CZ362597A3 - Mutanty, které produkují potenciátor pesticidní účinnosti kmene Bacillus - Google Patents

Mutanty, které produkují potenciátor pesticidní účinnosti kmene Bacillus Download PDF

Info

Publication number
CZ362597A3
CZ362597A3 CZ973625A CZ362597A CZ362597A3 CZ 362597 A3 CZ362597 A3 CZ 362597A3 CZ 973625 A CZ973625 A CZ 973625A CZ 362597 A CZ362597 A CZ 362597A CZ 362597 A3 CZ362597 A3 CZ 362597A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
bacillus thuringiensis
thuringiensis subsp
mutant
bacillus
subsp
Prior art date
Application number
CZ973625A
Other languages
English (en)
Inventor
Helle Outttrup
Robert L. Starnes
William D. Lidster
Denise Manker
Susan C. Macintish
Original Assignee
Abbott Laboratories
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Abbott Laboratories filed Critical Abbott Laboratories
Publication of CZ362597A3 publication Critical patent/CZ362597A3/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N47/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid
    • A01N47/08—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid the carbon atom having one or more single bonds to nitrogen atoms
    • A01N47/28—Ureas or thioureas containing the groups >N—CO—N< or >N—CS—N<
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/22—Bacillus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/22—Bacillus
    • A01N63/23—B. thuringiensis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Fertilizers (AREA)

