JPH11506004A - バシラス農薬活性の増強物質を産生する突然変異体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、バシラス（Bacillus）関連農薬、化学農薬および／または農薬特性を有するウイルスの農薬虫活性を増強する因子を産生するバシラス突然変異体に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 バシラス農薬活性の増強物質を産生する突然変異体 本出願は1993年11月３日付け出願第08/146,852号の一部継続出願であり、その 出願第08/146,852号は1993年７月20日付け出願第08/095,240号の一部継続出願で あり、その出願第08/095,240号は1992年12月14日付け出願第07/990,202号の一部 継続出願であり、その出願第07/990,202号は1992年11月５日付け出願第07/971,7 86号の一部継続出願である。 １．発明の分野 本発明は、バシラス（Bacillus）関連農薬、化学農薬および／または農薬特性 を有するウイルスの農薬活性を増強する因子を親株より多量に産生する突然変異 体バシラス株、あるいは親株より強い増強活性を有するそのような因子を産生す る突然変異体バシラス株、およびそのような突然変異株の生産方法に関する。ま た、本発明は、該因子の入手方法に関する。 ２．発明の背景 毎年、農業、林業および公衆衛生に有害な生物が、何百万ドルもの損害を与え ている。そのような有害生物を防除するために、種々の対策が講じられている。 １つの対策は、広域のまたは広スペクトルの活性を有する化学農薬を使用する ことである。しかしながら、化学農薬の使用には多くの欠点がある。特に、その 活性スペクトルが広いため、この種の農薬は、益虫や、有害生物に対する寄生生 物などの標的でない生物を殺してしまうことがある。また、化学農薬は、動物や ヒトに有毒なことが多い。さらに、標的有害生物は、そのような物質に繰返しさ らされると、抵抗性を発達させることが多い。 もう１つの対策には、昆虫、真菌および雑草の発生を防除する生物農薬の使用 が含まれる。生物農薬は、天然に存在する病原体および／またはこの病原体によ り産生される物質である。生物農薬を用いる利点としては、生物農薬では、化学 農薬と比べて、一般に、標的でない生物や環境に対する害が全体的に少ないこと が挙げられる。 ２．１．バシラス・スリンジエンシス 最も広く用いられている生物農薬は、バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）である。バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiens is）は、天然、特に土壌中や昆虫が豊富にいる環境に広く分布する運動性で桿状 のグラム 陽性細菌である。バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）は、 胞子形成期に、パラ胞子（parasporal）結晶性封入体を産生し、これがチョウ目 （鱗翅類）、ハエ目（双翅類）およびコウチュウ目（甲虫類）の感受性昆虫の幼 虫に摂食されて殺虫性を示す。その封入体の形状、数および組成は様々であるこ とが可能である。それは、27〜140kDaの範囲の大きさとなりうるδ−内毒素と称 される１以上のタンパク質よりなる。殺虫性δ−内毒素は、一般に、幼虫の腸内 のプロテアーゼにより、より小さな（トランケート化）毒性ポリペプチドに変換 され、中腸の破壊を引き起こし、最終的にその昆虫を死に至 Reviews 53:242-255）。 いくつかのバシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）株が、林 業、農業および公衆衛生の分野で生物農薬として広く用いられている。バシラス ・スリンジエンシス亜種クルスタキ（Bacillus thuringiensis subsp．kurstaki ）およびバシラス・スリンジエンシス亜種アイザワイ（Bacillus thuringiensis subsp．aizawai）は、鱗翅類に特異的なδ−内毒素を産生する。甲虫類に特異 的なδ−内毒素は、バシラス・ スリンジエンシス亜種テネブリオニス（Bacillus thuringiensis subsp．tenebr ionis）により産生される（Kriegら,1988,米国特許第4,766,203号）。さらに、 バシラス・スリンジエンシス亜種イスラエレンシス（Bacillus thuringiensis s ubsp．israelensis）は、双翅類に特異的なδ−内毒素を産生する（Goldberg，1 979，米国特許第4,166,112号）。 双翅類害虫に特異的な他のバシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringie nsis）株も既に記載されている。双翅類および鱗翅類に有毒なバシラス・スリン ジエンシス（Bacillus thuringiensis）分離株が開示されている（Hodgmanら，1 993,FEMS Microbiology Letters 114:17-22）。この分離株由来の精製した結晶 性δ−内毒素のSDSポリアクリルアミドケル電気泳動により、CryIA（b）毒素、C ryIB毒素およびCryIIA毒素と関連した３つのタンパク質種が示された。分子量が 140、122、76、72および38kDaのタンパク質よりなる双翅類に活性な結晶を産生 するバシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）分離株も開示され ている（Payne，1994，米国特許第5,275,815号）。EP0480,762は、それぞれ双翅 類害虫に対して活性であり、独特の結晶性δ−内毒素パターンを有す る５つのビー・ティー（B．t.）株を開示している。 鱗翅類、甲虫類および双翅類以外の有害生物に対する農薬活性を有するいくつ かのバシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）株が記載されてい る。線虫に有毒なδ−内毒素を産生する５つのバシラス・スリンジエンシス（Ba cillus thuringiensis）株が開示されている（Edwards，PayneおよびSoares，19 88，欧州特許出願第0 303 426 B1号）。寄生性原生動物の宿主となったヒトおよ び動物の治療に使用できるバシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiens is）PS81F株も開示されている（ThompsonおよびGaertner，1991，欧州特許出願 第0 461 799 A2号）。ダニ害虫に対する活性を有するいくつかのバシラス・スリ ンジエンシス（Bacillus thuringiensis）分離株も開示されている。これらの分 離株は、35kDa〜155kDaの（広い）範囲の分子量を有するタンパク質よりなる結 晶を産生する(Payne，CannonおよびBagley，1992，PCT出願第WO92/19106号）。 ハチ目（膜翅類）害虫に対する活性（Payne，Kennedy，Randall，MeierおよびUi ck，1992，欧州特許出願第0 516 306 A2号）、カメムシ目（半翅類）害虫に対す る活性（PayneおよびCannon，1993，米国特許第5,262,159 号）、吸虫害虫に対する活性（Hickle，Sick，Schwab，NarvaおよびPayne 1993 ，米国特許第5,262,399号）およびフシラプテラ（Phthiraptera）目害虫に対す る活性（PayneおよびHickle，1993，米国特許第5,273,746号）を有するバシラス ・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）株も開示されている。さらに、 オーストラリアヒツジの刈り取られた羊毛から分離されたもう１つの株であるバ シラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（Bacillus thuringiensis subsp．ku rstaki）WB3S-16は、ハジラミであるダマリニア・オビス（Damalinia ovis）［ フシラプテラ（Phthiraptera）害虫］に有毒だと開示されている(Drummond, Mil lerおよびPinnock，1992，J．Invert．Path．60:102-103)。 δ−内毒素は、プラスミド上に一般に位置するcry（結晶性タンパク質）遺伝 子にコードされる。cry 遺伝子は、相対的なアミノ酸相同性および農薬的特異性 に基づき、６つのクラスおよびいくつかのサブクラスに分類されている。主なク ラスとしては、鱗翅類特異的(cryI)、鱗翅類および双翅類特異的(crvII)、 よびWhiteley，1989，Microbiological Review53:242-255）、 甲虫類および鱗翅類特異的（Tailorら，1992，Molecular Microbiology 6:1211- 1217ではcryV 遺伝子と称されている）、および線虫特異的（Feitelsonら，1992 ，Bio/Technology 10:271-275ではcryV およびcrvVI 遺伝子と称されている）な ものが挙げられる。 δ−内毒素は、組換えＤＮＡ法により得られている。組換えＤＮＡ法により得 られたδ−内毒素は、結晶形態であることもあるし、そうでないこともある。 バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）のいくつかの株は、 β−外毒素Ｉ型またはスリンジエンシン（thuringiensin）として公知の単独で 農薬活性を示す熱安定性殺有害生物性アデニンヌクレオチド類似体を産生するこ とが示されている(Sebestaら，H.D．Burges(編)，Microbial Control of Pests and Plant Diseases，Academic Press，New York，1980，pp.249-281)。β−外 毒素Ｉ型は、いくつかのバシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis ）培養の上清中に見出されている。それは、701の分子量を有し、アデノシン、 グルコースおよびアラリン酸（allaric acid）よりなる（Farkas ら，Kurstak(編)，Microbial and Viral Pesticides，Marcel Dekker，New York ，1982，pp.35-72）。その宿主域には、イエバエ（Musca domestica）、マメス トラ・コンフィグラタ・ウオーカー（Mamestra configurata Walker）、ナミハ ダニ(Tetranychusurticae)、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaste r）およびニセナミハダニ（Tetranychus cinnabarinus）が含まれるが、これら に限定されるものではない。β−外毒素Ｉ型の毒性は、ATPとの競合によるＤＮ Ａ依存性ＲＮＡポリメラーゼの阻害によると考えられている。β−外毒素Ｉ型はcry プラスミドにコードされることが、５つのバシラス・スリンジエンシス（Ba cillus thuringiensis）株で示されている（Levinsonら，1990，J．Bacteriol． 172:3172-3179）。β−外毒素Ｉ型は、バシラス・スリンジエンシス亜種スリン ジエンシス（Bacillus thuringiensis subsp．thuringiensis）血清型Ｉ、バシ ラス・スリンジエンシス亜種トルウォルシ（Bacillus thuringiensis subsp．to lworthi）血清型９およびバシラス・スリンジエンシス亜種ダームスタディエン シス（Bacillus thuringiensis subsp．darmstadiensis）血清型10により産生さ れることが判明している。 β−外毒素II型として分類されているもう１つのβ−外毒素は、Levinsonら（ 1990，J．Bacteriol．172:3172-3179）に記載されている。β−外毒素II型は、 バシラス・スリンジエンシス亜種モリソニ(Bacillus thuringiensis subsp．mor risoni)血清型8abにより産生されることが判明しており、これは、レプチノタル サ・デセムリネアタ（Leptinotarsa decemlineata）に対して活性である。β− 外毒素II型の構造は、完全に知られているわけではないが、β−外毒素Ｉ型の構 造とは有意に異なっており、この違いは、β−外毒素II型では、アデニンの位置 にプソイドウリジン部分が存在する点にあり、リボース環に対する結合は通常は プロトンが占める位置で生じている（Levinson，HickleおよびFinch(編)，Analy tical Chemistry of Bacillus thuringiensis，ACS Symposium Series，Washing ton，D.C.，1990，pp.114-136）。さらに、プロトンNMRスペクトルでは、ヌクレ オシド塩基に相当するシグナル（7.95ppm）は１つしかなく、リボース型のアノ マータンパク質のシグナル（5.78ppm）はない。 バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）から単離されている他 の水溶性物質としては、イエバエ（Musca domestica）の幼虫に対して有毒なα−外毒素（Luthy，1980，FEMS Microbiol． Lett．8:1-7）；レシチナーゼ、キチナーゼおよびプロテアーゼを含む種々の酵 素であって、β−外毒素またはδ−内毒素と組み合わされた場合にのみ毒性作用 が発現されるγ−外毒素（Forsbergら，1976，Bacillus thuringiensis:Its Eff ects on Environmental Quality，National Research Council of Canada，NRC Associate Committee on Scientific Criteria for Environmental Quality，Su bcomittees on Pesticides and Related Compounds and Biological Phenomena ）；β−外毒素と同様の構造を有し、レプチノタルサ・デセムリネアタ（Leptin otarsa decemlineata）に対して同様に活性であるσ−外毒素（Argauerら，1991 ，J．Entomol．Sci．26:206-213）；及び、アンヒドロスリンジエンシン（anhyd rothuringiensin）（Prystasら，1975，Coll．Czechosslovak Chem．Comm．40:1 775）などが挙げられる。 ２．２．ツビッテルマイシン 植物病原体フィトフソラ・メディカギニス（Phytophthora medicaginis）の増 殖を阻害しアルファルファへの感染を抑制する物質がバシラス・セレウス（Baci llus cereus）から単離 されている（例えば、米国特許第4,877,738号および第4,878,936号を参照された し）。他の活性は開示されていない。ツビッテルマイシン（zwittermicin）Ａに ついては以下の構造が明らかとなっている（Heら，Tet．Lett．35:2499-2502） 。 ３．発明の目的 当該分野においては、B．t.製剤の致死性を増加させるための努力がなされて いる。そのための手段としては、致死性の増加した新しい株の探索、現存株を操 作する試み、B．t.の胞子および結晶と新規農薬担体、化学殺虫剤または増強物 質とを組み合わせることにより、より有効な製剤を設計する試みなどが挙げられ る（例えば、米国特許第5,250,515号(トリプシン阻害剤)を参照されたし）。し たがって、本発明の目的は、農薬の農薬活性を増強することである。多量の増強 物質を産生する株を分離することも本発明の目的である。 ４．発明の概要 本発明は、バシラス（Bacillus）関連農薬の農薬活性を増強する因子を産生す る突然変異バシラス株であって、該突然変異体により産生される因子の量が、対 応する親株により産生される因子の量より多いことを特徴とする突然変異バシラ ス株に関する。特定の実施態様では、該バシラス株は、バシラス・サチリス（Ba cillus subtilus）、バシラス・リヘニフォルミス（Bacillus licheniformis） およびバシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）よりなる群から 選ばれる。 前記突然変異体により産生される因子は増強物質である。本発明で定義する「 増強物質（potentiator）」は、有意な農薬活性を有さない、すなわち例えば、 バイオアッセイ（第６節を参照されたし）による測定で約3000μg/gを超えるLC_{5 0} （LC₅₀は、有害生物の50％を殺すのに必要な物質の濃度である）を有するが、 バシラス関連農薬の農薬活性を少なくとも50％増強するよう作用し、幼虫の生育 阻害を引き起こさない物質である。第２節で説明したとおり、δ−内毒素、トリ プシン阻害剤、外毒素などの農薬活性を増強しうる当該分野で公知の他の物質は 、農薬活性を有する。 特定の実施態様では、該因子は水溶性である。本発明の定義では、少なくとも 約１mgの物質が１mlの水に溶解しうる場合、物質または化合物は「水溶性」であ る。また、該因子は、化学農薬および／または農薬特性を有するウイルスの農薬 活性を増強することも可能である。 本発明で定義する「バシラス（Bacillus）関連農薬」は、バシラス［例えば、 バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）またはバシラス・サチ リス（Bacillus subtilis）］株、胞子または物質、例えば、有害生物に対する 活性を有するか又はそれを殺すタンパク質またはその断片、あるいは有害生物に 対する活性を有するか又はそれを殺すバシラスタンパク質（例えば、バシラス・ スリンジエンシスδ−内毒素）またはその断片をコードするバシラス遺伝子を発 現しうる微生物、および許容されうる担体（そのような担体の具体例に関しては 、以下の第５．２節を参照されたし）である。例えば、該有害生物は、昆虫、線 虫、ダニまたは巻貝（snail）であってもよい。有害生物に対する活性を有する か又はそれを殺すバシラスタンパク質またはその断片をコードするバシラス遺伝 子を発現しうる微生物は、葉面（植物葉の表面）および／または 根圏（植物根を取り囲む土壌）および／または水生環境に生息し、特定の環境（ 作物および他の昆虫生息場所）で野生型微生物とうまく競合し、有害生物に対す る活性を有するか又はそれを殺すバシラスタンパク質またはその断片をコードす るバシラス遺伝子の安定な維持および発現を与える。そのような微生物としては 、例えば、細菌、例えばバシラス（Bacillus）、シュードモナス（Pseudomonas ）、エルウィニア（Erwinia）、セラチア（Serratia）、クレブシエラ（Klebsie lla）、ザントモナス（Xanthomonas）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、 リゾビウム（Rhizobium）、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）、メチロ フィルス（Methylophilius）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）、アセト バクター（Acetobacter）、ラクトバシラス（Lactobacillus）、アルスロバクタ ー（Arthrobacter）、アゾトバクター（Azotobacter）、リューコノストク（Leu conostoc）、アルカリゲネス（Alcaligenes）およびクロストリジウム（Clostri dium）属；藻類、例えば藍藻（Cyanophyceae）、原核緑藻（Prochlorophyceae） 、紅藻（Rhodophyceae）、渦鞭藻（Dinophyceae）、黄金色藻（Chrysophyceae） 、プリムネシウ ム藻（Prymnesiophyceae）、黄緑藻（Xanthophyceae）、ラフィド藻（Raphidoph yceae）、珪藻（Bacillariophyceae）、真正眼点藻（Eustigmatophyceae）、ク リプト藻（Cryptophyceae）、ユーグレナ藻(Euglenophyceae)、プラシノ藻（Pra sinophyceae）および緑藻（Chlorophyceae）科；および真菌、特に酵母、例えば サッカロミセス（Saccharomyces）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、クル イベロミセス（Kluyveromyces）、スポロボロミセス(Sporobolomyces)、ロドト ルラ（Rhodotorula）およびオーレオバシディウム（Aureobasidium）などが挙げ られるが、これらに限定されるものではない。 本発明で定義する「農薬活性」は、有害生物を殺したりその成長を抑制したり 、あるいは有害生物の侵襲から植物を守る場合の有害生物に対する活性の量を示 す。 また、本発明は、 （a）バシラス（Bacillus）株を変異原で処理し、 （b）工程（a）の突然変異したバシラス株を、該突然変異体の選択に適した条 件下で増殖させ、そして （c）工程（b）の突然変異体を選択することを含んでなる、本発明の突然変異 体の生産方法に関する。 実質的に純粋な因子は、 （a）バシラス（Bacillus）株の突然変異体を適当な条件下で培養し、 （b）工程（a）の突然変異体の培養の上清を回収し、そして （c）工程（b）の上清から該因子を単離して、その実質的に純粋な因子を得る ことにより、該突然変異体から得ることができる。 前記突然変異体から得られる因子は、該因子と農薬担体とを含んでなる、また 、該因子とバシラス関連農薬、化学農薬および／または農薬特性を有するウイル スとを含んでなる組成物に製剤化してもよい。これらの組成物は、有害生物を防 除するのに、該因子と農薬的に許容される担体とを含んでなる組成物に有害生物 をさらすることなどによりバシラス関連農薬に対する有害生物の抵抗性を減少さ せるのに、あるいはバシラス関連農薬の農薬活性を増強するのに用いてもよい。 ５．図面の簡単な説明 図１は、Iaを精製するのに用いる一般的な方法を図示する。 図２は、Iaの¹³C NMRスペクトルを示す。 図３は、IaのプロトンNMRスペクトルを示す。 図４は、Iaのアセチル化誘導体でのnOe実験の結果を示す。 ６．発明の詳細な説明 親バシラス株は、例えばバシラス・サチリス（Bacillus subtilis）、バシラ ス・リヘニフォルミス（Baicillus licheniformis）またはバシラス・スリンジ エンシス（Bacillus thuringiensis）であることが可能である。親バシラス・ス リンジエンシスは、バシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ(Bacillus thur ingiensis subsp．kurstaki)、バシラス・スリンジエンシス亜種アイザワイ(Bac illus thuringiensis subsp．aizawai)、バシラス・スリンジエンシス亜種ガレ リアエ(Bacillus thuringiensis subsp．galleriae)、バシラス・スリンジエン シス亜種エントモシダス(Bacillus thuringiensis subsp．entomocidus)、バシ ラス・スリンジエンシス亜種テネブリオニス(Bacillus thuringiensis subsp．t enebrionis)、バシラス・スリンジエンシス亜種スリンジエンシス(Bacillus thu ringiensis subsp．thuringiensis)、バシラス・スリンジエンシス亜種アレスチ (Bacillus thuringiensis subsp．alesti)、バシラス・スリンジエンシス亜種カ ナディエンシス(Bacillus thuringiensis subsp．canadiensis)、バシラス・ スリンジエンシス亜種ダームスタディエンシス(Bacillus thuringiensis subsp ．darmstadiensis)、バシラス・スリンジエンシス亜種デンドロリムス(Bacillus thuringiensis subsp．dendrolimus)、バシラス・スリンジエンシス亜種フィニ チムス(Bacillus thuringiensis subsp．finitimus)、バシラス・スリンジエン シス亜種ケニアエ(Bacillus thuringiensis subsp．kenyae)、バシラス・スリン ジエンシス亜種モリソニ(Bacillus thuringiensis subsp．morrisoni)、バシラ ス・スリンジエンシス亜種スブトキシクス(Bacillus thuringiensis subsp．sub toxicus)、バシラス・スリンジエンシス亜種トウマノフィ(Bacillus thuringien sis subsp．toumanoffi)、バシラス・スリンジエンシス亜種トウマノフィ(Bacil lus thuringiensis subsp．toumanoffi)、バシラス・スリンジエンシス亜種ポン ディチェリエンシス(Bacillus thuringiensis subsp．pondicheriensis)、バシ ラス・スリンジエンシス亜種シャンドジエンシス(Bacillus thuringiensis subs p．shandogiensis)、バシラス・スリンジエンシス亜種ソット(Bacillus thuring iensis subsp．sotto)、バシラス・スリンジエンシス亜種ニジェリアエ(Bacillu s thuringiensis subsp．nigeriae)、 バシラス・スリンジエンシス亜種ユンナネンシス(Bacillus thuringiensis subs p．yunnanensis)、バシラス・スリンジエンシス亜種ダコタ(Bacillus thuringie nsis subsp．dakota)、バシラス・スリンジエンシス亜種ニディアナ(Bacillus t huringiensis subsp．nidiana)、バシラス・スリンジエンシス亜種トウホクエン シス(Bacillus thuringiensis subsp．tohokuensis)、バシラス・スリンジエン シス亜種クマモトエンシス(Bacillus thuringiensis subsp．