調べる。大体の予測されるサイズの増幅産物を表すゲルのバンド（エチジウムブロミドで染色してＵＶ光の下で見ることによって可視化）をゲルから切り出し、ＤＮＡを精製した。さらの興味のあるバンドも、増幅生成物のサザンブロット分析、および得られたフィルターをさらに保存された領域、例えば二次増幅のために使用したものに由来する標識プライマーでプローブすることによって、同定する。得られたＤＮＡを、ｐＣＲＩＩ（Invitrogen）またはｐＧｅｍＴ（これらに限定されない）などの好適なベクターにライゲーションする。次いで、クローンを配列決定し、ラットＤＲＧナトリウムチャンネル配列（ＳＮＳ−Ｂ）と類似性を有する配列を含むものを同定する。クローン分析上記からの候補クローンを使用して、実施例２に記載した方法を使用して構築したヒトｃＤＮＡＤＲＧライブラリーをスクリーニングする。全長クローンが同定されない場合には、全長ヒトｃＤＮＡ相同体をコードする陽性のオーバーラップするクローンを同定し、次いで全長クローンを実施例１に記載したように組み立てる。次いで生物活性を実施例４および７に記載したように確認する。実施例４：Xenopus laevis卵母細胞中でのラットおよびヒトのＤＲＧナトリウムチャンネルのインビトロ翻訳ラットＤＲＧナトリウムチャンネルｃＤＮＡ配列（ＳＮＳ−Ｂ）およびそのヒト相同体によってコードされるタンパク質の生物活性を実証するために、完全な二本鎖ｃＤＮＡコード配列を、ｃＤＮＡが正確な方向で挿入されるように、利用可能な制限酵素部位の１以上を使用してインビトロ転写ベクター（ｐＧＥＭシリーズ（Promega）が挙げられるがこれに限定されない）中にライゲートする。次いで、構築物を使用して細菌を形質転換し、正確な方向に正確な配列を有する構築物を、診断的制限酵素分析およびジデオキシ仲介鎖終始ＤＮＡ配列決定（Sang er他 1977 Proc Natl Acad Sci 74，5463）によって同定する。次いで、これらの構築物をコード配列の下流の制限部位で直線化し、直線化かつ精製したプラスミドを次いでインビトロ転写のための鋳型として利用する。十分な量の合成ｍＲＮＡが、クローニングベクター中に見出されるバクテリオファージプロモーターを認識するバクテリオファージ由来のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用してクローン化ＤＮＡのインビトロ転写を通じて産生される。そのようなポリメラーゼの例としては、Ｔ３、Ｔ７およびＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる（しかし、これらに限定されない）。上記方法の変形は、５’末端キャップ構造（７−メチルグアノシン）を含有するｍＲＮＡの合成であり、その安定性が増加し、その翻訳効率が増大する（Niel son およびShapiro 1986 Nuc Ac Res 14，5936）。これは、合成ｍＲＮＡ合成のために使用した反応混合物に７−メチルグアノシンを添加することによって達成される。キャップ構造は重合が起こる時に転写物の５’末端に取り込まれる。この方法を容易に行うためのキットが入手可能である。例えば、ｍＣＡＰＲＮＡキャッピングキット（Stratagene）インビトロ転写から生成した合成ＲＮＡを単離し精製する。次いでそれをXeno pus laevis卵母細胞中へのマイクロインジェクションによって翻訳する。５０ｎｌｓの１ｍｇ／ｍｌの合成ＲＮＡを文献で確立した方法に従って５期または６期の卵母細胞中にマイクロインジェクトする（Gurdon他、(1983)Methods in Enzym ol 101.370）。インキュベートしてｍＲＮＡの翻訳を行った後、卵母細胞を実施例７に記載されているような電気生理的または他の方法によってＤＲＧナトリウムチャンネルの発現について分析する。機能的ナトリウムチャンネルの発現のためのさらに別の方法は、クローン化ＤＮＡを直接に卵母細胞中で転写して翻訳することを可能にするｐＯＥＶ（Pfaff 他、Anal．Biochem．188，192-195(1990)）などのXenopus 卵母細胞タンパク質発現ベクターの核注入が含まれる。卵母細胞中で翻訳されたタンパク質は保存された真核細胞のシグナルに従って翻訳後修飾を受けているので、これらの細胞はクローン化遺伝子の構造的および機能的分析を行うための便利な系を提供する。ｐＯＥＶは、インビトロでｍＲＮＡを調製することなくクローン化ｃＤＮＡによってコードされるタンパク質の直接的分析のために使用することができ、非常に高い翻訳収量で卵母細胞中でタンパク質を翻訳するための現存する方法を単純化するものである。卵母細胞中でのベクターの転写は、ＴＦＩＩＩＡ遺伝子のためのプロモーターによって駆動され、これは翻訳用の１−２ｎｇ（２日以内の卵母細胞当たり）の安定なｍＲＮＡ鋳型を生成することができる。ベクターはまた、ｍＲＮＡとハイブリダイゼーションプローブを作製するためのインビトロ転写用のＳＰ６およびＴ７プロモーターを含有する。ＳＮＳチャンネル転写物をコードするＤＮＡクローンを卵母細胞核中に注入し、タンパク質は細胞中に２〜１０日間の期間で蓄積される。次いで機能的タンパク質の存在を、実施例７に記載するようにツイン電極電圧クランプを使用して評価する。実施例５：哺乳動物細胞中でのラットおよびヒトＤＲＧナトリウムチャンネルの発現安定な生物活性な様式でナトリウムチャンネルを産生することができる哺乳動物細胞発現系を確立することができるためには、タンパク質を発現することが望まれる細胞系に適切な正確なベクター中のチャンネルのｃＤＮＡから成る構築物を最初に作製しなければならない。哺乳動物細胞中で発現を駆動する強力なプロモーターを含む一連のベクターが入手可能である。ｉ／一時的発現与えられたｃＤＮＡの生物活性を迅速に測定するために、それを細胞中に直接導入し、得られたタンパク質活性を４８〜７２時間後にアッセイする。これは対象となるタンパク質を安定的に発現する細胞株を生み出すわけではないが、分子の生物活性に関する迅速な答えが得られる。具体的には、ヒトまたはラットＤＲＧナトリウムチャンネルを表すｃＤＮＡを、得られた構築物がｃＤＮＡを正確な方向で含有し、異種プロモーターが転写単位の発現を駆動できるように、好適な制限酵素を使用して好適なベクター（ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１（Invitrogen）が挙げられるが、これらに限定されない）中にライゲートする。