Description

Mutanty, které produkují potenciátor pesticidní účinnosti kmene Bači Hus
Tato patentová přihláška je částečnou pokračovací přihláškou přihlášky pořadového č. 08/146,852, podané 3. listopadu 1993, která je částečnou pokračovací přihláškou přihlášky pořadového č. 08/095,240, podané 20. července 1993, která je částečnou pokračovací přihláškou přihlášky pořadového č, 07/990,202, přihlášené 14. prosince 1992, která je pokračovací přihláškou přihlášky pořadového č. 07/971,786, podané 5. listopadu 1992.
Oblast techniky
Vynález se týká mutantního kmene Bacillus, který vytváří faktor potencující pesticidní aktivitu pesticidu souvisejícího s druhem Bacillus, chemického pesticidu a/nebo viru s pesticidními vlastnostmi, u nichž se takový faktor získává ve velkých množstvích, anebo má větší potencující aktivitu ve srovnání s mateřským kmenem, a týká se dále způsobů produkce takových mutantních kmenů. Vynález se také týká způsobů získávání tohoto faktoru.
Dosavadní stav techniky
Škůdci, působící každoročně škody v zemědělství, lesnictví a na obecněn zdraví, představují ztráty v milionech dolarů. Pro zvládnutí takových škůdců byly využity různé strategie.
Jedna ze strategií je užívání chemických pesticidů se širokým rozsahem nebo spektrem účinnosti. Použití chemických pesticidů však přináší řadu nevýhod. Tyto pesticidy, zejména pro své široké spektrum účinnosti, mohou ničit orgamismy, na které nebyly zamířeny, jako je blahodárný hmyz a paraziti ničivých škůdců. Navíc jsou chemické pesticidy obvykle toxické pro zvířata a lidi. Dále si škůdci, na které jsou zaměřeny, často vytvářejí resistenci na takové látky, pokud j im j sou opakovaně vystavovány.
Jinou strategii pro ovládání zamoření hmyzem, houbami a plevelem představuje užití biopesticidů. Biopesticidy jsou přirozeně se vyskytující pathogeny a/nebo substance těmito pathogeny vytvářené. Výhoda použití biopesticidů tkví v tom, že jsou v celkovém srovnání s chemickými pesticidy obyčejně méně škodlivé pro organismy, na které nejsou zaměřeny a pro okolní prostředí.
Bacillus thuringiensis
Nejrozšířenějším biopesticidem thuringiensis. Bacillus thuringiensis tyčinkovítá, gram-positivní bakterie, rozšířená, zejména v půdě a v prostředí
Bacillus thuringiensis vytváří paraspory ve krystalických inklusí, které jsou po požití insekticidní pro je je přírodě bohatém na
Bačillus pohyblivá, široce hmyz. formě citlivé hmyzí larvy řádu Lepidoptera, Diptera a Coleoptera. Inkluse se mohou lišit v tvaru, počtu a složení. Jsou tvořeny jedním nebo více proteiny nazývanými delta-endotoxiny, jejichž velikost se může pohybovat mezi 27 až 140 kDa. Insekticidní delta-endotoxiny jsou obvykle ve vnitřnostech larev přeměněny na menší (zkrácené) toxické polypeptidy způsobující destrukci vyživovacího kanálu a konečně uhynutí hmyzu (Hófte a Vhiteley, 1989, Microbiological Reviews 53:242 - 255).
Existuje několik kmenů Bacillus thuringiensis, které se jako biopesticidy široce užívají v lesnictví, agrikultuře a oblastech obecného zdraví. Bacillus thuringiensis subsp.
kurstaki a Bacillus thuringiensis subsp. aizawai produkují
delta-endotoxiny specifické pro Lepidoptera. Delta-endotoxin specifický pro Coleoptera produkuje Baciílus thuringiensis subsp. tenebrionis (Krieg a spol., 1988, U.S. patent č. 4,766,203). A dále Baciílus thuringiensis subsp. israelensis produkuje delta-endotoxin specifický pro Diptera (Goldberg, 1979, U.S. patent č. 4,166,112).
Pro dvoj křídle škůdce byly popsány i jiné specifické kmeny Baciílus thuringiensis. Byl popsán isolát Baciílus thuringiensis, který je toxický pro Diptera a Lepidoptera (Hodgman a spol., 1993, FEMS Microbiology Letters 114.-17 - 22). Elektroforesa přečištěného krystalu delta-endotoxinu z tohoto isolátu na SDS polyakrylamidovém gelu odhalila tři proteiny, které souvisejí s toxiny CrylA(b), CrylB a CrylIA. Byl rovněž popsán isolát Baciílus thuringiensis, který produkuje na Diptera účinnou krystalickou látku složenou z proteinů s molekulovou hmotností 140, 122, 76, 72 a 38 kDa (Payne, 1994, U.S. patent č. 5,275,815). EPO 480,762 uvádí pět kmenů Baciílus thuringensis, z nichž je každý účinný proti dvojkřídlým škůdcům a každý také má jedinečné složení krystalického delta-endotoxinu.
Bylo popsáno také několik kmenů Baciílus thuringiensis, které vykazují pesticidní účinnost proti jiným škůdcům, než jsou Lepidoptera, Coleoptera a Diptera. Bylo objeveno pět kmenů Baciílus thuringiensis produkujících endotoxiny, které jsou toxické vůči hlísticím (Edwards, Payne a Soares, 1988, Evropská patentová přihláška č. 0 303 426 Bl). Byl také objeven kmen Baciílus thuringiensis PS81F, který může být používán při ošetřování lidí a zvířat, hostících parazitická protozoa (Thompson a Gaertner, 1991, Evropská patentová přihláška č. 0 461 799 A2). Bylo popsáno i několik isolátů Baciílus thuringiensis jsou účinné proti akariosám. Tyto isoláty produkují krystaly složené z proteinů s molekulovou hmotností v (širokém) rozmezí od 35 kDa do 155 kDa (Payne, • · · · · ·
Cannon a Bagley, 1992, PCT přihláška č. VO 92/19106). Byly rovněž popsány kmeny Bacillus thuringiensis s účinností proti škůdcům patřícím do řádu Hymenoptera (Payne, Kennedy, Randall, Meier a Uick, 1992, Evropská patentová přihláška č. 0 516 306 A2), dále s účinností proti škůdcům řádu Hemiptera (Payne a Cannon, 1993, U.S. patent č. 5,262,159), nebo s účinností proti škodlivým motolicím (Hickle, Sick, Schwab, Narva a Payne, 1993, U.S. patent č. U.S. 5,262,399) a s účinností proti škůdcům řádu Phthiraptera (Payne a Hicle, 1993, U.S. patent č. 5,273,746). 0 jiném kmeni Bacillus thuringiensis supsp. kurstaki, VB3S-16, který byl isolován z vlněné stříže australských ovcí, bylo dále zjištěno, že je toxický pro štípavou veš Damalinia ovis, škůdce Phthiraptera (Drummond, Miller a Pinnock, 1992, J. Invert. Path. 60:102 - 103).
Delta-endotoxiny jsou kódovány pomoci cry (krystalický protein) genů, které jsou obvykle umístěny v plasmidech. Cry geny byly rozděleny do šesti tříd a několika podtříd založených na relativní homologii aminokyselin a pesticidní specifičnosti. Hlavní třídy jsou Lepidoptera - specifická (cry I), Lepidoptera- a Diptera-specifická (cry II), Coleoptera-specifická (cry III), Diptera-specifická (cry IV) (Hófte a Vhiteley, 1989, Microbiological Reviews 53:242-255), Coleoptera- a Lepidoptera-speciíická (označovaná jako cry V geny Tailorem a spol., 1992, Molecular Microbiology 6:1211-1217) a Nematoda-specifická (označovaná jako cry V a cry VI Feitelsonem a spol., 1992, Bio/Technology 10:271-275).
Delta-endotoxiny byly získávány metodami rekombinantní DNA. Delta-endotoxiny získané metodami rekombinantní DNA mohou anebo nemusí být v krystalické formě.
U některých kmenů Bacíllus thuringiensis se ukázalo, že produkují tepelně stálý pesticidní analog adenin nukleotidu, • 9
známý jako β-exotoxin typu I neboli thuríngiensin, který je sám pesticidní (Šebesta a spol., v H.D. Burges [editor], Microbial Control of Pests and Plant Diseases, Academie Press, New York, 1980, str. 249-281). β-Exotoxin typu I byl nalezen v matečném louhu některých kultur Bacillus thuringiensis. Má molekulovou hmotnost 701 a skládá se z adenosinu, glukosy a allarové kyseliny (Farkaš a spol., Coli. Czechoslovak Chem. Comm. 42:909-929; Ltithy a spol., v Kurstak [editor], Microbial and Viral Pesticides, Marcel Dekker, New York, 1982, str. 35-72). Okruh jeho hostitelů zahrnuje, ale není omezen na: Musea domestica, Mamestra configurata Valker, Tetranychus urticae, Drosophila melanogaster a Tetranychus cinnabarinus. Má se za to, že toxicitu β-exotoxinu typu I je třeba přičítat inhibici DNA-řízené RNA polymerázy v soutěži s ATP. Bylo prokázáno, že β-exotoxin typu I je kódován cry plasmidem u pěti kmenů Bacillus thuringiensis (Levinson a spol., 1990, J. Bacteriol. 172:3172-3179). Zjistilo se, že β-exotoxin typu I produkuje Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis serotyp 1, Bacillus thuringiensis subsp. tolworthi serotyp 9 a Bacillus thuringiensis supsp. darmstadiensis serotyp 10.
Jiný β-exotoxin byl popsán a klasifikován jako β-exotoxin typu II (Levinson a spol., 1990, J. Bacteriol. 172:3172-3179). Zjistilo se, že β-exotoxin typu II produkuje Bacillus thuringiensis subsp. morrisoni serotyp 8ab, a že je účinný proti Leptinotarsa decemlineata. Struktura β-exotoxinu typu II není zcela známá, ale výrazně se liší od struktury β-exotoxinu typu I, protože na místě adeninu je pseudouridinová část, ve které je připojení ke kruhu ribosy v pozici, jež by měla jinak být obsazena protonem (Levinson, v Hickle a Finch [editoři], Analytical Chemistry of Bacillus thuringiensis, ACS Symposium Series, Washington D.C., 199Q, str. 114-136). Dále je tu pouze jeden signál v protonovém NMR spektru odpovídající basi nukleosidu (při 7,95 ppm) a chybí signál protonu anomerů ribosy (5,78 ppm).
Mezi další ve vodě rozpustné látky, které byly isolovány z Bacillus thuringiensis patří alpha-exotoxin, který je toxický pro larvy Musea domestica (Luthy, 1980, FEMS Microbiol. Lett. 8:1-7)·, gamma-exotoxiny, což jsou různé enzymy zahrnující lecithinázy, chitinázy a proteázy, jejichž toxické účinky se projevují pouze ve spojení s beta-endotoxinem nebo delta-endotoxinem (Forsberg a spol., 1976, Bacillus thuringiensis: Its Effects on Environmental Quality, National Research Council of Canada, NRC Associate Committee on Scientific Criteria for Environmental Quality, Subcommittees on Pwsticides and Related Compounds and Biological Phenomena); sigma-exotoxin, který má podobnou strukturu jako beta-exotoxin a je také účinný proti Leptinotarsa decemlineata (Argauer a spol., 1991, J. Entomol. Sci. 26:206-213); a anhydrothuringiensin (Prystaš a spol.,
1975, Coli. Czechoslovak Chem. Comm. 40:1775).
Zwittermicin
Z Bacillus cereus byla isolována substance, která inhibuje růst rostlinného pathogenu Phythophthora medicaginis a omezuje infekci vojtěšky (viz například U.S. patenty č. 4,877,738 a 4,878,936). Jiná účinnost popsána nebyla. Pro zwittermicin A byla stanovena následuj ící struktura (He a spol., Tet. Lett. 35:2499-2502):
OH NH0 NHa
I I I
H0NCO-NH-CH0-CH-NHCO-CH-CH-CH-CH-CH0-CH-CH-CH0-OH
Z Z | | | z | z
CONH2 OH OH OH
Bylo vyvíjeno úsilí dosáhnout u formulací přípravků s Bacillus thuringiensis vyšší mortality. Zahrnovalo hledání nových kmenů se zvýšenou mortalitou, pokusy o zdokonalení existujících kmenů a pokusy navrhnout efektivnější formulaci kombinací spor Bacillus thuringiensis s novými pesticidními nosiči, chemickými pesticidy anebo zesilovači (viz na příklad U.S. patent č. 5,250,515, inhibitor trypsinu). Z těchto důvodů je účelem předkládaného vynálezu potencovat pesticidní účinnost pesticidů. Předmětem vynálezu je také isolace kmenů, které produkují větší množství potenciátoru.
Podstata vynálezu
Vynález se vztahuje na mutantní kmen Bacillus produkující faktor, který zesiluje pesticidní účinnost pesticidu souvisejícího s druhem Bacillus, při čemž množství faktoru produkovaného mutantem je větší, než množství faktoru produkované odpovídajícím mateřským kmenem. V konkrétním provedení je kmen Bacillus volen ze skupiny sestávající z Bacillus subtilus, Bacillus licheniformis a Bacillus thuringiensi s.
Faktor vytvářený řečeným mutantem je potencíátorem. Jak se zde definuje, potenciátor je substance, která nemá signifikantní pesticidní účinnost tak, že by měla na příklad LC^q (LC^q je koncentrace látky nutná k usmrcení 50 % škůdců) více než kolem 3000 pg/g při stanovení bioassayem (viz dále), která však působí zvýšení pesticidní účinnosti pesticidu souvisejícího s druhem Bacillus zhruba alespoň o 50 % a nezpůsobuje zabránění larvárního růstu. Jak bylo zmíněno výše, jiné substance, o nichž je známo, že jsou schopny zvyšovat pesticidní účinnost, jako jsou delta-endotoxiny, inhibitory trypsinu a exotoxiny, pesticidní účinnost mají.
Ve specifickém provedení je faktor ve vodě rozpustný. Jak se zde definuje, substance nebo sloučenina je ve vodě rozpustná, pokud se alespoň kolem 1 mg látky může rozpustit ·· ···· v 1 ml vody. Faktor může také potencovat pesticidní účinnost chemického pesticidu a/nebo viru s pesticidními vlastnostmi.
Jak se zde definuje, pesticid související s druhem Bacillus je kmen Bacillus (na příklad Bacillus thuringiensis nebo Bacillus subtilis), spora nebo substance, například protein nebo jeho fragment, které jsou účinné proti škůdcům nebo je hubí, anebo mikroorganismus schopný exprimovat gen Bacillus, který kóduje protein Bacillus nebo jeho fragment, který je účinný proti škůdcům nebo je hubí (například Bacillus thuringiensis delta-endotoxin), a přijatelný nosič (pro příklady takových nosičů viz níže oddíl 5.2). Škůdcem může být na přiklad hmyz, hlíštice, roztoč nebo slimák. Mikroorganismus schopný exprimovat gen, který kóduje protein druhu Bačillus nebo jeho fragment, který je účinný proti, nebo hubí škůdce sídlící na povrchu listů rostlin (phylloplane), a/nebo v rhizosféře (půda obklopující kořeny rostlin), a/nebo ve vodném prostředí a je schopný v daném prostředí (úroda a jiné hmyzí lokality) úspěšně soutěžit s divoce se vyskytujícími mikroorganismy a poskytovat stálé udržování a expresi genu Bacillus, v němž je zakódován protein druhu Bacillus nebo jeho fragment, který má účinnost proti, anebo zabíjí škůdce. Příklady takových mikroorganismů představují, avšak nejsou omezeny na bakterie, například rodu Bacillus, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella,
Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas,
Methylophi Hus,
Arthrobacter, a Clostridium;
Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Azotobacter, Leuconostoc, Alcaligenes na řasy, například čeledi Cyanophyceae,