kumamotoensis)、 バシラス・スリンジエンシス亜種トチギエンシス(Bacillus thuringiensis subs p．tochigiensis)、バシラス・スリンジエンシス亜種トンプソニ(Bacillus thur ingiensis subsp．thompsoni)、バシラス・スリンジエンシス亜種ウハネンシス( Bacillus thuringiensis subsp．wuhanensis)、バシラス・スリンジエンシス亜 種キュウシュウエンシス(Bacillus thuringiensis subsp．kyushuensis)、バシ ラス・スリンジエンシス亜種オストリニアエ(Bacillus thuringiensis subsp．o striniae)、バシラス・スリンジエンシス亜種トルウォルシ(Bacillus thuringie nsis subsp．tolworthi)、バシラス・スリンジエンシス亜種パキスタニ(Bacillu s thuringiensis subsp． pakistani)、バシラス・スリンジエンシス亜種ジャポネンシス(Bacillus thurin giensis subsp．japonensis)、バシラス・スリンジエンシス亜種コルメリ（Baci llus thuringiensis subsp．colmeri)、バシラス・スリンジエンシス亜種ポンデ ィチェリエンシス(Bacillus thuringiensis subsp．pondicheriensis)、バシラ ス・スリンジエンシス亜種シャンドンジエンシス(Bacillus thuringiensis subs p．shandongiensis)、バシラス・スリンジエンシス亜種ネオレオネンシス(Bacil lus thuringiensis subsp．neoleonensis)、バシラス・スリンジエンシス亜種コ レアネンシス(Bacillus thuringiensis subsp．coreanensis)、バシラス・スリ ンジエンシス亜種シロ(Bacillus thuringiensis subsp．silo)、バシラス・スリ ンジエンシス亜種メキシカネンシス(Bacillus thuringiensis subsp．mexcanens is)およびバシラス・スリンジエンシス亜種イスラエレンシス（Bacillus thurin giensis subsp．israelensis）を含む（これらに限定されるものではない）野生 型株であることが可能である。 特定の実施態様では、親バシラス・スリンジエンシス株は、バシラス・スリン ジエンシス亜種クルスタキ(Bacillus thuringiensis subsp．kurstaki)である。最も具体的な実施態様では、該親株は 、バシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ(Bacillus thuringiensis subsp ．kurstaki)EMCC0086株(NRRLB-21147としてNRRLに寄託されている)である。さら に別の特定の実施態様における該突然変異体は、NRRLに寄託されており受託番号 NRRL B-21445を有するEMCC0129の同定特徴を有するか、あるいは、NRRLに寄託さ れており受託番号NRRLB-21444を有するEMCC0130の同定特徴を有する。 ６．１．突然変異体の入手方法 親株を変異原で処理して、突然変異事象を誘導してもよい。具体的には、バシ ラス・スリンジエンシス(Bacillus thuringiensis)株を突然変異させ、その親株 より実質的に多量の因子を産生しうる突然変異体を選択するための１つの方法で は、該親株を i）変異原で処理し、 ii）その処理された細胞を適当な培地（例えば、NSMP培地）中で培養し、そし て iii）より多量の因子を産生する細胞を選択する。 工程（i）では、該変異原は、例えば、化学変異原であるN −メチル−N′−ニトロ−N−ニトロソグアニジン、N,N′−ジニトロ−N′−ニト ロソグアニジンまたはメタンスルホン酸エチル、γ線照射、Ｘ線および／または UV照射であってもよい。 該細胞は、例えばキャピラリー電気泳動または該因子に対する抗体を用いるイ ムノアッセイにより、該因子の産生に関してアッセイすることにより選択する。 本発明の高産生突然変異体のもう１つの入手方法では、例えば、液体培地中で 親株を増殖させ、突然変異体の選択に適した寒天培地上に該培養ブロスをまいた 後、自然突然変異体を選択することを意図してもよい。 本発明の高産生突然変異体の他のスクリーニング方法では、例えば、質量に基 づき、遠心分離により直接または質量に関する他の分離手段により、該突然変異 体を他の物質から分離することを意図してもよい。 ６．２．該因子の入手 本発明のバシラス突然変異体は、当該分野で公知の培地および発酵技術を用い て培養してもよい（例えば、Rogoffら，1969，J．Invertebrate Path．14:122-1 29; Dulmageら，1971，J．Invertebrate Path．18:353-358; Dulmageら，Microb ial Control of Pests and Plant Diseases，H.D．Burges編，Academic Press，N.Y. ，1980を参照されたし）。特定の実施態様では、該発酵培地は、加水分解された タンパク質、加水分解された炭水化物、塩および微量金属を含んでいてもよい。 該発酵培地はまた、所望により、１以上のアミノ酸を含んでいてもよい。発酵サ イクルが完了したら、当該分野でよく知られている手段（例えば、遠心分離およ び／または限外濾過）によりB．t.の胞子および結晶を該発酵ブロスから分離す ることにより、上清を回収することができる。該因子は、当該分野でよく知られ ている手段（例えば、限外濾過、蒸発および噴霧乾燥）により回収しうる上清中 に含まれている。この方法については、後続の節でより詳しく説明する。 該因子の精製は、当該分野で公知の種々の方法により行うことができ、これら の方法としては、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティーお よびサイズ排除カラムクロマトグラフィー）、電気泳動的方法、溶解度差による 方法、抽出または当該分野で公知の他のいずれかの標準的な技術などが挙げられ るが、これらに限定されるものではない。 種々の有害生物に対するバシラス関連農薬、農薬活性を有す るウイルスまたは化学農薬の農薬活性に対する因子の増強活性は、人工昆虫飼料 への混合、人工飼料への重層、葉への塗布、葉の浸漬および葉面散布などの当該 分野で公知の方法によりアッセイしてもよい。そのようなアッセイの具体例につ いては、以下の第７節で説明する。産生される因子の量は、例えばキャピラリー 電気泳動により定量してもよい。 該因子は約350〜約1200、特定の実施態様では約350〜約700の分子量を有して いてもよい。 該因子は、バシラス関連農薬の農薬活性を少なくとも1.5倍、所望により約100 0倍まで、好ましくは約100倍〜約400倍増強する。特定の実施態様では、該因子 は、完全長形態の又はタンパク質分解によりプロセシングされたトランケート化 形態のCryI（CryIA、CryIBおよびCryICが含まれるが、これらに限定されるもの ではない）、CryII、CryIII、CryIV、CryVまたはCryVIタンパク質を含む（これ らに限定されるものではない）バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuring iensis）δ−内毒素の農薬活性を約1.5倍〜約1000倍増強する。最も具体的な実 施態様では、該因子は、B.t．δ−内毒素を約100倍〜約400倍増強する。該因子 は、化学農薬および／または農 薬特性を有するウイルスの農薬活性を増強することもできる。 該因子は、水溶性であることが可能であり、約100℃までの水中で少なくとも ５分間安定であることが可能であり、直射日光に少なくとも約10時間さらされた 場合に安定であることが可能であり、および／またはpH約２で約10日間安定であ ることも可能である。該因子は、13個の炭素原子を有していてもよい。さらに、 該因子は、およそδ1.5、3.22、3.29、3.35、3.43、3.58、3.73、3.98、4.07、4 .15、4.25、4.35の¹H NMRシフト、並びに、およそ31.6、37.2、51.1、53.3、54. 0、 54.4、61.5、61.6、64.1、65.6、158.3、170.7および171.3の¹³Cシフトを有 していてもよい。 最も具体的な実施態様では、前記因子は、Iaまたはその塩の構造を有する。該 塩の形態においても、バシラス関連農薬を増強しうる。 ６．３．該因子を含む組成物 本発明の突然変異体から得られた因子は、単独で；前記定義のとおり有害生物 に対する活性を有するか又はそれを殺すか又は植物を有害生物から守るバシラス 株、胞子、タンパク質または断片、そのそれ以外の物質であるバシラス関連農薬 と；化学農薬および／または昆虫病原性ウイルスと、並びに、許容される担体と 共に、農薬組成物、すなわち例えば、懸濁剤、溶液剤、乳濁液、粉剤、分散性顆 粒、水和剤、乳剤、エーロゾルまたは含浸顆粒に製剤化することができる。その ようなバシラス株としては、例えば、バシラス・スリンジエンシス亜種クルスタ キ（Bacillus thuringiensis subsp．kurstaki）（Abbott Laboratories，Inc. からDIPEL^TMとして、SandozからJAVELIN^TMとして、Novo Nordisk A/SからBIOBIT^TM として、Novo Nordisk A/SからFORAY^TMとして、Novo Nordisk A/SからBIOCOT^{T M} として、MycogenからMVP^TMとして、Novo Nordisk A/SからBACTOSPEINE^TMとして 、およびSandozからTHURICIDE^TMとしてそれぞれ市販されているもの）、バシラ ス・スリンジエンシス亜種アイザワイ（Bacillus thuringiensis subsp．aizawa i）（Novo Nordisk A/SからFLORBAC^TMとして、およびAbbott Laboratories，Inc.からXENTARI^TMとしてそれぞれ市販されているもの）、バシ ラス・スリンジエンシス亜種テネブリオニス(Bacillus thuringiensis subsp．t enebrionis)（Novo Nordisk A/SからNOVODOR^TMとして、SandozからTRIDENT^TMと して、MycogenからM-TRAK^TMおよびM-ONE^TMとして、およびAbbott Laboratories ，Inc.からDITERRA^TMとしてそれぞれ市販されているもの）、バシラス・スリン ジエンシス亜種イスラエレンシス（Bacillus thuringiensis subsp．israelensi s）（Novo Nordisk A/SからBACTIMOS^TMまたはSKEETAL^TMのいずれかとして、Sand ozからTEKNAR^TMとして、およびAbbott Laboratories，Inc.からVECTOBAC^TMとし てそれぞれ市販されているもの）、バシラス・スリンジエンシス・クルスタキ／ テネブリオニス（Bacillus thuringiensis kurstaki/tenebrionis）（Ecogenか らFOIL^TMとして市販されているもの）、バシラス・スリンジエンシス・クルスタ キ／アイザワイ（Bacillus thuringiensis kurstaki/aizawai）（EcogenからCON DOR^TMとして、およびCiba-GeigyからAGREE^TMとしてそれぞれ市販されているもの ）、及び、バシラス・スリンジエンシス・クルスタキ／クルスタキ（Bacillus t huringiennsis kurstaki/ kurstaki）（Ecogen からCUTLASS^TMとして市販されているもの）などが挙げられるが、これらに限定 されるものではない。バシラス関連タンパク質は、CryI、CryII、CryIII、CryIV 、CryVおよびCryVIを含む（これらに限定されるものではない）群から選んでも よい。化学農薬は、例えば、ジフルベンズロンなどの昆虫成長制御剤、チオジカ ルブ、メソミルなどのカーバメイト剤、クロルピリホスなどの有機リン剤、シペ ルメトリン、エスフェンバレレートなどのピレスロイド剤、氷晶石などの無機フ ッ素、およびピロールであってもよい。昆虫病原性ウイルスは、バキュロウイル ス、例えばオートグラファ・カルフォルニカ（Autographa californica）核多角 体病ウイルスス（NPV）、シングラファ・ファルシフェラ（Syngrapha falcifera ）NPV、シジア・ポモネラ（Cydia pomonella）GV（グラニュローシスウイルス） 、ヘリオシス・ゼア（Heliothis zea）NPV、ママイガ（Lymantria dispar）NPV 、オルジア・シュードツガタ（Orgyia pseudotsugata）NPV、シロイチモジヨト ウ（Spodoptera exigua）NPV、ネオディプリオン・レコンテイ（Neodiprion lec ontei）NPV、マツノキハバチ（Neodiprion sertifer）NPV、ハリシナ・ブリリア ンス（Harrisina brillians）NPVおよびエンド ピザ・ビテアナ・クレメンス（Endopiza viteana Clemens）NPVであってもよい 。 