得られた発現構築物を好適な細胞株中に導入するが、細胞株としてはＣＯＳ−７細胞（アフリカ−グリーン猿腎臓細胞株）、ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎臓細胞株）およびＮＩＨ３Ｔ３細胞（マウス繊維芽細胞株）が含まれるがこれらに限定されない。ＤＮＡを、リン酸カルシウムトランスフェクション、エレクトロポレーションまたはリポフェクタミン（Gibco）トランスフェクションを含むがこれらに限定されない標準法（Sambrook他 1989 Molecular Cloning Second Edition，Cold Spring Harbour Laboratory Press）によって導入する。湿らしたインキュベーター中で３７℃で必要なインキュベート時間後に、細胞を実施例７に記載した方法を使用して活性なラットＤＲＧナトリウムチャンネルの存在について試験する。ｉｉ）安定な発現安定な発現系の産生は一時的発現を上回る幾つかの利点を有する。安定な表現型を有し、外来タンパク質の発現レベルを特定でき、そしてある発現系ではそれを調節することができる、クローナル細胞株を作製できる。また、抗生物質耐性をコードする遺伝子を取り込んでいる一連のベクターが入手可能であり、導入した構築体でトランスフェクトした細胞の選択が可能になる。この型の細胞株は組織培養中で生育させることができ、長期間の貯蔵のために凍結することができる。これを達成するために入手可能な幾つかの系、例えば、ＣＨＯ、ＣＶ−１、ＮＩＨ−３Ｔ３が存在する。具体的には、ＣＯＳ−７細胞を以下の方法でリポフェクタミン（Gibco BRL）を使用してリポフェクションによってトランスフェクトすることができる。各試料につき、２×１０⁶細胞をトランスフェクションの前日に９０ｍｍ組織培養プレート中に接種する。これをＣＯ₂インキュベーター中で３７℃で一晩インキュベートして翌日に５０〜８０％の集密度にする。トランスフェクションの日に、以下の溶液を滅菌１２×７５ｍｍチューブ中に調製する：溶液Ａ：各トランスフェクションにつき、１０〜５０μｇのＤＮＡを９９０μｌの無血清培地（Opti-M EM 1 Reduced Serum Medium Gibco BRL）中に希釈する。溶液Ｂ：各トランスフェクションにつき、５０μｌのリポフェクタミン試薬を９５０μｌの無血清培地中に希釈する。２つの溶液を合わせ、穏やかに混合し、室温で４５分間インキュベートする。この間に細胞を無血清培地で一回リンスする。各トランスフェクションにつき、９ｍｌの無血清培地をＤＮＡ−リポフェクタミンチューブに添加する。この溶液を穏やかに混合し、リンスした細胞の上に重ねる。プレートをＣＯ₂ インキュベーター中で３７℃で５時間インキュベートする。インキュベーション後に、培地を新しい完全培地と交換し、細胞をインキュベーターに戻す。細胞を実施例４および７に詳述するようにトランスフェクション後７２時間の活性をアッセイする。トランスフェクションの効率を確認するために、ｐｃＤＮＡ３中のβ−ガラクトシダーゼをＤＲＧナトリウムチャンネルｃＤＮＡのすぐ横でトランスフェクトする。このコントロールプレートを、色原体基質を使用してβ−ガラクトシダーゼ活性につき染色し、細胞染色の割合を計算した。ＤＲＧの一時的トランスフェクションのために、ｃＤＮＡを最初に、ｐｃＤＮＡ３（Invitrogen ）などの真核細胞発現ベクター中にクローン化しなければならない。実施例６：昆虫細胞中でのラットＤＲＧナトリウムチャンネルの発現バキュロウイルス発現系は、オートグラファカリフォルニア核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）などのバキュロウイルスを使用して、Spodoptera frugiperda 細胞に由来するＳｆ９または２１クローナル細胞株などの昆虫細胞中で大量の標的タンパク質を産生する。高度の発生量の多角体病遺伝子の発現は組織培養中では非本質的であり、その強いプロモーター（ｐｏｌｈ）は外来遺伝子産物の合成のために使用することができる（Smith他、1983 Mol Cell Biol 3，2156-2165）。多角体プロモーターは感染の非常に遅い段階で（感染後２０時間）最高に発現する。ラットＤＲＧナトリウムチャンネルｃＤＮＡがｐｏｌｈプロモーターまたはｐ１０等の別の後期プロモーターの下流にクローニングされている転移ベクターを限定されないがBaculoGoldＤＮＡ（PharMingen）などの修飾したＡｃＮＰＶウイルスＤＮＡと一緒に昆虫細胞中にトランスフェクトする。修飾ＤＮＡは致死的変異を含有し、トランスフェクション後に感染性ウイルス粒子を産生することができない。ｐＡｃＹＭ１（Matsuura他 1987 J Gen Virol 68，1233-1250）またはｐＶＬ１３９２／３（Invitrogen）などの（これらに限定されないが）相補的転移ベクターと同時トランスフェクションすると、生存可能な組み換えウイルスの産生が可能になる。得られるウイルス粒子の９９％以上がプラスミド救助されたウイルスから由来すべきであるけれども、プラークアッセイによってウイルス粒子をさらに精製することが望ましい。組み換えストックがクローナルであることを確認するために、シングルプラークをプラークアッセイから取り出し、増幅して組み換えウイルスストックを産生する。組み換え表現型を一回確認すれば、ウイルスストックを使用して昆虫細胞に感染し、機能的ラットＤＲＧナトリウムチャンネルを発現することができる。増加した発現を付与することができるバキュロウイルス発現の方法の多数の変法が存在する（O'Reilly 他 1992 Baculovirus Expression Vectors; A Laboratory Manual，Oxford University Press）。ラットまたはヒトのＤＲＧナトリウムチャンネルの発現はｃＤＮＡをｐＶＬ１３９２中にクローニングして、これをＳｆ２１昆虫細胞中に導入することによって達成される。実施例７：クローン化ヒトおよびラットＤＲＧナトリウムチャンネル発現の電気生理的解明 Xenopus laevis 卵母細胞を使用して発現ベクター中のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの注入後にチャンネルを発現させる。