Prochlorophyceae, Rhodophyceae, Dinophyceae, Chrysophyceae,
Prymnesiophyceae,
Xanthophyceae,
Raphidophyceae,
Bačillariophyceae,
Eustigmatophyceae,
Cryptophyceae,
Euglenophyceae, Prasinophyceae a Chlorophyceae; a na houby, zejména kvasinky, například rodu Saccharomyces, Cryptococcus,
Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula a Aureobasidium.
Jak se zde definuje, pesticidní účinnost se měří velikostí účinku proti škůdcům při jejich zahubení, nebo při zabránění jejich růstu, anebo při ochraně rostliny před zamořením škůdcem.
Vynález se také týká způsobu získání mutantu podle tohoto vynálezu, který zahrnuje:
(a) ošetření kmene Bacillus mutagenem;
(b) pěstování mutovaného kmene Bacillus podle stupně (a) za podmínek vhodných pro selekci mutantu;
(c) selekci mutantu získaného ve stupnmi (b).
Podstatně čistý faktor může být z mutantu získán takto:
(a) kultivací mutantu kmene Bacillus za vhodných podmínek;
(b) odebráním supernatantu kultury mutantu ze stupně (a) a (c) isolací faktoru ze supernatantu kultury mutantu podle stupně (b) a získání podstatně čistého faktoru.
Faktor získaný z řečeného mutantu může být formulován do kompozice obsahující faktor a pesticidní nosič, právě tak jako faktor a pesticid související s druhem Bacillus, chemický pesticid a/nebo virus s pesticidními vlastnostmi. Tyto kompozice se mohou užívat k potírání škůdců snižováním resistence škůdce na pesticidy související s druhem Bacillus, což spočívá na vystavení škůdce vůči kompozici, která obsahuje faktor a pesticidně přijatelný nosič anebo na potenciaci pesticidní účinnosti pesticidu souvisejícího s druhem 'Qacillus.
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1 ukazuje schematicky obecný postup použitý pro čistění Ia.
·· ···♦
Obrázek 2 ukazuje C NMR spektrum Ia.
Obrázek 3 ukazuje NMR spektrum Ia.
Obrázek 4 ukazuje výsledky NOE experimentů acetylderivátu Ia.
Mateřským kmenem Bacillus může být například Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis nebo Bacillus thuringiensis. Mateřský Bacillus thuringiensis může být kmenem divokého typu, což zahrnuje, ale neomezuje se na Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, Bacillus thuringiensis subsp. aizawai, Bacillus thuringiensis subsp. galleriae, Bacillus thuringiensis subsp. subsp. tenebrionis, thuringiensis, Bacillus thuringiensis subsp. subsp. darmstadiensis, dendrolimus, Bacillus entomocidus,
Bací llus thuringiensis canadiensis,
Bačillus
Bacillus thuringiensis thuringiensis subsp. subsp. alesti, Bacillus Bacillus thuringiensis thuringiensis subsp.
thuringiensis subsp. finitimus,
Bacillus thuringiensis subsp. kenyae, Bacillus thuringiensis subsp. morrisoni, Bacillus thuringiensis subsp. subtoxicus, Bacillus thuringiensis subsp. toumanoffi, Bacillus thuringiensis subsp. pondicheriensis, Bacillus thuringiensis subsp. shandogiensis, Bacillus thuringiensis subsp. Bacillus thuringiensis subsp.
thuringiensis subsp. yunnanensis, susp. dakota, Bacillus thuringiensis thuringiensis subsp.tohokuensis, subsp. kumamotoensis, tochigiensis, Bacillus Bacillus thuringiensis thuringiensis subsp.
subsp. ostriniae, Bacillus Bacillus thuringiensis thuringiensis subsp.
sotto,
Bačillus nigeriae,
Bacillus thuringiensis subsp. indiana, Bacillus Bacillus thuringiensis thuringiensis subsp. subsp. thompsoni, wuhanensis, Bacillus
Bacillus thuringiensis tolworthi, Bačillus
Bačillus thuringiensis subsp.
kyushuensis, thuringiensis subsp. subsp. pakistani, japonensis, Bacillus thuringiensis ·· ····
thuringiensis thuringiensis subsp.
subsp.
·· · subsp. colmeri , pondicheriensis,
Bacíllus
Bacíllus shandongiensis, Bacillus thuringiensis subsp. neoleonensis,
Bačillus thuringiensis subsp.
coreanensis, Bacillus thuringiensis subsp. silo, Bacillus thuringiensis subsp. mexicanensis a Bacillus thuringiensis subsp. israelensis.
V typickém provedení je mateřským kmenem Bacillu thuringiensis Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki. Nejčastěji je v typickém provedení mateřským kmenem Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki kmen EMCC0086 (uložený v NRRL jako NRRL B-21147). Mutant ještě v jiném typickém provedení má identifikační charakteristiky EMCC0129, je deponován v NRRL a má přírůstkové číslo NRRL B-21445, nebo má identifikační charaktristiky EMCC0130 a přírůstkové číslo NRRL B-2144.
Metody získání mutantu
Mateřský kmen může být ošetřen mutagenem, aby došlo k indukci mutačního pochodu. Konkrétně při jedné z metod mutace kmene Bacillus thuringiensis a selekce takových mutantů, které jsou schopné produkovat podstatně větší množství faktoru než jejich mateřský kmen, je mateřský kmen:
i) ošetřen mutagenem ii) ošetřené buňky se kultivují ve vhodném kultivačním mediu (na příklad NSMP medium) a iii) vyberou se buňky, které produkují větší množství faktoru.
Ve stupni (i) může být mutagenem na příklad chemický mutagen, N-methyl-N -nitro-N-nitrosoguanidin,
N,N -dinitro-N -nitrosoguanidin, nebo methansulfonan ethylnatý, gamma záření, rentgenové záření a/nebo UV-záření
Buňky se vyberou na základě zkoušky na produkci faktoru, na příklad pomocí kapilární elektroforesy anebo pomocí •· ···· imunoanalýzy za použití protilátky faktoru.
Jiný způsob získání vysoce produktivních mutantů podle vynálezu může představovat pěstování matečného kmene v kapalném prostředí a vybrání spontánních mutantů po rozestření živné směsi kultury na agarové medium vhodné pro selekci mutantů.
Za další metody výběru vysoce produktivních mutantů podle vynálezu lze považovat separaci mutantů od jiného materiálu na základě hmotnosti centrifugováním, nebo jinými prostředky, které se používají k separaci na základě hmotnosti.
Získávání faktoru
Mutanty Bačillus podle předkládaného vynálezu mohou být pěstovány za použití medií a fermentačních technik, které jsou v oboru běžné (viz na příklad Rogoff a spol., 1969, J. Intervertebrate Path. 14:122-129; Dulmage a spol., 1971, J. Intervertebrate Path. 18:353-358; Dulmage a spol., v Microbial Control of Pests and Plant Diseases, H.D. Burges, editor, Academie Press, N.Y., 1980). Při typickém provedení může fermentační prostředí obsahovat hydrolysovaný protein, hydrolysovaný uhlohydrát, soli a stopové kovy. Fermentační prostředí může také případně obsahovat jednu nebo více aminokyselin. Po dokončení fermentačního cyklu může být kapalina nad kulturou získána po oddělení spor Bacillu thuringiensis a krystalů z fermentační živné směsi v oboru dobře známými prostředky, jako je centrifugování a/nebo ultrafiltrace. Faktor se nalézá v kapalině nad kulturou a může být získán v oboru dobře známými způsoby, na příklad ultrafiltrací, odpařením nebo sušením rozprašováním. Tento postup je podrobněji popsán v následujícím oddílu.
Čistění faktoru může být provedeno různými v oboru známými procedurami, včetně, nikoliv však pouze, ·· ···· • * ···· · ··· ·· · • · • ·
chromatografických (na příklad iontoměniče, afinitní a rozdělovači kolonová chromatografie), elektroforetických procedur, diferenční rozpustnosti, extrakce, anebo jakékoliv standardní techniky známé v oboru.
Potencující účinnost faktoru pesticidní účinnosti pesticidu souvisejícího s druhem Bacillus, viru majícího pesticidní účinnost nebo chemického pesticidu proti různým škůdcům může být stanovena v oboru známými postupy jako je přidávání do umělé hmyzí potravy, překrývání umělé potravy, natíráni listu, namáčení listu a postřik listu. Modelové příklady takových zkoušek jsou popsány níže. Množství produkovaného faktoru může být kvantifikováno například kapilární elektroforesou.
Faktor může mít molekulovou hmotnost od kolem 350 do kolem 1200 nebo ve specifickém případě od kolem 350 do kolem 700.
Faktor znásobuje pesticidní účinnost pesticidu souvisejícího s kmenem Bacillus nejméně zhruba 1,5-krát, popřípadě až zhruba 1000-krát, výhodně pak zhruba 100-krát až zhruba 400-krát. V typickém případě znásobuje faktor circa 1,5-krát až circa 1000-krát pesticidní účinnost delta-endotoxinu Bacillu thuringiensis, včetně, avšak nikoliv pouze Cryl (včetně, avšak nikoliv pouze CrylA, CrylB a CrylC), CrylI, CrylII, CrylV, CryV, nebo CryVI proteinu v jeho původní délce nebo proteolyticky zpracované zkrácené formě. V nejčastějších případech znásobuje faktor delta-endotoxin Bacillu thuringiensis circa 100-krát až circa 400-krát. Faktor může také násobit pesticidní účinnost chemického pesticidu a/nebo viru s pesticidními vlastnostmi.
Faktor může být také ve vodě rozpustný, stálý ve vodě až circa do 100 C nejméně po dobu asi 5 minut, stálý při vystavení přímému slunečnímu světlu nejméně po dobu asi 10 hodin, a/nebo stálý při přibližně pH 2 asi 10 dni. Faktor může mít 13 uhlíků. K tomu dále může mít faktor v ^H NMR spektru chemické posuny kolem δ 1,5; 3,22; 3,29; 3,35; 3,43; 3,58; 3,73; 3,98; 4,07; 4,15; 4,25; 4,35 a chemické posuny 13C kolem 31,6; 37,2; 51,1; 53,3; 54,0; 54,4; 61,5; 61,6;
64,1; 65,6; 158,3; 170,7 a 171,3.
V nejčastějších typických případech má řečený faktor strukturu Ia
OH NHO NHO
I II
HoNC0-NH-CHo-CH-NHC0-CH-CH-CH-CH-CH9-CH-CH-CH9-0H
II
OHOH 2 Ϊ......
conh2 nebo je jeho solí, související s druhem
Sůl
Bači llus.
by byla schopna (Ia) zesilovat pesticid
Kompozice obsahující faktor
Faktor získaný z mutantu podle tohoto vynálezu, se může formulovat samostatně, nebo s pesticidem souvisejícím s druhem Bacillus, který, jak je svrchu definováno, je kmenem Bacíllus, sporou, proteinem nebo fragmentem, nebo jinou jeho substancí, s účinností proti škůdcům nebo která hubí škůdce nebo chrání rostliny proti škůdci, nebo dále s chemickým pesticidem a/nebo s entomopathogenním virem a přijatelným nosičem, do pesticidní kompozice/í, což je na příklad suspense, roztok, emulse, prachový pudr, dispersibilní granule, prach ulpívající po zvlhčení, koncentrát pro emulsi, aerosol nebo obalované granule. Příklady takových kmenů Bacillus zahrnují, avšak nejsou omezeny na Bacillus
TM thuringiensis subsp. kurstaki (na trhu jako DIPEL od Abbott Laboratories, lne., JAVELUN^ od Sandoz, BIOBIT^ od Novo Nordisk A/S, FORAY^ od Novo Nordisk A/S, BIOCOT^ od Novo Nordisk A/S, MVP^ od Mycogen, BACTOSPEINE^ od Novo Nordisk A/S a THURICIDE™ od Sandoz); Bacillus thuringiensis subsp.
aizawai (na trhu jako FLORBAC™ od Novo Nordísk A/S a XENTARI^M od Abbott Laboratoríes, lne.); Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis (na trhu jako NOVODOR™ od Novo Nordísk A/S, TRIDENT™ od Sandoz, M-TRAK™ a M-ONE™ od Mycogen a DTERRA^ od Abbott Laboratoríes, lne.); Bacillus thuringiensis subsp. israelensis (na trhu buď jako BACTIMOS™ nebo SKEETAL™ od Novo Nordísk A/S, TEKNAR™ od Sandoz, a VECTOBAC™ od Abbott Laboratoríes, lne.); Bacillus thuringiensis kurstaki/tenebrionis (na trhu jako FOIL™ od Ecogen); Bacillus thuringiensis kurstaki/aizawai (na trhu jako CONDOR od Ecogen a AGREE™ od Ciba Geigy); Bacillus thuringiensis kurstaki/kurstaki (na trhu jako CUTLASS™ od
Ecogen). Protein související vybrán ze skupiny, neomezené CrylII, CrylV, CryV a Cry VI. například regulátor hmyzího karbamát jako thiodicarb a chlorpyrifos, pyrethroid jako anorganický fluorid virus může představovat nukleární polyhedrosis Syngrapha falcifera, NPV Heliothis zea, pseudotsugata, NPV s druhem Bacillus může být však jenom, na Cryl, CrylI, Chemickým pesticidem může být růstu jako diflubenzuron, methomyl, organofosfát jako cypermethrin a esfenvalerate, pyrrol. Entomopathogenní například virus californica, NPV Cydia pomonella, NPV Orgyia Neodiprion jako kryolit a baculovirus, (PNV) Autographa
GV (virus granulosis) NPV Limantria dispar, Spodoptera exigua, NPV lecontei, NPV Neodiprion sertifer, NPV Harrisina brillians a NPV Endopiza viteana Clemens.
Ve směsích, které obsahují substanci a pesticid související s druhem Bacillus, může být substance přítomna v množství nejméně asi 0,1 g/BIU nebo 0,05 g faktoru na g delta-endotoxinu nebo spory bacilu, volívá se asi 300 g/BIU nebo 150 g substance na g delta-endotoxinu a spory bacilu, nejlépe pak 2 g/BIU nebo 1 g substance na g delta-endotoxinu a spory bacilu. Jak se zde definuje, BIU
je miliarda mezinárodních jednotek, jak se určuje bioassayem. Při bioassayi je vzorek srovnáván se standardním referenčním materiálem druhu Bacillus, za použití Trichoplusia ni nebo j iného škůdce j ako standardního testovacího hmyzu. Potence se určí vydělením referenčního standardu LCg0 a pak násobením potencí referenčního standardu.
V dalším provedení může komposice obsahovat faktor v podstatně čisté formě, nebo faktor z kapaliny nad kulturou bacilu ve vysušené, koncentrované nebo kapalné formě a pesticidně přijatelný nosič, jak je níže na příkladech vyloženo. Tato kompozice může být na rostlinu aplikována odděleně, na příklad na transgenní rostliny. Ve specifickém případě lze kompozici aplikovat na rostlinu již před tím obsahující a exprimující gen Bacillus thuringiensis. V jiném případě je možné kompozici aplikovat na rostlinu, která byla kompozici Bacillus thuringiensis vystavena dříve. Při dalším případě lze kompozici aplikovat v jiných prostředích dvojkřídlého škůdce/ů jako na příklad ve vodě nebo v půdě. Koncentrace substance v kompozici je asi od 0,001 % do asi 60 % hmotnostních.
Kompozici obsahující substanci a navíc ještě pesticidně přijatelný nosič ke kontrole škůdce lze používat také ke snížení resistence škůdce na pesticid. Alternativně je možné používat kompozici k potencování pesticidu souvisejícího s druhem Bacillus. V jednom z provedení se kompozice aplikuje ve stejném čase jako pesticid v množství alespoň kolem 2 g substance/BIU až do případných cca 300 g substance/BIU. V jiném provedení lze kompozici aplikovat do zhruba 24 hodin po pesticidu jako adjuvans pro rozvinutí působivosti residuálního pesticidu.