該物質およびバシラス関連農薬を含む組成物では、該物質は、少なくとも約0. 1g/BIUまたは0.05gの因子(バシラスδ−内毒素および胞子１gあたり)、所望によ り約300g/BIUまたは150gまでの物質（バシラスδ−内毒素および胞子１ｇあたり ）、好ましくは２g/BIUまたは１ｇの物質（バシラスδ−内毒素および胞子１gあ たり）の量で存在していてもよい。本発明で定義する「BIU」は、バイオアッセ イにより決定されるビリオン国際単位である。該バイオアッセイは、標準的な試 験昆虫としてトリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni）または他の有害生物を用 いて、標準的なバシラス基準物質と該サンプルとを比較する。効力は、基準とな る標準LC₅₀を割り、ついで基準となる標準効力を掛けることにより求める。 もう１つの実施態様では、該組成物は、実質的に純粋な形態の該因子またはバ シラスからの乾燥、濃縮または液体形態の上清と、農薬的に許容される担体（そ の具体例は以下に開示する）とを含んでいてもよい。この組成物は、別々に植物 （例えば、トランスジェニック植物）に適用してもよい。特に、該組成物 は、バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）遺伝子を既に含有 し発現している植物に適用してもよい。もう１つの実施態様では、該組成物は、 バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）組成物に既にさらされ ている植物に適用してもよい。もう１つの実施態様では、該組成物は、双翅類害 虫の他の環境（例えば、水または土壌）に適用してもよい。該物質は、該組成物 中に約0.001％〜約60％（w/w）の濃度で存在する。 また、該物質と農薬的に許容される担体とを含む組成物は、有害生物を防除す るための他に、農薬に対する有害生物の抵抗性を減少させるために使用してもよ い。あるいは、該組成物は、バシラス関連農薬を増強するために使用してもよい 。１つの実施態様における該組成物は、少なくとも約２g物質/BIU、所望により 約300g物質/BIUまでの量にて農薬と同時に適用してもよい。もう１つの実施態様 では、農薬の後約24時間まで、該組成物を補助剤として適用して、残留農薬の効 力を持続させてもよい。 前記組成物は、界面活性剤、不活性担体、保存剤、湿潤剤、摂食刺激物質、誘 引剤、カプセル化剤、結合剤、乳化剤、染料、 UV防止剤、緩衝剤、流動剤、または製品の取り扱いおよび特定の標的有害生物へ の適用を容易にする他の成分を加えることにより得てもよい。 適当な界面活性剤としては、アニオン化合物、例えばカルボキシラート（例え ば、長鎖脂肪酸の金属カルボキシラート）；N−アシルサルコシナート；脂肪族 アルコールエトキシラートとリン酸とのモノまたはジ−エステルまたはそのよう なエステルの塩；脂肪族アルコールスルファート、例えばドデシル硫酸ナトリウ ム、オクタデシル硫酸ナトリウムまたはセチル硫酸ナトリウム；エトキシ化脂肪 族アルコールスルファート；エトキシ化アルキルフェノールスルファート；リグ ニンスルホナート；石油スルホナート；アルキルアリールスルホナート、例えば アルキル−ベンゼンスルホナートまたは低級アルキルナフタレンスルホナート、 例えばブチル−ナフタレンスルホナート；塩またはスルホン化ナフタレン−ホル ムアルデヒド縮合物；スルホン化フェノール−ホルムアルデヒド縮合物の塩；ま たはより複雑なスルホナート、例えばアミドスルホナート、例えばオレイン酸と Ｎ−メチルタウリンとのスルホン化縮合生成物、またはジアルキルスルホスクシ ナート、例えばスルホン酸ナトリ ウムまたはコハク酸ジオクチルなどが挙げられる。非イオン性界面活性剤として は、脂肪酸エステル、脂肪族アルコール、脂肪酸アミドまたは脂肪族アルキル− もしくはアルケニル−置換フェノールとエチレンオキシドとの縮合生成物、多価 アルコールエーテルの脂肪酸エステル、例えばソルビタン脂肪酸エステル、その ようなエステルとエチレンオキシドとの縮合生成物、例えばポリオキシエチレン ソルビタール脂肪酸エステル、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのブ ロック共重合体、アセチレングリコール、例えば2,4,7,9−テトラエチル−5−デ シン−4,7−ジオール、またはエトキシ化アセチレングリコールなどが挙げられ る。カチオン界面活性剤としては、例えば、脂肪族モノ−、ジ−またはポリアミ ン（アセタート、ナフテナートまたはオレアートとして）；酸素含有アミン、例 えばポリオキシエチレンアルキルアミンのアミンオキシド；カルボン酸とジ−ま たはポリアミンとの縮合により製造されるアミド結合アミン；または第四級アン モニウム塩などが挙げられる。 不活性物質としては、例えば、カオリン、雲母、石膏、肥料、フィロケイ酸塩 、炭酸塩、硫酸塩またはリン酸塩などの無機物質；糖、デンプン、シクロデキス トリンなどの有機物質；また は木材製品、コルク、トウモロコシ穂軸の粉末、もみ殻、落花生殻、クルミ殻な どの植物物質などが挙げられる。 本発明の組成物は、直接施用に適した形態であってもよいし、施用前に適量の 水または他の希釈剤による希釈を要する濃縮物または一次組成物であってもよい 。農薬成分の濃度は、個々の製剤の性質、特に、それが濃縮物であるか直接使用 できるかよって異なる。該組成物は、１〜98％の固体または液体の不活性担体と 、０〜50％、好ましくは0.1〜50％の界面活性剤とを含有する。これらの組成物 は、市販品に表示されている薬量にて投与することとなるが、好ましくは、乾燥 形態では１エーカー当たり約0.01ポンド〜5.0ポンド、液体形態では１エーカー 当たり約0.01パイント〜25パイントである。 さらに別の実施態様では、標的有害生物の環境に施用した際の農薬活性を持続 させるよう、バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）の結晶性 δ−内毒素および／または因子を製剤化前に処理することができるが、これは、 該前処理が該結晶性δ−内毒素または物質を損なわない場合に限られる。そのよ うな処理は、該組成物の特性に悪影響を及ぼさない限り、化学的および／または 物理的手段により行うことができ る。化学試薬としては、例えば、ハロゲン化剤；アルデヒド、例えばホルムアル デヒド、グルタルアルデヒド；抗感染薬、例えば塩化ゼフィラン（zephiran chl oride）；アルコール、例えばイソプロパノール、エタノール；組織学的固定液 、例えばブアン（Bouin's）固定液、ヘリー（Helly's）固定液（例えば、Humaso n，Animal Tissue Techniques，W.H．Freeman and Co.，1967を参照されたし） などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。 本発明の組成物は、例えば、有害生物が植物上に出現し始めた時点で、あるい は防護手段として有害生物の出現前に、噴霧または散粉により植物に直接施用す ることができる。本発明の範囲内の防護すべき植物としては、禾穀類（小麦、大 麦、ライ麦、エンバク、イネ、モロコシ類および関連作物）、ビート（テンサイ および飼料ビート）、石果、ナシ状果、小果樹類（リンゴ、セイヨウナシ、プラ ム、モモ、アーモンド、サクラ、イチゴ、ラズベリーおよびブラックベリー）、 マメ科植物（アルファルファ、インゲンマメ、ヒラマメ、エンドウ、ダイズ）、 油料植物（アブラナ、カラシナ、ケシ、オリーブ、ヒマワリ、ココナッツ、ヒマ 、カカオマメ、ラッカセイ）、キュウリ類（キ ュウリ、ペポカボチャ、メロン）、繊維植物（棉、アマ、アサ、ジュート）、柑 橘果樹類（オレンジ、レモン、グレープフルーツ、マンダリン）、野菜（ホウレ ンソウ、レタス、アスパラガス、キャベツおよび他のアブラナ属の植物、ニンジ ン、タマネギ、トマト、ジャガイモ）、クスノキ科植物（アボガド、セイロンニ ッケイ、ショウノウ）、落葉樹および針葉樹（シナノキ、イチイ、オーク、ハン ノキ、ポプラ、カバノキ、モミ、カラマツ、マツ）、またはトウモロコシ、芝草 、タバコ、ナッツ、コーヒー、サトウキビ、茶、ブドウ、ホップ、バナナなどの 植物、天然ゴム植物、鑑賞植物などが挙げられるが、これらに限定されるもので はない。該組成物は、茎葉、畦間、全面散布用顆粒、「レイバイ（lay-by）」ま たは土壌灌注施用により適用することができる。植物の成長の初期段階は該植物 が最も著しく被害を受け得る時であるため、植物の成長の初期段階で有効な有害 生物防除を行うことが一般に重要である。必要と考えられる場合には、散布液ま たは粉剤に別の農薬を含有させるのが便利なこともある。好ましい実施態様では 、本発明の組成物は、植物に直接施用される。 また、本発明の組成物は、池、湖、小川、河川、よど、およ び双翅類害虫、特に公衆衛生上重要な害虫が発生しやすい他の場所に直接施用す ることもできる。該組成物は、噴霧、散粉、振りかけなどにより施用することが できる。 本発明の組成物は、チョウ目、例えばアクロイア・グリセラ（Achroia grisel la）、アクレリス・グロベラナ（Acleris gloverana）、アクレリス・バリアナ （Ackleris variana）、リンゴコカクモンハマキ（Adoxophyes orana）、タマナ ヤガ（Agrotis ipsilon）、アラバマ・アルジラセア(Alabama argillacea)、ア ルソフィラ・ポメタリア(Alsophila pometaria)、アミエロイス・トランシテラ( Amyelois transitella)、アナガスタ・クエニエラ(Anagasta kuehniella)、アナ ルシア・リネアテラ（Anarsia lineatella）、アニソタ・セナトリア（Anisota senatoria）、アンセラエ・ペルニイ(Antheraeapernyi)、アンチカルシア・ゲマ タリス(Anticarsia gemmatalis)、アルキプス種（Archips sp.）、アルジロタエ ニア種（Argyrotaenia sp.）、アセチス・ミンダラ（Athetis mindara）、ボン ビクス・モリ（Bombyx mori）、ブカラトリクス・スルベリエラ（Bucculatrix t hurberiella）、スジマダラメイガ（Cadra cautella）、コリストネウラ種（Cho ristoneura sp.）、コキリス・ホスペス（Cochylis hospes）、コリアス・ユリセメ(Colias eurytheme)、コルシラ・セファロニカ（Corcyra cephalonica）、シジア・ラチ フェレアヌス（Cydia latiferreanus）、シジア・ポモネラ（Cydia pomonella） 、ダタナ・インテジェリマ（Datana integerrima）、デンドロリムス・シベリク ス（Dendrolimus sibericus）、デスミア・フネラリス（Desmia funeralis）、 ジアファニア・ヒアリナタ(Diaphania hyalinata)、ジアファニア・ニチダリス （Diaphania nitidalis）、ジアトラエ・グランジオセラ（Diatraea grandiosel la）、ジアトラエ・サッカラリス（Diatraea saccharalis）、エンノモス・スブ シグナリア（Ennomos subsignaria）、エオレウマ・ロフティニ（Eoreuma lofti ni）、チャマダラメイガ（Ephestia elutella）、エラニス・チリアリア（Erann is tiliaria）、エスチグメネ・アクレ（Estigmene acrea）、ユーリア・サルブ リコラ（Eulia salubricola）、ブドウホソハマキ（Eupoecilia ambiguella）、 ユープロクチス・クリソロエ（Euproctis chrysorrhoea）、ユーキソア・メソリ ア(Euxoa messoria)、ハチノスツヅリガ(Galleriamellonella)、ナシヒメシンク イ（Grapholita nlolesta）、ハリシナ・アメリ カナ（Harrisina americana）、ヘリコベルパ・サブフレクサ（Helicoverpa sub flexa）、ヘリコベルパ・ゼア（Helicoverpa zea）、ヘリオチス・ビレセンス(H eliothis virescens)、ヘミレウカ・オリビアエ（Hemileuca oliviae）、ホモエ オソマ・エレクテルム（Homoeosoma electellum）、アメリカシロヒトリ（Hypha ntria cunea）、ケイフェリア・リコペルシセラ（Keiferia lycopersicella）、 ラムディナ・フィスセラリア・フィスセラリア（Lambdina fiscellaria fiscell aria）、ラムディナ・フィスセラリア・ルグブロサ（Lambdina fiscellaria lug ubrosa）、ヤナギドクガ（Leucoma salicis）、ロベシア・ボトラナ（Lobesia b otrana）、ロキソステジ・スチクチカリス（Loxostege sticticalis）、マイマ イガ（Lymantria dispar）、マカラ・シルシサリス（Macalla thyrsisalis）、 マラコソマ種（Malacosoma sp）、ヨトウガ（Mamestra brassicae）、マメスト ラ・コンフィグラタ（Mamestra configurata）、マンジュカ・キンケマクラタ（ Manduca quinquemaculata）、マンジュカ・セクスタ(Manduca sexta)、マルカ・ テスツラリス（Maruca testulalis）、メランクラ・ピクタ（Melanchra picta） 、ナミスジフユナミシャク（Operophtera brumata）、オルギア種 （Orgyia sp.）、オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis）、パレアク リタ・ベルナタ（Paleacrita vernata）、パピリオ・クレスフォンテス（Papili o cresphontes）、ワタアカミムシ（Pectinophora gossypiella）、フリガニジ ア・カリフォルニカ（Phryganidia californica）、フィロノリクテル・ブラン カルデラ（Phyllonorycter blancardella）、ピエリス・ナピ（Pieris napi）、 ピエリス・ラパエ（Pieris rapae）、プラチペナ・スカブラ（Plathypena scabr a）、プラチノタ・フロウエンダナ（Platynota flouendana）、プラチノタ・ス ルタナ（Platynota sultana）、プラチプチリア・カルジュイダクチラ（Platypt ilia carduidactyla）、プロディア・インテルプンクテラ（Plodia interpuncte lla）、コナガ（Plutella xylostella）、ポンチア・プロトディセ（Pontia pro todice）、シューダレチア・ウニプンクタ（Pseudaletia unipuncta）、シュー ドプルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）、サブロデス・アエグ ロタタ（Sabulodes aegrotata）、シズラ・コンシナ（Schizura concinna）、シ トトロガ・セレアレラ（Sitotroga cerealella）、スピロノタ・オセラナ（Spil onota ocellana）、スポドプテラ種（Spodoptera sp.）、サウルンス トポエア・ピチオカンパ（Thaurnstopoea pityocampa）、チネオラ・ビスセリエ ラ（Tineola bisselliella）、トリチョプルシア・ニ（Trichoplusia ni）、ウ デア・ルビガリス（Udea rubigalis）、キシロミケス・クリアリス（Xylomyges curialis）、イポノメウタ・パデラ（Yponomeuta padella）；ハエ目、例えばア エデス種（Aedes sp.）、アンデス・ビッタツス（Andes vittatus）、アナスト レファ・ルーデンス（Anastrepha ludens）、アナストレファ・サスペンサ（Ana strepha suspensa）、アノフェレス・バルベリ（Anopheles barberi）、アノフ ェレス・クアドリマクラツス（Anopheles quadrimaculatus）、アルミケレス・ スバルバツス（Armigeres subalbatus）、カリフォラ・スチジアン（Calliphora stygian）、カリフォラ・ビシナ（Calliphora vicina）、セラチチス・カピタ タ（Ceratitis capitata）、キロノムス・テンタンス（Chironomus tentans）、 クリソミア・ルフィファシエス（Chrysomya rufifacies）、コクリオミイア・マ セラリア（Cochliomyia macellaria）、キュレックス種（Culexsp.）、キュリセ タ・イノルナタ（Culiseta inornata）、ダキュス・オレアエ（Dacus oleae）、 タマネギバエ（Delia antiqua）、タネバエ（Delia platura）、キイロ ショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）、ユーペオデス・コロラエ（Eup eodes corollae）、グロシナ・オーステニ（Glossina austeni）、グロシナ・ブ レビパルピス（Glossina brevipalpis）、グリシナ・フシペス（Glossina fusci pes）、グロシナ・モルシタンス・セントラリス（Glossina morsitans centrali s）、グロシナ・モルシタンス・モルシタンス（Glossina morsitans morsitans ）、グロシナ・モリスタンス・スブモルシタンス（Glossina morsitans submors itans）、グロシナ・パリディペス（Glossina pallidipes）、グロシナ・パルパ リス・ガンビエンシス（Glossina palpalis gambiensis）、グロシナ・パルパリ ス・パルパリス（Glossina palpalis palpalis）、グロシナ・タチノイデス（Gl ssina tachinoides）、ハエマゴグス・エクイヌス（Haemagogus equinus）、ハ エマトビア・イリタンス（Haematobia irritans）、ヒポデルマ・ボビス（Hypod erma bovis）、ヒポデルマ・リネアツム（Hypoderma lineatum）、リユーコピス ・ニナエ（Leucopis ninae）、ルシリア・キュプリナ（Lucilia cuprina）、ル シリア・セリカタ（Lucilia sericata）、ルツオミイア・ロングルパイピス（Lu tzomyia longlpaipis）、ルツオミイア・シャンノニ （Lutzomyia shannoni）、リコリエラ・マリ（Lycoriella mali）、メイエチオ ラ・デストラクター（Mayetiola destructor）、ムスカ・アウツムナーリス（Mu sca autumnalis）、イエバエ（Musca domestica）、ネオベリエリア種（Neobell ieria sp）、ネフロトマ・スツラリス（Nephrotoma suturalis）、オフィラ・ア エネセンス（Ophyra aenescens）、ファエニシア・セリカタ（Phaenicia serica ta）、フレボトムス種（Phlebotomus sp.）、フォルミア・レジナ（Phormia reg ina）、サベセス・シアネウス（Sabethes cyaneus）、サルコファガ・ブラタ（S arcophaga bullata）、スカトファガ・ステルコラリア（Scatophaga stercorari a）、ストモキシス・カルシトランス（Stomoxys calcitrans）、トクソルヒンチ テス・アンボイネンシス（Toxorhynchites amboinensis）、トリプテロイデス・ バンブサ（Tripteroides bambusa）などの害虫に対して有効と考えられる。しか しながら、本発明の組成物は、コウチュウ目、例えばレプチノタルサ種（Leptin otarsa sp.）、インゲンマメゾウムシ（Acanthoscelides obtectus）、アズキゾ ウムシ（Callosobruchus chinensis）、エピラチナ・バリベスチス（Epilachna varivestis）、ピルハルタ・ルテオラ（Pyrrhalta luteola）、アリモドキゾウムシ（Cylas formicarius elegantulus）、リストロ ノツス・オレゴネンシス（Listronotus oregonensis）、シトフィルス種（Sitop hilus sp.）、シクロセファラ・ボレアリス（Cyclocephala borealis）、シクロ セファラ・イマクラタ（Cyclocephala immaculata）、マクロダクチルス・スブ スピノサス（Macrodactylus subspinosus）、ボピリア・ジャポニカ（Popillia japonica）、リゾトログス・マジャリス（Rhizotrogus majalis）、ガイマイゴ ミムシダマシ（Alphitobius diaperinus）、ヒメコクヌストモドキ（Palorus ra tzeburgi）、チャイロコメノゴミムシダマシ（Tenebrio molitor）、コメノゴミ ムシダマシ（Tenebrio obscurus）、コクヌストモドキ（Tribolium castaneum） 、ヒラタコクヌストモドキ（Tribolium confusum）、トリボリウス・デストラク ター（Tribolius destructor）；ダニ（Acari）、例えばオリゴニクス・プラテ ンシス（Oligonychus pratensis）、リンゴハダニ（Panonychus ulmi）、ナミハ ダニ（Tetranychus urticae）；ハチ目、例えばイリドミルメックス・フミリス （Iridomyrmex humilis）、ソレノプシス・インビクタ（Ｓolenopsis invicta） ；シロアリ目、例えばレチクリテルメス・ヘスペルス （Reticulitermes hesperus）、レチクリテルメス・フラビペス（Reticuliterme s flavipes）、イエシロアリ（Coptotermes formosanus）、ズーテルモプシス・ アングスチコリス（Zootermopsis angusticollis）、ネオテルメス・コンネクサ ス（Neotermes connexus）、インシシテルメス・ミノル（Incisitermes minor） 、インシシテルメス・イミグランス（Incisitermes immigrans）；ノミ目（Siph onaptera）、例えばセラトフィルス・ガリナエ（Ceratophyllus gallinae）、セ ラトフィルス・ニガー（Ceratophyllus niger）、ノソプシルス・ファスシアツ ス（Nosopsyllus fasciatus）、レプトプシラ・セグニス（Leptopsylla segnis ）、クテノセファリデス・カニス（Ctenocephalides canis）、クテノセファリ デス・フェリス（Ctenocephalides felis）、エチクノファガ・ガリナセア（Ech icnophaga gallinacea）、プレックス・イリタンス（Pulex irritans）、キセノ プシラ・チェオピス（Xenopsylla cheopis）、キセノプシラ・ベクサビリス（Xe nopsylla vexabilis）、ツンガ・ペネトランス（Tunga penetrans）；およびハ リセンチュウ目（TYLENCHIDA）、例えばサツマイモネコブセンチュウ（Melodido gyne incognita）、キタネグサレセン チュウ（Pratylenchus penetrans）などの害虫に対して有効と考えられる。 以下に記載する実施例は例示にすぎず、限定的なものではない。 ７．実施例：Iaの特徴づけ Iaは、ここで詳細に説明するとおりに回収し精製する。以下、Iaの特徴づけに ついて詳細に説明する。 ７．１．Ia の回収および精製 バシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（B．thuringiensis subsp．kurs taki）EMCC0086株（NRRLにB-21147として寄託されている）を、デンプン、加水 分解されたデンプン、グルコースなどの炭素源およびタンパク質、加水分解され たタンパク質、コーンスティープリカーなどの窒素源よりなる培地中、30℃で72 時間発酵させる。該発酵において13時間の時点でIaの生成が検出される。活性は 、約30時間の時点でピークとなることが判明している。 バシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（B．thuringiensis subsp．kurs taki）発酵からの上清を遠心分離により回収し、ついで、Rhone Poulenc UF系を 用いて30kDa MW-CO 膜を通す限外濾過により清澄化する。この30kDaの濾過により、30kDaの分子量を 超えるあらゆる残存細胞残渣、結晶性δ−内毒素、胞子、および可溶性タンパク 質が除去された。該透過物を蒸発により 10倍濃縮する。該透過物を遠心分離し 、ついで0.2μで濾過して該ブロスからの不溶物をさらに除去すると、Iaを含有 する透明なブロスが残る。 図１に図式的に示す多工程精製法により、Iaの精製を均一になるまで行う。既 に大まかに説明した回収プロトコールと組み合わせて、５kDaの限外濾過工程に より該精製を続けた。この５kDaの限外濾過からの透過物をSulfopropyl（SP）陽 イオン交換樹脂に吸着させ、酢酸アンモニウム溶液で溶出する。ついで、凍結乾 燥により該化合物を約30倍濃縮し、BioRad P2サイズ排除カラムを用いて該塩お よび他の混入物を除去する。P2カラムからのプールを高分解SP HPLC陽イオン交 換カラム内で移動させて、均一な化合物を得る。凍結乾燥を繰り返すことにより 、該混入塩を除去する。 活性をシロイチモジヨトウ（Spodoptera exigua）ミクロバイオアッセイによ りモニターし、純度をキャピラリー電気泳動により測定する。Iaの50μlと、BIO BIT^TMFC（100μl）から精 製したCryIA(c)タンパク質（15μg/ml）の50μlとからなるサンプルを、固化人 工昆虫飼料500μlを含有するゼリートレーの個々のウェルに施用する。種々のサ ンプルを含有するトレーを風乾する。