発現は一時的であり、従って機能的研究は注入後適当な時点で行う。模造（mock）の注入をした卵母細胞との比較により内因的に発現した特徴として新規なチャンネルが欠けていることが実証されるであろう。例えば、Fraser，Moon & Djamgoz（1993）Electrophysiology of Xenop us oocytes: an expression system in molecular neurobiology，In: Electrop hysiology: A practical approach，Wallis，D.J.編 Oxford University Press 第４章、６５−８６頁などに記載されているような標準２電極電圧クランプ（ＴＥＶＣ）技術を使用して、付加した膜電位の変化に対するイオン電流の応答の特徴を調べることができる。適切に改変した生理食塩水培地を使用して検出可能なイオン電流の型を操作できる。ナトリウム流の活性化および不活性化の動力学、そのイオン選択性、逆の電位に対する細胞外培地のイオン濃度の変化の影響、およびＴＴＸに対する感受性（または耐性）は明確な特徴であろう。同様の電気生理的試験を行って、永久的または一時的に発現する哺乳動物細胞株中での機能的発現の成功を評価できるが、パッチクランプ法はＴＥＶＣよりも適切であろう。例えば、Hamill他（1981）Pflugers Arch．391:85-100およびFen wick 他（1982）J.Physiol．331，599-635などに記載されているような全細胞、細胞付着パッチ、インサイドアウトパッチまたはアウトサイドアウトパッチ形態を使用してチャンネルの特徴を評価できるであろう。例えば、単離したトランスフェクトした細胞（上記を参照）を、発現したナトリウムチャンネル流を記録するためにパッチクランプ技術の全細胞変法を使用して電圧クランプ化する。記録は室温で（２２〜２４℃）で得られるであろう。外部および内部記録溶液の両方を使用してＮａ＋流が以前に記載されているように単離されるであろう（ Lalik他、Am．J．Physiol．264:C803-809，1992: West他、Neuron 8:59-70，199 2）。外部溶液（ｍＭ）：塩化ナトリウム、６５；塩化コリン、５０；ＴＥＡ −Ｃｌ、２０；ＫＣｌ、１．５；塩化カルシウム、１；塩化マグネシウム、５；グルコース、５；ＨＥＰＥＳ、５；ｐＨ７．４そしてモル浸透圧濃度（osmolali ty）３２０。内部溶液（ｍＭ）：ＣｓＦ、９０；ＣｓＣｌ、６０；塩化ナトリウム、１０；ＭｇＣｌ₂、２；ＥＧＴＡ、１０；ＨＥＰＥＳ、１０；ｐＨ７．２そしてモル浸透圧濃度（osmolality）３１５発現したナトリウムチャンネル流の動力学および電圧パラメーターを調べ、文献に存在するデータと比較する。これには、電流−電圧の関係およびピーク電流振幅が含まれる。細胞を−７０ｍＶで電圧クランプし、５０ｍＶ（１０ｍＶの変化量で）への脱分極パルスを使用して電流を生成する。発現したナトリウムチャンネル流の薬理はＮａチャンネルブロッカー、テトロドトキシン（ＴＴＸ）を使用して試験される。今日、ナトリウムチャンネルはＴＴＸ感受性とＴＴＸ耐性とに分類されている：各々、低い（１−３０ｎＭ）および高い（＞１μＭ）濃度のＴＴＸでブロックされる（Elliot & Elliot，J．Phys iol.（Lond.）463，39-56，1993，Yang他、J．Neurosci．12:268-277，1992; W1 992）。チャンネルは１マイクロモル濃度以下の濃度のテトロドトキシンにより影響を受けず、１０マイクロモル濃度の濃度のテトロドトキシンで部分的にのみブロックされるにすぎない。実施例８：精製したチャンネルの産生市販の結合した転写−翻訳システムを使用して、ＳＮＳクローンの３５−Ｓメチオニン標識タンパク質産物を産生できる（図３を参照）。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で評価した場合、得られたタンパク質のサイズはＤＮＡ配列決定によって得られるタンパク質の推定サイズと一致する。使用したシステムは Promega TNTシステム（Promega Technical Bulletin 126 1993）である。実験は提供された操作の通りに行う（図３を参照）。実施例９：スクリーニングアッセイにおけるラットまたはヒトナトリウムチャンネルの使用クローン化ナトリウムチャンネルを発現する細胞株を使用して、ナトリウムイオンを細胞膜を通過させる、即ち、チャンネルをブロックするか、その開放を増大させるチャンネルの能力に対する薬物の効果を測定できる。チャンネルの活性化は電圧依存性であるので、脱分極条件が、薬物作用によって改変されるであろうベースラインの活性の観察のために必要であろう。脱分極は、例えば細胞外カリウムイオン濃度を２０または４０ｍＭに上昇させることによって、あるいは電気パルスの反復によって達成できる。ナトリウム伝導性チャンネルの活性化の検出は、放射標識したナトリウムイオン、グアニジンの流量によって、あるいは例えば変色または発光タンパク質の蛍光を導くレポーター遺伝子の活性化によって達成できるであろう。ナトリウムチャンネル活性に対する薬物作用の有効性を続いて確認するには、上記のものと同様の電気生理的試験が必要であろう。実施例１０：インビトロ流入アッセイ１．２２Ｎａ＋流入アッセイ：TamkumおよびCatterall，Mol.Pharm．19:78(19 81)により報告された方法から改良したアッセイを適用した。ナトリウムチャンネル遺伝子を発現する卵母細胞または細胞を、０．１３Ｍの塩化ナトリウム、５ｍＭのＫＣｌ、０．８ｍＭのＭｇＳＯ₄、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−トリス（ｐＨ７．４）、および５．５ｍＭのグルコースを含有する緩衝液中に懸濁する。細胞懸濁液のアリコートを、２２ＮａＣｌ（１．３μＣｉ／ｍｌ、New England Nucl ear，Boston，MA）、０．１２８Ｍの塩化コリン、２．６６ｍＭの塩化ナトリウム、５．４ｍＭのＫＣｌ、０．８ｍＭのＭｇＳＯ₄、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−トリス（ｐＨ７．