Takové, svrchu uváděné kompozice, lze získat po přidání povrchově aktivního činidla, inertního nosiče, ochranného prostředku, zvlhčovadla, chuťového stimulantu, atraktantu, ·· ····
kapsulačního činidla, pojidla, emulsifikátoru, barviva, ochrany proti UV záření, pufru, zkapalňujícího činidla nebo jiných komponent, které usnadňují manipulaci a aplikaci zaměřenou na určité škůdce.
Vhodná povrchově aktivní činidla jsou anionaktivní sloučeniny jako karboxyláty, například kovové soli mastných kyselin o dlouhém řetězci; N-acylsarkosinát; mono- nebo diestery fosforečné kyseliny s ethoxyláty mastných alkoholů či soli takových esterů; sulfáty mastných alkoholů jako dodecylsíran sodný, oktadecylsíran sodný nebo cetylsíran sodný; sulfáty ethoxylovaných mastných alkoholů; sulfáty ethoxylovaných alkylfenolů; ligninsulfonáty; ropné sulfonáty; alkylarylsulfonáty jako alkylbenzensulfonáty, nebo nižší alkylnaftalensulfonáty, na příklad butylnaftalensulfonát; soli sulfonovaných kondensačních produktů naftalenu a formaldehydu; soli sulfonovaných kondensačních produktů fenolu a formaldehydu; nebo složitější sulfonáty jako amidsulfonáty, například olejové kyseliny a sulfosukcináty, na příklad sulfonovaný kondensační produkt N-methyltaurinu nebo dialkyl dioktyl sulfosukcinát sodný. Mezi neionogenními činidly se pak používají kondensační produkty ethylenoxidu a esterů mastných kyselin, mastných alkoholů, amidů mastných kyselin, nebo alkyl- či alkenylfenolů s mastnými alkyly či alkenyly, dále estery polyhydroxyalkoholetherů, například estery sorbitolu a mastných kyselin, kondensační produkty takových esterů a ethylenoxidu, například estery mastných kyselin a polyoxyethylensorbitolu, blokové kopolymery ethylenoxidu a propylenoxidu, acetylenické glykoly jako 2,4,7,9-tetraethyl-5-decin-4,7-diol, nebo ethoxylované acetylenické glykoly. Příklady kationaktivních povrchově aktivních činidel představují na příklad alifatické mono-, di- nebo polyaminy ve formě acetátů, naftenátů nebo oleátů, ·· ····
dále kyslík obsahující amin jako aminoxid polyoxyethylenalkylaminu, potom amidovými skupinami seřetězený amin, získaný kondensací karboxylové kyseliny s di- či polyaminem, anebo kvarterní amoniová sůl.
Příklady inertních materiály jako kaolin, fylosilikáty, uhličitany, i organické materiály jako materiálů zahrnuj i anorganické slídu, sádru, umělé hnojivo, sírany nebo fosforečnany, dále cukr, škroby nebo cyklodextriny, anebo botanické materiály jako lesní produkty, korek, rozemleté kukuřičné palice, rýžové slupky, slupky burských oříšků a skořápky vlašských ořechů.
Kompozice podle předkládaného vynálezu mohou být ve formě vhodné pro přímou aplikaci, nebo jako koncentrát či základní směs, která před aplikací vyžaduje zředění příslušným množstvím vody nebo jiného ředidla. Koncentrace pesticidu se bude měnit v závislosti podle povahy jednotlivé formulace, konkrétně podle toho, zda je to koncentrát, nebo zda je pro přímé použití. Kompozice obsahuje 1 až 98 % pevného nebo kapalného inertního nosiče a 0 až 50 %, nejlépe 0,1 až 50 % povrchově aktivního činidla. Kompozice se aplikují v dávkách určených pro komerční produkt, nejlépe kolem 0,01 kg/ha (lb/akr) až 5,6 kg/ha (lb/akr), pokud jsou v suchém stavu a kolem 0,007 1/ha (0,01 pint/akr) do 17,5
1/ha (25 pint/akr), pokud jsou kapalné.
Podle dalšího způsobu provedení může být krystalický delta-endotoxin Bacillu thuringiensis a/nebo faktor před formulací ošetřen tak, aby byla prodloužena pesticidní účinnost při jeho aplikaci v prostředí ničeného škůdce, pokud toto předběžné ošetření neničí krystalický delta-endotoxin nebo substanci. Takové ošetření nůže být uskutečněno chemickými a/nebo fysikálními prostředky, pokud toto ošetření neovlivní zhoubně vlastnosti směsi/í. Mezi příklady chemických činidel patří, ale nejsou omezeny na halogenační ·· ···· činidla, aldehydy jako formaldehyd a glutaraldehyd, činidla proti infekci jako zephiran chlorid, alkoholy jako isopropanol a ethanol a histologické fixativy jako Bouin-ův fixativ a Helly-ho fixativ (viz na příklad Humason, Animal Tissue Techniqes, V.H. Freeman and Co., 1967).
Kompozice podle vynálezu lze aplikovat přímo na rostlinu, například postřikem nebo poprášením v době, kdy se na rostlině začal objevovat škůdce nebo jako ochranné opatření před jeho příchodem. Mezi rostliny, které lze chránit v rozsahu tohoto vynálezu patří, ale nej sou omezeny jen na ně: obiloviny (pšenice, ječmen, žito, oves, rýže, čirok a příbuzné plodiny), řepy (cukrová řepa, krmná řepa), peckoviny, jádroviny a měkké ovoce (jablka, hrušky, švestky, broskve, mandle, třešně, jahody, maliny, borůvky), luskoviny (vojtěška, fazole, čočka, hrách, sója), olejniny (řepka, hořčice, mák, olivy, slunečnice, kokos, skočce poskytující ricinový olej, kakaové boby, podzemnice olejná), okurkovité rostliny (okurky, dýně, melouny), vláknité rostliny (bavlna, len, konopí, juta), citrusové ovoce (pomeranče, citrony, grapefruity, mandarinky), zelenina (špenát, salát, chřest, zelí a jiné košťáloviny, mrkve, cibule, rajčata, brambory), vavřínovité rostliny (avokado, skořice, kafr), opadavé listnaté stromy i jehličnany (lípy, tisy, duby, olše, topoly, břízy, jedle, modříny, borovice), nebo rostliny jako jsou kukuřice, trávníkové rostliny, tabák, ořechy, káva, třtina cukrová, vinná réva, chmel, banánovníky, kaučukovníky stejně tak jako rostliny okrasné. Kompozici lze aplikovat na list, zapravením do země, rozhozem granulí, na poslední chvíli při sklizni nebo nasáknutím do půdy. Zpravidla je důležité získat kontrolu nad škůdcem v raných stadiích vývoje rostliny, protože to je doba, kdy může být poškozena nejvážněji. Pokud se má za to, že je to nutné, může postřik nebo poprašek obsahovat výhodně i jiný pesticid. V preferovaném provedení • · · · · ·
4 • • 4 • 4 4
• · • 4 • • 4 • · · · · • • • • • · 4 ··· 4 4 4 4
• 4 4 4 4 • • · * • · · 4 4 4
se kompozice podle vynálezu aplikuje přímo na rostlinu.
Kompozice podle předkládaného vynálezu mohou být také aplikovány přímo do rybníků, jezer, potoků, řek, stojatých vod a dalších míst vystavených zamoření dvojkřídlými škůdci, zvláště škůdci ohrožuj ícímí obecné zdraví. Kompozice může být aplikována sprej ováním, práškováním, postřikem a tak podobně.
Kompozice podle předkládaného vynálezu může být účinná proti škůdcům řádu Lepidoptera, například Achroia grisella, Acleris gloverana, Acleris variana, Adoxophyes orana, Agrotis ipsilon, Alabama argillacea, Alsophila pometaria, Amyelois transitella, Anagasta kuehniella, Anarsia lineatella, Anisota senatoria, Antheraea pernyi, Anticarsia gemmatalis, Archips sp., Argyrotaenia sp. , Athetis mindara, Bombyx moři, Bucculatrix thurberiella, Cadra cautella, Choristoneura sp., Cochylis hospes, Colias eurytheme, Corcyra cephalonica, Cydia latiferreanus, Cydia pomonella, Datana integerrima, Dendrolimus sibericus, Desmia funeralis, Diaphania hyalinata, Diaphania nitidalis, Diatraea grandiosella, Diatraea saccharalis, Ennomos subsignaria, Eoreuma loftini, Ephestia elutella, Erannis tiliaria, Estigmene acrea, Eulia salubricola, Eupoecilia ambiguella, Euproctis chrysorrhoea, Euxoa messoria, Galleria mellonella, Grapholita molesta, Harrisina americana, Helicoverpa subflexa, Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Hemileuca oliviae, Homoeosoma electellum, Hyphantria cunea, Keiferia lycopersicella, Lambdirta fiscellaria, Lambdina fiscellaria lugubrosa, Leucoma salicis, Lobesia botrana, Loxostege sticticalis, Lymantria dispar, Macalla thyrsisalis, Malacosoma sp., Mamestra brassicae, Mamestra configurata, Manduca quinquemaculata, Manduca sexta, Maruca testulalis, Melanchra pieta, Operoptera brumata, Orgyia sp., Ostrinia nubilalis, Paleacrita vernata, Papilio cresphontes, Pectinophora gossypiella, Phryganidia californica, Phylonorycter blancardella, Pieris napi, Pieris flouendana, Platynota
Plodia interpunctella,
Pseudaletia rapae, Plathypena scabra, Platynota sultana, Platyptilia carduidactyla, Plutella xylostella, Pontia protodice, Pseudoplusia concinna, Spodoptera bisselliella, curialis, Aedes sp., includens, Sabulodes Sitotroga cerealella, sp., Thaurnstopoea
Trichoplusia ni, Udea
Yponomeuta pádella;
Andes vittatus, aegrotata,
Spilonota pityocampa, rubigalis, dále řádu Diptera
Anastrepha ludens, unipuncta, Schizura ocel lana, Tineola
Xylomyges na příklad Anastrepha suspensa, Anopheles quadrimaculatus, Armigeres subalbatus, Calliphora stygian, Calliphora vicina, Ceratitis capitata, Chironomus tentans, Chrysomya rufifacies, Cochliomyia macellaria, Culex sp., Culiseta inornata, Dacus oleae, Delia antiqua, Delia platura, Delia radicum, Drosophila melanogaster, Eupeodes corollae, Glossina austeni, Glossina brevipalpis, Glossina fuscipes, Glossina morsitans centralis, Glossina morsitans morsitans, Glossina morsitans submorsitans, Glossina pallidipes, Glossina palpalis gambiensis, Glossina palpalis palpalis, Glossina tachinoides, Haemagogus equinus, Haematobia irritans, Hypoderma bovis, Hypoderma lineatum, Leucopis ninae, Lucilia čupřina, Lucilia sericata, Lutzomyia longlpaipis, Lutzomyia shannoni, Lycoriella malí, Mayetiola destructor, Musea autumnalis, Musea domestica, Neobillieria sp., Nephrotoma suturalis, Ophyra aenescens, Phaenicia sericata, Phlebotomus sp., Phormia regina, Sabethes cyaneus, Sarcophaga bullata, Scatophaga stercoraria, Stomoxys calcitrans, Toxorhynchites amboinensis, Tripteroides bambusa. Avšak kompozice podle vynálezu mohou být také účinné proti hmyzím škůdcům řádu Coleoptera, například Leptinotarsa sp., Acanthoscelides obtectus, Callosobruchus chinensis, Epilachna varivestis, Pyrrhalta luteola, Cylas formocarius elegantulus, Listronotus oregonensis, Sitophylus sp., Cyclocephala borealis, ·· ····
Cyclocephala immaculata, Makrodactylus subspinosus, Popillia japonica, Rhizotrogus majalis, Alphitobius diaperinus, Palorus ratzeburgi, Tenebrio molitor, Tenebrio obscurus, Tribolium castaneum, Tribolium confusum, Tribolius destructor; dále řádu Acari, například Oligonychus pratensis,
Panonychus ulmi, Tetranychus urticae; nebo řádu Hymenoptera, například Iridomyrmex humilis, Solenopsis invicta; či řádu Isoptera, například Reticulitermes hesperus, Reticulitermes flavipes, Coptotermes formosanus, Zootermopsis angusticollis,
Neotermes connexus,
Incisitermes mi nor,
Incisitermes immigrans;
gallinae, nebo řádu Siphonaptera, například Ceratophyllus
Ceratophyllus niger, Nosopsyllus fasciatus,
Leptopsylla segnis, Ctenocephalides canis, Ctenocephalides felis, Echicnophaga gallinacea, Pulex irritans, Xenopsylla cheopis, Xenopsylla vexabilis, Tunga penetrans; anebo řádu
Tylenchida, například Melodidogyne incognita, Pratylenchus penetrans.
Příklady provedení vynálezu
Následující příklady jsou uváděny pro ilustraci, nikoliv však aby omezovaly.
Charakterisace Ia
Podrobně se popisuje získávání a čištění Ia. Podrobnosti o charakterisaci Ia jsou uvedney dále.
1. Získání a čistění Ia
Kmen Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki EMCC0086 (uložený v NRRL jako B-21147) byl fermentován 72 hodin při 30 C v mediu složeném ze zdroje uhlíku jako je škrob, škrobový hydrolysát nebo glukosa a ze zdroje dusíku jako je protein, proteinový hydrolysát nebo výluh z obilí. Tvorba Ia ·· ···· hodinách během fermentace. Vrchol
PO nalezen nad subsp.
zhruba po 30 hodinách.
živnou půdou z fermentace Bacillu kurstaki byla odcentrifugována a poté membránou 30 kDa MV-CO s použitím Rhóne
Ultrafiltrací se odstranily jakékoliv a rozpustný
Filtrát byl odpařením poté centrifugován a dalšímu odstranění byla stanovována účinnosti byl
Kapalina thuringiensis vyčeřena ultrafiltací Poulenc UF systému. zbytky buněk, krystaly delta-endotoxinu, spory protein s zahuštěn větší hmotností než 30 desetinásobně. Filtrát kDa.
filtrován membránou 0,2 μπι, nerozpustných částic z živného roztoku obsahujícího Ia.
byl k roztoku a získání čistého
Vyčistění Ia do homogenity se dosáhlo použitím mnohastupňového čistícího pochodu, který je schematicky uveden na obrázku 1. V návaznosti na postup přípravy popsaný shora, pokračoval čistící proces stupněm ultrafiltrace na 5 kDa. Filtrát po 5 kDa ultrafiltraci byl absorbován na kationtoměnič Sulfopropyl (SP) a eluován roztokem octanu amoného. Látka byla pak přibližně 30x zkoncentrována lyofilisací a sůl a ostatní kontaminanty byly odstraněny pomocí dělící kolony BioRad P2. Podíl z P2 kolony poskytl homogenní sloučeninu po projití kolonou s vysokým rozlišením, obsahující SP HPLC kationtoměnič. Kontaminující sůl byla odstraněna opakovanou lyofilisací.
Účinnost byla monitorována pomocí mikrobioassaye se Spodoptera exigua a čistota se určovala kapilární elektroforesou. Vzorek, sestávající z 50 μΐ Ia a 50 μΐ proteinu CrylA(c) (15 pg/ml) , přečištěný z BIOBITu^ FC (100 μΐ) byl přidáván do individuálních nádobek v želatinovém tácku obsahujících 500 μΐ ztužené umělé hmyzí potravy. Tácky obsahující různé vzorky byly vysušeny na vzduchu. Do nádobek obsahujících vysušený vzorek byly přidány dvě až čtyři Spodoptera exigua v druhém nebo časném třetím vývojovém ·* ···· stadiu. Nádobky byly zataveny do plastikového sáčku s dírami a ínkubovány pří 30 C 2 až 3 dny. Potom byl zaznamenán stupeň zakrnění a úmrtnosti. Pro každý vzorek bylo běžně provedeno 5 replik.
2. Stanovení struktury