２〜４匹の２齢または３齢初期のシロイチ モジヨトウ（Spodoptera exigua）を、該乾燥サンプルを含有するウェルに加え る。穴のあいたマイラー（mylar）で該ウェルをふさぎ、30℃で２〜３日間イン キュベートする。ついで生育阻害程度および死亡率（％）を記録する。典型的に は、各サンプルについて、５個の同型ウェルを用いて実験を行う。 ７．２．構造の解明 該活性化合物は、水溶性であるが、有機溶媒には溶けないことが判明している 。それは正に荷電しており、シリカ薄層クロマトグラフィーで示されるとおり、 ニンヒドリンと反応する。該化合物の¹³CおよびプロトンNMRを、それぞれ図２お よび３に示す。¹³C NMRによる実験は、13個の炭素の存在を示した（3−[トリメ チルシリル]プロピオン酸を基準とした）。DEPT実験から、３個の四級炭素（C） 、７個のメチン（CH）、３個のメチレン（CH₂）が存在し、メチル基（CH₃）は存 在しないことが判明した。1−Dデカップリング及びCOSYなどのプロトンカ ップリング実験により、８個の炭素を含有する１個の大きなスピン系が同定され る。さらに、２個の炭素よりなるより小さなスピン系が存在する。炭素プロトン 相関実験（HMBC）により、該分子中の各プロトン共鳴をその結合炭素に帰属させ ることができた。 該活性化合物（13mg）をピリジン中無水酢酸で処理すると、より一層極性が低 いアセチル化誘導体が得られた。この誘導体をHPLCにより精製して、３mgの純粋 なアセチル化誘導体を得る。質量分析から、該誘導体は７個のアセタートおよび 690の分子量（これより、該活性化合物の分子量は396となる）を有することが判 明し、偶数個の窒素が存在することが示される。また、６個のアセタートを含有 する断片および５個のアセタートを含有する断片が検出される。５個および６個 のアセタート娘イオンに関する高分解能データは、645.2594（６個のアセタート ）および607.2519（５個のアセタート）であり、これは、Iaが以下の分子式であ ることを示す：C₁₃H₂₈N₆O₈。 該活性化合物（13mg）を6N HClで処理すると、ニンヒドリン陽性の誘導体が得 られた。これらの結果は、アミド結合が存在することを示す。該誘導体は、薄層 クロマトグラフィーによ り測定した場合、2,3−ジアミノプロピオン酸と同じR_f値を有していた。これら の結果とNMRデータとから、2,3−ジアミノプロプオン酸の存在が示唆される。 Iaの分析に用いるもう１つの技術はnOe（核オーバーハウザー効果）であり、 これにより、プロトンが空間を介して互いに接近していることを検出できる。nO eは、Iaアセチル化誘導体上で行う。二次元nOe実験（NOESY）では、8.06ppmのN- Hプロトンと5.17プロトンとの間にnOeが認められる（図４）。 Iaは、以下の構造であることが明らかとなった： それは、ウレイドアミドとして分類することができる。成分には、２個のアミド 、１個の尿素、２個のアミノ、および５個のヒドロキシルが含まれる。それは、 ７個のキラル中心を含有する。 ７．３．Ia の特性 単離されたIaは、バシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（Bacillus thu ringiensis subsp．kurstaki）およびバシラス・スリンジエンシス亜種アイザワ イ（Bacillus thuringiensis subsp．aizawai）の結晶性δ−内毒素殺有害生物 性タンパク質のシロイチモジヨトウ（Spodoptera exigua）に対する活性を、そ の殺有害生物性タンパク質の形態に関係なく、増強することが判明している。製 剤化B.t.k.、単離結晶、完全長（130kDaの分子量）またはトランケート化CryIA タンパク質（〜65kDaの分子量）のすべての農薬活性（殺有害生物活性）が増強 される。CryIIおよびCryIC封入体の活性も増強される。また、個々のトランケー ト化CryIA(a)、(b)および(c)タンパク質の活性も増強することが判明している。 Iaと該Cryタンパク質とのインキュベーション時間は、対生物活性に臨界的でな いことが判明している。しかしながら、Iaは単独では不活性である。増強レベル は、トランケート化CryIAタンパク質、CryIIおよびCryIC封入体では100〜200倍 、また、完全長CryIA(c)では約320倍であることが判明している（それぞれ表Ｉ およびIIを参照されたし）。特に、完全長タンパク質 の場合、240μg/mlのCryIA(c)単独で得られるのと同じ昆虫死亡率/生育阻害評点 が、Iaを用いると、0.75μg/mlのCryIA(c)で得られた。トランケート化CryIA(c) の場合、CryIA(c)のサンプル単独を0.075のOD₂₈₀で試験した場合と同じ生育阻害 評点が、Iaと組み合わせると、同じサンプルの0.0006のOD₂₈₀で得られた。75μg /mlのCryIIタンパク質単独で得られるのと同じ生育阻害評点および同様の死亡率 が、Iaと組み合わせると、0.6μg/mlの濃度のCrII封入体で得られた（すなわち 、125倍の増強である）。75μg/mlのCryICタンパク質単独と同様の死亡率および 生育阻害評点が、Iaを加えると、0.3μg/mlのCryIC封入体で得られ、これは、25 0倍の増強レベルを示す。生育阻害を引き起こす濃度のCryIAタンパク質にIaを加 えると、死亡が認められた。 Iaは、５分間煮沸しても安定であるが、オートクレーブ（＞190℃）によりす べての活性が失われることが判明している。さらに、それは、直射日光に少なく とも10時間さらされた場合でも安定である。Iaは、pH２で３日間安定であるが、 pH12では不安定である。それは、過ヨウ素酸または濃塩酸にされされると、すべ ての活性を失うことが判明している。 ７．４．バシラス・スリンジエンシスの他の亜種およびバシラスの他の種の評 価 いくつかのバシラス種をIa産生に関して評価する。デンプン、加水分解された デンプン、グルコースなどの炭素源およびタンパク質、加水分解されたタンパク 質、コーンスティープリカーなどの窒素源よりなる培地中、供試株を30℃で72時 間発酵させる。前記のシロイチモジヨトウ（Spodoptera exigua）ミクロバイオ アッセイにより、Iaの産生に関して該上清を試験する。バシラス・スリンジエン シス亜種アイザワイ（B.thuringiensis subsp．aizawai）EMCC0087株（NRRL B-2 1148としてNRRLに寄託されている）およびバシラス・スリンジエンシス亜種ガレ リアエ（B．thuringiensis subsp．galleriae）（NRRLに寄託されている）は、 バシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（B．thuringiensis subsp．kursta ki）とほぼ同じ濃度でIaを産生することが判明している。 Iaは、バシラス・サチリス（B．subtilis）、バシラス・セレウス（B．cereus ）、Ｂ．ｔ．亜種アレスチ（B.t．subsp．alesti）、Ｂ．ｔ．亜種カナデイエン シス（B.t．subsp．canadiensis）、Ｂ．ｔ．亜種ダームスタディエンシス（B.t ．subsp． darmstadiensis）、Ｂ．ｔ．亜種デンドロリムス（B.t．subsp．dendrolims）、 Ｂ．ｔ．亜種エントモシドウス（B.t．subsp．entomocidus）、Ｂ．ｔ．亜種フ ィニチムス（B.t．subsp．fintimus）、Ｂ．ｔ．亜種イスラエレンシス（B.t．s ubsp．israelensis）、Ｂ．ｔ．亜種ケニアエ（B.t．subsp．kenyae）、Ｂ．ｔ ．亜種モリソニ（B.t．subsp．morrisoni）、Ｂ．ｔ．亜種スブトキシクス（B.t ．subsp．subtoxicus）、Ｂ．ｔ．亜種テネブリオニス（B.t．subsp．tenebrion is）、Ｂ．ｔ．亜種スリンジエンシス（B.t．subsp．thuringiensis）およびＢ ．ｔ．亜種トウマノフィ（B.t．subsp．toumanoffi）、バシラス・セレウス（B ．cereus）、バシラス・サチリス（B．subtilis）およびバシラス・スリンジエ ンシス亜種クルスタキ（B.thuringiensis subsp．kurstaki）cry- spo-突然変異 体においても産生されることが、キャピラリー電気泳動により確認されている。 特に、Iaの濃度を定量するには、50μm×57cmのコーティングされていない毛 管、0.2Mリン酸緩衝液（pH6.8）、15KVの電圧、200nmでの検出器が備わっている Beckman P/ACEキャピラリー電気泳動系を用いる。サンプルの容量は20nlであり 、作 動時間は25分である。 精製されたIaを標準物質として1.25mg/ml、0.625mg/ml、0.3125mg/ml、0.156m g/mlおよび0.078mg/mlの濃度で用いて、標準曲線を作成する。直線の検量線を作 成する。得られたｙ＝ｍｘ＋ｂの式を用いて、各サンプル中のIaの濃度を求める 。 それぞれの実験を行う前に、毛管に緩衝液（0.2Mリン酸，pH6.8）を３分間通 す。それぞれ25分間の実験の後、毛管に１N NaOHを１分間通し、該毛管をHPLC水 で１分間、0.5Mリン酸で３分間濾過し、HPLC水で１分間濾過する。各ピーク下の 面積を合計し、ピーク面積を求め、標準曲線から最終濃度を算出する。 ７．５．B.t. 製品の評価 種々の商業的に入手可能なB.t.製品中に存在するIaの量を、既に第6.4節に記 載したキャピラリー電気泳動により測定する。BACTOSPEINE^TM、JAVELIN^TM、NOVO DOR^TM、SPHERIMOS^TM、BACTIMOS^TM、FORAY^TM、FLORBAC^TMおよびBIOBIT^TMは、Novo Nordisk A/Sから得られる。XENTARI^TMおよびDIPEL^TMは、Abbott Laboratories から得られる。AGREE^TMは、Ciba-Geigyから得られる。MVP^TMはMycogenから、CUT LASS^TMはEcogenから得られる。 結果を以下の表IIIに示す。これは、Iaが、0.001g Ia/BIU未満から0.071g Ia/ BIUまでの範囲の種々の量で存在することを示す。 ７．６．飼料混入バイオアッセイ ３齢のシロイチモジヨトウ（Spodoptera exigua）幼虫、２齢のヘリコベルパ ・ゼア（Helicoverpa zea）幼虫、３齢のスポドプテラ・フルジペルダ（Spodopt era frugiperda）幼虫、２齢のヘリオシス・ビレセンス（Heliothisvirescens） 幼虫、３齢のトリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni）幼虫、３齢のシュードプ ルシア・インクルデンス（Pseudoplusia includens）幼虫、３齢のコナガ（Plut ella xylostella）幼虫、３齢のスポドプテラ・リットラリス（Spodoptera litt oralis）および３齢のヨトウガ（Mamestra brassicae）幼虫を用いて、人工飼料 混入バイオアッセイによりB.t.k.活性を測定する。 B.t.製品にIaを加えることによる増強のレベルを測定するために、そして影響 を受ける昆虫の範囲を明確にするために、飼料混入バイオアッセイを行う。シロ イチモジヨトウ（Spodoptera exigua）に対して高濃度のIa（7.4〜23.7gIa/BIU ）を用いる実験では、精製されたIa（70％の有効成分、30％のアセタート対イオ ン）を用いて、BIOBIT^TMFC（FCはフロアブル製剤を表す）を増強する。表IVに記 載する残りのデータは、BIOBIT^THPWP（高効力水和剤）がIa（0.658％有効成 分）により増強されることを示す。スポドプテラ・リットラリス(S．littoralis )およびヨトウガ(M．brassicae)は、FLORBAC^TMHPWPおよびIaを用いて試験した。 種々のB.t.製品を秤量し、Iaを加えて0.1〜237g Ia/BIUとする。容量は0.1％T ween^TMで調整する。サンプルを１分間音波処理し、ついで最終容量まで希釈する 。ニートのサンプル（Iaを含まない）および基準物質も調製する。基準物質は、 １ミリグラム当たり 16,000国際単位（IU）の効力を有するとされているB.t.k ．HD-1-S-1980（NRRLから入手）、および53,000スポドプテラ（Spodoptera）単 位/mg（SU）の効力を有するとされているJAVELIN^TMWGを含む。 水、寒天、糖、カゼイン、小麦胚芽、メチルパラベン、ソルビン酸、あまに油 、セルロース、塩およびビタミンよりなる標準人工飼料を、20Lの加熱されたや かん中で調製する。これにより、10〜12個のサンプル（各試験物質は７つの異な る濃度を有する）を試験するのに十分な飼料が得られる。該B.t.溶液を連続希釈 して、16mlのアリコートを得る。各アリコートを184gの溶融飼料に加える。次に 該混合物をホモジナイズし、ついで40個のセルを担持するプラスチックトレーに 注ぐ。各 飼料バッチについて３つの対照トレーを調製する。該飼料が冷えて固化したら、 齢が判明している１匹の昆虫（２齢〜３齢）を各セルに加え、透明なマイラーの 多孔シートで該トレーを覆う。該トレーを棚上に置き、28℃、相対湿度65％で４ 日間インキュベートする。 ４日後、昆虫の死亡率を評価する。