４）、５ｍＭのウアバイン、１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、および５．５ｍＭのグルコースを含む緩衝液に添加して、１００μＭのベラトリジン（Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO）の存在下または不在下で３７℃ で２０秒間インキュベートする。流入アッセイは、０．１６３Ｍの塩化ナトリウム、０．８ｍＭのＭｇＳＯ₄、１．８ｍＭのＣａＣｌ₂、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ− トリス（ｐＨ７．４）および１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含む氷冷洗浄緩衝液３ｍｌを添加して停止し、ガラス繊維フィルター（Whatman GF/C）上に回収し、３ｍｌの洗浄緩衝液で２回洗浄する。放射活性の取り込みをガンマカウンターで測定する。特異的なテトロドトキシン−耐性流入を、１０μＭのトランスメトリン（transmethrin）または１μＭ（＋）のトランスアレトリン（trans allethri n）の不在下または存在下における２２Ｎａ＋取り込みの相違によって測定する。テトロドトキシン感受性流入は、１μＭのテトロドトキシン（Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO）の不在下または存在下での２２Ｎａ＋取り込みの相違によって測定される。グアニジン流入：Reith，Eur．J．Pharmacol．188:33(1990)により記載された方法から別のアッセイを改良する。このアッセイでは、ナトリウムイオンをグアニジニウムイオンに取り替える。卵母細胞または細胞を、４．７４ｍＭのＫＣｌ、１．２５ｍＭのＣａＣｌ₂、１．２ｍＭのＫＨ₂ＰＯ₄、１．１８ｍＭのＭｇＳＯ₄、２２ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、２２ｍＭの塩化コリンおよび１１ｍＭのグルコースを含有する緩衝液で２回洗浄する。卵母細胞または細胞を、２５０μＭのグアニジンを含有する同一の緩衝液中に１９〜２５℃で５分間懸濁する。１４Ｃ標識したグアニジン塩酸塩（３０〜５０ｍＣｉ／ｍｍｏｌ、New Engl and Nuclear，Boston，MAにより供給）のアリコートを１０μＭのベラトリジンの不在下または存在下で添加し、混合物を３分間インキュベートする。取り込み反応をWhatman GF/Fフィルターによる濾過によって停止した後、氷冷０．９％生理食塩水で２５ｍｌ洗浄する。放射活性取り込みをシンチレーション計測によって測定する。実施例１１インビトロ系でのナトリウムチャンネルの発現を測定すると同時にインビボでの発現の分布および相対レベルを分析し、機能をブロックすることを試みるために、図１に示すＳＮＳタンパク質配列から誘導したペプチドおよびタンパク質フラグメントに対してポリクローナルおよびモノクローナル抗体が作成される。ａ）免疫原グルタチオン−スルホトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質を、Phar maciaから得たＰＧＥＸベクターを使用して構築する（SmithおよびJohnson Gene 67:31-40(1988)）。ＳＮＳ−Ｂ以外の既知のナトリウムチャンネルとほとんど相同性を有さない細胞内および細胞外ループの両方を含む融合タンパク質が作製される。一つのそのような方法では、フラグメントをｐＧｅｘ−５Ｘ３またはｐＧｅｘ４ｔ２中にサブクローニングし、図４に詳細な地図で示すような細胞外、細胞内またはＣ末端ドメインをコードするインフレーム融合タンパク質を作製することが含まれる。ｐＧＥＸ融合ベクターを、アンピシリンの存在下で成長した E．coli XL-1 blue 細胞または他の好適な細胞中に形質転換する。培養物がＯＤ６００＞０．５の光学密度に達した後に、融合タンパク質合成を１００マイクロモル濃度のＩＰＴＧの添加によって誘導し、培養物をさらに１〜４時間インキュベートする。細胞を遠心によって採取し、氷冷リン酸緩衝生理食塩水で洗浄する。次いで、得られたペレット（各５０ｍｌ培養物からの３００マイクロリットルのＰＢＳに溶解）を２ｍｍ直径プローブを使用して氷上で超音波処理し、溶解した細胞をマイクロ遠心し、破片を除去する。次いで、５０マイクロリットルのグルタチオン−アガロースビーズを各ペレットに添加し、室温で２分間穏やかに混合した後、ビーズをＰＢＳ中で連続的にスピンすることにより洗浄する。洗浄したビーズを次いで、Laemmliゲル試料緩衝液中で煮沸し、１０％ポリアクリルアミドＳＤＳゲルに適用する。予測された分子量の位置に移動する物質が、クーマシーブルーによる簡単な染色と、分子量マーカーとの比較によりゲル上で同定される。次いで、この物質をゲルから電気溶出させ、以下に記載するように免疫原として使用する。ｂ）抗体作製雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを、フロインド完全アジュバンド中に乳化した１〜１００マイクログラムのＧＳＴ融合タンパク質で腹腔内（intraperiteonally）に免疫する。４週間後、動物をさらにフロインド不完全アジュバンド中に乳化した融合タンパク質（１〜１００マイクログラム）で免疫する。４週間後、動物をフロインド不完全アジュバンドで乳化した１〜１００マイクログラムのＧＳＴ融合タンパク質で腹腔内に免疫する。７日後、動物の尾から採血し、その血清を以下のスクリーンによって免疫原に対する抗体の産生につき評価する（注入は全て皮下に行い、１０倍多い免疫原を使用する以外は、ウサギポリクローナル血清の産生のための方法と同じである。ポリクローナルウサギ血清を耳静脈血液から単離する）。０．５％のＮＰ−４０および１％の正常ヤギ血清を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の連続的な１０倍希釈の血清（１：１００〜１：１０００，０００）を、ＰＢＳ中の１０％ヤギ血清で予め処理した新生児ラット脊髄の４％パラホルムアルデヒドで固定した１０ミクロンの切片に適用する。一晩インキュベーションした後、切片をＰＢＳ中で洗浄し、１％正常ヤギ血清を含有するＰＢＳ中で２時間ヤギ抗マウス抗体のＦＩＴＣ結合Ｆ（ａｂ）₂フラグメント（１：２００）とともに暗所でインキュベートする。