Účinná sloučenina je ve vodě rozpustná a nerozpustná je v organických rozpouštědlech. Má posltvní náboj a reaguje s ninhydrinem, jak to bylo prokázáno chromatografií na tenké vrstvě, na silikagelu. C a H NMR spektra sloučeniny jsou na obrázku 2 respektive 3. NMR experimenty vyjevily přítomnost 13 uhlíků (vztaženo k 3-[trimethylsilyljpropionové kyselině jako standardu). DEPT experiment určil přítomnost tří kvarterních uhlíků (C), sedmi methinových skupin (CH), tří methylenových (CH2) a nepřítomnost methylové skupiny (CH^). Pomocí couplingu protonů jako je 1-D decoupling a COSY byl identifikován rozsáhlý spinový systém osmi uhlíků. Vedle toho je přítomen menší spinový systém dvou uhlíků. Korelační experiment uhlík - proton (HMBC) umožnil přiřazení resonance každého protonu v molekule k uhlíku, na který je vázán.
Reakce účinné sloučeniny (13 mg) s acetanhydridem v pyridinu poskytla acetylderivát, který je mnohem méně polární. Tento derivát byl čištěn pomocí HLPC a poskytl 3 mg čistého acetylderivátu. Hmotnostní spektroskopie ukázala, že derivát má 7 acetylových skupin a molekulární hmotnost 690, což pro účinnou sloučeninu dává molekulovou hmotnost 396 a indikuje, že je přítomen sudý počet dusíkových atomů. Byly také detegovány fragmenty se 6 a 5 acetyly. Data z vysokého rozlišení pro dceřinné ionty s 5 a 6 acetyly jsou 645,2594 (6 acetylů) a 607,2519 (5 acetylů), což značí, že molekulový vzorec pro Ia je
Působení 6 N HC1 na aktivní sloučeninu (13 mg) poskytlo derivát, který je positivní na ninhydrin. Tyto výsledky ·* «··· udávají přítomnost amidových vazeb. Tento derivát má stejnou hodnotu Rf jaká byla chromatografii na tenké vrstvě stanovena pro 2,3-diaminopropionovou kyselinu. To spolu s NMR daty udává přítomnost 2,3-diaminopropionové kyseliny.
Další technika, která byla využita pro analýzu Ia, je NOE (Nucleár-ní Overhauser-ův Efekt), který umožňuje určit jak blízko v prostoru má jeden proton ke druhému. NOE byl proveden na acetylovaném Ia. Ve dvojrozměrném NOE experimentu (NOESY), byl NOE pozorován mezi N-H protonem s δ 8,06 ppm a protonem s δ 5,17 (Obrázek 4).
Pro Ia byla stanovena následující struktura:
OH NH~ NHO
I I I
H2NCO-NH-CH2-CH-NHCO-CH-CH-CH-CH-CH2-CH-CH-CH2-OH
CONH2 OH OH OH
Lze ji označit jako ureidoamid. Jejími konstituenty jsou dvě amidové skupiny, močovina, dvě aminoskupiny a pět hydroxyskupin. Má sedm chirálních center.
3. Vlastnosti Ia
Zjistilo se, že isolovaný Ia znásobuje účinnost krystalického delta-endotoxinu pesticidních proteinů Bacillu thuringiensis subsp. kurstaki a Bacillu thuringiensis subsp. aizawai vůči Spodoptera exigua bez ohledu na formu pesticidních proteinů. Pesticidní účinnost se potencuje jak u formulací Bacillu thuringiensis subsp. kurstaki, tak u isolovaných krystalů i u CrylA proteinů nezkrácených (molekulární hmotnost 130 kDa) či zkrácených (- 65 kDa molekulární hmotnosti). Účinnosti inklusí CrylI a CrylC se rovněž znásobují. Zjistilo se také, že je potencována účinnost individuálních zkrácených proteinů Cryla (a), (b) ·· ···· a (c). Nezjistilo se, že by pro bioaktívitu byla kritická inkubační doba Ia s Cry proteinem. Avšak samotný Ia je inaktivní. Bylo nalezeno, že úroveň potencování je 100 až 200 násobná pro zkrácené CrylA proteiny, CryII a CrylC inkluse a přibližně 320-ti násobná pro CrylA (c) plné délky (víz Tabulka I respektive II). Konkrétně, jestliže se použije Ia, způsobí 0,75 pg/ml CrylA (c) stejný poměr mortalita/zakrnění hmyzu jako 240 gg/ml samotného CrylA (c). V případě zkráceného CrylA (c) 0,0006 OD280 poskytly v kombinaci s Ia stejné skoré v zakrnění jako stejný vzorek Cryla (c) testovaný sám s 0,075 OD2gQ ’ Inkluse CrylI při koncentraci 0,6 pg/ml daly v kombinaci s Ia stejné skoré v zakrnění a podobnou mortalitu jako 75 gg/ml samotného CrylI proteinu, což je 125ti násobná potenciace, Inkluse CrylC, při 0,3 pg/ml s přidáním Ia vykázaly podobnou mortalitu a skoré zakrnění jako 75 pg/ml CrylC protein samotný, což odpovídá 250ti násobné úrovni potenciace. Koncentrace proteinu CrylA, která způsobovala zakrnění, po přidání Ia vykázala mortalitu.
Zjistilo se, že Ia je stálý po pětiminutovém varu, ale při autoklávování (>190 C) veškerou aktivitu ztrácí. Dále je stálý, je-li vystaven po dobu nejméně 10 hodin přímému slunečnímu světlu. Ia je stálý 3 dny při pH 2, ale nestálý při pH 12. Bylo zjištěno, že veškerou aktivitu ztrácí, je-li vystaven působení kyseliny jodisté nebo koncentrované kyseliny solné.
Tabulka I POTENCIAČNÍ EFEKTY Ia U ČIŠTĚNÉHO ZKRÁCENÉHO PROTEINU B.t.
Protein B. thuringiensi s Spodoptera exigua
Tvp OD 280 Ia Mortalita1 Skoré zakrnění
Cryla (a) 0,055 - 0/5 2,2
0,040 - 0/5 2,2
0,020 - 0/5 2,0
0,020 + 2/5 0,0
·' ··♦·
• · ·· · • · · • ···· · ·· • • « · • • • · • · • ··· • • • • •
• * ··· * * ·· · ··· •
0,010 + 0/5 0,2
0,005 + 0/5 0,0
0,0025 + 0/5 0,4
0,0012 + 0/5 1,8
0,0006 + 0/5 1,6
CrylA (c) 0,075 0/5 3,4
0,040 - 0/5 2,6
0,020 - 0/5 2,8
0,020 + 1/5 0,0
0,010 + 0/5 0,2
0,005 + 1/5 0,0
0,0025 + 2/5 2,0
0,0012 + 0/5 1,0
0,0006 + 1/5 1,0
Žádný NA + 0/5 4,0
Žádný NA 0/5 4,0
^Mortalita = počet mrtvého hmyzu/počet všeho hmyzu po 2 dnech 2Skore zakrnění je definováno průměrnou velikostí živých hmyzích larev na konci bioessaye: 4,0 = neošetřená kontrola, 3,0 = 75 % velikosti neošetřené kontroly, 2,0 = 50 % velikosti neošetřené kontroly, 1,0 = 25 % velikosti neošetřené kontroly, 0,0 = žádný růst nebo nezměněná velikost od začátku experimentu.
Tabulka II POTENCIAČNÍ EFEKTY Ia U PROTEINU B. THURINGIENSIS
Protein B. thuringiensis Spodoptera exigua
Typ pg/ml Ia Mortalita3- 9 Skoré zakrnění
Cryla (c) 240 1/5 0,5
120 0/5 2,2
60 0/5 2,2
30 0/5 4,0
60 + 5/5 —
30 + 5/5 —
15 + 4/5 0,0
3 + 4/5 1,0
0,8 + 2/5 1,6
CrylI 300 1/5 0,8
150 2/5 0,7
75 1/5 0,2
38 0/5 0,8
19 0/5 1,6
• 0 0 0 • 0 00 ♦
• • 0 0
0 • 000 0 0
0 0 0
00 0 • • 00 0
9 - 0/5 1,8
5 - 1/5 4,0
38 + 3/5 1,0
19 + 2/5 0,5
9 + 3/5 0,0
5 + 1/5 0,5
2,4 + 1/5 0,0
1,2 + 3/5 0,5
0,6 + 2/5 0,3
CrylI 300 - 2/5 0,3
150 - 2/5 0,0
75 - 1/5 0,8
38 - 0/5 3,2
38 + 5/5 —
19 + 5/5 —
9 + 5/5 —
5 + 4/5 0,0
2,4 + 1/5 0,0
1,2 + 5/5 —
0,6 + 3/5 1,5
0,3 + 2/5 1,3
Žádný NA - 0/5 4,0
Žádný NA + 0/5 4,0
^Mortalita = počet mrtvého hmyzu/počet všeho hmyzu po 2 dnech 2Skore zakrnění je definováno průměrnou velikostí živých hmyzích larev na konci bioessaye: 4,0 = neošetřená kontrola,
3,0 = 75 % velikosti neošetřené kontroly, 2,0 = 50 % velikosti neošetřené kontroly, 1,0 = 25 % velikosti neošetřené kontroly, 0,0 = žádný růst nebo nezměněná velikost od začátku experimentu.
4. Zhodnocení dalších subspecies Bacillu thuringiensis a dalších species druhu Bacillus
Některé Bacillus species byly hodnoceny z hlediska tvorby Ia. Kmeny byly fermentovány 72 hodin při 30 C v prostředí, které obsahovalo zdroj uhlíku jako škrob, škrobový hydrolysát nebo glukosu a zdroj dusíku jako protein, hydrolysát proteinu nebo výluh z obilí. Kapaliny nad živnou půdou byly na tvorbu Ia testovány pomocí mikrobioassaye se Spodoptera exigua, jak je shora popsáno. Bylo zjištěno, že Bacillus thuringiensis subsp. aizawai druh EMCC0087 (uložený v NRRL jako NRRL B-21148) a Bacillus thuringiensis subsp. galleriae (uložený v NRRL), produkují Ia přibližně ve stejné koncentraci jako Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki.
Ia produkuje také B. subtilis, B. cereus, B. thuringiensis subsp. alesti, B. t. subsp. canadiensis, B. t. subsp. darmstadiensis, B. t. subsp. dendrolimus, B. t. subsp. entomocidus, B. t. subsp. finitimus, B. t. subsp. israelensis, B. t. subsp. kenyae, B. t. subsp. morrisoni, B. t. subsp. subtoxicus, B. t. subsp. tenebrionis, B. t. subsp. thuringiensis, B t. subsp. toumanoffi, B. cereus, B. subtilis a B. thuringiensis subsp. kurstaki cry- spo- mutant jak bylo stanoveno kapilární elektroforesou.
Pro kvantifikaci hodnot Ia byl použit Beckman P/ACE systém kapilární elektroforesy, opatřený neplněnou kapilárou 50 pm x 57 cm, 0,2 M fosfátový pufr o pH 6,8, při napětí 15 kV a detekci při 200 nm. Objemy vzorků jsou 20 nl a doba stanovení 25 minut.
Standardní křivka byla vytvořena za použití čištěného Ia jako standardu při hodnotách 1,25 mg/ml, 0,625 mg/ml, 0,3125 mg/ml, 0,156 mg/ml a 0,078 mg/ml. Vznikla lineární kalibrační křivka. Výsledkem rovnice y = mx + b se určovala koncentrace Ia v každém vzorku.
Před každým stanovením se kapilára po dobu 3 minut proplachovala proudem pufru (0,2 M fosfát, pH 6,8). Po každém 25 minutovém stanovení se kapilára proplachovala 1 minutu 1 N NaOH, 1 minutu filtrovanou vodou pro HPLC, 3 minuty 0,5 M kyselinou fosforečnou a 1 minutu filtrovanou vodou pro HLPC. Integrací plochy pod každým peakem byla určena její velikost akonečná koncentrace byla vypočtena na základě standardní křivky.
5. Hodnocení komerčních produktů B. thuringiensis
Množství Ia přítomného v různých komerčně dostupných produktech B. thuringiensis se určovalo kapilární elektroforesou, která je popsána svrchu v odstavci 4. BACTOSPEINE™, JAVELIN™, NOVODOR™, SPHERIMOS™, BACTIMOS™, FORAY™, FLORBAC™ a BIOBIT™ byly získány od Novo Nordisk A/S. XENTARI™ a DIPEL™ byly získány od Abbott Laboratories. AGREE™ pocházel od Ciba-Geigy, MVP™ dodával Mycogen a CUTLASS™ byl získán od firmy Ecogen.
Výsledky jsou uvedeny níže v Tabulce III a ukazují, že Ia je přítomen v různém množství v rozmezí od méně než 0,001 g Ia/BIU až do 0,071 g Ia/BIU.
Tabulka III Ia V KOMERČNÍCH PRODUKTECH BACILLUS THURINGIENSIS
Produkt Typ Šarže č. Potence Ia g/BIU
JAVELIN™ VG Btk 99942281 32000 IU/mg 0,071
XENTARI™ Bta 58715PG 15000 IU/mg 0,06
AGREE™ Bta/Btk RA208004 25000 IU/mg 0,033
BIOBIT™ HPVP Btk 5012 48950 U/mgPIA 0,018
BIOBIT™ FC Btk AG46669071 8 BIU/1 0,013
FORAY™ 48B Btk BBN7018 12,6 BIU/1 0,012
DIPEL™ Btk 58739PG 32 000 IU/mg 0,011
FORAY™ 76B Btk 20,0 BIU/1 0,007
BACTOSPEINE™ Btk B0B001 123653 IU/mg 0,003
BACTOSPEINE™ Btk KX02A 100 000 IU/mg 0,003
BACTOSPEINE™ Btk VP 16 000 IU/mg < 0,001
NOVODOR™ Btt 9024 16,3 milionů LTU/qt 9,5 x 10-9 g/LTU
FLORBAC™ Bta 082-31-1 30 000 U/mg E < 0,001
·· ····
SPHERIMOS™ B. sphr BSN006 žádný
MVP™ Btk 21193542 žádný
CUTLASS™ Btk/Btk žádný
BACTIMOS™ Bti BIB0024 11 700 IU/mg zadný
6. Bíoassaye s přidávanou výživou
Účinnost B. t. k. se stanovovala bioassayem s přidáváním umělé výživy pro larvy třetího stadia vývoje Spodoptera exigua, druhého stadia larev Helikoverpa zea, třetího stadia larev Spodoptera frugiperda, druhého stadia larev Heliothis virescens, třetího stadia larev Trichoplusia ni, třetího stadia larev Pseudoplusia includens, třetího stadia larev Plutella xylostella, třetího stadia larev Spodoptera littoralis a třetího stadia larev Mamestra brassicae.
Bíoassaye s přidávanou výživou se prováděly ke zjištění úrovně potenciace po přidáni Ia ke komerčním produktům B.
thuringiensis experimentech exigua (7,4 - a stanovení rozsahu působení na hmyz. V s vysokými koncentracemi Ia vůči Spodoptera 23,7 g Ia/BIU), byl k potenciaci BIOBITu™ FC
(FC znamená ztekutelný koncentrát) použit čištěný Ia (70 % aktivní složky, 30 % neutralisačního acetátového iontu). Získaná, v tabulce IV uvedená, data ukazují potenciaci BIOBITu™ HPVP (HPVP = smáčitelný prach s vysokou účinností) pomocí Ia (0,658 % aktivní složky). S. littoralis a M. brassicae byly testovány FLORBACem™ HPVP a Ia.
Byly navazovány různé komerční produkty B. thuringiensis a byl k nim přidán Ia, aby vzniklo 0,1 až 237 g Ia/BIU. Objem
TM byl adjustován s 0,1 % Tween . Vzorky byly na 1 minutu vystaveny ultrazvuku a pak zředěny na konečný obj em. Byly připraveny také čisté vzorky (bez Ia) a referenční látky. Referenční látky představují B. t. k. HD-1S-1980 (získaný od
NRRRL), u něhož se udává síla 16 000 mezinárodních jednotek «· ···· ’Τ'ΐνί (IU) na miligram a JAVELIN1 , jemuž se přisuzuje síla 53 000 Spodoptera jednotek/mg (SU).
Standardní umělá výživa složená z vody, agaru, cukru, kaseinu, pšeničných klíčků, methyl parabenu (= methyl
4-hydroxybenzoát), sorbové kyseliny, lněného oleje, celulosy, solí a vitaminů se připravovala ve 20 1, vyhřívaném kotli. To poskytlo dostatek výživy pro testování 10 až 12 vzorků se sedmi různými koncentracemi pro každou testovanou látku. Roztoky B.t. byly sériově zředěny na alikvotní podíly o 16 ml Každý alikvot byl přidán ke 184 g roztavené výživy. Následně se směs homogenisovala a nalila na plastikový tác obsahující 40 jednotlivých buněk. Pro každou násadu výživy byly připraveny tři kontrolní tácy. Na to byla potrava ochlazena a ztužena, do každé buňky byl přidán hmyz určitého stáří (druhé až třetí vývojové stadium) a tácy byly pokryty perforovanou folií průhledného plastu. Tácy byly umístěny do polic a čtyři dny podrobeny inkubaci při 28 C a 65 %-ní relativní vlhkosti.
Po čtyřech dnech byla spočítána mortalita hmyzu. Na vrch každého tácu bylo zamířeno prudké fouknutí a larvy, které se nehýbaly, byly počítány jako mrtvé. Byla vypočtena procenta mortality a data byla analyzována pomocí paralelních kontrolních analýz. Byly stanoveny LC^q, LCgg, směrnice regresních přímek, koeficient odchylek a potence. Stanovení vzorků se provádělo nejméně třikrát, nebo dokud tři potence nebyly mezi 20 % kolem vypočteného průměru pro každý vzorek. Pro výpočet vzrůstu aktivity spojené s každou koncentrací Ia, byla provedena korekce LC^g poměru R.t./Ia ve vzorku tak, aby odpovídal množství B.t. ve vzorku. LCgg párových čistých vzorků se vydělily korigovanými LC^g hodnotami a tak se získal násobek snížení LC^g spojený s Ia.
Pro essay na Lobesia bothrana byl použit následující postup. Vinné hrozny napadené od Lobesia bothrana byly shromážděny na nepostříkaném poli a odstranily se larvy. Byla ·· ····
• · <·· · ·· ·· • • · • ♦ •
• · · • ··· •
• ···· Φ • • •
• · ··· · • ··· ··· ·· •
připravena serie ředění Ia ve vodě (250 gg/ml, 500 gg/ml a 1000 μg/ml). Doprostřed petri misky se umístila jedna larva. Jakmile se zpozorovalo, že larva pije, byla přemístěna do petri misky s čersvě utrženými bobulemi hroznů. Larvy byly uchovávány při 22C, 3 - 4 dny.
Jak ukazuje tabulka IV u všech případů bylo zaznamenáno signifikantní snížení LC^q
Tabulka IV BIOASSAYE S PŘIDÁVANOU VÝŽIVOU
Hmyz g Ia na BIU Vzrůst účinnosti, násobek snížení LC^q