各トレーが載るテーブルの上面板を鋭く強 打し、動かない幼虫は死亡しているとみなす。死亡率（％）を算出し、該データ を平行プロビット分析により分析する。LC₅₀、LC₉₀、回帰直線の勾配、変動係数 および効力を推定する。サンプルは、最低３回、あるいは各サンプルについて３ つの効力が算出平均の20％以内になるまで実験に付す。Iaの各濃度と関連した活 性の増加を算出するために、該サンプル中のB.t.の量を表すよう該B.t./Iaサン プルのLC₅₀を補正する。対になったニートサンプルのLC₅₀を、補正されたLC₅₀値 で割って、Iaと関連したLC₅₀の減少倍率を求める。 以下の方法を用いて、ロベシア・ボスラナ(Lobesia bothrana)に関してアッセ イする。ロベシア・ボスラナ(Lobesia bothrana)による攻撃を受けたブドウつる を未噴霧圃場で採集し、幼虫を取り出す。Iaの一連の希釈物（250μg/ml、500μ g/ml および1000μg/ml）を水中で調製する。１匹の幼虫をペトリ皿の中央に入れる。 その幼虫が飲むのが観察されると、新たに切られたブドウ果実が入ったペトリ皿 中にそれを移動させる。その幼虫を22℃で３〜４日間保存する。 表IVに示すとおり、すべての種でLC₅₀の有意な減少が認められる。 シロイチモジヨトウ（Spodoptera exigua）に対する種々の製品がIaにより増 強されることを、前記の飼料混入バイオアッセイにより判定する。添加Iａ/BIU 製品の量を、以下の表Ｖに示す。Ia/B.t.製品混合物を、寒天をベースとする小 麦胚芽カゼイン飼料に加えた。昆虫をその飼料上に４日間載せ、28℃で維持する 。死亡率を記録し、プロビット分析により分析する。LC₅₀、LC₉₀および効力を、 Iaを欠く対応製品から算出する。表Ｖに示す結果は、種々の製造元から入手した 種々のB.t.k.およびB.t.a.製品がIaにより増強されることを示す。これらの製品 に含まれるB.t.株は、前記第5.2節に記載されている。 ７．７．葉面バイオアッセイ BIOBIT^TMFCおよびIaを用いて、ブロッコリ植物上の２齢のシロイチモジヨトウ （Spodoptera exigua）幼虫で葉面バイオアッセイを行う。BIOBIT^TMFCに対するI aの割合は、２g Ia/BIU BIOBIT^TMFCと同じである。この処理を、１エーカー当た り20ガロンの担体容量にて、トラックスプレヤーによりブロッコリ植物に適用す る。デポジットした散布液が乾燥した後で、その植物から葉を切り取り、２齢の シロイチモジヨトウ(Spodoptera exigua)幼虫にたからせる。結果を以下の表VI に示す。BIOBIT^TMFC＋Iaの場合には、8.7BIU/ヘクタールの処理量で100％の死亡 率が認められるが、BTOBTT^TMFC単独の場合の死亡率は、58.8BIU/ヘクタールで92 ％、17.6BIU/ヘクタールで８％であった。また、処理された植物を、直射日光下 に８時間置き、ついで葉を切り取り、上記幼虫にたからせる。日光下で８時間後 、BIOBIT^TMFC単独の場合には、58.8BIU/ヘクタールで27％の死亡率であったが、 BIOBIT^TMFC＋Iaの場合には、8.7BIU/ヘクタールで100％の死亡率であった。 ４齢初期の幼虫で行った葉面アッセイにおいては、BIOBIT^TMFC単独では52BIU/ ヘクタールで75％の死亡率であり、BIOBIT^TM FC（FCはフロアブル製剤である）＋Iaでは13BIU/ヘクタールで100％の死亡率で あった。 ７．８．圃場試験 ガーボンゾビーンズ（garbonzo beans）［シロイチモジヨトウ（Spodoptera e xigua）］による圃場試験は、BIOBIT^TMFC単独では70 BIU/ヘクタールで51％の防 除が得られ、２g Ia/BIU BIOBIT^TMFCでは40 BIU/ヘクタールで89％の防除が得ら れる（未処理の場合との比較）ことを示した。JAVELIN^TMWGでは、 45 BIU/ヘクタールで51％の防除が得られた。 スイートコーン［シロイチモジヨトウ（Spodoptera exigua）］による圃場試 験は、39.5 BIU/ヘクタール、２g Ia/BTU BIOBIT^TMFCで84％の防除が得られるこ とを示した。 ７．９．抵抗性比 感受性および抵抗性のコナガ（Plutella xylostella）のコロニーをバイオア ッセイする。抵抗性の蛾は、フロリダで野外採集されたサンプルであり、JAVELI N^TMWGに集中的にさらされた後、B.t.抵抗性を発達させている。Iaと併用された 場合のBIOBIT^TMHPWPを、葉浸漬バイオアッセイにより分析する。JAVELIN^TMおよ びXENTARI^TMに対する抵抗性を、Iaを使用しないでアッセイする。直径６cmの円 盤状のキャベツ葉を、８つの異なる濃度のB.t.製品またはB.t./Ia製剤の１つに1 0秒間浸す。濃度範囲は、１〜1000ppmである。その円盤状の葉を２時間風乾し、 ２齢（0.2〜0.4mg）幼虫が入ったプラスチックペトリ皿に入れる。昆虫25匹/薬 量/日を２回反復実験して、昆虫50匹/薬量を得る。27℃で72時間後、死亡率を記 録する。薬量死亡率回帰を、プロビット分析により分析する。その感受性の蛾の LC₅₀およびLC₉₀値を割ることにより、抵抗性比を算 出する。結果を表VIIに示す。この結果は、２g Ia/BIUおよび４g Ia/BIUによりB IOBIT^TMHPWPが増強されることを示す。特に、４g Ia/BIUの場合、LC₅₀抵抗性比 は２倍減少し、LC₉₀抵抗性比は10倍減少する。 ７．10．突然変異体 ７．10．１．株 バシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ(Bacillus thuringiensis subsp ．kurstaki)EMCC0086株（NRRL B-21147）、セプトリア・ノドルム（Septoria no dorum）（A04119）、およびアルテルナリア・アルテルナタ（Alternaria altern ata）（株 ６、IM-SMP）を用いる。 ７．10．2．真菌増殖阻害アッセイ セプトリア・ノドルム（Septoria nodorum）およびアルテルナリア・アルテル ナタ（Alternaria alternata）の真菌寒天平板を用いて、該因子を産生するバシ ラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（Bacillus thuringiensis subsp．kurs taki）株の突然変異体を同定する。該因子は、両方の真菌の増殖を阻害する。 その２つの真菌を、十分な胞子形成が得られるまで、PDA（ジャガイモデキス トロース寒天）平板上26℃で10〜14日間増殖させる。UV光期と暗期とを交互にし （それぞれ１２時間）、アルテルナリア・アルテルナタ（Alternaria alternata ）をインキュベートする。その平板から胞子を取り出し、無菌水に懸濁させる。 セプトリア・ノドルム（Septoria nodorum）の胞子を無菌G1フィルターで濾過す る。Burker-TurkまたはFuchs-Rosenthalカウンターを用いて、アルテルナリア・ アルテルナタ（Alternaria alternata）胞子の濃度を１ml当たり約２×10⁵個に 調整し、セプトリア・ノドルム（Septoria nodorum）胞子の濃度を１ml当たり約 ２×10⁶個に調整する。ついで、この胞 子懸濁液1.5mlのサンプルを、水中の無菌40％グリセロール1.5mlと混合し、−20 ℃で１日間凍結し、ついで、使用するまで−80℃で保存する。 胞子サンプル（前記のもの）1.5mlと、最終濃度100μg/mlのストレプトマイシ ンを含む抗生物質寒天培地No．２（１リットル当たり25.5g）の115mlとを46℃で 混合し、該混合物を無菌プラスチックトレー（Nunc No.101875）に移すことによ り、該因子の試験平板を調製する。寒天が固化した後、寒天中にmmの穴をあける （１トレー当たり１２０個の穴）。 無菌水１ml当たり 100μgのストレプトマイシン中で、培養のサンプルを連続 希釈し、その希釈サンプルの10μlを前記のとおり調製したトレーに分注する。 そのトレーを26℃で２日間インキュベートする。陽性対照として、該因子の希釈 も同様に行う。 その真菌増殖阻害アッセイの感受性は、どちらの真菌の場合も、１リットル当 たり該因子0.05グラム（ほとんど見えない）および１リットル当たり該因子0.１ グラム（透明域）の範囲である。 ７．10．3．因子のキャピラリーゾーン電気泳動測定 分析前に、遠心分離および／または0.2μmナイロン膜フィルターによる濾過に より、全培養ブロスサンプルから細胞および他の不溶物を除く。50μm×47cmの コーティングされていないキャピラリー、0.1Mリン酸（pH6.6）よりなるランニ ング緩衝液、15KVの電圧および200nmでの検出器を備えたBeckmanP/ACEキャピラ リー電気泳動系を用いて、該因子を定量する。各作動前に、該毛管に該ランニン グ緩衝液を２分間通す。ローディングするサンプルの容量は、20nlである。 分析のための作動時間は12分であり、該因子は約8.5分で溶出する。該因子の 濃度を、純粋な該化合物の標準曲線に対して決定する。 それぞれの12分の作動の合間に、該毛管に、1N水酸化ナトリウムを0.5分間、0 .1N水酸化ナトリウムを0.5分間、HPLC水を0.5分間、そして1.5Mリン酸を0.5分間 通す。 ７．10．4．バシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ株の突然変異誘発 バシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ(Bacillus thuringiensis subsp ．kurstaki)NB75株の胞子を、まず、700K ラドのγ線で処理する。その照射された胞子を連続希釈し、TY寒天平板上にまき 、30℃で２日間インキュベートする。その処理からの80個の突然変異体を、TY寒 天平板上での単コロニーストリーキングにより精製し、ついで、以下の組成の培 地100mlを含有する500ml振とうフラスコに移す： コーンスティープリカー 15g/リットル マルトデキストリン 40g/リットル ジャガイモタンパク質 30g/リットル KH₂PO₄ 1.77g/リットル K₂HPO₄ 4.53g/リットル 該振とうフラスコを30℃、250rpmで３日間インキュベートする。 該振とうフラスコ培養のそれぞれからサンプル５mlを毎日取り、遠心分離して 、該細胞をペレット化する。脱イオン水１ml当たり0.1mgの濃度のストレプトマ イシン中で、該上清を２〜10倍希釈し、ついで、第8.2節に記載のとおり、抗真 菌活性に関して試験する。ついで、真菌増殖の最大阻害を引き起こす突然変異体 の培養サンプルを、第8.3節に記載のとおり、キャピラリーゾーン電気泳動によ り該因子の量に関して分析す る。第１突然変異からの最高産生突然変異体 は、NBB-76である。 第１世代突然変異体NBB-76をついで、N,N′−ジニトロ−N′−ニトロソグアニ ジン（NTG）を用いる第２突然変異に付す。具体的には、オートクレーブする前 にpH7.3に調整された以下の組成のTYブロス100mlを含有する500ml振とうフラス コ中、該突然変異株を30℃、240rpmで一晩培養する： トリプトン 20g/リットル 酵母エキス ５g/リットル FeCl₂−4H₂O ６mg/リットル MnCl₂−4H₂O １mg/リットル MgSO₄−7H₂O 15mg/リットル その一晩培養物を、TY培地を含有する新しい振とうフラスコ中に100倍希釈し 、該培養が対数増殖に到達するまで（約４時間）、30℃、240rpmで培養する。該 培養の10mlのサンプルを該振とうフラスコから取り出し、ついで0.45μm Nalgen e濾過ユニットを用いてジャーム濾過（germfiltered）する。該フィルター上の 細胞を、１ml当たりNTG100μgを含有するTM緩衝液10mlに再懸濁する。TM緩衝液 は、水酸化ナトリウムでpH ６に調整された脱イオン水１リットル当たり6.05gのトリスおよび5.08gのマレイ ン酸よりなる。該懸濁細胞を37℃で30分間インキュベートし、ついで真空源に接 続して、該細胞からNTGを除去する。該細胞を20mlのM9緩衝液で２回洗浄後M9緩 衝液10mlに再懸濁して、連続希釈し、TY寒天平板上にまき、30℃で２日間インキ ュベートする。M9緩衝液は、脱イオン水１リットル当たり8.78gのNa₂HPO₄−2H₂O 、３gのKH₂PO₄、４gのNaCl、および0.2gのMgSO₄−7H₂Oよりなる。突然変異体を 単離し、前記のとおり試験する。第２ラウンドの突然変異から得られた最高産生 突然変異体は、EMCC0130である。 第２世代の突然変異体EMCC0130をついで、前記のとおりNTGを用いる第３の突 然変異に付す。第３ラウンドの突然変異から得られた最高産生突然変異体は、NB C-217である。 第３世代の突然変異体NBC-217をついで、前記のとおりNTGを用いる第４の突然 変異に付す。第４ラウンドの突然変異から得られた最高産生突然変異体は、EMCC 0129である。 ７．10．５．突然変異体および親株による因子産生 １リットル当たり0.2mlの微量金属で補足され、ついで滅菌前にH₃PO₄でpH７に 調整された以下の成分よりなる培地50ml を含有する250ml振とうフラスコ中で、突然変異体EMCC0130、NBC-217およびEMCC 0129並びに親株バシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ（Bacillus thuring iensis subsp．