切片をさらにＰＢＳ中で洗浄し、Ci tifluor中にマウントし、蛍光顕微鏡検査により調べる。脊髄中のラミナー（lam inar）ＩＩの特異的染色を示す血清を保持し、そのような抗体を産生するマウスをモノクローナル抗体の産生のために引き続いて使用する。３週間後、有用な抗体を産生するマウスをアジュバンドを使用せずにＧＳＴ−融合タンパク質で免疫する。３日後、動物を屠殺し、その脾臓を取り出し、リンパ球細胞を、ポリエチレングリコールを使用して、チミジンキナーゼ陰性ミエローマ株ＮＳ０または均等物と融合する。各実験からの融合細胞を、ミエローマ細胞を殺すために、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地並びにヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（ＨＡＴ）培地の存在下で３×２４ウエルプレート中で成長させる（ KohlerおよびMilstein，Eur.J.Immunol 6，511-519(1976)）。ハイブリドーマを含有するウエルからの組織培養上清を上記したように免疫蛍光によりさらにスクリーニングし、陽性のウエルからの細胞を限界希釈によりクローン化する。次いで、陽性の試験用クローン化ハイブリドーマからの抗体を使用してラット背根神経節の抽出物をウエスタンブロットし、抗体がサイズ約２００，０００のバンドを認識するかどうかを決定し、ＳＮＳナトリウムチャンネルに対するモノクローナル抗体の特異性を確認する。次いで、これらの基準の両方による試験の結果陽性である細胞外ドメインに対する抗体を、ナトリウムチャンネル機能の電気生理的試験（実施例７を参照）、並びにナトリウムチャンネルを発現する細胞株中でのイオン流量または染料に基づいたアッセイに依存すスクリーニング（実施例９および１０）において活性をブロックする機能について評価する。実施例１２：発現の細胞型分布 In situハイブリダイゼーションにより、感覚ニューロンのサブセット中におけるＳＮＳの存在を実証する。位置１７４０および１９６０の間のＳＮＳフラグメントをｐＧｅｍ４ｚ中にサブクローニングし、ＤＩＧ−ＵＴＰ標識センスまたはアンチセンスｃＲＮＡを生成した。試料の調製、ハイブリダイゼーション、およびアルカリホスファターゼ結合抗ＤＩＧ抗体によるin situハイブリダイゼーションの視覚化は、Schaeren-WimersN.およびGerfin-Moser A.Histochemistry 1 00，431-440（1993）に記載されている通りに行った。実施例１３：Xenopus oocytes中で発現させたラットＤＲＧナトリウムチャンネルの電気生理的特性ＳＮＳナトリウムチャンネルをコードするＤＮＡを含有するpBluescript SKプラスミドを市販のキット（Erase a base system，Promega，Madison，Wisconsin ，USA）を使用して開始メチオニンの上流の位置−２１に消化した。直線化および消化したプラスミドをＫｐｎＩで切断し、卵母細胞発現ベクターｐＳｐ６４ＧＬ（Ｓｍａ−ＫｐｎＩ）部位中にサブクローニングした。ｐＳＰ６４ＧＬはｐＳＰ６４．Ｔに由来する。ｐＳＰ６４ＴをＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、Kl enowフラグメントで平滑末端にし、再環化する。ｐＧｅｍ７２（＋）ポリリンカー（ＳｍａＩ−ＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ）の一部をｐＳＰ６４．Ｔの平滑末端化したＢｇｌＩＩ部位にライゲーションした。ＤＮＡインサート用（ＳｍａＩ−ＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ）および直線化用（ＳａｌＩ−ＸｂａＩ −ＢａｍＨＩ）の変更したポリリンカーを有するこのベクターをｐＳＰ６４ＧＬと称する。得られたプラスミドをＸｂａＩで直線化し、１ｍＭの７−メチルＧｐｐＧを使用してｃＲＮＡをＳＰ６ポリメラーゼで転写した。ｃＲＮＡ（７０ｎｇ）をXenopus 卵母細胞に記録の７〜１４日前に注入した。直径、従ってキャパシタンスがより小さいために、未成熟なＩＶ期の卵母細胞を選択した。卵母細胞を３ＭのＫＣｌ電極（≦１ＭΩ）で突き刺し、１９．５〜２０．５℃の温度で、１１５ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１．８ｍＭのＭｇＣｌ₂、および１ｍＭのＣａＣｌ₂を含有する改変Ri nger溶液（ｐＨ７．２）で３〜４ｍｌ／分で灌流した。２つの電極電圧−クランプ電流記録のデジタルリーク差引き（digital leak substraction）を、試験脱分極コマンドと同一の振幅の過分極パルスによって生成したリーク電流を使用して行った。リークコマンドが時間依存的電流を引き出した卵母細胞は廃棄した。１０回の記録の平均を試験およびリークの両方に使用した。ナトリウムチャンネルｃＲＮＡを注入した卵母細胞中において、１０ｍＶの段階で−６０ｍＶから−２０〜＋４０ｍＶのコマンド電位へと、そして−８０ｍＶから−３０〜＋２ｍＶのコマンド電位へと、１０ｍＭの段階で脱分極することによって、内向き電流を喚起した。電流トレースを電圧段階の開始から最初の１．５ｍｓの間にブランクにし、明確さのためにキャパシティ過渡電流（capacity t ransients）を削除する。ピーク電流は２つの保持電位に関して同一のコマンド電圧において到達するが、定常状態の不活性化のために−６０ｍＶからわずかに小さい。ナトリウムチャンネル流に対する、Ｎ−メチル−Ｄ−グルコサミンによる外部Ｎａ＋の５０％または１００％置換の効果を、卵母細胞に付与される脱分極電流を−６０から＋１ｍＶへと段階的にすることによって引き出した。データを方程式ｈ_x＝１／（１＋ｅｘｐ（（ｖ−ｖ₅₀）／ｋ））に当てはめた。式中、Ｖはパルス前の電位であり、Ｖ₅₀は５０％不活性化の電位であり、ｋは傾き係数である（最四角形が適合する）。ピークＮａ⁺流に対するＴＴＸ（１０μＭおよび１００μＭ）の効果（−６０〜＋２０ｍＶの試験パルス）も測定した。効果は洗浄すると速やかに可逆的であった。ｃＲＮＡ注入から７日間の最小のインキュベーション後に、−３０ｍＶに対して正の電位への段階的脱分極によって内向き電流が引き出され、これは＋１０〜＋２０ｍＶの間でピークに達し、１６４±７２ｎＡの平均最大振幅を有し（−６０ｍＶの保持電位から、ｎ＝１３）、＋３５．