Spodoptera exigua (BIOBIT™ HPVP) 0,1 0,2 2,0 4,0 1.5 1,7 4,3 7.5
Spodoptera exigua 7,4 13
(BIOBIT™ FC) 15 26
30 34
118 59
237 79
Spodoptera frugiperda 0,2 2,2
(BIOBIT™ HPVP) 0,8 3,9
2,0 7,2
4,0 11,6
Trichoplusia ni (BIOBIT™ HPVP) 0,1 0,2 1,1 1,2
2,0 2,0
4,0 3,1
Pseudoplusia includens (BIOBIT™ HPVP) 0,1 0,2 0 1,2
0,8 2,1
2,0 2,4
4,0 3,4
Plutellaxylostella (BIOBIT™ HPVP) 0,2 0,8 2,0 1,6 1.3 1.4
4,0 1,9
Helicoverpa zea (BIOBIT™ HPVP) 3,2 12,6
Heliothis virescens (BIOBIT™ HPVP) 3,2 4,2
Lobesia bothrana (BIOBIT™ HPVP) 2,0 3,0
Spodoptera littoralis (FLORBAC™ HPVP) 2,0 8,6
Mamestra brassicae (FLORBAC™ HPVP) 2,0 4,9
Potenciace různých komerčních produktů na Spodoptera exigua pomocí Ia byla určována, jak popsáno svrchu, bioassayem s přidávánou výživou. Množství přidaného Ia na BIU komerčního produktu j sou uvedena níže, v tabulce V. Směs Ia/vzorek produktu B.t. byl přidán do výživy obsahující kasein pšeničných klíčků na agaru. Hmyz byl k výživě umístěn na čtyři dny a udržován při 28 C. Mortalita byla zaznamenávána a analyzována průběžně. LC^q, LC^q a potence byly vypočítávány z paralelních vzorků, které Ia neobsahovaly. Výsledky, které jsou uvedeny v tabulce V, ukazují, že Ia potencuje rozdílné produkty B.t.k. a B.t.a. pocházející z různých zdrojů. Druhy B. thuringiensis obsažené v těchto vzorcích, jsou popsány svrchu v oddíle 5.2.
| Tabulka V | POTENCIACE PRODUKTŮ B. thuringiensis NA Spodoptera exigua
Produkt g Ia na BIU Vzrůst účinnosti, násobek snížení LC^q
BACTOSPEINE™ VP 0,4 1,04
1,7 2,3
CONDOR™ 0,4 1,7 2,4 5,1
AGREE™ 0,4 1,1
1,7 1,6
CUTLASS™ 0,4 1,1
1,7 2,5
MVP™ 0,4 6,0
1,7 7,7
2,0 12,1
FLORBAC™ HPVP 0,2 1,1
0,8 2,0
DIPEL™ 2X 0,2 1,2
0,8 2,3
2,0 3,9
JAVELIN™ VG 0,2 0
0,8 1,08
2,0 2,9
XENTARI™ 0,2 1,2
0,8 1,6
2,0 2,4
7. Bioassaye na list
Bioassaye na list se prováděly s larvami Spodoptera
TM exigua ve druhém stadiu na brokolicích a použit byl BIOBIT FC a Ia. Poměr Ia k BIOBITu™ FC byl 2 g Ia/BIU BIOBIT™ FC. Brokolice byly ošetřeny pomocí pojízdného ostřikovače a objem s nosičem byl 225 1/ha (20 gal/akr). Když postřik na listech uschl, byly listy z rostlin otrhány a zamořeny larvami Spodoptera exigua druhého stadia. Níže, v tabulce VI, jsou uvedeny výsledky. 100 %ní mortalita byla zaznamenána při dávce BIOBITu™ FC + Ia 8,7 BlU/ha, zatímco samotný BIOBIT™ FC usmrtil 92 % larev při 58,8 BlU/ha a 8 % při 17,6 BlU/ha. Ošetřené rostliny byly také na osm hodin vystaveny přímému slunečnímu záření a pak byly listy otrhány a zamořeny. Po osmi hodinách na slunečním světle vykázal samotný BIOLIT FC • · · při 58,8 BIU/ha mortalitu 27 %, zatímco BIOBIT™ FC + Ia vykázal 100 % mortality při 8,7 BIU/ha.
Při pokusech na list prováděných s larvami časného čtvrtého stadia vykázal samotný BIOBIT™ FC 75 % mortality při 52 BIU/ha a BIOBIT™ FC (FC znamená ztekutelný koncentrát) spolu s Ia vykázal 100 % mortality při 13 BIU/ha.
Tabulka VI BIOASSAYE NA LIST
Ošetření BIU/ha mortalita % larvární stadium
BIOBIT™ FC 58,8 92 2
BIOBIT™ FC 17,6 8 2
BIOBIT™ FC + Ia 8,7 100 2
BIOBIT™ FC + sluneční
záření 8 hodin 58,8 27 2
BIOBIT™ FC + Ia +
sluneční záření 8 hodin 8,7 100 2
BIOBIT™ FC 52 75 4
BIOBIT™ FC + Ia 13 100 4
8. Polní pokusy
Polní pokusy na cizrně (Spodoptera exigua) ukázaly, že výsledek u samotného BIOBITu™ FC při 70 BIU/ha byl 51 %, zatímco 2 g Ia/BIU BIOBIT™ FC při 40 BIU/ha vykázaly 89 % (vztaženo na neošetřený případ). JAVELIN™ VG při 45 BIU/ha vykázal 51 %.
Polní pokusy na kukuřici cukrové (Spodoptera frugiperda) ukázaly, že s 2 g Ia/BIU BIOBIT™ FC při 39,5 BIU/ha je výsledek 84 %.
9. Stupně resistence
Bioassaye byly uskutečněny s koloniemi citlivé a resistentní Plutella xylostella. Resistentní můry byly z pole sesbírané vzorky z Floridy, u nichž se vyvinula resistence vůči B. t. po intensivní exposici na JAVELIN VG. Analýzy byly prováděny s BIOBITem™ HPVP a Ia při bioassay s namáčením listu. Resistence vůči JAVELIN™ a XENTARI™ byly zjišťovány bez Ia. Disk ze zelného listu o průměru šesti cm byl na 10 sekund ponořen do jedné z osmi různých koncentrací vzorků B. t. nebo formulací B. t./Ia. Rozsah koncentrací byl od 1 ppm do 1000 ppm. Disky listů byly dvě hodiny sušeny na vzduchu a umístěny do plastikových petri misek s larvami (0,2 až 0,4 mg) druhého stadia. Dávka dvacetipěti kusů hmyzu/den byla opakována dvakrát, aby bylo dosaženo dávky 50 kusů. Mortalita se zaznamenávala po 72 hodinách při 27 C. Regrese mortality u dávky se analyzovala průběžně. Stupně resistence byly vypočítány dělením hodnot LC^q a LC^q citlivých můr. Výsledky jsou v tabulce VII a ukazují, že BIOBIT™ HPVP potencuje při 2 g Ia/BIU a 4 g Ia/BIU. Konkrétně při 4 g Ia/BIU je dvojnásobné snížení stupně resistence LC^q a desetinásobné snížení stupně resistence lc90.
Tabulka VII STUPNĚ RESISTENCE Plutella xylostella (B.t.k. resistentní)
Testovaný vzorek lc50 rr LC90 RR
JAVELIN™ VG 302,6 3829,7
BIOBIT™ HPVP 20,5 98,5
2 g Ia/BIU BIOBIT™ HPVP 23,2 88,0
4 g Ia/BIU BIOBIT™ HPVP 10,4 11,5
XENTARI™ 9,7 8,2
10. Mutanty
10.1. Kmen
Byl použit kmen Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki EMCC0086 (NRRL B-21147), Septoria nodorum (A04119) a Alternaria alternata (druh 6, IM-SMP).
10.2. Assay inhibice fungálního růstu
Mutanty druhu Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, které produkují faktor, byly identifikovány za použití plísňových agarových ploten se Septoria nodorum a Alternaria alternata. Faktor inhibuje růst obou plísní.
Tyto dvě plísně rostly na PDA (agar bramborové dextrosy) plotnách při 26 C 10 - 14 dní dokud nebylo získáno dostatečné množství spor. Inkubace Alternaria alternata se prováděla při alternujícím UV zářením a tmou (každé 12 hodin). Spory byly z ploten odstraněny Septoria nodorum
Koncentrace spor přibližně 2 x 10^ byla adjustována a suspendovány ve sterilní vodě. Spory byly filtrovány sterilním G1 filtrem.
Alternaria alternata byla adjustována na v ml a koncentrace spor Septoria nodorum přibližně na 2 x 10^ v ml pomocí
Burkeřová-Turkova nebo Fuchsova-Rosenthalova počítadla.
Vzorky 1,5 ml suspense spor byly pak smíseny s 1,5 ml sterilního 40 % glycerolu ve vodě, zmrazený 1 den na -20 C a potom, až do použití, uchovávány při -80 C.
Plotny pro testování faktoru se připravovaly smísením
1,5 ml vzorku spor (jak je nahoře popsáno) při 46 C se 115 ml antibiotického agarového media č.2 (25,5 g na litr), obsahujícího streptomycin v konečné koncentraci 100 gg na ml a přenesením směsi na sterilní plastikové desky (Nunc č. 101875). Když agar ztuhl, byly do něj udělány mm vpichy (120 děr na desku).
Vzorky kultury byly sériově zředěny 100 gg streptomycinu ····» · · ♦ ··· ♦ • · · · · • ······ · · · na ml sterilní vody a 10 μΐ zředěných vzorků bylo rozděleno na plotny připravené, jak je shora popsáno. Plotny byly při 26 C inkubovány 2 dny. Jako positivní kontrola se provádělo také ředění faktoru.
Citlivost assaye inhibice fungálního růstu leží v rozmezí 0,05 g faktoru na litr (stěží viditelné) a 0,1 g faktoru na litr (čistá zóna) pro obě plísně.
10.3. Stanovení faktoru kapilární zonovou elektroforesou
Před analýzou byly ze vzorku živné směsi celé kultury odstraněny centrifugováním, a/nebo filtrací nylonovým membránovým filtrem 0,2 μπι, buňky a jiné nerozpustné částice. Množství faktoru se stanovovalo pomocí Beckman P/AC systému kapilární elektroforesy, opatřeného nepotahovanou kapilárou 50 μπι x 47 cm, s použitím pufru sestávajícího z 0,1 M fosfátu o pH 6,6, napětí bylo 15 kV a detekce při 200 nm. Před každým stanovením byla kapilára promyta 2 minuty proudem pufru. Objem násady vzorku byl 20 nl.
Časový průběh analýzy byl 12 minut a eluace faktoru trvala přibližně 8,5 minuty. Koncentrace faktoru byla určena relativně vůči standardní křivce čisté sloučeniny.
Mezi každým 12 minutovým cyklem byla kapilára postupně propláchnuta 0,5 minuty 1 N hydroxidem sodným, 0,5 minuty 0,1 N hydroxidem sodným, 0,5 minuty vodou pro HPLC a 0,5 minuty 1,5 M kyselinou fosforečnou.
10.4. Mutagenese kmene B. thuringiensis subsp. kurstaki
Spory Bacillu thuringiensis subsp. kurstaki byly nejdříve ozářeny gamma-paprsky dávkou 700 krad. Ozářené spory byly sériově naředěny, rozprostřeny na TY agarové plotny a podrobeny 2 dny inkubaci při 30 C. Osmdesát z takto ošetřených mutantů bylo čištěno naproužkováním jednotlivých kolonií na TY agarové plotny a potom přeneseno do 500 ml
• · · třepacích nádobek obsahujících 100 ml media o následujícím složení:
obilní výluh maltodextrin protein z brambor kh2po4 k2hpo4 g/1 g/1 g/1
1,77 g/1
4,53 g/1
Třepací nádobky se inkubovaly při 30 C, 250 ot./min 3 dny.
Z každé kultury v třepací nádobce byly denně odebírány 5 ml vzorky a buňky byly peletlsovány centrifugováním. Kapaliny nad kulturami byly 2-10 krát zředěny deionisovanou vodou se streptomycinem o koncentraci 0,1 mg na ml a potom testovány na antifungální účinnost jak se popisuje v odstavci 8.2. Vzorky kultur těch mutantů, které vykázaly největší inhibici fungálního růstu, byly pak kapilární zonovou elektroforesou, jak popsáno v odstavci 8.3., analyzovány na množství faktoru. Nejproduktivnější mutant z první mutace je NBB-76.
NBB-76, mutant první generace, byl potom podroben druhé mutaci za použití N,N -dinitro-N -nitrosoguanidinu (NTG). V daném případě byl druh mutantu kultivován přes noc při 30 C, 240 ot./min, v 500 ml třepací nádobce obsahující 100 ml TY živné půdy o následujícím složení a adjustované před autoklávováním na pH 7,3:
trypton 20 g/1
extrakt z droždí 5 g/1
FeCl2.4 H20 6 mg/l
MnCl2.4 H20 1 mg/l
MgSO4.7 H20 15 mg/l
• · · • « ·· «· ···
Po noční kultivaci byla kultura 100 krát zředěna do nové třepací nádoby s TY živnou půdou a kultivována při 30 C, 240 ot./min, dokud kultura nedosáhla logaritmický růst (přibližně 4 hodiny). Z třepací nádobky byl odebrán 10 ml vzorek kultury a filtrován pomocí filtrační jednotky Nalgene 0,45 μιη. Buňky z filtru byly znovu suspendovány v 10 ml TM pufru obsahujícího 100 pg NTG na ml. TM pufr se skládá z 6,05 g Tris a 5,08 g maleinové kyseliny na litr deionisované vody a je hydroxidem sodným adjustován na pH 6. Suspense buněk byla podrobena 30 minut inkubaci při 37 C a potom připojena na zdroj vakua, aby se z buněk odstranil NTG. Dříve než byly buňky znovu suspendovány v 10 ml M9 pufru, byly dvakrát promyty 20 ml M9 pufru, potom byly sériově zředěny, rozprostřeny na TY agarové plotny a 2 dny při 30 C byly inkubovány. Pufr M9 se skládá z 8,78 g Na2HPO4.2 H20, 3 g KH2PO4, 4 g NaCl a 0,2 g MgSO4.7 H20 na litr deionisované vody. Mutanty byly isolovány a testovány jak popsaáno svrchu. Nejproduktivnějši mutant získaný z druhého kola mutace je EMCC0130.
EMCC0130, mutant druhé generace, byl potom podroben třetí mutaci za použití NTG, jak je nahoře popsáno. Nejproduktivnější mutant získaný z třetího kola mutace je NBC-217.
Jak popsáno nahoře, byl i mutant třetí generace, NBC-217 za použití NTG podroben čtvrté mutaci. Nejproduktivnější mutant ze čtvrtého kola mutace je EMCC0129.
10.5. Produkce faktoru mutanty a mateřskými kmeny
Mutanty EMCC0130, NBC-217 a EMCC0129 a mateřské kmeny Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki EMCC0086 byly pěstovány ve 250 ml třepacích nádobkách, které obsahovaly 50 ml media složeného z následujících komponent, doplněných stopovými kovy o 0,2 ml na litr a potom, před sterilizaci,
adjustovaného H3PO4 nt ipH 7:
hydrolyzovaný rostlinný protein 30 g/1
hydrolyzovaný škrob 40 g/1
k2hpo4 5 g/1
MgSO4 0,3 g/1
Kultury v třepacích nádobkách byly inkubovány při 30 C a 250 ot./min, po 3 dny.
Kvantitativní analýza faktoru produkovaného mutanty a mateřskými druhy byla provedena kapilární zonovou analýzou, jak je popsáno v odstavci 8.3. Kvantitativní analýza ukazuje, že mutant EMCC0129 produkuje přibližně 0,9 g faktoru na litr živné kultury po třech dnech v třepacích nádobkách, zatímco mateřský druh produkuje přibližně 0,15 g na litr. Mutant EMCC0129 dává zhruba šestkrát více faktoru než mateřský kmen.
Tabulka VIII PRODUKCE FAKTORU MUTANTY Bacillu thuringiensis subsp. kurstaki
Mutant Faktor (g/1)
Mateřský kmen 0,15
EMCC0130 0,65
NBC-217 0,65
EMCC0129 0,75
Vynález zde popsaný a nárokovaný není ve svém rozsahu omezen na provedení zde uváděná, protože tato provedení jsou zamýšlena jako ilustrace některých aspektů vynálezu. Jakákoliv ekvivalentní provedení je třeba považovat za jsoucí v rozsahu tohoto vynálezu. Ve skutečnosti různé modifikace vynálezu, spolu se zde ukázanými a popsanými, se stanou z předcházejícího popisu zřejmými pro ty, kteří mají zkušenosti ·· ···· v oboru. Takové modifikace jsou také považovány za spadající do rozsahu připojených nároků.
Jsou zde citovány různé reference, jejichž obsahy jsou vtěleny odkazem v jejich celistvostech.
Uložení mikroorganismů
Následující kmeny Bacillu thuringiensis byly podle Budapešťské dohody uloženy v Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Nothern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604, USA.
Druh Přírůstkové číslo Datum uložení
EMCC0086 NRRL B-21147 6 . října 1993
EMCC0129 NRRL B-21445 23. května 1995
EMCC0130 NRRL B-21444 23. května 1995
Kmeny byly deponovány za podmínek, které zaručuj i, že
přístup ke kultuře bude dosažitelný během řízení o této patentové přihlášce tomu, koho určí Commissioner of Patents and Trademarks (předseda úřadu pro patenty a ochranné známky), který je pro to zmocněn pod 37 C.F.R. 1.14 a U.S.C. 122. Uložený vzorek představuje podstatně čistou kulturu každého deponovaného druhu. Uložený vzorek je dostupný, jak vyžadují cizí patentová práva v zemích, v nichž jsou zaregistrovány protějšky nebo příbuzné přihlášky subjektu. Avšak je třeba rozumět, že dostupnost uloženého vzorku nezakládá volnost provozovat předložený vynález za narušení patentových práv udělovaných státním aktem.