kurstaki）EMCC0086を増殖させる： 加水分解された植物タンパク質 30g/リットル 加水分解されたデンプン 40g/リットル K₂HPO₄ ５g/リットル MgSO₄ 0.3g/リットル。 該振とうフラスコ培養を、30℃、250rpmで３日間インキュベートする。 該突然変異体および該親株により産生された因子の定量分析を、第8.3節に記 載のとおり、キャピラリーゾーン電気泳動により行う。定量分析によると、振と うフラスコ中で３日後、突然変異体EMCC0129は培養ブロス１リットルあたり約0. 9gの該因子を産生するが、親株は１リットル当たり約0.15gを産生することを示 す。突然変異体EMCC0129は、親株より約６倍多くの因子を産生する。 本明細書に開示している特定の実施態様は本発明のいくつかの態様を例示する ものであるため、本明細書に記載し特許請求している発明の範囲は、これらの実 施態様により限定されるものではない。同等の実施態様はいずれも、本発明の範 囲内にあると意図される。実際、これまでの記載から、本明細書に示し記載して いるものに加え、本発明の種々の修飾が当業者に明らかとなるであろう。そのよ うな修飾も、添付する請求の範囲の範囲内にあると意図される。 本明細書では種々の参照文献を引用しているが、それらの開示の全体を参考と して本明細書に組込むこととする。 ８．微生物の寄託 バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）の以下の株は、ブダ ペスト条約に従い、Agricultural Research Service Patent Culture Collectio n(NRRL)，Northern Regional Research Center(1815 University Street，Peori a，Illinois，61604，USA)に寄託されている。 これらの株は、本特許出願の係属中は、該培養を入手する権利を有すると特許 商標庁長官が認めた者でなければ該培養を入手できないことを米国特許法施行規 則第1.14条および米国特許法第122条に基づき保証されることを条件として、寄 託されている。該寄託は、各寄託株が実質的に純粋な培養であることを表すもの である。該寄託は、本出願またはその子出願の対応出願が出願されている国の国 内特許法の規定に従い入手するこ とができる。しかしながら、寄託物の入手可能性は、政府の指令により付与され た特許権の信用を失わせるように本発明を実施することを許可するものではない と理解されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ０１Ｎ 63/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｅ (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 リドスター，ウイリアム・デイ アメリカ合衆国、カリフオルニア・95819、 サクラメント、デイ・ストリート・4641 (72)発明者 マンカー，デニーズ アメリカ合衆国、カリフオルニア・95616、 デイビス、プラド・レイン・3037 (72)発明者 マツキントツシユ，スーザン・シー アメリカ合衆国、カリフオルニア・95695、 ウツドランド、デボラ・ストリート・908

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．バシラス（Bacillus）関連農薬の農薬活性を増強する因子を産生するバシ ラス株の突然変異体であって、該突然変異体により産生される因子の量が、対応 する親株により産生される因子の量より多く、該バシラス株が、バシラス・リヘ ニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バシラス・サチリス(Bacillus subtil us)およびバシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）よりなる群 から選ばれることを特徴とする突然変異体。 ２．該突然変異体が、対応する親株より少なくとも約２倍多くの因子を産生す る、請求項１に記載の突然変異体。 ３．該因子が、およそδ1.5、3.22、3.29、3.35、3.43、3.58、3.73、3.98、4 .07、4.15、4.25および4.35の¹H NMRシフト、並びに、およそ31.6、37.2、51.1 、53.3、54.0、54.4、61.5、61.6、64.1、65.6、158.3、170.7および171.3の¹³C シフトを有する、請求項１に記載の突然変異体。 ４．該因子が、構造Ｉ またはその塩で示される請求項１に記載の突然変異体。 ５．該バシラス（Bacillus）株がバシラス・スリンジエンシス（Bacillus thu ringiensis）株である、請求項１に記載の突然変異体。 ６．該バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）株が、バシラ ス・スリンジエンシス亜種アイザワイ(Bacillus thuringiensis subsp．aizawai )、バシラス・スリンジエンシス亜種アレスチ(Bacillus thuringiensis subsp． alesti)、バシラス・スリンジエンシス亜種カナディエンシス(Bacillus thuring iensis subsp．canadiensis)、バシラス・スリンジエンシス亜種コルメリ(Bacil lus thuringiensis subsp．colmeri)、バシラス・スリンジエンシス亜種コレア ネンシス(Bacillus thuringiensis subsp．coreanensis)、バシラス・ スリンジエンシス亜種ダコタ(Bacillus thuringiensis subsp．dakota)、バシラ ス・スリンジエンシス亜種ダームスタディエンシス(Bacillus thuringiensis su bsp．darmstadiensis)、バシラス・スリンジエンシス亜種デンドロリムス(Bacil lus thuringiensis subsp．dendrolimus)、バシラス・スリンジエンシス亜種エ ントモシダス(Bacillus thuringiensis subsp．entomocidus)、バシラス・スリ ンジエンシス亜種フィニチムス(Bacillus thuringiensis subsp．finitimus)、 バシラス・スリンジエンシス亜種ガレリアエ(Bacillus thuringiensis subsp．g alleriae)、バシラス・スリンジエンシス亜種インディアナ(Bacillus thuringie nsis subsp．indiana)、バシラス・スリンジエンシス亜種イスラエレンシス（Ba cillus thuringiensis subsp．israelensis）、バシラス・スリンジエンシス亜 種ケニアエ(Bacillus thuringiensis subsp．kenyae)、バシラス・スリンジエン シス亜種クマモトエンシス(Bacillus thuringiensis subsp．kumamotoensis)、 バシラス・スリンジエンシス亜種クルスタキ(Bacillus thuringiensis subsp．k urstaki)、バシラス・スリンジエンシス亜種キュウシュウエンシス(Bacillus th uringiensis subsp．kyushuensis)、バシ ラス・スリンジエンシス亜種ジャポネンシス(Bacillus thuringiensis subsp．j aponensis)、バシラス・スリンジエンシス亜種メキシカネンシス(Bacillus thur ingiensis subsp．mexcanensis)、バシラス・スリンジエンシス亜種モリソニ(Ba cillus thuringiensis subsp．morrisoni)、バシラス・スリンジエンシス亜種ネ オレオネンシス(Bacillus thuringiensis subsp．neoleonensis)、バシラス・ス リンジエンシス亜種ニジェリアエ(Bacillus thuringiensis subsp．nigeriae)、 バシラス・スリンジエンシス亜種オストリニアエ(Bacillus thuringiensis subs p．ostriniae)、バシラス・スリンジエンシス亜種パキスタニ(Bacillus thuring iensis subsp．pakistani)、バシラス・スリンジエンシス亜種ポンディチェリエ ンシス(Bacillus thuringiensis subsp．pondicheriensis)、バシラス・スリン ジエンシス亜種シャンドンジエンシス(Bacillus thuringiensis subsp．shandon giensis)、バシラス・スリンジエンシス亜種シロ(Bacillus thuringiensis subs p．silo)、バシラス・スリンジエンシス亜種ソット(Bacillus thuringiensis su bsp．sotto)、バシラス・スリンジエンシス亜種スブトキシクス(Bacillus thuri ngiensis subsp． subtoxicus)、バシラス・スリンジエンシス亜種テネブリオニス(Bacillus thuri ngiensis subsp．tenebrionis)、バシラス・スリンジエンシス亜種トンプソニ(B acillus thuringiensis subsp．thompsoni)、バシラス・スリンジエンシス亜種 トチギエンシス(Bacillus thuringiensis subsp．tochigiensis)、バシラス・ス リンジエンシス亜種トウホクエンシス(Bacillus thuringiensis subsp．tohokue nsis)、バシラス・スリンジエンシス亜種トルウォルシ(Bacillus thuringiensis subsp．tolworthi)、バシラス・スリンジエンシス亜種トウマノフィ(Bacillus thuringiensis subsp．toumanoffi)、バシラス・スリンジエンシス亜種ウハネン シス(Bacillus thuringiensis subsp．wuhanensis)およびバシラス・スリンジエ ンシス亜種ユンナネンシス(Bacillus thuringiensis subsp．yunnanensis)の株 よりなる群から選ばれる、請求項５に記載の突然変異体。 ７．該バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）株がバシラス ・スリンジエンシス亜種クルスタキ(Bacillus thuringiensis subsp．kurstaki) 株である、請求項５に記載の突然変異体。 ８．該突然変異体が、NRRLに寄託されNRRL B-wwwwの受託 番号を有するEMCC0129の同定特徴を有するか、またはNRRLに寄託されNRRL B-xxx xの受託番号を有するEMCC0130の同定特徴を有する、請求項１に記載の突然変異 体。 ９．該バシラス（Bacillus）関連農薬が、バシラス・スリンジエンシス（Baci llus thuringiensis）δ−内毒素または農薬的に活性なその断片を含む、請求項 １に記載の突然変異体。 10．該バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）δ−内毒素ま たは農薬的に活性なその断片が、CryI、CryII、CryIII、CryIV、CryVおよびCryV Iよりなる群から選ばれる、請求項９に記載の突然変異体。 11．該バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）δ−内毒素ま たは農薬的に活性なその断片がCryIA δ−内毒素または農薬的に活性なその断 片である、請求項10に記載の突然変異体。 12．該バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）δ−内毒素ま たは農薬的に活性なその断片がCryIC δ−内毒素または農薬的に活性なその断 片である、請求項10に記載の突然変異体。 13．該バシラス（Bacillus）関連農薬がバシラス・スリンジ エンシス（Bacillus thuringiensis）の胞子を含む、請求項１に記載の突然変異 体。 14．該因子が、 （a）バシラス（Bacillus）株の突然変異体を適当な条件下で培養し、 （b）工程（a）の突然変異体の培養の上清を回収し、そして （c）工程（b）の上清から該因子を単離することにより得られる、請求項１に 記載の突然変異体。 15．該因子が、バシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）株の 培養の上清から得られる、請求項14に記載の突然変異体。 16．（a）バシラス（Bacillus）株を変異原で処理し、 （b）工程（a）の突然変異したバシラス株を、該突然変異体の選択に適した条 件下で増殖させ、そして （c）工程（b）の突然変異体を選択することを含んでなる、請求項１に記載の 突然変異体の生産方法。 17．請求項16の方法により得られるバシラス（Bacillus）株の突然変異体。