５±２．２ｍＶ（ｎ＝１０）の逆転電位を有する。内向き電流は、一時的カチオン（Ｎ−メチル−Ｄ−グルコサミン）によって外部培地中のＮａ＋を完全に置換すると、逆転した。電流の逆転電位は過分極指令中で１３．７±３．２ｍＶだけ５０％Ｎａ＋中においてシフトした（ｎ＝３；Ｎａ＋選択的チャンネルについでの予測値、１７．５ｍＶ）。１秒のプレパルスによって産生した不活性化は−３０．０±１．３ｍＶで最大の半分であった（傾き係数１４．０±１．７ｍＶ、ｎ＝５）。ＴＴＸは、ナノモル濃度で作用せず、１０μＭで１９．１±８．３％の減少のみを産生した（ｎ＝３）。見積もりの最大の半分阻害濃度（ＩＣ₅₀）は５９．６ ±１０．１μＭのＴＴＸであった。局所麻酔薬リグノカインもまた弱い阻害性を示し、−６０ｍＶから＋１０ｍＶへの脱分極パルスによって引き出されたピーク電流に対して１ｍＭで４１．７± ５．４％の最大ブロックを産生した（１毎分；ｎ＝３）一方、同一の条件下で、１００μＭのフェニトイン（phenytoin）は作用しなかった。ＤＲＧニューロンのＴＴＸ非感受性Ｎａ＋流と同様なのは、ピークＮａ⁺流を減少する際の、Ｐｂ²⁺対Ｃｄ²⁺の有効性とランクオーダーであった（各々５０μ Ｍおよび１００μＭで、Ｐｂ²⁺については−６３．９±１８．１％であるのに対してＣｄ²⁺については−２４．４±７．９％；ｎ＝３、Ｐ＝０．０１８９）。すなわち、卵母細胞が発現したＤＲＧナトリウムチャンネルの電気生理的および薬理学的特性は、卵母細胞系での発現の抑制を与えれば、感覚ニューロンＴＴＸ非感受性チャンネルの特性で同様である。ＤＲＧナトリウムチャンネルを発現する卵母細胞では、Ｉ／Ｖプロットのピークは、同様の逆転電位にもかかわらずＤＲＧＴＴＸ非感受性電流のものより脱分極した電位で生じた。この相違は、他のＮａ⁺チャンネルのサブユニットとともに発現した場合に、より負の電位に活性化をシフトすることが知られている、ＤＲＧに見いだされたアクセサリーβ１サブユニットの不在を反映しているかもしれない。さらに、ＳＮＳナトリウムチャンネルに対してより負の活性化閾値を示すスプライス変異体が、感覚ニューロンに見いだされるより負な電位に活性化をシフトさせるのかもしれない。実施例１４：新生または成体ラット組織サンド細胞株におけるＤＲＧナトリウムチャンネルの分布ノザンブロットおよび逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、新生児および成体ラット組織をＤＲＧナトリウムチャンネルメッセンジャーＲＮＡの発現について試験した。ＳＮＳナトリウムチャンネル核酸配列の内部ドメイン領域１（ヌクレオチド位置１，４７８−１，８９２）からのランダムプライムした³²Ｐ標識ＤＮＡＰｓｔＩ−ＡｃｃＩフラグメントプローブ（５０ｎｇ、比活性２×１０⁹ｃｐｍ／μｇＤＮＡ）を使用して組織から抽出した全ＲＮＡをプローブした。以下の組織および細胞株を試験した：新生ラットからの中枢神経系及び非ニューロン組織；新生 Schwann細胞および交感神経ニューロンを含む末梢神経組織、並びにＣ６グリオーマ、ヒト胎児カルシノーマ株Ｎ−tera−２およびＮ−tera−２ニューロ、ラット感覚ニューロン由来の株ＮＤ７およびＮＤ８、およびＮＧＦの存在下で生育させたヒト神経芽細胞腫ＳＭＳ−ＫＣＮおよびＰＣ１２細胞；下垂体、上頸神経節、腹腔神経節、三叉神経中脳路核、輸精管、膀胱、回腸、並びに誕生時にカプサイシン（５０ｍｇ／ｋｇ）で処理した成体動物のＤＲＧを含む成体ラット組織、および新生ＤＲＧコントロール。全ＲＮＡ（１０μｇ）、または上頸神経節試料（１０μｇ）およびカプサイシン処理した成体ラットＤＲＧ（５μｇ）を別にした組織からの２５μｇのＲＮＡをノザンブロットした。全ＲＮＡを１．２％アガロースホルムアルデヒドゲル上で分離し、Hibond-Nフィルター（Amersham）上にキャピラリーブロットした。ブロット上のＲＮＡの量は、リボソームＲＮＡのエチジウムブロミド染色によって並びに偏在して発現したＬ−２７リボソームタンパク質転写物によるハイブリダイゼーションによって判断した場合で、ほぼ同一であった。フィルターを、５０％ホルムアミド、０．５％のドデシル硫酸ナトリウムを含有する５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、１００μｇ／ｍｌの煮沸超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（平均サイズ３００ｂｐ）、１０μｇ／ｍｌのポリＵおよび１０μｇ／ｍｌのポリＣ中において４５℃で６時間プレハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションプローブ１ｍｌ当たり１０⁷ｃｐｍを使用して同一の条件下での３６時間のハイブリダイゼーション後に、フィルターを２×ＳＳＣで室温で簡単に洗浄し、次いで、６８℃で１５分間０．５％のＳＤＳを含む２×ＳＳＣで２回洗浄し、次いで６８℃で０．５％のＳＤＳ、０．２×ＳＳＣ中で２０分間洗浄した。フィルターをオートラジオグラフィーフィルム（Kodak X-omat）上で一晩または４日間オートラジオグラフィーをとった。ＲＴ−ＰＣＲ実験のために、新生ラット組織（脾臓、肝臓、腎臓、肺、腸、筋肉、心臓、上頸神経節、脊髄、脳幹、海馬、小脳、皮質および背根神経節）からの１０μｇの全ＲＮＡ、または培養中のコントロールまたはカプサイシン処理ラットＤＲＧまたはＤＲＧニューロンからの２μｇの全ＲＮＡをＤＮａｓｅＩで処理し、酸性フェノールで抽出してゲノムＤＮＡを除去する。ｃＤＮＡをオリゴｄＴ（１２−１８）プライマーを使用してSuperscript逆転写酵素により合成し、Qiagen 5 tips上で精製した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用してｃＤＮＡを増幅し（３５サイクル、９４℃で１分、５５℃で１分および７２℃で１分）、生成物をアガロースゲル上で分離し、エチジウムブロミドで染色する。Ｌ−２７プライマー（Ninkina 他（1983）Nucleic Acids Res ．21，3175-3182）を、５’−ＣＡＧＣＴＴＣＧＣＴＣＡＧＡＡＧＴＡＴＣＴ−３’(配列番号９)および５’−ＴＴＣＴＣＧＣＣＧＴＴＣＣＡＣＡＣＧＧＡＧＡ−３’(配列番号１０)から成るＤＲＧナトリウムチャンネル特異的プライマーとともに反応の開始後５サイクル目にＰＣＲ反応に添加した。ＤＲＧナトリウムチャンネルをコードするｍＲＮＡの転写は、ノザンブロットまたはｍＲＮＡの逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応を使用した場合、いずれの非ニューロン組織または中枢神経系において検出できなかった。上頸神経節およびSchwann細胞含有座骨神経集団からの交感神経ニューロン、並びに幾つかのニューロン細胞株もまた陰性であった。しかし、新生および成体ラットＤＲＧからの全ＲＮＡ抽出物からはノザンブロット上に約７ｋｂのサイズの強いシグナルが得られた。これらのデータはＤＲＧナトリウムチャンネルが発生の初期においてのみ発現するわけではないことを示唆している。ＤＲＧナトリウムチャンネルプライマーおよびＬ−２７リボソームタンパク質プライマーを使用する各種組織からのオリゴｄＴプライムしたｃＤＮＡのＲＴ− ＰＣＲは、ＤＲＧ組織のみにおいてＤＲＧナトリウムチャンネル転写物が存在することを示した。カプサイシン（一晩１０μＭ）で培養かつ処理したＤＲＧニューロンまたはカプサイシン（連続する２日間で５０ｍｇ／ｋｇ）で処理し、その後５日後にＤＲＧを単離した新生動物から解剖したＤＲＧニューロンからのＤＲＧナトリウムチャンネルおよびＬ−２７転写物についてもＲＴ−ＰＣＲを行った。Ｌ−２７プローブからのシグナルはカプサイシン処理細胞培養物または動物中において、カプサイシンで処理しなかったコントロールと比較して同一であった。コントロールと比較して、カプサイシンで処理した培養物または動物からのＤＲＧナトリウムチャンネルシグナル中には有意な減少が存在した。逆転写酵素処理を行わないコントロールＰＣＲ反応も実施して、ゲノムＤＮＡの汚染をコントロールした。新生ラットをカプサイシンで処理し、全成体ＤＲＧＲＮＡを続いてノザンブロットによって試験したところ、シグナルは実質的に減少しており、ＤＲＧナトリウムチャンネル転写物がカプサイシン感受性（優越的に侵害受容性の）ニューロンによって選択的に発現していることが示唆される。これらのデータは、ＤＲＧニューロンの両培養物でのＲＴ−ＰＣＦ実験によって、および全動物試験において確認された。実施例１５：ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるラット組織中でのＤＲＧナトリウムチャンネルの分布Ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションを使用して、成体三叉神経神経節並びに新生および成体ラットＤＲＧの両方における単一細胞レベルでのＤＲＧナトリウムチャンネル転写物の発現を調べた。ＳＮＳナトリウムチャンネル核酸配列の位置１，７３６〜１，７９７の間の内部ドメイン領域ＩのＳＮＳナトリウムチャンネルＰＣＲフラグメントをｐＧｅｍ３Ｚ（Promega，Madison，Wisconsin，USA）中にサブクローニングし、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）−ＵＴＰ（Boehringer-Mannheim，Germany）標識したセンスまたはアンチセンスｃＲＮＡを各々ＳＰ６またはＴ７ポリメラーゼを使用して作製した。アルカリホスファターゼ結合抗−ＤＩＧ抗体を使用するin situハイブリダイゼーションの試料の調製、ハイブリダイゼーションおよび可視化は以下の改良を加えて、Schaeren-Wimers他、A.（1993）Histochemistry 100: 431-440に記載されているように行った。新生ラット腰椎ＤＲＧの凍結組織切片（１０μＭ厚さ）、および成体三叉神経神経節ニューロンを４％のパラホルムアルデヒドを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で１０分間固定した。切片を０．１Ｍのトリエタノールアミン、０．２５％の無水酢酸中で１０分間アセチル化した。プレハイブリダイゼーションを、５０％のホルムアミド、４×ＳＳＣ、１００μ ｇ／ｍｌの煮沸超音波処理ｓｓＤＮＡ、５０μｇ／ｍｌの酵母ｔＲＮＡ、２×デンハルト溶液中で室温で１時間行った。ハイブリダイゼーションを同一緩衝液中で６５℃で一晩行った。プローブ濃度は５０ｎｇ／ｍｌであった。切片を２×ＳＳＣ中で３０分間７２℃で１時間洗浄し、０．１×ＳＳＣ中え３０分間７２℃で２回洗浄した後、抗ジゴキシゲニンアルカリホスファターゼ結合抗体を使用して室温で可視化した。次いで同一の切片を、大直径ニューロン中に見られる神経フィラメントに特異的なマウスモノクローナル抗体ＲＴ９７で染色した。両組織からの感覚ニューロンのサブセットは、ＤＲＧナトリウムチャンネル特異的プローブにより強いシグナルを示した。大直径ニューロン特異的モノクローナル抗体ＲＴ９７とＤＲＧナトリウムチャンネル特異的プローブによる免疫組織化学の組み合わせにより、大部分の大直径ニューロンはＤＲＧナトリウムチャンネル転写物を発現しないことが示された。小直径ニューロンはＤＲＧナトリウムチャンネル特異的プローブで染色されたが、大直径ニューロンは染色されなかった。実施例１６：ＳＮＳナトリウムチャンネルの部位特異的突然変異誘発−ＴＴＸ感受性ＳＮＳナトリウムチャンネルはテトロドトキシン非感受性心臓ナトリウムチャンネルと６５％の相同性を有する。チャンネル心房に沿って並ぶ多数の残基がテトロドトキシン結合に関与している。ＳＮＳナトリウムチャンネルのアミノ酸配列は９個のそのような残基のうち７個において他のテトロドトキシン感受性ナトリウムチャンネルと配列同一性を示す。１個の相違はＤ（９０５）Ｅでの保存的置換でる。一個の残基（Ｃ−３５７）は、ナトリウムチャンネルに対するテトロドトキシン結合において重要な役割を担うことが示された。ＳＮＳナトリウムチャンネルでは、親水性セリンがこの位置で見つかる一方、ＴＴＸに感受性である他のナトリウムチャンネルはこの位置にフェニルアラニンを有する。標準技術および配列ＴＧＡＣＧＣＡＧＧＡＣＴＣＣＴＧＧＧＡＧＣＧＣＣ（配列番号３１）を有するプライマーを使用する部位特異的突然変異誘発を使用してＳＮＳナトリウムチャンネル中の位置３５７で、セリンの代わりにフェニルアラニンに置き換える。変異したＳＮＳナトリウムチャンネルは、Xenopus 卵母細胞中で発現した場合、天然のチャンネルと同様の振幅および時間経過で電圧ゲート化電流を産生する。しかしながら、ＴＴＸへの感受性は回復して２．５ｎＭのＩＣ₅₀を与え（＋−０．４、ｎ＝５）、同一の位置に芳香族基を有する他の電圧ゲート化ナトリウムチャンネルと同様であった。以下の表はＳＮＳナトリウムチャンネル、およびラット脳ｉｉａ、筋肉Ｉ型、心臓テトロドトキシン非感受性ナトリウムチャンネルについてのＩＣ₅₀を示す。ＴＴＸ感受性ＦＲＬＭ配列番号１１；ＴＱＤＦＷＥＮＬＹ配列番号１２；ＴＱＤＹＷＥＮＬＹ配列番号１３；ＴＱＤＣＷＥＲＬＹ配列番号１４；ＴＱＤＳＷＥＲＬＹ配列番号１５；ＴＱＤＦＷＥＲＬＹ配列番号１６実施例１８ポリクローナル抗体を、ＳＮＳナトリウムチャンネルタンパク質アミノ酸配列から誘導される以下のペプチドに対してウサギにおいて作製した：ペプチド１ＴＱＤＳＷＥＲ（配列番号１７）ペプチド２ＧＳＴＤＤＮＲＳＰＱＳＤＰＹＮ（配列番号１８）ペプチド３ＳＰＫＥＮＨＧＤＦＩ（配列番号１９）ペプチド４ＰＮＨＮＧＳＲＧＮ（配列番号２０）ペプチドをキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合し、ウサギ中に繰り返し注入する。ウサギからの血清をウエスタンブロットによって処理する。幾つかの血清は陽性の結果を示し、血清中にペプチドに特異的な抗体が存在することが示された。参考文献 Catterall W.A.（1992）Physiol．Rev．72，S4-S47 CohenS.A．および Barchi R.L.（1993）Int．Rev．Cytology 137c，55-103 Hodgkin A.L.およびHuxley A.F.(1952)J.Physiol．116，473-496 Hille B.（1991）Ionic channels in excitable membranes(Sinauer Sunderland MA) Jeftjina S.（1994）Brain Res．639，125-134 Kohler G.およびMilstein C.（1976）Eur J．Immunol 6，511-519 Lewin B.（1995）Genes V Oxford University Press，Oxford Melton D 他（1984）Nucleic Acids Res．12，7035 Nowycky M.（1993）in Sensory Neurons（Scott S.編）OUP，Oxford Omri，G.およびMeir，H.（1990）J．Membrane Biol．115，13-29 Pearce，R.J．およびDuchen M.R.（1994）Neuroscience 63，1041-1056 Pfaff SL; Tamkun-MM; Taylor-WL（1990 Anal-Biochem．1990 188 192-195） Schaeren-Wimers N.およびGerfin-Moser A.(1993)Histochemistry 100,431-440 Smith D.B.およびJohnson K.S.（1988）Gene 67，31-40

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 48/00 // Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ

Claims

【特許請求の範囲】１．ナトリウムチャンネルがテトロドトキシンに対して非感受性である、哺乳動物感覚ニューロンナトリウムチャンネルタンパク質。２．タンパク質が背根神経節に由来する、請求の範囲第１項記載のナトリウムチャンネルタンパク質。３．ナトリウムチャンネルタンパク質がラットタンパク質である、請求の範囲第２項記載のナトリウムチャンネルタンパク質。４．ナトリウムチャンネルタンパク質がヒトタンパク質である、請求の範囲第２項記載のナトリウムチャンネルタンパク質。５．タンパク質が配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８に示すアミノ酸配列を含む、請求の範囲第３項記載のナトリウムチャンネルタンパク質。６．タンパク質が配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求の範囲第５項記載のナトリウムチャンネルタンパク質。７．タンパク質がＮＣＩＭＢ受託番号４０７４４で寄託されたインサートによってコードされるアミノ酸配列を含む、請求の範囲第３項記載のナトリウムチャンネルタンパク質。８．請求の範囲第１項から第７項のナトリウムチャンネルタンパク質をコードする核酸配列またはその相補鎖。９．核酸配列が配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に示す核酸配列のコード部分を含む、請求の範囲第８項記載の核酸配列。１０．核酸配列が配列番号１に示す核酸配列のコード部分を含む、請求の範囲第９項記載の核酸配列。１１．請求の範囲第８項または請求の範囲第１０項の鎖にハイブリダイズする核酸。１２．ＮＣＩＭＢ受託番号４０７４４で寄託されたインサートのコード部分の配列を含むラット背根神経節ナトリウムチャンネルタンパク質をコードする核酸配列またはその相補鎖。１３．請求の範囲第８項〜第１２項の核酸配列を含むベクター。１４．請求の範囲第８項〜第１２項の核酸配列で形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞。１５．テトロドトキシンに非感受性である哺乳動物背根神経節ナトリウムチャンネルの調節物質を同定するための方法であって、上記チャンネルに試験化合物を接触させ、上記チャンネルの活性を検出することを含む方法。１６．請求の範囲第１項記載のナトリウムチャンネルタンパク質に特異的な抗体。１７．請求の範囲第１項〜第７項記載のナトリウムチャンネルタンパク質をコードする核酸配列。１８．請求の範囲第１２項に定義した核酸配列を含む発現ベクター。１９．請求の範囲第１８項に定義した発現ベクターを含む宿主細胞。２０．請求の範囲第１項〜第７項のいずれか１項に定義したナトリウムチャンネルタンパク質の製造方法であって、請求の範囲第１９項に定義した宿主細胞をナトリウムチャンネルタンパク質の発現に好適な条件下で培養し、発現したナトリウムチャンネルタンパク質を所望により精製することを含む方法。