Claims (17)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Mutant kmene Baciílus produkující faktor, který zesiluje pesticidní účinnost pesticidu souvisejícího s druhem Baciílus, kde množství faktoru produkovaného mutantem je větší, než množství faktoru produkované odpovídajícím mateřským kmenem, přičemž řečený druh Baciílus je volen ze skupiny sestávající z Baciílus licheniformis, Baciílus subtilus a Baciílus thuringiensis.
  2. 2. Mutant podle nároku 1, kde mutant produkuje nejméně kolem dvojnásobného množství faktoru než odpovídající mateřský kmen.
  3. 3. Mutant podle nároku 1, kde faktor má v ^H NMR spektru chemické posuny kolem δ 1,5; 3,22; 3,29; 3,35; 3,43; 3,58; 3,73; 3,98; 4,07; 4,15; 4,25; 4,35 a chemické posuny 13C
    64,1;
    kolem
    65,6;
    31,6;
    158,3;
    37,2; 51,1; 53,3;
    170,7 a 171,3.
    54,0; 54,4; 61,5;
    61,6;
  4. 4. Mutant podle nároku 1, kde faktor má stukturu I
    OH NH9 NH9
    I I I
    HoNC0-NH-CHo-CH-NHC0-CH-CH-CH-CH-CH9-CH-CH-CH9-0H
    I 2 I
    OH OH o — —
    I conh2 nebo je její solí.
  5. 5.
    Mutant podle nároku
    1, kde kmen Baciílus je (I) kmen
    Baciílus thuringiensis.
  6. 6. Mutant podle nároku 5, kde kmen Baciílus thuringiensis je volen ze skupiny tvořené kmeny Baciílus ·· ···· thuringiensis subsp. aizawai, Bacillus thuringiensis subsp. alesti, Bacillus thuringiensis subsp. canadiensis, Bacillus thuringiensis subsp. colmeri, Bacillus thuringiensis subsp. coreanensis, Bacillus thuringiensis susp. dakota, Bacillus thuringiensis subsp. darmstadiensis, Bacillus thuringiensis subsp. dendrolimus, Bacillus thuringiensis subsp. entomocidus, Bacillus thuringiensis subsp. finitimus, Bacillus thuringiensis subsp. galleriae, Bacillus thuringiensis subsp. indiana, Bacillus thuringiensis subsp. israelensis, Bacillus thuringiensis subsp. kenyae, Bacillus thuringiensis subsp. kumamotoensis, Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, Bacillus thuringiensis subsp. kyushuensis, Bacillus thuringiensis subsp. japonensis, Bacillus thuringiensis subsp. mexicanensis, Bacillus thuringiensis subsp. morrisoni, Bacillus thuringiensis subsp. neoleonensis, Bacillus thuringiensis subsp. nigeriae, Bacillus thuringiensis subsp. ostriniae, Bacillus thuringiensis subsp. pakistani, Bacillus thuringiensis subsp. pondicheriensis, Bacillus thuringiensis subsp. shandongiensis, Bacillus thuringiensis subsp. silo, Bacillus thuringiensis subsp. sotto, Bacillus thuringiensis subsp. subtoxicus, Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, Bacillus thuringiensis subsp. thompsoni, Bacillus thuringiensis subsp. tochigiensis, Bacillus thuringiensis subsp. tohokuensis, Bacillus thuringiensis subsp. tolworthi, Bacillus thuringiensis subsp. toumanoffi, Bacillus thuringiensis subsp. wuhanensis and Bačillus thuringiensis subsp. yunnanensis.
  7. 7. Mutant podle nároku 5, kde kmen Bacillus thuringiensis je kmen Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki.
  8. 8. Mutant podle nároku 1, kde mutant má identifikační charakteristiku EMCC0129, je uložen v NRRL a má přírůstkové ·♦ ♦··· identifikační charakteristiku a má přírůstkové číslo NRRL číslo NRRL B-wwww anebo má EMCC0130, je uložen v NRRL B-xxxx.
  9. 9. Mutant podle související pesticid nároku 1, kde s druhem Bacillus zahrnuje delta-endotoxin Bacillus thuringiensis nebo jeho pesticidně účinný fragment.
  10. 10. Mutant podle nároku 9, kde delta-endotoxin Bacillus thuringiensis nebo jeho pesticidně účinný fragment se volí ze skupiny tvořené Cryl, CrylI, CrylII, CrylV, CryV a CryVI.
  11. 11. Mutant podle nároku 10, kde delta-endotoxin Bacillus thuringiensis nebo jeho pesticidně účinný fragment je CrylA delta-endotoxin nebo jeho pesticidně účinný fragment.
  12. 12. Mutant podle nároku 10, kde delta-endotoxin Bacillus thuringiensis nebo jeho pesticidně účinný fragment je CrylC delta-endotoxin nebo jeho pesticidně účinný fragment.
  13. 13. Mutant podle nároku 1, kde s druhem Bacillus související pesticid zahrnuje sporu druhu Bacillus thuringiensis.
  14. 14. Mutant podle nároku 1, kde se faktor získává (a) pěstováním mutantu kmene Bacillus za vhodných podmínek;
    (b) odebráním supernatantu kultury mutantu ze stupně (a) a (c) isolací faktoru ze supernatantu ze stupně (b).
  15. 15. Mutant podle nároku 14, kde se faktor získává ze supernatantu kultury kmene Bačillus thuringiensis.
    ♦ ···
    99 · ·· ♦ · • 9 • • · · • • 9 9 • • ···· · • • • 99 9 • • · • • 9 • ·♦· · ··· ··· 99 •
  16. 16. Způsob získání mutantu podle nároku 1, vyznačující se tím, že zahrnuje (a) ošetření kmene Bacillus mutagenem;
    (b) pěstování mutovaného kmene Bacillus ze stupně (a) za podmínek vhodných pro selekci mutantu a (c) selekci mutantu ze stupně (b).
  17. 17. Mutant kmene Bacillus, získaný způsobem podle nároku
    16.
    $ 2 • · ·· ··♦· ·· ·« · · · • · · · · • « · · · · ·
    Supernatant z fermentace B.t.k.(10 x NB75) centrifugování filtrace 0,2 μπι membránou
    V
    Surový supernatant 0.2 um ultrafiltrace na 5 kDa y
    Filtrát 5 kDa
    SP kationtoměnič v
    SP podíl zahuštění lyofilisací
    V
    P2 podíl gelová filtrace P2
    SP HPLC kolona v
    Podíl z SP HPLC opakovaná lyofilisace
CZ973625A 1995-05-30 1996-05-17 Mutanty, které produkují potenciátor pesticidní účinnosti kmene Bacillus CZ362597A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US45496795A 1995-05-30 1995-05-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ362597A3 true CZ362597A3 (cs) 1998-02-18

Family

ID=23806816

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ973625A CZ362597A3 (cs) 1995-05-30 1996-05-17 Mutanty, které produkují potenciátor pesticidní účinnosti kmene Bacillus

Country Status (14)

Country Link
EP (1) EP0828819B1 (cs)
JP (1) JP3794705B2 (cs)
AT (1) ATE221912T1 (cs)
AU (1) AU717681B2 (cs)
CA (1) CA2222801A1 (cs)
CZ (1) CZ362597A3 (cs)
DE (1) DE69622859T2 (cs)
DK (1) DK0828819T3 (cs)
ES (1) ES2183947T3 (cs)
HU (1) HUP9802569A3 (cs)
PL (1) PL183156B1 (cs)
PT (1) PT828819E (cs)
WO (1) WO1996038539A1 (cs)
ZA (1) ZA963315B (cs)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2866202B1 (fr) * 2004-02-12 2006-08-18 Getade Agri Concept Procede de traitement phytosanitaire biologique des vegetaux, notamment de la vigne et compositions adaptees
WO2021231757A1 (en) * 2020-05-13 2021-11-18 Bayer Cropscience Lp Bacillus thuringiensis strains and methods for controlling pests

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ZA938163B (en) * 1992-11-05 1994-06-06 Novo Nordisk Entotech Inc Potentiator of bacillus pesticidal activity

Also Published As

Publication number Publication date
ES2183947T3 (es) 2003-04-01
CA2222801A1 (en) 1996-12-05
ZA963315B (en) 1997-10-27
JP3794705B2 (ja) 2006-07-12
AU717681B2 (en) 2000-03-30
HUP9802569A2 (hu) 1999-02-01
WO1996038539A1 (en) 1996-12-05
HUP9802569A3 (en) 2002-07-29
JPH11506004A (ja) 1999-06-02
PL323472A1 (en) 1998-03-30
PT828819E (pt) 2002-12-31
DE69622859D1 (de) 2002-09-12
DE69622859T2 (de) 2003-04-30
AU5797096A (en) 1996-12-18
ATE221912T1 (de) 2002-08-15
EP0828819B1 (en) 2002-08-07
PL183156B1 (pl) 2002-05-31
EP0828819A1 (en) 1998-03-18
DK0828819T3 (da) 2002-12-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0670677B1 (en) Potentiator of Bacillus pesticidal activity
US5859235A (en) Dipteran-active uracil derivative
US6268181B1 (en) Methods for producing a potentiator of Bacillus pesticidal activity
CA2223034C (en) Methods for producing a potentiator of bacillus pesticidal activity
CA2225565C (en) Novel bacillus thuringiensis pesticidal substance
US5976563A (en) Pesticidal composition and Bacillus thuringiensis strain
US5976564A (en) Pesticidal composition and bacillus thurigiensis strain
EP0814663B1 (en) NOVEL PESTICIDAL COMPOSITION AND method
EP0828819B1 (en) Mutants which produce a potentiator of bacillus pesticidal activity
US6277624B1 (en) Mutants which produce a potentiator of Bacillus pesticidal activity
US6406691B1 (en) Potentiator of Bacillus pesticidal activity
MXPA97000326A (en) Novedous active compound and dipters and cepa debacillus thuringien

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic