PL183156B1 - Mutanty wytwarzające czynnik wzmacniający aktywności pestycydowe Bacillus - Google Patents

Mutanty wytwarzające czynnik wzmacniający aktywności pestycydowe Bacillus

Info

Publication number
PL183156B1
PL183156B1 PL96323472A PL32347296A PL183156B1 PL 183156 B1 PL183156 B1 PL 183156B1 PL 96323472 A PL96323472 A PL 96323472A PL 32347296 A PL32347296 A PL 32347296A PL 183156 B1 PL183156 B1 PL 183156B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
bacillus thuringiensis
bacillus
thuringiensis subsp
mutant
subsp
Prior art date
Application number
PL96323472A
Other languages
English (en)
Other versions
PL323472A1 (en
Inventor
Helle Outtrup
Robert L. Starnes
William D. Lidster
Denise C. Manker
Susan C. Macintosh
Original Assignee
Abbott Lab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Abbott Lab filed Critical Abbott Lab
Publication of PL323472A1 publication Critical patent/PL323472A1/xx
Publication of PL183156B1 publication Critical patent/PL183156B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N47/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid
    • A01N47/08—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid the carbon atom having one or more single bonds to nitrogen atoms
    • A01N47/28—Ureas or thioureas containing the groups >N—CO—N< or >N—CS—N<
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/22—Bacillus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/22—Bacillus
    • A01N63/23—B. thuringiensis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Fertilizers (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

1. Mutant szczepu Bacillus, znamienny tym, ze wytwarza sie czynnik wzmacniajacy aktywnosc pestycydowapestycydu zwiazanego z Bacillus, przy czym ilosc czynnika wytwa- rzanego przez mutanta jest co najmniej 2 razy wieksza niz ilosc czynnika wytwarzanego przez odpowiadajacy szczep rodzicielski, zas szczep Bacillus wybrany jest z grupy skladajacej sie z Bacillus licheniformis, Bacillus subtilus i Bacillus thuringiensis. 12. Mutant wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze pestycyd zwiazany z Bacillus obejmu- je przetrwalniki Bacillus thuringiensis. PL PL PL PL PL

Description

1. ZAKRES WYNALAZKU
Wynalazek dotyczy zmutowanego szczepu Bacillus, który wytwarza czynnik wzmacniający aktywność pestycydową pestycydu związanego z Bacillus, pestycydu chemicznego i/lub wirusa o właściwościach pestycydowych, w którym czynnik taki otrzymuje się w większych ilościach lub posiada on wyższą aktywność wzmacniającą w porównaniu ze szczepem macierzystym oraz metod wytwarzania takich zmutowanych szczepów. Wynalazek dotyczy także metod otrzymywania czynnika.
2. PODSTAWA WYNALAZKU
Co roku szkodniki powodują straty milionów dolarów w rolnictwie, leśnictwie i w dziedzinie zdrowia publicznego. Do zwalczania takich szkodników stosowano różne strategie.
Jedną ze strategii jest stosowanie pestycydów chemicznych o szerokim zakresie lub spektrum aktywności. Jednakże, stosowanie pestycydów chemicznych ma różne wady. Szczególnie, z powodu ich szerokiego spektrum aktywności, pestycydy te mogą niszczyć organizmy, które nie są celem działania, takie jak owady pożyteczne i pasożyty destrukcyjnych szkodników. Ponadto, pestycydy chemiczne są często toksyczne dla zwierząt i ludzi. Co więcej, u będących celem szkodników często rozwija się oporność, jeśli powtarzalnie wystawia się je na działanie takich substancji.
Inna strategia obejmuje stosowanie biopestycydów do zwalczania plag owadów, grzybów i chwastów. Biopestycydy są naturalnie występującymi patogenami i/lub substancjami wytwarzanymi przez te patogeny. Zaletą stosowania biopestycydów jest to, że w porównaniu z pestycy4
183 156 darni chemicznymi, są one generalnie mniej szkodliwe dla organizmów, które nie są celem działania i środowiska jako całości.
2.1. Bacillus thuringiensis
Najpowszechniej stosowanym biopestycydem jest BaczY/us thuringiensis. Bacillus thuringiensis jest ruchliwą, Gram-dodatnią bakterią o kształcie pałeczki, która jest szeroko rozpowszechniona w przyrodzie, zwłaszcza w glebie i środowiskach bogatych w owady. Podczas wytwarzania przetrwalników Bacillus thuringiensis wytwarza paraprzetrwalnikowe krystaliczne inkluzje, które są owadobójcze po spożyciu przez podatne larwy owadów z rzędów motyli, muchówek i chrząszczy. Inkluzje mogą różnić się kształtem, liczbą i składem. Składają się one z jednego lub więcej białek związanych endotoksynami delta, których wielkość może pozostawać w zakresie 27-140 kDa. Owadobójcze endotoksyny delta sąna ogół przekształcane przez proteazy w jelicie larwy na mniejsze (skrócone) polipeptydy toksyczne, powodujące uszkodzenie jelita środkowego i, ostatecznie, śmierć owada (Hófte i Whiteley, 1989, Microbiological Reviews 53: 242:255).
Istnieje kilka szczepów Bacillus thuringiensis, które są powszechnie stosowane jako biopestycydy w leśnictwie, rolnictwie i w dziedzinie zdrowia publicznego. Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki i Bacillus thuringiensis subsp. aizawi wytwarzająendotoksyny delta specyficzne wobec motyli. Endotoksynę delta specyficzną wobec chrząszczy wytwarza Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis (Krieg i in., 1988, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 766 203). Ponadto, Bacillus thuringiensis subsp. israelenensis wytwarza endotoksyny delta specyficzne wobec muchówek (Goldberg, 1979, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 166 112).
Opisano również inne szczepy Bacillus thuringiensis specyficzne wobec szkodników należących do muchówek. Ujawniono izolat Bacillus thuringiensis, który jest toksyczny wobec muchówek i motyli (Hodgman i in., 1993,FEMSMicrobiologyLetters 114:17-22). Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym z SDS oczyszczonej krystalicznej endotoksyny delta z tego izolatu ujawniła trzy rodzaje białek, które odpowiadają toksynom CryIA(b), CrylB i CryllA. Ujawniono również izolat Bacillus thuringiensis, który wytwarza aktywny wobec muchówek kryształ złożony z białek o masach cząsteczkowych 140,122,76,72 i 38 kDa (Payne, 1994, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 275 815). Europejski opis patentowy nr 480 762 ujawnia pięć szczepów B.t.,z których każdy jest aktywny wobec szkodników należących do muchówek; każdy z nich posiada także unikalny wzór endotoksyn delta kryształów.
Opisano kilka szczepów Bacillus thuringiensis, które posiadają aktywność pestycydową wobec szkodników innych ni motyle, chrząszcze i muchówki. Ujawniono pięć szczepów Bacillus thuringiensis, które wytwarzają endotoksyny delta toksyczne dla nicieni (Edwards, Payne i Soares, 1988, europejskie zgłoszenie patentowe nr 0 303 426 BI). Ujawniono również szczep PS81F Bacillus thuringiensis, który można stosować do leczenia ludzi i zwierząt będących żywicielami pasożytniczych pierwotniaków (Thompson i Gaertner, 1991, europejskie zgłoszenie patentowe nr 0 461 799 A2). Ujawniono także kilka izolatów Bacillus thuringiensis o aktywności wobec szkodników zjadliwych. Izolaty te wytwarzają kryształy składające się z białek o masach cząsteczkowych w (szerokim) zakresie od 35 kDa do 155 kDa (Pyne, Cannon i Bagley, 1992, zgłoszenie PCT światowego opisu patentowego nr 92/19106. Ujawniono również szczepy Bacillus thuringiensis o aktywności wobec szkodników z rzędu błonkówek (Payne, Kennedy, Randall, Meier i Uick, 1992, europejskie zgłoszenie patentowe nr 0 516 306 A2); o aktywności wobec szkodników z rzędu pluskiwaków (Payne i Cannon, 1993, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 262 159); o aktywności wobec szkodników należących do przywr (Hickle, Sick, Schwab, Narva i Payne, 1993, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 262 399) oraz o aktywności wobec szkodników z rzędu wszy zwierzęcych (Payne i Hickle, 1993, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 273 746). Ponadto ujawniono, że inny szczep Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, WB3 S-16, wyizolowany z wełny po strzyży owiec australijskich, jest toksyczny dla wszy Damalinia ovis, szkodnika z rzędu wszy zwierzęcych (Drummond, Miller i Pinnock, 1992, J. Invert. Path. 60: 102-103).
183 156
Endotoksyny delta kodowane są przez geny ery (białek kryształów), które na ogół zlokalizowane sąw plazmidach. Geny ery podzielono w oparciu o względnąhomologię aminokwasową i specyficzność wobec szkodników na sześć klas i kilka podklas. Główne klasy są specyficzne wobec motyli (cryl); motyli i muchówek (cryll); chrząszczy (eryIII); muchówek (cryIV) (Hófte i Whiteley, 1989, Microbiological Reviews 53: 242-255); chrząszczy i motyli (określane jako geny cryV przez Taylora i in., 1992, Molecular Microbiology 6: 1211-1217) oraz nicieni (określane jako geny cryV i cryVI przez Feitelsona i in., 1992, Bio/Technology 10: 271-275).
Endotoksyny delta wytwarzano metodami rekombinacji DNA. Endotoksyny delta wytwarzane metodami rekombinacji DNA mogą mieć lub nie mieć postaci kryształów.
Wykazano, że niektóre szczepy Bacillus thuringiensis wytwarzają termostabilny pestycydowy analog nukleotydów adenylowych, znany jako egzotoksyna β typu I lub turyngiensyna, która sama ma właściwości pestycydowe (Sebesta i in., w: H.D. Burges (red.), Microbial Control of Pests and Plant Diseases, Academic Press, Nowy Jork, 1980, str. 249-281). Egzotoksynę β typu I stwierdzono w supematantach niektórych hodowli Bacillus thuringiensis. Posiada ona masę cząsteczkową 701 i składa się z adenozyny, glukozy i kwasu alarynowego (Farkas i in., 1977, Coli. Czechosslowak Chem. Comm. 42:909-929; Liithy i in., w: Kurstak (red.) Microbial and Viral Pesticides, Marcel Dekker, Nowy Jork, 1982, str. 35-72). Zakres podatnych gatunków obejmuje, ale nie ogranicza się do Musca domestica, Mamestra configurata Walker, Tetranychus urticae, Drosophila melanogaster i Tetranychus cinnabarinus. Uważa się, że toksyczność egzotoksyny β typu I powodowana jest hamowaniem zależnej od DNA polimerazy DNA poprzez współzawodnictwo z ATP. Wykazano, że egzotoksynę β typu I koduje plazmid ery w pięciu szczepach Bacillus thuringiensis i in., 1990, J. Bacteriol. 172:3172-3179). Stwierdzono, że egzotoksynę β typu I wytwarzają serotyp 1 Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis, serotyop 9 Bacillus thuringiensis subsp. tolworthi i serotyp 10 Bacillus thuringiensis subsp. darmstadiensis.
Opisano inną egzotoksynę β, sklasyfikowaną jako egzotoksynę β typu II (Levinson i in., 1990, J. Bacteriol. 172: 3172-3179). Stwierdzono, że egzotoksynę β typu II wytwarza serotyp 8 abBacillus thuringiensis subsp. morrisoni oraz, że jest ona aktywna wobec Leptinotarsa decemlineata. Struktura egzotoksyny β typu II nie jest w pełni znana, ale znacząco różni się ona od struktury egzotoksyny β typu I pod tym względem, że w miejscu adeniny znajduje się reszta pseudourydyny, w której przyłączenie do pierścienia rybozy znajduje się w pozycji, która w innym wypadku byłaby zajęta przez proton (Levinson w: Hinckle i Finch (red.), Analytical Chemistry of Bacillus thuringiensis, ACS Symposium Series, Waszyngton, D.C., 1990, str. 114-136). Ponadto, wprotonowym widmie NMR występuje tylko jeden sygnał odpowiadający zasadzie nukleozydu (przy 7,95 ppm) i brak jest sygnału anomerycznego protonu typu rybozy (5,78 ppm).
Inne rozpuszczalne w wodzie substancje, które wyizolowano zBacillus thuringiensis, obejmują egzotoksynę alfa, która jest toksyczna dla larw Musca domestica (Luthy, 1980, FEMS Microbiol. Lett. 8: 1-7), egzotoksyny gamma, które są różnymi enzymami, obejmującego lecytynazy, chitynazy i proteazy, których toksyczne wpływy przej awiaj ą się tylko łącznie z egzotoksynami beta i endotoksynami delta (Forsberg i in., 1976, Bacillus thuringiensis: Its effects on Environmental Quality, National Research Council of Canada, NRC Associate Committee on Scientific Criteria for Environmental Quality, Subcommittees on Pesticides and Related Compounds and Biological Phenomena); egzotoksynę sigma, która posiada strukturę podobną do egzotoksyny beta i która również jest aktywna wobec Leptinotarsa decemlineata (Argauer i in., 1991, J. Entomol. Sci. 26: 206-213: oraz anhydroturyngiensynę (Prystas i in., 1975, Coli. Czechosslowak Chem. Comm. 40: 1775).
2.2. ZWITTERMYCYNA
Z Bacillus cereus wyizolowano substancję, która hamuje wzrost patogenu roślinnego Phytophora medicaginis i zmniejsza infekcję lucerny (patrz na przykład opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach 4 877 738 i 4 878 936). Nie ujawniono żadnej innej aktywności. Dla zwittermycyny A ustalono następującą strukturę (He i in., Tet. Lett. 35:2499-2502):
183 156
3. PRZEDMIOT WYNALAZKU
W nauce dąży się do uzyskania wyższej śmiercionośności preparatów B. t. Wykorzystane sposoby obejmowały poszukiwania nowych szczepów o zwiększonej śmiercionośności, próby modyfikowania istniejących szczepów oraz próby zaprojektowania bardziej skutecznych preparatów przez łączenie przetrwalników i kryształów B. t. z nowymi nośnikami pestycydowymi, pestycydami chemicznymi lub czynnikami wzmacniającymi (patrz na przykład opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 250 515, inhibitor trypsyny). Dlatego też, przedmiotem niniejszego wynalazku jest wzmocnienie aktywności pestycydowej pestycydów. Przedmiotem wynalazku jest również wyizolowanie szczepów, które wytwarzająduże ilości czynnika wzmacniającego.
4. PODSUMOWANIE WYNALAZKU
Wynalazek dotyczy zmutowanego szczepu Bacillus, który wytwarza czynnik wzmacniający aktywność pestycydowąpestycydu związanego z Bacillus, przy czym ilość czynnika wytwarzanego przez mutanta jest wyższa niż ilość czynnika wytwarzanego przez odpowiedni szczep macierzysty. W specyficznym rozwiązaniu, szczep Bacillus wybiera się z grupy składającej się z Bacillus subtilus, Bacillus licheniformis i Bacillus thuringiensis.
Czynnik wytwarzany przez rzeczonego mutanta j est czynnikiem wzmacniaj ącym. Jak zdefiniowano w niniejszym opisie, „czynnik wzmacniający” jest substancją, która nie posiada znaczącej aktywności pestycydowej, np. jej LC50 wynosi (LC50 jest stężeniem substancji wymaganym do zabicia 50% szkodników) powyżej około 3000 gg/g, jak określono w oznaczeniu biologicznym (patrz część 6), ale działa zwiększając aktywność pestycydową pestycydu związanego z Bacillus o przynajmniej około 50% i nie powoduje zahamowania rozwoju larwalnego. Jak stwierdzono w części 2, inne znane w nauce substancje zdolne do wzmacniania aktywności pestycydowej, takie jak endotoksyny delta, inhibitory trypsyny i egzotoksyny, posiadają aktywność pestycydową.
W szczególnym rozwiązaniu, czynnik jest rozpuszczalny w wodzie. Jak zdefiniowano w niniejszym opisie, substancja lub związek jest „rozpuszczalny w wodzie”, jeśli przynajmniej około 1 mg substancji można rozpuścić w 1 ml wody. Czynnik może również wzmacniać aktywność pestycydowąpestycydu chemicznego i/lub wirusa o właściwościach pestycydowych.
Jak zdefiniowano w niniejszym opisie, „pestycydem związanym z Bacillus” jest szczep, przetrwalnik lub substancja Bacillus (np. Bacillus thuringiensis lub Bacillus subtilis), np. białko lub jego fragment posiadający aktywność wobec lub zabijający szkodniki, bądź mikroorganizm zdolny do ekspresji genu Bacillus kodującego białko Bacillus lub jego fragment posiadający aktywność wobec lub zabijający szkodniki (np. endotoksynę delta Bacillus thuringiensis) oraz odpowiedni nośnik (dla przykładów takich nośników patrz część 5.2, infra). Szkodnikiem może być, na przykład, owad, nicień, roztocze lub ślimak. Mikroorganizm zdolny do ekspresji genu Bacillus kodującego białko Bacillus lub jego fragment posiadający aktywność wobec lub zabijający szkodniki zasiedla filosferę (powierzchnię liści roślin) i/lub ryzosferę (glebę otaczającą korzenie roślinne) i/lub środowiska wodne i jest zdolny do uwieńczonego sukcesem współzawodniczenia z określonym środowisku (rośliny uprawne i inne naturalne siedliska owadów) z mikroorganizmami typu dzikiego oraz zapewnia stabilne utrzymywanie i ekspresję genu Bacillus kodującego białko Bacillus lub jego fragment posiadający aktywność wobec lub zabijający szkodniki. Przykłady takich mikroorganizmów obejmują, ale nie ograniczają się do bakterii, np.
183 156 z rodzajów Bacillus, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Sterptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter,Azotobacter,Leuconostoc,Alcaligenes i Clostridiunr, glonów, np. z rodzin Cyanophyceae, Prochlorophyceae, Rhodophyceae, Dinophyceae, Chrysophyceae, Prymnesiophyceae, Xanthophyceae, Raphidophyceae, Bacillariophyceae, Eustigmatophyceae, Cryptophyceae, Euglenophyceae, Prasinophyceae i Chlorophyceae·, oraz grzybów, szczególnie drożdży, np. z rodzajów Saccharomyces, Cryptococus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula i Aureobasidium.
Jak zdefiniowano w niniejszym opisie, „aktywność pestycydowa” określa wysokość aktywności wobec szkodnika mierzoną poprzez zabijanie lub hamowanie wzrostu szkodnika, bądź ochronę rośliny przed zarażeniem szkodnikami.
Wynalazek dotyczy także metody otrzymywania mutanta według niniejszego wynalazku, obejmującej:
(a) traktowanie szczepu Bacillus mutagenem;
(b) hodowlę zmutowanego szczepu Bacillus z etapu (a) w warunkach odpowiednich do selekcji mutanta; i (c) selekcjonowanie mutanta z etapu (b).
Zasadniczo czysty czynnik można otrzymać z mutanta przez:
(a) hodowlę zmutowanego szczepu Bacillus w odpowiednich warunkach;
(b) odzyskanie supemtantu hodowli mutanta z etapu (a); i (c) wyizolowanie czynnika z supemtantu z etapu (b) w celu otrzymania zasadniczo czystego czynnika.
Czynnikowi otrzymanemu z rzeczonego mutanta można nadawać postać kompozycji zawierającej czynnik i nośnik pestycydowy, jak również czynnik i pestycyd związany z Bacillus, pestycyd chemiczny i/lub wirus o właściwościach pestycydowych. Kompozycje te można stosować do zwalczania szkodnika, zmniejszania odporności szkodnika na pestycyd związany z Bacillus poprzez wystawienie szkodnika na działanie kompozycji zawierającej czynnik i pestycydowe dopuszczalny nośnik lub do wzmacniania aktywności pestycydowej pestycydu związanego z Bacillus.
5. KRÓTKI OPIS FIGUR
Figura 1 schematycznie przedstawia ogólną procedurę stosowaną do oczyszczania la.
Figura 2 przedstawia widmo l3C NMR la.
Figura 3 przedstawia widmo protonowe NMR la.
Figura 4 przedstawia wyniki doświadczeń z acetylowaną pochodną la.
6. SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU
Macierzystym szczepem Bacillus może być, na przykład, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis lub Bacillus thuringiensis. Macierzystym Bacillus thuringiensis może być szczep typu dzikiego, który obejmuje, ale nie ogranicza się doBacillus thuringiensis subsp. kurstaki, Bacillus thuringiensis subsp. aizawai, Bacillus thuringiensis subsp. galleriae, Bacillus thuringiensis subsp. entomocidus, Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis, Bacillus thuringiensis subsp. alesti, Bacillus thuringiensis subsp. canadiensis, Bacillus thuringiensis subsp. darmstadiensis, Bacillus thuringiensis subsp. dendrolimus, Bacillus thuringiensis subsp. finitimus, Bacillus thuringiensis subsp. kenyae, Bacillus thuringiensis subsp. morrisoni, Bacillus thuringiensis subsp. subtoxicus, Bacillus thuringiensis subsp. toumanffi, Bacillus thuringiensis subsp. toumanoffi, Bacillus thuringiensis subsp. pondicheriensis, Bacillus thuringiensis subsp. shandongiensis, Bacillus thuringiensis subsp. sotto, Bacillus thuringiensis subsp. nigeriae, Bacillus thuringiensis subsp. yunnanensis, Bacillus thuringiensis subsp. dakota, Bacillus thuringiensis subsp. nidiana, Bacillus thuringiensis subsp. tohokuensis, Bacillus thuringiensis subsp. kumamotoensis, Bacillus thuringiensis subsp. tochigiensis, Bacillus thuringiensis subsp. thompsoni, Bacillus thuringiensis subsp. wuhanensis, Bacillus thuringiensis subsp. kyushuensis, Bacillus thuringiensis subsp. ostriniae, Bacillus thuringiensis subsp. tolworthi, Bacillus thuringiensis subsp. pakistani, Bacillus thuringiensis sdhsp.japonesis, Bacillus thuringiensis subsp. colmeri, Bacillus thuringiensis subsp. pondicheriensis, Bacillus thurin
183 156 giensis subsp. shandogienis, Bacillus thuringiensis subsp. neoleonensis, Bacillus thuringiensis subsp. coreanensis, Bacillus thuringiensis subsp. siło, Bacillus thuringiensis subsp. mexcanensis i Bacillus thuringiensis subsp. israelenensis.
W szczególnym rozwiązaniu, macierzystym szczepem Bacillus thuringiensis jest Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki. W najbardziej specyficznym rozwiązaniu, szczepem macierzystym jest szczep EMCC0086 Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki (zdeponowany w NRRL jako NRRL B-21147). Mutant w jeszcze innym szczególnym rozwiązaniu posiada cechy charakterystyczne EMCC0129, zdeponowanego w NRRL i posiadającego numer dostępu NRRL B-21445 lub cechy charakterystyczne EMCC0130, zdeponowanego w NRRL i posiadającego numer dostępu NRRL B-2144.
6.1. METODY OTRZYMYWANIA MUTANTA
Szczep macierzysty można traktować mutagenem w celu indukcji mutacji. Szczególnie, w metodzie imitowania szczepów Bacillus thuringiensis i selekcjonowania takich mutantów, które są zdolne do wytwarzania zasadniczo większych ilości czynnika, niż ich szczepy macierzyste, szczep macierzysty:
i) traktuje się mutagenem;
ii) traktowane komórki hoduje się w odpowiednim podłożu hodowlanym (np. podłożu NSMP); i iii) selekcjonuje się komórki, które wytwarzają większą ilość czynnika.
W etapie (i) mutagenem może być na przykład chemiczny mutagen N-metylo-N'-nitroN-nitrozoguanidyna, N,N'-dinitro-N'-nitrozoguanidyna lub metanosulfonian etylu, promieniowanie gamma, promieniowanie X i promieniowanie UV.
Komórki selekcjonuje się przez oznaczanie wytwarzania czynnika, na przykład przez elektroforezę kapilarną lub oznaczenie immunologiczne z zastosowaniem przeciwciała skierowanego przeciw czynnikowi.
Można rozważać inną metodę otrzymywania mutantów o wysokiej produktywności według wynalazku, taką jak namnażanie szczepu macierzystego w podłożu płynnym i selekcjonowanie spontanicznych mutantów po wysianiu hodowli bulionowej na podłożu agarowym odpowiednim do selekcji mutantów.
Można rozważać inne metody przeszukiwania pod kątem mutantów o wysokiej produktywności według wynalazku, takie jak oddzielenie mutantów od innego materiału w oparciu o różnice mas, bezpośrednio przez wirowanie lub innymi sposobami rozdzielania pod względem masy.
6.2. OTRZYMYWANIE CZYNNIKA
Mutanty Bacillus według niniejszego wynalazku można hodować stosując podłoża i techniki hodowlane znane w tej dziedzinie (patrz, na przykład, Rogoff i in., 1969, J. Invertebrate Path. 14:122-129; Dulmage i in., w: Microbial Control of Pests and Plant Diseases, H.D. Burges, red., Academic Press, N.Y., 1980). W szczególnym rozwiązaniu podłoża fermentacyjne mogą zawierać zhydrolizowane białko, zhydrolizowany węglowodan, sole i metale śladowe. Podłoża fermentacyjne mogą także ewentualnie zawierać jeden lub więcej aminokwasów. Po zakończeniu cyklu fermentacyjnego, supematant można odzyskać przez oddzielenie przetrwalników i kryształów B.t. od brzeczki fermentacyjnej sposobami dobrze znanymi w tej dziedzinie, na przykład przez wirowanie i/lub ultrafiltrację. Czynnik zawarty jest w supematancie, który można odzyskać sposobami dobrze znanymi w tej dziedzinie, np. przez ultrafiltrację, odparowanie i suszenie rozpyłowe. Procedurę opisano bardziej szczegółowo w poniższych częściach.
Oczyszczanie czynnika można przeprowadzić stosując różne procedury znane w nauce, obejmujące, ale nie ograniczone do chromatografii (np. jonowymiennej, powinowactwa i sączenia molekularnego), procedur elektroforetycznych, różnicowej rozpuszczalności, ekstrakcji lub jakiejkolwiek innej standardowej techniki znanej w nauce.
Wzmacniającą aktywność czynnika na aktywność pestycydową pestycydu związanego z Bacillus, wirusa posiadającego aktywność pestycydową lub pestycydu chemicznego, wobec różnych szkodników można oznaczać stosując procedury znane w nauce, takie jak wprowadzanie
183 156 sztucznej diety dla owadów, pokrywanie sztuczną dietą, malowanie liści, zanurzanie liści i spryskiwanie listowia. Szczegółowe przykłady takich oznaczeń podano w części 7 infra. Ilość wytwarzanego czynnika można ocenić ilościowo przez, na przykład, elektroforezę kapilarną.
Czynnik może mieć masę cząsteczkową od około 350 do około 1200 lub, w szczególnym rozwiązaniu, od około 350 do około 700.
Czynnik wzmacnia aktywność pestycydową pestycydu związanego z Bacillus przynajmniej około 1,5 raza do nawet około 1000 razy, korzystnie od około 100 razy do około 400 razy. W szczególnym rozwiązaniu czynnik wzmacnia aktywność pestycydową białka endotoksyny delta Bacillus thuringiensis, obejmującej, ale nie ograniczonej do Cryl (obejmującej, ale nie ograniczonej do CrylA, CrylB i CrylC), Cryll, Crylll, CryIV, CryV lub CryVI w postaci o pełnej długości lub postaci proteolitycznie zmodyfikowanej, skróconej od około 1,5 raza do około 1000 razy. W najbardziej specyficznym rozwiązaniu, czynnik wzmacnia endotoksynę delta B.t. od około 100 razy do 400 razy. Czynnik może również wzmacniać aktywność pestycydową pestycydu chemicznego i/lub wirusa o właściwościach pestycydowych.
Czynnik może również być rozpuszczalny w wodzie, stabilny w wodzie do temperatury około 100°C w ciągu przynajmniej 5 minut, stabilny przy poddawaniu bezpośredniemu działaniu światła słonecznego w ciągu przynajmniej około 10 godzin i/lub stabilny w pH około 2 w ciągu około 10 dni. Czynnik może posiadać 13 atomów węgla. Ponadto, czynnik może posiadać w widmie *H NMR przesunięcia przy około δ 1,5, 3,22, 3,29, 3,35, 3,43, 3,58, 3,73, 3,98,4,07, 4,15, 4,25,4,35 i w widmie 13C przesunięcia przy około 31,6, 37,2, 51,1, 53,3,54,0, 54,4, 61,5,61,6, 64,1,65,6, 158,3, 170,7 i 171,3.
W najbardziej specyficznym rozwiązaniu rzeczony czynnik posiada strukturę la lub jego soli. Sól powinna być zdolna do wzmacniania pestycydu związanego z Bacillus.
6.3. KOMPOZYCJE ZAWIERAJĄCE CZYNNIK
Kompozycję(e) pestycydową(e), to jest na przykład zawiesinę, roztwór, emulsję, proszek do opylania, granulki dyspergowalne, proszek zwilżalny, koncentrat emulgujący, aerozol lub impregnowane granulki można tworzyć z samego czynnika otrzymanego z mutantów według niniejszego wynalazku; z pestycydem związanym z Bacillus, którym jak zdefiniowano supra, jest szczep Bacillus, przetrwalnik, białko lub jego fragment, lub inna substancja pochodząca z nich o aktywności wobec owadów lub zabijająca szkodniki, lub chroniąca rośliny przed szkodnikiem; z pestycydem chemicznym i/lub wirusem patogennym wobec owadów oraz dopuszczalnym nośnikiem. Przykłady takich szczepów Bacillus obejmują, ale nie ograniczają się do Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki (sprzedawany jako DIPEL™ przez Abbot Laboratories, Inc., JAVELIN™ przez Sandoz, BIOBIT™ przez Novo Nordisk A/S, FORAY™ przez Novo Nordisk A/S, BIOCOT™ przez Novo Nordisk A/S, MVP™ przez Mycogen, BACTOSPEINE™ przez Novo Nordisk A/S i THURICIDE™ przez Sandoz); Bacillus thuringiensis subsp. aizawai (sprzedawany jako FLORBAC™ przez Novo Nordisk A/S i XENTARI™ przez Abbott Laboratories, Inc.); Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis (sprzedawany jako NOVODOR™ przez Novo Nordisk A/S, TRIDENT™ przez Sandoz, M-TRAK™ i M-ONE™ przez Mycogen i DITERRA™ przez Abbott Laboratories, Inc.); Bacillus thuringiensis subsp. israelensis (sprzedawany jako BACTIMOS™ albo SKEETAL™ przez Novo Nordisk A/S, TEKNAR™ przez Sandoz i VECTOBAC™ przez Abbott Laboratories, Inc.); Bacillus thuringiensis kurstaki/tenebrionis (sprzedawany jako FOIL™ przez Ecogen); Bacillus thuringiensis kurstaki/aizawi (sprzedawany jako CONDOR™ przez Ecogen i AGREE™ przez Ciba-Geigy) oraz Bacillus thu
183 156 ringiensis kurstaki/kurstaki (sprzedawany jako CUTLASS™ przez Ecogen). Związane z Bacillus białko można wybrać z grupy obejmującej, ale nie ograniczonej do Cryl, Cryll, Crylll, CryIV, CryV i CryVI. Pestycydem chemicznym może być, na przykład, regulator wzrostu owadów, taki jak diflubenzuron, karbaminian, taki jak tiodikarb i metomyl, preparat fosforoorganiczny, taki jak chlorpyrifos, piretroid, taki jak cypermetrin i walerianian esfenu, nieorganiczny związek fluoru, taki jak kriolit oraz pirol. Wirusem patogennym wobec owadów może być bakulowirus, np. wirus jądrowej poliedrozy (NPV) Autographa califomica, NPV Syngrapha falcifera, GV (wirus granulozy) Cydia pomonella, NPV Heliothis zea, NPV Lymantria dispar, NPV Orgyia pseudotsugata, NPV Spodoptera exigua, NP V Neodipron lecontei, NPV Neodipron sertifer, NPV Harrisina brillians i NPV Clemens Endopiza viteana.
W kompozycjach zawierających substancję i pestycyd związany z Bacillus, substancja może występować w ilości co najmniej około 0,1 g/BIU lub 0,05 g czynnika na g endotoksyny delta i przetrwalników Bacillus, ewentualnie do około 300 g BIU lub 150 g substancji na g endotoksyny delta i przetrwalników Bacillus, korzystnie 2 g/BIU lub 1 g substancji na g endotoksyny delta i przetrwalników Bacillus. Jak zdefiniowano w niniejszym opisie, “BIU” jest to miliard jednostek międzynarodowych określanych w oznaczeniu biologicznym. W oznaczeniu biologicznym porównuje się próbkę ze standardowym materiałem odniesienia Bacillus, jako standardowego owada testowego stosując Trichoplusia ni lub innego szkodnika. Siłę działania określa się przez podzielenie LC50 materiału odniesienia, następnie mnożąc przez siłę działania standardu odniesienia.
W innym rozwiązaniu, kompozycja może zawierać czynnik w zasadniczo czystej postaci lub supematant pochodzący z hodowli Bacillus w suchej, zatężonej lub płynnej postaci oraz pestycydowe dopuszczalny nośnik, którego przykłady ujawniono infra. Kompozycję tę można stosować odrębnie na roślinę, np. rośliny transgeniczne. W szczególności, kompozycję można stosować na roślinę wcześniej zawierającą i eksprymującągen Bacillus thuringiensis. W innym rozwiązaniu, kompozycję można stosować na roślinę wcześniej wystawioną na działanie kompozycji Bacillus thuringiensis. W innym rozwiązaniu, kompozycję można stosować w innych środowiskach szkodliwych muchówek, np. w wodzie lub glebie. Substancja występuje w kompozycji w stężeniu od około 0,001% do około 60% (w/w).
Kompozycję zawierającą substancję i pestycydowo dopuszczalny nośnik, poza zwalczaniem szkodnika, można również stosować do obniżania odporności szkodnika na pestycyd. Alternatywnie, kompozycję można również stosować do wzmacniania pestycydu związanego z Bacillus. W jednym rozwiązaniu, kompozycję można stosować w tym samym czasie, co pestycyd, w ilości co najmniej około 2 g substancji/BIU do ewentualnie około 300 g substancji/ BIU. W innym rozwiązaniu, kompozycję można stosować do około 24 godzin po pestycydzie, jako adiuwant dla zwiększenia skuteczności pozostałego pestycydu.
Takie ujawnione powyżej kompozycje można otrzymać przez dodanie czynnika powierzchniowo czynnego, obojętnego nośnika, środka konserwującego, środka pochłaniającego wilgoć, środka pobudzającego żerowanie, środka wabiącego, czynnika kapsułkującego, lepiszcza, emulgatora, barwnika, czynnika zabezpieczającego przed UV, buforu, środka poprawiającego płynność lub innego składnika dla manipulowania i stosowania produktu wobec konkretnych szkodników docelowych.
Odpowiednie czynniki powierzchniowo czynne obejmują związki anionowe, takie jak sole kwasów karboksylowych, na przykład sól długolańcuchowego kwasu tłuszczowego z metalem; N-acylosarkozynian; mono- lub diestry kwasu fosforowego z etoksylanami alkoholi tłuszczowych lub sole takich estrów; siarczany alkoholi tłuszczowych, takie jak siarczan sodowy dodecylu, siarczan sodowy oktadecylu lub siarczan sodowy cetylu; siarczany etoksylowanych alkoholi tłuszczowych; siarczany etoksylowanych alkilofenoli; sulfoniany ligniny; sulfoniany naftowe; sulfoniany alkiloarylowe, takie jak sulfonian alkilobenzenowy lub sulfoniany alkilonaftalenu o krótkim łańcuchu alkilowym, np. sulfonian butylonafłalenu; sole sulfonowanych produktów kondensacji naftalenu z formaldehydem; sole sulfonowanych produktów kondensacji naftalenu z formaldehydem, sole sulfonowanych produktów kondensacji fenolu z formaldehydem lub bar
183 156 dziej złożone sulfoniany, takie jak amidosulfoniany, np. sulfonowany produkt kondensacji kwasu oleinowego i N-metylotauryny lub sulfobursztyniany dialkilowe, np. sulfonian sodowy bursztynianu dioktylowego. Czynniki niejonowe obejmują produkty kondensacji estrów kwasów tłuszczowych, alkoholi tłuszczowych, amidów kwasów tłuszczowych lub fenoli podstawionych tłuszczową grupą alkilową lub alkenylową z tlenkiem etylenu, estry kwasów tłuszczowych i polihydroksylowych alkoholoeterów, np. estry kwasów tłuszczowych i sorbitanu, produkty kondensacji takich estrów z tlenkiem etylenu, np. estry kwasów tłuszczowych i polioksyetylenosorbitanu, kopolimery blokowe tlenku etylenu i tlenku propylenu, glikole acetylenowe, takie jak 2,4,7,9-tetraetylo-5-decyno-4,7-diol lub etoksylowane glikole acetylenowe. Przykłady kationowych czynników powierzchniowo czynnych obejmują, na przykład, alifatyczną mono-, dilub poliaminę, takąjak octan, naftenian lub oleinian; aminę zawierającą tlen, takąjak tlenek aminy polioksyetylenowanej alkiloaminy; aminę z wiązaniem amidowym przygotowanąprzez kondensację kwasu karboksylowego z di- lub poliaminą, bądź czwartorzędową sól amonową.
Przykłady obojętnych materiałów obejmują mineralne substancje nieorganiczne, takie jak kaolin, mika, gips, nawóz sztuczny, filokrzemiany, węglany, siarczany lub fosforany; materiały organiczne, takie jak cukier, skrobie lub cyklodekstryny; lub materiały botaniczne, takie jak produkty z drewna, korek, sproszkowane kaczany kukurydzy, łuski ryżu, łupiny orzechów ziemnych i łupiny orzechów włoskich.
Kompozycje według niniejszego wynalazku mogą mieć postać odpowiednią do bezpośredniego stosowania lub koncentracji bądź pierwotnej kompozycji, która przed zastosowaniem wymaga rozcieńczenia odpowiednią ilością wody lub innego rozcieńczalnika. Stężenie pestycydu będzie różne w zależności od charakteru konkretnej postaci, szczególnie od tego, czy jest ona koncentratem, czy jest przeznaczona do bezpośredniego stosowania. Kompozycja zawiera 1 do 98% stałego lub płynnego obojętnego nośnika i od 0 do 50%, korzystnie od 0,1 do 50% środka powierzchniowo czynnego. Kompozycje te będą stosowane w ilości określonej dla produktu komercyjnego, korzystnie od około 0,01 funta do 5 funtów na akr, jeśli są w postaci stałej i od około 0,01 pinta do 25 pint na akr, jeśli mają postać płynną.
W dalszym rozwiązaniu, krystalicznąendotoksynę delta Bacillus thuringiensiis i/lub czynnik można, przed utworzeniem z nich preparatu, poddawać działaniu maj ącemu na celu wydłużenie aktywności pestycydowej po zastosowaniu w środowisku docelowego szkodnika, pod warunkiem, że to działanie wstępne nie wywiera ujemnego wpływu na właściwości kompozycji. Przykłady odczynników chemicznych obejmują, ale nie ograniczają się do czynników chlorowcujących, aldehydów, takich jak formaldehyd i glutaraldehyd; przeciwinfekcyjnych, takich jak chlorek zefirami; alkoholi, takich jak izopropanol i etanol; oraz utrwalaczy histologicznych, takich jak utrwalacz Bouina i utrwalacz Heli/ego (patrz, na przykład, Humason, Animal Tissue Techniques, W.H. Freeman and Co., 1967).
Kompozycje według wynalazku można stosować bezpośrednio na rośliny przez, na przykład, rozpylanie lub opylanie, w czasie, gdy szkodnik zaczyna pojawiać się na roślinie lub ochronie przed pojawieniem się szkodników. Rośliny, które mogąbyć chronione według niniejszego wynalazku obejmują, ale nie ograniczają się do zbóż (pszenicy, jęczmienia, żyta, owsa, ryżu, sorgo i zbliżonych roślin uprawnych), buraków (buraka cukrowego i buraka pastewnego), pestkowców, drzew jabłkowatych i owoców miękkich (jabłoni, gruszy, śliw, brzoskiwni, migdałowców, wiśni, truskawek, malin i jeżyn), roślin strączkowych (lucerny, fasoli, soczewicy, grochu, soi), roślin oleistych (rzepaku, gorczycy, maku, oliwek, słoneczników, palm kokosowych, rącznika, kakaowców, orzechów ziemnych), dyniowatych (ogórków, dyni, melonów), roślin włóknistych (bawełny, lnu, konopi, juty), owoców cytrusowych (pomarańczy, cytryn, grejpfrutów, mandarynek), warzyw (szpinaku, sałaty, szparagów, kapusty i innych kapustnych, marchwi, cebuli, pomidorów, ziemniaków), warzywnowatych (awokado, cynamonowca, kamforowca), drzew liściastych i iglastych (lip, cisów, dębów, olszy, topoli, brzóz, jodeł, modrzewi, sosen) lub takich roślin jak kukurydza, rośliny darniowe, tytoń, orzechy, kawa, trzcina cukrowa, herbata, winorośl, chmiel, banany i rośliny kauczukowe, jak również rośliny ozdobne. Kompozycje można stosować na liście, do bruzd, w postaci granulek do rozsiewania rzutowego, „bocznicowo” lub
183 156 przez drenaż gleby. Ogólnie rzecz biorąc ważne jest uzyskanie skutecznego zwalczania szkodników na wczesnych etapach wzrostu roślin, ponieważ jest to czas, w którym rośliny mogą ulec najsilniejszym uszkodzeniom. Jeżeli uważa się to za konieczne, dogodne może być, aby substancja do rozpylania lub opylania zawierała inny pestycyd. W korzystnym rozwiązaniu, kompozycję według wynalazku stosuje się bezpośrednio na roślinę.
Kompozycję według niniejszego wynalazku można również stosować bezpośrednio do stawów, jezior, strumieni, rzek, wód stojących i innych obszarów zagrożonych plagą szkodliwych muchówek, a zwłaszcza szkodnikami mającymi związek ze zdrowiem publicznym. Kompozycję można stosować przez rozpylanie, opylanie, zraszanie lub podobne.
Kompozycje według niniejszego wynalazku mogą być skuteczne wobec szkodliwych owadów z rzędu motyli, np. Achroia grisella, Acleris gloverana, Acleris yariana, Adoxophyes orana, Agrotis ipsilon, Alabama argillacea, Alsophila pometaria, Amyelois transitella, Anagasta kuehniella, Anarsia lineatella, Anisota senatoria, Antheraeapernyi, Anticarsia gemmatalis, Archips sp., Argyrotaeniasp., Athetis mindara, Bombyxmori, Bacculatrix thurberiella, Cadra cautella, Choristoneura sp., Cichylis hospes, Colias eurytheme, Corcyra cephalonica, Cydia latiferreanus, Cydiapomonella, Datana integerrima, Dendrolimus sibericus, Desmia funeralis, Diaphania hyalineata, Diaphanianitidalis, Diatraea grandiosella, Diatraea saccharalis, Ennomos subsignaria, Eoreuma loftini, Ephestia elutella, Erannis tiliaria, Estigmene acrea, Eulia salubricola, Eupoeclia ambiguella, Euproctis chrysorrhoea, Euxoa messoria, Galleria mellonella, Grapholita molesta, Harrisina americana, Helicoyerpa subflexa, Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Hemileuca oliviae, Homoeosoma electellum, Hyphantria cunea, Keiferia lycopersicella, Lambdina fiscellaria fiscellaria, Lambdina fiscellaria lugubrosa, Leucoma salicis, Lobesia botrana, Loxostege sticticalis, Lymantria dispar, Macalla thyrsisalis, Malacosoma sp., Mamestra brassicae, Mamestra configurata, Manduca quinquemaculata, Manduca sexta, Maruca testulalis, Melanchra pieta, Operophtera brumata, Orgyia sp., Ostrinia nubilalis, Paleacrita yernata, Papilio cresphontes, Pectinophora gossypiella, Phryganidia californica, Phyllonorycter blancardella, Pieris napi, Pieris rapae, Plathypena scabra, Platynotaflouendana, Platynota sułtana, Platyptilia carduidactyla, Plodia interpunctella, Plutella xylostella, Pontia protodice, Pseudaletia unipuncta, Pseudoplusia includens, Sabulodes aegrotata, Schizura concinna, Sitotroga cerealella, Spilonota ocellana, Spodopterasp., Thaumstopoeapityocampa, Tineolabisselliella, Trichoplusia ni, Udea rubigalis, Xylomyges curialis, Yponomeuta padella; rzędu muchówek, np. Aedes sp., Andes yittatus, Anastrepha ludens, Anastrepha suspensa, Anopheles barberi, Anopheles guadrimaculatus, Armigeres subalbatus, Calliphora stygian, Calliphora vicina, Ceratitis capitata, Chironomus tentans, Chrysomya rufifacies, Cochliomyia macellaria, Culexsp., Culiseta inornata, Dacus oleae, Delia antiqua, Deliaplatura, Delia radicum, Drosophila melanogaster, Eupeodes corollae, Glossina austeni, Glossina brevipalpis, Glossina fiiscipes, Glossina morsitans centralis, Glossina morsitans morsitans, Glossina morsitans submorsitans, Glossina pallidipes, Glossina palpalis gambiensis, Glossina palpalis palpalis, Glossina tachinoides, Haemagogus eguinus, Haematobia irritans, Hypoderma bovis, Hypoderma lineatum, Leucopis ninae, Lucilla cuprina, Lucilla sericata, Lutzomyia longlpaipis, Lutzomyia shannoni, Lycoriella mali, Mayetiola destructor, Musca autumnalis, Musca domestica, Neobellieria sp., Nephrotoma suturalis, Ophyra aenescens, Phaenicia sericata, Phlebotomus sp., Phormia regina, Sabethes cyaneus, Sacrophaga bullata, Scatophaga stercoraria, Stomoxys calcitrans, Toxorhynchites amboinensis, Tripteroides bambusa. Jednakże, kompozycje według wynalazku mogą również być aktywne wobec szkodliwych owadów z rzędu chrząszczy, np. Leptinotarsa sp., Acanthoscelides obtectus, Callosobrunchus chinensis, Epilachna varivestis, Pyrrhalta luteola, Cylas formicarius elegantulus, Listronotus oregonensis, Sitophilus sp., Cyclocephala borealis, Cyclocephala immaculata, Macrodactylus subspinosus, Popilliajaponica, Rhizotrogus majalis, Alphitobius diaperinus, Palorus ratzeburgi, Tenebrio molitor, Tenebrio obscurus, Tribolium castaneum, Tribolium confusum, Tribolius destructor, roztoczy, np. Oligonychuspratensis, Panonychus ulmi, Tetranychus urticae·, błonkówek, np. Iridomyrmex humilis, Solenopsis invicta; termitów, np. Reticulitermes hesperus, Reticulitermesflavipes, Coptotermes
183 156 formosanus, Zootermopsis angusticollis, Neotermes connexus, Incisitermes minor, Incisitermes immigrans; pcheł, np. Ceratophyllus gallinae, Ceratophyllus niger, Nosopsyllus fasciatus, Leptopsylla segnis, Ctenocephalides canis, Ctenocephalides felis, Echicnophaga gallinacea, Pulex irritans, Xenopsylla cheopis, Xenopsylla vexabilis, Tunga penetrans oraz nicieni z rodziny węgorkowatych, np. Melodidogyne incognito, Pratylenchus penetrans.
Poniższe przykłady przedstawiono w celu ilustracji, ale nie ograniczania.
7. PRZYKŁAD: CHARAKTERYSTYKA la
Jak to wyszczególniono w niniejszym opisie, la odzyskuje się i oczyszcza. Charakterystykę la przedstawiono szczegółowo infra.
7.1. ODZYSKIWANIE I OCZYSZCZANIE la
Fermentację szczepu EMCC0086 B. thuringiensis subsp. kurstaki (zdeponowanego w NRRL jako B-21147) prowadzi się w ciągu 72 godzin w temperaturze 30°C w podłożu składającym się ze źródła węgla, takiego jak skrobia, hydrolizat skrobiowy lub glukoza i źródła azotu, takiego jak białko, hydrolizat białkowy namok kukurydziany. Wytwarzanie la wykrywa się w 13 godzinie fermentacji. Najwyższą aktywność stwierdza się w około 30 godzinie.
Supematant z fermentacji B. thuringiensis subsp. kurstaki odzyskuje się przez wirowanie, a następnie klaruje przez ultrafiltrację przez membranę MW-CO o przepuszczalności do 30 kDa, stosując w tym celu układ UF Rhone Poulenc. Filtracja przez membrany o przepuszczalności do 30 kDa prowadziła do usunięcia pozostałych szczątków komórek, krystalicznej delta-endotoksyny, przetrwalników i białek rozpuszczalnych o masie cząsteczkowej wyższej niż 30 kDa. Przesącz zagęszcza się 10-krotnie przez odparowanie. Przesącz wiruje się, a następnie filtruje przez membranę o średnicy porów 0,2 μ w celu dalszego usunięcia nierozpuszczalnych składników brzeczki, otrzymując klarowną brzeczkę zawierającą la.
Oczyszczanie la do homogenności uzyskuje się stosując wieloetapową procedurę oczyszczania przedstawioną schematycznie na figurze 1. W odniesieniu do procesu otrzymywania opisanego powyżej, oczyszczanie prowadzono z etapem ultrafiltracji przez membranę o przepuszczalności do 5 kDa. Przesącz otrzymany w wyniku ultrafiltracji przez membranę o przepuszczalności do 5 kDa adsorbuje się na złożu kationowymiennym Sulphopropyl (SP) i eluuje roztworem octanu amonu. Związek zagęszcza się następnie około 30-krotnie przez liofilizację, a sól i inne zanieczyszczenia usuwa się stosując kolumnę do sączenia molekularnego P2 BioRad. Połączone frakcje z kolumny P2 rozdziela się na kolumnie SP HPLC do wysokorozdzielczej chromatografii kationowymiennej, co prowadzi do uzyskania homogennego związku. Zanieczyszczającą sól usuwa się przez powtarzalną liofilizację.
Aktywność mierzy się stosując mikrooznaczanie biologiczne wykorzystując Spodoptera exigua, a czystość oznacza się przez elektroforezę kapilarną. Próbki zawierające 50 μΐ la i 50 μΐ białka CrylA(c) (15 μg/ml) oczyszczonego z BIOBIT™ FC (100 μΐ) nanosi się do pojedynczych studzienek w galaretowatej podstawce zawierających 500 μΐ zestalonej, sztucznej diety dla owada. Podstawki zawierające różne próbki suszy się na powietrzu. Do studzienek zawierających wysuszone próbki dodaje się dwa do czterech owadów Spodoptera exigua w fazie drugiej lub wczesnej trzeciej wylinki. Studzienki zamyka się stosując mylar z otworami i inkubuje w ciągu 2-3 dni w temperaturze 30°C. Następnie rejestruje się stopień zahamowania rozwoju oraz procent śmiertelności. Zazwyczaj prowadzi się 5 powtórzeń identycznych studzienek dla każdej próbki.
7.2. OKREŚLENIE STRUKTURY
Stwierdzono, że aktywny związek jest rozpuszczalny w wodzie, a nierozpuszczalny w rozpuszczalnikach organicznych. Jest on dodatnio naładowany i reaguje z ninhydryną, co udowodniono stosując chromatografię cienkowarstwową na krzemionce. NMR 13C i protonowy związek przedstawiono odpowiednio na figurach 2 i 3. Badania 13C NMR wykazały obecność 13 atomów węgla (odnoszące się do kwasu 3-(trimetylosililopropionowego). Doświadczenie DEPT wykazało, że w związku tym występują trzy czwartorzędowe atomy węgla (C), siedem grup metinowych (CH), trzy grupy metylenowe (CH2) i żadnej grupy metylowej (CH3). Stosując doświadczenia odsprzęgania protonów, takie jak odsprzęganie 1-D i COSY, zidentyfikowano jeden
183 156 duży układ spinowy zawierający osiem atomów węgla. Ponadto, obecny jest mniejszy układ spinowy zawierający dwa atomy węgla. Eksperyment korelacyjny węglowo-protonowy (HMBC) umożliwił 'wyznaczenie rezonansu każdego protonu w cząsteczce do związanego z nim atomu węgla.
W wyniku traktowania aktywnego związku (13 mg) bewodnikiem octowym w pirydynie powstaje acetylowana pochodna, która jest znacznie mniej polarna. Pochodną tę oczyszczono przez HPLC, uzyskując 3 mg czystej zacetylowanej pochodnej. Analiza z wykorzystaniem spektroskopii masowej wykazała, że pochodna ta posiada 7 grup acetylowych i masę cząsteczkową 690, co daje masę cząsteczkową aktywnego związku 396 i wskazuje, że obecna jest parzysta liczba atomów azotu. Wykryto również fragmenty zawierające 6 grup acetylowych i 5 grup acetylowych. Dane o wysokiej rozdzielczości dla jonów potomnych zawierających 5 i 6 grup acetylowych wynoszą645,2594 (6 grup acetylowych) i 607,2519 (5 grup acetylowych), co wskazuje na następujący wzór cząsteczkowy la: C13H28N6O8.
Działanie na aktywny związek (13 mg) 6 N HC1 prowadzi do wytworzenia pochodnej dającej dodatnią reakcję z ninhydryną. Wyniki te wskazująna obecność wiązań amidowych. Pochodna ma taką samą wartość Rf, jaką wyznaczono przez chromatografię cienkowarstwową dla kwasu 2,3-diaminopropionowego. Wyniki te wraz z danymi NMR sugerują obecność kwasu 2,3 -diaminopropionowego.
Inną techniką wykorzystywaną do analizy la jest nOe (jądrowy efekt Overhausera), dzięki której można wyznaczyć wzajemną bliskość protonów w przestrzeni. nOe zastosowano wobec zacetylowanej pochodnej la. W dwukierunkowym doświadczeniu nOe (NOES Y), nOe obserwuje się pomiędzy protonem N-H przy 8,06 ppm i protonem 5,17 (figura 4).
Ustalono następującą strukturę la:
Związek ten można zaliczyć do ureidoamidów. Jego składniki obejmują2 grupy amidowe, mocznik, dwie aminy i pięć grup hydroksylowych. Zawiera on siedem centrów chirałnych.
7.3. WŁAŚCIWOŚCI la
Stwierdzono, że wyizolowany la wzmacnia aktywność białek pestycydowych krystalicznej delta-endotoksyny5ć7cz7/us thuringiensis subsp. kurstaki'}. Bacillus thuringiensis subsp. aizawi wobec Spodoptera exigua bez względu na postać białek pestycydowych. Wzmacniana jest aktywność pestycydowa preparatów B. t. k., wyizolowanych kryształów i białek CrylA o pełnej długości (masa cząsteczkowa 130 kDa) lub skróconych (masa cząsteczkowa około 65 kDa). Wzmocniona jest również aktywność inkluzji Cryll i CrylC. Stwierdzano również wzmacnianie aktywności pojedynczych, skróconych białek CrylA(a), (b) i (c). Nie stwierdzono, aby czas inkubacji la z białkiem Cry miał zasadnicze znaczenie dla aktywności biologicznej. Jednakże, sam la jest nieaktywny. Stwierdzono, że poziom wzmocnienia wynosi 100-200 razy dla skróconych białek CrylA oraz inkluzji CryllC i Cryl i około 320 razy dla pełnej długości CrylA(c) (patrz odpowiednio tabela I i II). Śzczególnie w przypadku białka o pełnej długości 0,75 gg/ml CrylA(c) powodowało taką samą śmiertelność owadów/stopień zahamowania rozwoju, gdy dodano la, jak 240 gg/ml samego białka CrylA(c). W przypadku skróconego CrylA(c), przy OD280 wynoszącym 0,0006 w połączeniu z la otrzymano taki sam stopień zahamowania rozwoju, jak dla próbki samego CrylA(c) przy OD280 wynoszącym 0,075. Inkluzje Cryll w stężeniu 0,6 gg/ml w połączeniu z la dawały taki sam stopień zahamowania rozwoju i podobną śmiertelność jak samo białko Cryll w stężeniu 0,75 gg/ml, co stanowi 125-krotne wzmocnienie. Inkluzje CrylC przy stężeniu 0,3 gg/ml z dodatkiem la dają podobną śmiertelność i stopień zahamowania rozwoju, jak samo
183 156 białko CrylC w stężeniu 75 pg/ml, co odzwierciedla 250-krotny poziom wzmocnienia. Stężenie białka CrylA, które powodowało zahamowanie rozwoju, po dodaniu la prowadziło do śmierci.
Stwierdzono, że la zachowuje stabilność po utrzymywaniu temperatury wrzenia w ciągu 5 minut, ale traci całą aktywność podczas autoklawowania (>190°C). Ponadto, jest on stabilny po poddaniu bezpośredniemu działaniu światła słonecznego w ciągu co najmniej 10 godzin. la jest stabilny w pH 2 w ciągu 3 dni, ale niestabilny w pH 12. Stwierdzono, że traci całą aktywność po wystawieniu na działanie kwasu nadjodowego lub stężonego HC1.
Tabela I
Wzmacniający wpływ la na oczyszczone skrócone białka Bt
Białko Bt Spodoptera exigua
Typ OD280 la Śmiertelność Stopień zahamowania rozwoju
Cryla(a) 0,055 - 0/5 2,2
0,040 - 0/5 2,2
0,020 - 0/5 2,0
0,020 + 0/5 0,0
0,010 + 0/5 0,2
0,005 + 0/5 0,0
0,0025 + 0/5 0,4
0,0012 + 0/5 1,8
0,0006 + 0/5 1,6
CrylA(c) 0,075 - 0/5 3,4
0,040 - 0/5 2,6
0,020 - 0/5 2,8
0,020 + 1/5 0,0
0,010 + 0/5 0,2
0,005 + 1/5 0,0
0,0025 + 2/5 2,0
0,0012 + 0/5 1,0
0,0006 + 1/5 1,0
brak + 0/5 4,0
brak - 0/5 4,0
Śmiertelność = liczba owadów martwych/liczba wszystkich owadów po 2 dniach;
Stopień zahamowania rozwoju zdefiniowano jako średnią wielkość żywej larwy owada pod koniec oznaczenia biologicznego: 4,0 =kontrola nietraktowana, 3,0 = 75% wielkości kontroli, 2,0 = 50% wielkości kontroli, 1,0 = 25% wielkości kontroli, 0,0 = brak wzrostu lub wielkość niezmieniona od rozpoczęcia doświadczenia.
Tabela Π
Wzmacniający wpływ la na białko Bt
Białko Bt Spodoptera exip.ua
Typ OD280 la Śmiertelność Stopień zahamowania rozwoju
1 2 3 4 5
CtylA(c) 240 - 1/5 0,5
120 - 0/5 2,2
60 - 0/5 2,2
183 156 ciąg dalszy tabeli II
1 2 3 4 5
30 - 0/5 4,0
60 + 5/5 —
30 + 5/5 —
15 + 4/5 0,0
3 + 4/5 1,0
0,8 + 2/5 1,6
Cryll 300 - 1/5 0,8
150 - 2/5 0,7
75 - 1/5 0,2
38 - 0/5 0,8
19 - 0/5 1,6
9 - 0/5 1,8
5 - 1/5 4,0
38 + 3/5 1,0
19 + 2/5 0,5
9 + 3/5 0,0
5 + 1/5 0,5
2,4 + 1/5 0,0
1,2 + 3/5 0,5
0,6 + 2/5 0,3
Cryll 300 - 2/5 0,3
150 - 2/5 0,0
75 - 1/5 0,8
38 - 0/5 3,2
38 + 5/5 —
19 + 5/5 —
9 + 5/5 —
5 + 4/5 0,0
2,4 + 1/5 0,0
1,2 + 5/5 —
0,6 + 3/5 1,5
0,3 + 2/5 1,3
brak - 0/5 4,0
brak + 0/5 4,0
*Śmiertelność = liczba owadów martwych/liczba wszystkich owadów po 2 dniach;
Stopień zahamowania rozwoju zdefiniowano jako średnią wielkość żywej larwy owada pod koniec oznaczenia biologicznego: 4,0 = kontrola nietraktowana, 3,0 = 75% wielkości kontroli, 2,0 = 50% wielkości kontroli, 1,0 = 25% wielkości kontroli, 0,0 = brak wzrostu lub wielkość niezmieniona od rozpoczęcia doświadczenia.
7.4. OCENA INNYCH PODGATUNKÓW Bacillus thuringiensis I INNYCH GATUNKÓW Bacilli
Kilka gatunków Bacilli oceniono pod kątem wytwarzania la. Szczepy poddawano fermentacji w ciągu 72 godzin w temperaturze 30°C w podłożu zawierającym źródło węgla, takie jak skrobia, hydrolizat skrobiowy lub glukoza oraz źródło azotu, takie jak białko, hydrolizat
183 156 białkowy lub namok kukurydziany. Supematanty testowano pod kątem wytwarzania la stosując opisane powyżej mikrooznaczenie biologiczne z wykorzystaniem Spodoptera exigua. Stwierdzono, że szczepy B. thuringiensis subsp. aizawi EMCC0087 (zdeponowany w NRRL jako NRRL B-21148) i B. thuringiensis subsp. galleriae (zdeponowany w NRRL) wytwarzają la w przybliżeniu w takim samym stężeniu, jak Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki.
Jak określono przez elektroforezę kapilarną, la wytwarzają również B. subitilis, B. cereus, B. t. subsp. alesti,B. t. subsp. canadiensis,B. t. subsp. darmstadiensis,B. t. subsp. dendrolimus,B. t. subsp. entomocidus, B. t. subsp. finitimus, B. t. subsp. israelensis, B. t. subsp. kenyae, B. t. subsp. morrisoni, B. t. subsp. subtoxicus, B. t. subsp. tenebrionis, B. t. subsp. thuringiensis, B. t. subsp. toumanoffi, B. cereus, B. subitilis i mutant ery- spo- B. thuringiensis subsp. kurstaki.
Do ilościowego oznaczania la stosuje się zwłaszcza Beckman P/ACE Capillary Electrophories System wyposażony w nieopłaszczonąkapilarę o wymiarach 50 pm x 57 cm, 0,2 M bufor fosforanowy pH 6,8, napięcie 15 KV i detekcję przy długości fali 200 nm. Objętości próbek wynoszą 20 nl, a czas rozdziału 25 minut.
Krzywą standardową tworzy się jako standard stosując oczyszczony la o stężeniach 1,25 mg/ml, 0,625 mg/ml, 0,3125 mg/ml, 0,156 mg/ml oraz 0,078 mg/ml. Tworzy się liniowąkrzywą kalibracyjną. Otrzymane równanie y - mx + b stosuje się do obliczania stężenia la w każdej próbce.
Przed każdym rozdziałem kapilarę przemywa się buforem do elektroforezy (0,2 M bufor fosforanowy pEl 6,8) w ciągu trzech minut. Po każdym trwającym 25 minut rozdziale kapilarę przemywa się 1N NaOH w ciągu 1 minuty, wodąfiltrowanąprzez HPLC w ciągu 1 minuty, 0,5 M kwasem fosforowym w ciągu 3 minut i wodąfiltrowanąprzez HPLC w ciągu 1 minuty. Pole powierzchni pod każdym pikiem całkuje się i określa się pole powierzchni piku oraz oblicza się stężenie końcowe na podstawie krzywej standardowej.
7.5. OCENA PRODUKTÓW B. t.
Ilość la obecnego w różnych komercyjnie dostępnych produktach określono przez elektroforezę kapilamąopisanąpowyżej w części 6.4, supra. BACTOSEPINE™, JAVELIN™, NOVODOR™, SPHERIMOS™, BACTIMOS™, FORAY™, FLORBAC™ i BIOBIT™ Novo Nordisk A/S . XENTARI™ i DIPEL™ uzyskano z Abbot Laboratories. AGREE™ uzyskano z Ciba-Geigy; MVP™ uzyskano z Mycogen i CUTLASS™ uzyskano z Ecogen.
Wyniki przedstawione w tabeli III, infra, wskazują, że la występuje w zróżnicowanych ilościach, w zakresie od mniej niż 0,001 g la/BIU do 0,071 g la/BIU.
Tabela III la w produktach Bacillus thuringiensis
Produkt Typ Numer serii Siła działania la g/BIU
1 2 3 4 5
JAVELINl WG Btk 9942281 32000 lU/mg 0,071
XENTARI™ Bta 58715PG 15000IU/mg 0,06
AGREE™ B ta/Btk RA2080 25000 TU/mg 0,033
BIOBIT™ HPWP Btk 5012 48950 U/mgPIA 0,018
BIOBIT™ FC Btk AG46669071 8 BIU/L 0,013
FORAY™ 48B Btk BBN7018 12,6 BIU/L 0,012
DIPEL™ Btk 58739PG 32000 lU/mg 0,011
TM FORAY 76B Btk 20,0 BIU/L 0,007
BACTOSPEINE™ Btk BOB001 123653 lU/mg 0,003
BACTOSPEINE™ Btk ΚΧ02Α 100000 lU/mg 0,003
BACTOSPEINE™ Btk WP 16000 lU/mg <0,001
NOYODOR™ Btt 9024 16,3 miliona LTU/qt O 9,5 x 10 g/LTU
183 156 ciąg dalszy tabeli III
1 2 3 4 5
FLORBAC™ Bia 082-31-1 30000 U/mg E <0,001
SPHERIMOS™ Bsphr BSN006 brak
MVP™ Btk 21193542 brak
CUTLASS™ Btk/Btk brak
BACTIMOS™ Bń BIB0024 11700IU/mg brak
7.6. OZNACZENIA BIOLOGICZNE WPROWADZANIA DO POKARMU
Aktywność B. t. k. określa się przez oznaczenie biologiczne wprowadzania do sztucznego pokarmu z zastosowaniem larw Spodoptera exigua w stadium trzeciej wylinki, larw Helicoverpa zea w stadium drugiej wylinki, larw Spodopterafrugiperda w stadium trzeciej wylinki, larw Heliothis yirecens w stadium drugiej wylinki, larw Trichoplusia ni w stadium trzeciej wylinki, larw Pseudoplusia includens w stadium trzeciej wylinki, larw Plutella xylostella w stadium trzeciej wylinki, larw Spodoptera littorialis w stadium trzeciej wylinki i larw Mamestra brassicae w stadium trzeciej wylinki.
W celu określenia poziomu wzmocnienia pod wpływem dodania la do produktów B. t. i ustalenia zakresu podlegających wpływowi owadów, przeprowadzono oznaczenia biologiczne prowadzania do pokarmu. W doświadczeniach z wysokimi stężeniami la wobec Spodoptera exigua (7,4-23,7 g la/BIU), oczyszczony la (70% składnika aktywnego, 30% octanowego jonu o przeciwnym ładunku) stosuje się do wzmocnienia BIOBIT™ FC (FC oznacza koncentrat do uzyskiwania postaci płynnej). Pozostałe dane podane w tabeli IV przedstawiają wzmocnienie BIOBIT™ HPWP (zwilżalny proszek o wysokiej sile działania) przez la (0,658% aktywnego czynnika). S. Littoralis i M. Brassicae testowano stosując FLORBAC™HPWP i la.
Różne produkty B. t. waży się i dodaje la w ilości odpowiadającej 0,1 do 237 g la/BIU. Objętość doprowadza się 0,1 % Tween™. Próbki sonikuje się w ciągu 1 minuty, a następnie rozcieńcza do objętości końcowej. Przygotowuje się również próbki samego pestycydu (bez la) i substancji odniesienia. Substancje odniesienia obejmują B. t. k. HD-1S-1980 (otrzymany z NRRL) o oznaczonej sile działania 16000 jednostek międzynarodowych (IU) na miligram i JAVELIN™ WG o oznaczonej sile działania 53000 jednostek Spodoptera (SU)/mg.
Standardowy sztuczny pokarm złożony z wody, agaru, cukru, kazeiny, kiełków pszenicy, parabenu metylowego, kwasu sorbinowego, oleju lnianego, celulozy, soli i witamin przygotowuje się w ogrzewanym kotle o pojemności 20 litrów. Zapewnia to wystarczającą ilość pokarmu do przetestowania 10 do 12 próbek dla siedmiu różnych stężeń każdej testowanej substancji. Roztwory B. t. poddaje się kolejnym rozcieńczeniom uzyskując próbki o objętości 16 ml. Każdą próbkę dodaje się do 184 g płynnego pokarmu. Mieszaninę następnie homogenizuje się, a potem wlewa do plastikowej płytki zawierającej 40 pojedynczych komór. Dla każdej partii pokarmu przygotowuje się po trzy płytki kontrolne. Po schłodzeniu i zestaleniu, do każdej komory dodaje się jednego owada o znanym wieku (stadium 2-3 wylinki) i płytki przykrywa się arkuszem przejrzystego mylar z otworami. Płytki umieszcza się w statywach i inkubuje w ciągu czterech dni w temperaturze 28°C i 65% wilgotności względnej.
Po czterech dniach określa się śmiertelność owadów. Każdąpłytkę uderza się mocno o blat stołu i larwy, które się nie poruszają, liczy się jako martwe. Oblicza się procent śmiertelności i dane analizuje się wykorzystując równoległą analizę probit. Ocenia się LC50, LC90, nachylenie linii regresji, współczynnik wariacji i siły działania. Próbki analizowano minimum trzy razy lub dopóki trzy wartości siły działania nie różniły się o więcej niż 20% od obliczonej średniej dla każdej próbki. W celu obliczenia wzrostu aktywności związanego z każdym stężeniem la, w LC50 próbki B. t./Ia uwzględnia się poprawkę, tak aby odzwierciedlało ilość B. t. w próbce. LC50 sparowanych próbek la dzieli się przez poprawione wartości LC50 otrzymując wielokrotność obniżenia LC50 związaną z la.
183 156
W oznaczeniu z Lobesia bothrana stosuje się następującą procedurę. Winoroślą zaatakowane Lobesia bothrana zbiera się z nieopryskiwanych upraw i usuwa larwy. Wykonuje się szereg rozcieńczeń la (250 pg/ml, 500 pg/ml i 1000 gg/ml) w wodzie. Jednąlarwę umieszcza się na środku szalki Petri'ego. Po zaobserwowaniu picia przez larwę, przenosi się ją na świeżo ścięte winogrona. Larwy utrzymywano w temperaturze 22°C w ciągu 3-4 dni.
Jak przedstawiono w tabeli IV, obserwowano znaczące obniżenia LC50 dla wszystkich gatunków.
Tabela IV
Oznaczenia biologiczne wprowadzania do pokarmu
Owad g la na BIU Wzrost aktywności Wielokrotność obniżenia LC50
1 2 3
Spodoptera exigua (BIOBIT™ HPWP) 0,1 1,5
0,2 1,7
2,0 4,3
4,0 7,5
Spodoptera exigua (BIOBIT™ FC) 7,4 13
15 26
30 34
118 59
237 79
Spodopterafrugiperda (BIOBIT™HPWP) 0,2 2,2
0,8 3,9
2,0 7,2
4,0 11,6
Trichoplusia ni TM (BIOBIT HPWP) 0,1 1,1
0,2 1,2
2,0 2,0
4,0 3,1
Pseudoplusia includens TM (BIOBIT HPWP) 0,1 0
0,2 1,2
0,8 2,1
2,0 2,4
4,0 3,4
Plutella xylostella TM (BIOBIT HPWP) 0,2 1,6
0,8 1,3
2,0 1,4
4,0 1,9
Helicoverpa zea (BIOBIT™ HPWP) 3,2 12,6
Hehothis virescens 3,2 4,2
(BIOBIT™ HPWP)
183 156 ciąg dalszy tabeli IV
1 2 3
Lobesia bothrana (BIOBIT™ HPWP) 2,0 3,0
Spodoptera littorialis (FLORBAC™ ) 2,0 8,6
Mamestra brassicae TM (FLORBAC ) 2,0 4,9
Wzmocnienie przez la różnych produktów wobec Spodoptera exigua określa się stosując opisane supra oznaczenie biologiczne wprowadzania do pokarmu. Ilość la dodanego/BIU produktu przedstawiono w tabeli V infra. Mieszaninę la/produkt B. t. wprowadza się do opartego na agarze pokarmu zawierającego kiełki pszenicy i kazeinę. Owady umieszcza się na pokarmie na cztery dni w temperaturze 28°C. Śmiertelność rejestruje się i analizuje wykorzystując analizę probit. LC50, LC90 i siłę działania oblicza się przez porównanie z produktem nie zawierającym la. Wyniki przedstawione w tabeli V wskazują że la wzmacnia różne produkty B. t. k. i B. t. a. uzyskane z różnych źródeł. Szczepy B. t. zawarte w tych produktach opisano w części 5.2., supra.
Tabela V
Wzmacnianie produktów B. t. wobec Spodoptera exigua
Owad g la na BIU Wzrost aktywności Wielokrotność obniżenia LC50
TM BACTOSPEINE WP 0,4 1,7 1,04 2,3
CONDOR™ 0,4 1,7 2,4 5,1
AGREE™ 0,4 1,7 1,1 1,6
TM CUTLASS 0,4 1,7 1,1 2,5
MVP™ 0,4 1,7 2,0 6,0 7,7 12,1
FLORBAC™ HPWP 0,2 0,8 1,1 2,0
TM DIPEL 2x 0,2 0,8 2,0 1,2 2,3 3,9
JAVELIN™ WG 0,2 0,8 2,0 0 1,08 2,9
XENTARI™ 0,2 0,8 2,0 1,2 1,6 2,4
183 156
7.7. OZNACZENIA BIOLOGICZNE NA LIŚCIACH
Oznaczenia biologiczne na liściach prowadzi się z larwami Spodoptera exiguana w stadium drugiej wylinki na brokułach, stosując BIOBIT™ FC i la. Stosunek la do BIOBIT™ FC jest taki sam, 2 g la/BIU BIOBIT™ FC. Brokuły poddaje się traktowaniu w objętości nośnika 20 galonów na akr stosując rozpylacz gąsienicowy. Po wyschnięciu rozpylonego środka liście usuwa się, a następnie infekuje larwami Spodoptera exigua w stadium drugiej wylinki. Wyniki przedstawiono w tabeli VI infra. 100% śmiertelności obserwuje się przy ilości 8,7 BIU/hektar BIOBIT™ FC + la, podczas gdy sam BIOBIT™ FC zabija 92% larw w ilości 58,8 BIU/hektar i 8% w ilości 17,6 BIU/hektar. Traktowane rośliny wystawia się również na bezpośrednie działanie światła słonecznego w ciągu ośmiu godzin, po czym liście wycina się i infekuje. Po ośmiu godzinach na świetle, sam BIOBIT™ FC w ilości 58,8 BIU/hektar powoduje 27% śmiertelności, podczas gdy BIOBIT™ FC + la powodują 100% śmiertelności w ilości 8,7 BIU/hektar.
W oznaczeniu na liściach wykonanym z larwami we wczesnym stadium czwartej wylinki stwierdzono 75% śmiertelności dla samego BIOBIT™ FC w ilości 52 BIU/hektar i 100% śmiertelności dla BIOBIT™ FC (FC oznacza koncentrat do uzyskiwania postaci płynnej) + la w ilości 13 BIU/hektar.
Tabela VI
Oznaczenia biologiczne na liściach
Traktowanie BIU/hektar % śmiertelności Wylinka larwalna
BIOBIT™ FC 58,8 92% 2
TM BIOBIT FC 17,6 8% 2
BIOBIT™ FC + la 8,7 100% 2
BIOBIT™ FC + 8 h światła słonecznego 58,8 27% 2
BIOBIT™ FC + la + 8 h światła słonecznego 8,7 100% 2
BIOBIT™ FC 52 75% 4
BIOBIT™ FC + la 13 100% 4
7.8. PRÓBY POLOWE
Próby połowę wobec fasoli odmiany garbonzo (Spodoptera exigua) wykazały, że sam BIOBIT™ FC w ilości 70 BIU/hektar zapewnia 51% zwalczania szkodnika, podczas gdy 2 g la/BIU BIOBIT™ FC w ilości 40 BIU/hektar zapewnia 89% zwalczania (w odniesieniu do braku traktowania). JAVELIN™ WG w ilości 45 BIU/hektar zapewnia 51% zwalczania.
Próby połowę wobec kukurydzy cukrowej (Spodoptera frugiperdd) wykazały, że przy ilości 39,5 BIU/hektar, 2 g la/BIU BIOBIT™ FC zapewnia 84% zwalczania.
7.9. STOSUNKI OPORNOŚCI
Oznaczeniu biologicznemu poddano wrażliwe i oporne kolonie Plutella xylostella. Próbki opornych ciem zebrano z pól z Florydy, gdzie rozwinęła się oporność na B.t.,^ wyniku intensywnej ekspozycji na JAVELIN™ WG. BIOBIT™ HPWP z la poddaje się analizie stosując oznaczenie biologiczne z zanurzaniem liści. Oporność na JAVELIN™ i XENTARI™ określa się bez la. Krążki liści kapusty o średnicy sześciu centymetrów zanurza się na 10 sekund w jednym z ośmiu różnych stężeń produktów B. t. preparatów B. ń/Ia. Stosuje się stężenia w zakresie od 1 do 1000 ppm. Krążki liściowe pozostawia się na dwie godziny do wyschnięcia na powietrzu, a następnie umieszcza się w plastikowych szalkach Petri'ego z larwami w stadium drugiej wylinki (0,2 do 0,4 mg). Dwadzieścia pięć owadów/dawkę/dzień podwojono otrzymując 50 owadów/dawkę. Po 72 godzinach w temperaturze 27°C rejestruje się śmiertelność. Regresję zależności dawka-śmiertelność analizuje się wykorzystując analizę probit. Stosunki oporności oblicza się dzieląc wartości LC50i LC90 dla wrażliwych ciem. Wyniki przedstawiono w tabeli VII i wykazują one, że BIOBIT™ HPWP ulega wzmocnieniu dla 2 g la/BIU i 4 g la/Biu. Szczególnie dla 4 g
183 156 la/BIU występuje 2-krotne obniżenie stosunku oporności LC50 i 10-krotne obniżenie stosunku oporności LC90.
Tabela VII
Stosunki oporności Plutella xylostella (opornych na B. t. k.)
Testowany produkt Stosunek oporności LC50 Stosunek oporności LC90
TM JAVELIN WG 302,6 3829,7
BIOBIT™ HPWP 20,5 98,5
TM 2,0 g la/BIU BIOBIT HPWP 23,2 88,0
4,0 g la/BIU BIOBIT™ HPWP 10,4 11,5
TM XENTARI 9,7 8,2
7.10. MUTANTY
7.10.1. Szczep
Stosuje się szczepy Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki EMCC0086 (NRRL B-21147), Septoria nodorum (A04119) i Altenaria altemata (szczep 6, IM-SMP).
7.10.2. Oznaczenie hamowania wzrostu grzybów
Mutanty szczepu Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, które wytwarzają czynnik, identyfikuje się stosując agarowe płytki z grzybami Septoria nodorum i Altenaria altemata. Czynnik hamuje wzrost obu grzybów.
Oba grzyby hoduje się na płytkach z podłożem PDA (agarowe podłoże ziemniaczanodekstrozowe) w temperaturze 26°C w ciągu 10-14 dni, aż do uzyskania wystarczającego zarodnikowania. Altenaria altemata inkubuje się stosując naprzemiennie okresy światła UV i ciemności (po 12 godzin). Zarodniki usuwa się z płytek i zawiesza w jałowej wodzie. Zarodniki grzybami Septoria nodorum sączy się przez jałowy sączek Gl. Stężenie zarodników Altenaria altemata doprowadza się do około 2 x 105 na ml, a stężenie zarodników Septoria nodorum doprowadza się do około 2 x 106 na ml używając licznika Bruker-Turka lub Fuchsa-Rosenthala. Zawiesinę zarodników o objętości 1,5 ml miesza się z 1,5 ml jałowego 40% glicerolu w wodzie, mrozi w ciągu 1 dnia w temperaturze -20°C, a następnie przechowuje się w temperaturze -80°C do czasu zastosowania.
Płytki testowe dla czynnika przygotowuje się mieszając w temperaturze 46°C 1,5 ml próbki zarodników (jak to opisano powyżej) ze 115 ml podłoża agarowego z antybiotykiem numer 2 (22,5 g na litr) zawierającego streptomycynę w końcowym stężeniu 100 pg na ml, a następnie przenosi się tę mieszaninę do jałowych, plastikowych podstawek (Nunc, numer katalogowy 101875). Po zastygnięciu agaru, robi się w nim otwory o wielkości mm (120 otworów na podstawkę).
Próbki hodowli rozcieńcza się kolejno w jałowej wodzie zawierającej 100 pg streptomycyny na ml i rozcieńczone próbki o objętości lOpl nanosi się na płytki przygotowane jak opisano powyżej. Płytki inkubuje się w temperaturze 26°C w ciągu 2 dni. Analizowano również rozcieńczenia czynnika jako kontrolę pozytywną.
Czułość oznaczenia hamowania wzrostu grzybów pozostaje w zakresie od 0,05 grama czynnika na litr (ledwo widoczne) do 0,1 grama czynnika na litr (klarowna strefa) dla obu gatunków grzybów.
7.10.3. Pomiar czynnika z zastosowaniem strefowej elektroforezy kapilarnej
Komórki i inne cząstki nierozpuszczalne usuwa się przed analizą z pełnej próbki brzeczki hodowlanej przez wirowanie łub sączenie przez nylonowe membrany o średnicy porów 0,2 pm. Do ilościowego oznaczania czynnika stosuje się Beckman P/ACE Capillary Electrophoresis System wyposażony w nieopłaszczoną kapilarę o wymiarach 50 pm x 47 cm; bufor rozdzielający zawierający 0,1 M fosforan, pH 6,6, napięcie 15 KV i detekcję przy długości fali 200 nm. Przed każdym rozdziałem kapilarę przemywa się buforem rozdzielającym w ciągu 2 minut. Objętość nakładanej próbki wynosi 20 nl.
183 156
Czas rozdziału dla analizy wynosi 12 minut, gdzie czynnik ulega elucji w około 8,5 minucie. Stężenie czynnika określa się w odniesieniu do krzywej standardowej otrzymanej dla czystego związku.
Pomiędzy każdym trwającym 12 minut rozdziałem kapilarę przemywa się kolejno 1 N wodorotlenkiem sodowym w ciągu 0,5 minuty, 0,1 N wodorotlenkiem sodowym w ciągu 0,5 minuty, wodąHPLC w ciągu 0,5 minuty i 1,5 M kwasem fosforowym w ciągu 0,5 minuty.
7.10.4. Mutageneza szczepu B. thuringiensis subsp. kurstaki
Przetrwalniki szczepu NB75 Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki poddaje się najpierw działaniu promieni gamma w dawce 700 Kradów. Napromieniowane przetrwalniki poddaje się kolejnym rozcieńczeniom, rozpyla się na płytki agarowe TY i inkubuje w temperaturze 30°C w ciągu 2 dni. Uzyskane w ten sposób 80 mutantów oczyszcza się przez rozprowadzenie pojedynczych kolonii na agarowych płytkach TY, a następnie przenosi się do kolb do wytrząsania o objętości 500 ml zawierających po 100 ml podłoża o następującym składzie:
Namok kukurydziany 15 g/litr
Maltodekstryna 40 g/litr
Białko ziemniaka 30 g/litr
KH2PO4 1,77 g/litr
K2HPO4 4,53 g/litr
Kolby do wytrząsania inkubuje się w temperaturze 30°C, przy 250 obrotach na minutę w ciągu 3 dni.
Codziennie z każdej wytrząsanej kolby pobiera się próbki hodowli o objętości 5 ml i odwirowuje się je w celu osadzania komórek. Supematant rozcieńcza się 2-10 krotnie w wodzie dejonizowanej zawierającej streptomycynę w stężeniu 0,1 mg/ml, a następnie testuje się pod kątem aktywności przeciwgrzybowej, jak opisano w części 8.2. Próbki hodowli tych mutantów, które powodują największe zahamowanie wzrostu grzybów analizuje się następnie pod kątem ilości czynnika stosując strefową elektroforezę kapilarną, jak opisano w części 8.3. Mutantem o najwyższej produktywności, uzyskanym z pierwszej rundy mutacji, jest NBB-76.
Mutanta z pierwszej rundy mutacji NBB-76 poddaje się następnie drugiej mutacji z zastosowaniem N,N'-dinitro-N'-nitrozoguanidyny (NTG). Szczegółowo, szczep mutanta hoduje się przez noc w temperaturze 30°C, przy 240 obrotach na minutę, w kolbie do wytrząsania o objętości 500 ml zawierającej 100 ml bulionu TY o następującym składzie, doprowadzonej do pH 7,3 przed autoklawowaniem:
Trypton 20 g/litr
Ekstrakt drożdżowy 5 g/litr
FeCl2-4H2O 6 g/litr
MnCl2-4H2O 1 g/litr
MgSO4-7H2O 15 g/litr
Całonocną hodowlę rozcieńcza się 100-krotnie w nowej kolbie do wytrząsania zawierającej podłoże TY i hoduje się w temperaturze 30°C, przy 240 obrotach na minutę, aż do osiągnięcia przez hodowlę fazy wzrostu logarytmicznego (około 4 godziny. Z kolby pobiera się próbkę hodowli o objętości 10 ml, a następnie bakterie odsącza się stosując jednostkę filtrującą Nalgene o średnicy porów 0,45 pm. Komórki na sączku ponownie się zawiesza w 10 ml buforu TM zawierającego 100 pg NTG na ml. Bufor TM zawiera 6,05 g Trisu i 5,08 g kwasu maleinowego na litr wody dejonizowanej doprowadzonych do pH 6 wodorotlenkiem sodowym. Zawieszone komórki inkubuje się w temperaturze 37°C w ciągu 30 minut, a następnie przyłącza się do źródła zmniejszonego ciśnienia w celu usunięcia NTG z komórek. Komórki przemywa się dwa razy 20 ml buforu M9 przed zawieszeniem w 10 ml buforu M9, rozcieńcza się kolejno, rozprowadza na płytki z podłożem agarowym TY i inkubuje w temperaturze 30°C w ciągu 2 dni. Bufor M9
183 156 zawiera 8,78 g Na2HPO4-2H2O,3 g KH2PO4,4 g NaCl i 0,2 g MgSO4-7H2O na litr wody dejonizowanej. Mutanty izoluje się i testuje, jak opisano powyżej. Mutantem o najwyższej produktywności uzyskanym z drugiej rundy mutacji jest EMCC0130.
Mutanta EMCC0130 uzyskanego w drugiej rundzie mutacji poddaje się następnie trzeciej rundzie mutacji stosując NTG, jak opisano powyżej. Mutantem o najwyższej produktywności uzyskanym z trzeciej rundy mutacji jest NBC-217.
Mutanta NBC-217 uzyskanego w drugiej rundzie mutacji poddaje się następnie czwartej rundzie mutacji stosując NTG, jak opisano powyżej. Mutantem o najwyższej produktywności uzyskanym z czwartej rundy mutacji jest EMCC0129.
7.10.5. Wytwarzanie czynnika przez mutanty i szczep rodzicielski
Mutanty EMCC0130, NBC-217 i EMCC0129 oraz szczep rodzicielski Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki EMCC0086 hoduje się w kolbach do wytrząsania o objętości 250 ml zawierających 50 ml podłoża obejmującego następujące składniki wzbogacone w mikroelementy w ilości 0,2 ml na litr, doprowadzonego do pH 7 H3PO4, bezpośrednio przed sterylizacją:
Hydrolizat białka roślinnego 30 g/litr
Hydrolizat skrobiowy 40 g/litr
KH2PO4 5 g/litr
MgSO4 0,3 g/litr
Hodowle w kolbach do wytrząsania inkubuje się w temperaturze 30°C, przy 250 obrotach na minutę w ciągu 3 dni.
Ilościową analizę czynnika wytwarzanego przez mutanty i szczep rodzicielski przeprowadza sięprzez strefową elektroforezę kapilamą,jak opisano w części 8.3. Analiza ilościowa wykazuje, że mutant EMCC0129 wytwarza około 0,9 g czynnika na litr brzeczki hodowlanej po 3 dniach w wytrząsanych kolbach, podczas gdy szczep rodzicielski wytwarza około 0,15 g na litr. Mutant EMCC0129 wytwarza około 6-krotnie więcej czynnika niż szczep rodzicielski.
Tabela VIII
Wytwarzanie czynnika przez mutanty Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki
Mutant Czynnik (g/litr)
Szczep rodzicielski 0,15
EMCC0130 0,65
NBC-217 0,65
EMCC0129 0,75
Zakres opisanego i zastrzeganego tu wynalazku nie jest ograniczony przez ujawnione tu szczegółowe rozwiązania, ponieważ rozwiązania te mają na celu zilustrowanie kilku aspektów wynalazku. Jest zamiarem, aby wszelkie równoważniki rozwiązań wchodziły w zakres tego wynalazku. W rzeczywistości, różne modyfikacje wynalazku poza tymi przedstawionymi i opisanymi w niniejszym opisie, staną się oczywiste na podstawie tego opisu dla specjalistów w tej dziedzinie. Jest również zamiarem, aby takie modyfikacje wchodziły w zakres dołączonych zastrzeżeń.
W niniej szym opisie cytowano różne odnośniki literaturowe, ujawnienia których włączono w całości poprzez odnośniki.
8. DEPOZYT MIKROORGANIZMÓW
Następujące szczepy Bacillus thuringiensis zdeponowano na warunkach Porozumienia Budepesztańskiego w Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604, USA.
183 156
Szczep Numer dostępu Data depozytu
EMCC0086 NRRL B-21147 6 października 1993
EMCC0129 NRRL B-21445 23 maja 1995
EMCC0130 NRRL B-21444 23 maja 1995
Szczepy zdeponowano na warunkach, które zapewniają, że dostęp do kultur podczas trwania postępowania patentowego tego zgłoszenia patentowego będzie możliwy dla osób określonych przez kierownika Biura Patentowego i Znaków Towarowych, upoważnionego do tego na podstawie 37 C.F.R. § 1.14 i 35 U.S.C. § 122. Depozyt stanowi zasadniczo czystą kulturę każdego ze zdeponowanych szczepów. Depozyt jest dostępny, zgodnie z wymaganiami zagranicznego prawa patentowego, w krajach, w których złożono kopie niniejszego zgłoszenia lub jego odpowiedniki. Jednakże, powinno być zrozumiałe, że dostępność depozytu nie stanowi licencji na praktykowanie niniejszego wynalazku z naruszeniem praw patentowych przyznawanych w wyniku działań rządowych.
181156
181 156
181156
181 156
Obserwowane nOe : 8.2
8.06
5.17
5.17,5.34
9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 5.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0
FIG.4
181156
10-krotnie zatężony supernatant po fermentacji Btk NB75
Wirowanie ł
Sączek o średnicy porów 0,2 pm Nieoczyszczony supernatant po sączeniu przez sączek o średnicy porów 0,2 pm
Ultrafiltracja przez błonę o przepuszczalności do 5 kDa ł
Permeat do 5 kDa
Wymiana kationowa na SP 4
Połączone zebrane frakcje
Zatężanie przez liofilizację
I
Sączenie molekularne na P2
Ψ
Połączone zebrane frakcje
SP HPLC
I
Zebrane frakcje po SP HPLC
I
Wielokrotne liofolizacja

Claims (15)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Mutant szczepu Bacillus, znamienny tym, że wytwarza się czynnik wzmacniający aktywność pestycydową pestycydu związanego z Bacillus, przy czym ilość czynnika wytwarzanego przez mutanta jest co najmniej 2 razy większa niż ilość czynnika wytwarzanego przez odpowiadający szczep rodzicielski, zaś szczep Bacillus wybrany jest z grupy składającej się z Bacillus licheniformis, Bacillus subtilus i Bacillus thuringiensis.
  2. 2. Mutant według zastrz. 1, znamienny tym, że czynnik posiada w widmie 'H NMR przesunięcia przy około δ 1,5,3,22,3,29,3,35,3,43,3,58,3,73,3,98,4,07,4,15,4,25,4,35 i widmie 13C przesunięcia przy około 31,6,37,2,51,1,53,3,54,0,54,4,61,5,61,6,64,1,65,6,158,3,170,7 i 171,3.
  3. 3. Mutant według zastrz. 1, znamienny tym, że wytwarza czynnik posiadaj ący strukturę I
    lub jego sól.
  4. 4. Mutant według zastrz. 1, znamienny tym, że szczep Bacillus jest szczepem Bacillus thuringiensis.
  5. 5. Mutant według zastrz. 4, znamienny tym, że szczep Bacillus thuringiensis wybiera się z grupy składajcej się ze szczepów Bacillus thuringiensis subsp. aizawai, Bacillus thuringiensis subsp. alesti, Bacillus thuringiensis subsp. canadiensis, Bacillus thuringiensis subsp. colmeri, Bacillus thuringiensis subsp. coreanensis, Bacillus thuringiensis subsp. dakota, Bacillus thuringiensis subsp. darmstadiensis, Bacillus thuringiensis subsp. dendrolimus, Bacillus thuringiensis subsp. entemocidus, Bacillus thuringiensis subsp. finitimus, Bacillus thuringiensis subsp. galleriae, Bacillus thuringiensis subsp. indiana, Bacillus thuringiensis subsp. israelensis, Bacillus thuringiensis subsp. kenyae, Bacillus thuringiensis subsp. kumamotoensis, Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, Bacillus thuringiensis subsp. kyushuensis, Bacillus thuringiensis schsp.japonensis, Bacillus thuringiensis subsp. mexcanensis, Bacillus thuringiensis subsp. morrisoni, Bacillus thuringiensis subsp. neoleonensis, Bacillus thuringiensis subsp. nigeriae, Bacillus thuringiensis subsp. ostriniae, Bacillus thuringiensis subsp. pakistani, Bacillus thuringiensis subsp. pondicheriensis, Bacillus thuringiensis subsp. shandonginensis, Bacillus thuringiensis subsp. siło, Bacillus thuringiensis subsp. sotto, Bacillus thuringiensis subsp. subtoxicus, Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, Bacillus thuringiensis subsp. thompsoni, Bacillus thuringiensis subsp. tochigiensis, Bacillus thuringiensis subsp. tohokuensis, Bacillus thuringiensis subsp. tolworthi, Bacillus thuringiensis subsp. toumanoffi, Bacillus thuringiensis subsp. wuhanensis i Bacillus thuringiensis subsp. yunnanensis.
  6. 6. Mutant według zastrz. 4, znamienny tym, że szczepem Bacillus thuringiensis jest szczep Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki.
  7. 7. Mutant według zastrz. 1, znamienny tym, że mutant posiada cechy charakterystyczne EMCC0129, zdeponowanego w NRRL i posiadającego numer dostępu NRRL B-wwww lub cechy charakterystyczne EMCC0130, zdeponowanego w NRRL i posiadającego numer dostępu NRRL Β-χχχχ.
    183 156
  8. 8. Mutant według zastrz. 1, znamienny tym, że pestycyd związany z Bacillus obejmuje endotoksynę delta Bacillus thuringiensis lub jej aktywny pestycydowe fragment.
  9. 9. Mutant według zastrz. 9, znamienny tym, że endotoksynę delta Bacillus thuringiensis lub jej aktywny pestycydowe fragment wybiera się z grupy składającej się z Cryl, Cryll, Crylll, CryIV, CryV i CryVI.
  10. 10. Mutant według zastrz. 9, znamienny tym, że endotoksyną delta Bacillus thuringiensis lub jej aktywnym pestycydowe fragmentem jest endotoksyna delta CrylABacillus thuringiensis lub jej aktywny pestycydowe fragment.
  11. 11. Mutant według zastrz. 9, znamienny tym, że endotoksyną delta Bacillus thuringiensis lub jej aktywnym pestycydowe fragmentem jest endotoksyna delta CrylC Bacillus thuringiensis lub jej aktywny pestycydowe fragment.
  12. 12. Mutant według zastrz. 1, znamienny tym, że pestycyd związany z Bacillus obejmuje przetrwalniki Bacillus thuringiensis.
  13. 13. Mutant według zastrz. 1, znamienny tym, że czynnik otrzymany został przez (a) hodowlę mutanta szczepu Bacillus w odpowiednich warunkach; (b) odzyskiwanie supematantu z hodowli mutanta z hodowli mutanta z etapu (a); i (c) izolowanie czynnika z supematantu z etapu (b).
  14. 14. Mutant według zastrz. 13, znamienny tym, że czynnik otrzymuje się z supematantu hodowli szczepu Bacillus thuringiensis.
  15. 15. Sposób otrzymywania mutanta według zastrz. 1, znamienny tym, że (a) traktuje się szczep Bacillus mutagenem;
    (b) namnaża się zmutowany szczep Bacillus z etapu (a) w warunkach odpowiednich do selekcji mutanta; i (c) przeprowadza się selekcję mutanta z etapu (b).
PL96323472A 1995-05-30 1996-05-17 Mutanty wytwarzające czynnik wzmacniający aktywności pestycydowe Bacillus PL183156B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US45496795A 1995-05-30 1995-05-30
PCT/US1996/007136 WO1996038539A1 (en) 1995-05-30 1996-05-17 Mutants which produce a potentiator of bacillus pesticidal activity

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL323472A1 PL323472A1 (en) 1998-03-30
PL183156B1 true PL183156B1 (pl) 2002-05-31

Family

ID=23806816

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL96323472A PL183156B1 (pl) 1995-05-30 1996-05-17 Mutanty wytwarzające czynnik wzmacniający aktywności pestycydowe Bacillus

Country Status (14)

Country Link
EP (1) EP0828819B1 (pl)
JP (1) JP3794705B2 (pl)
AT (1) ATE221912T1 (pl)
AU (1) AU717681B2 (pl)
CA (1) CA2222801A1 (pl)
CZ (1) CZ362597A3 (pl)
DE (1) DE69622859T2 (pl)
DK (1) DK0828819T3 (pl)
ES (1) ES2183947T3 (pl)
HU (1) HUP9802569A3 (pl)
PL (1) PL183156B1 (pl)
PT (1) PT828819E (pl)
WO (1) WO1996038539A1 (pl)
ZA (1) ZA963315B (pl)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2866202B1 (fr) * 2004-02-12 2006-08-18 Getade Agri Concept Procede de traitement phytosanitaire biologique des vegetaux, notamment de la vigne et compositions adaptees
AR122093A1 (es) * 2020-05-13 2022-08-10 Bayer Cropscience Lp Cepas de bacillus thuringiensis y métodos para el control de plagas

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ZA938163B (en) * 1992-11-05 1994-06-06 Novo Nordisk Entotech Inc Potentiator of bacillus pesticidal activity

Also Published As

Publication number Publication date
ES2183947T3 (es) 2003-04-01
HUP9802569A2 (hu) 1999-02-01
ZA963315B (en) 1997-10-27
AU717681B2 (en) 2000-03-30
PT828819E (pt) 2002-12-31
CA2222801A1 (en) 1996-12-05
PL323472A1 (en) 1998-03-30
CZ362597A3 (cs) 1998-02-18
DK0828819T3 (da) 2002-12-02
JP3794705B2 (ja) 2006-07-12
WO1996038539A1 (en) 1996-12-05
DE69622859D1 (de) 2002-09-12
HUP9802569A3 (en) 2002-07-29
AU5797096A (en) 1996-12-18
EP0828819A1 (en) 1998-03-18
JPH11506004A (ja) 1999-06-02
DE69622859T2 (de) 2003-04-30
ATE221912T1 (de) 2002-08-15
EP0828819B1 (en) 2002-08-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU683859B2 (en) Potentiator of (bacillus) pesticidal activity
US5859235A (en) Dipteran-active uracil derivative
DE69531731T2 (de) Neue pestizid-zusammenstellungen und bacillus thuringiensis stämme
CA2223034C (en) Methods for producing a potentiator of bacillus pesticidal activity
US6268181B1 (en) Methods for producing a potentiator of Bacillus pesticidal activity
US5976563A (en) Pesticidal composition and Bacillus thuringiensis strain
US5976564A (en) Pesticidal composition and bacillus thurigiensis strain
CZ291438B6 (cs) Kmen Bacillus thuringiensis s pesticidním účinkem
EP0828819B1 (en) Mutants which produce a potentiator of bacillus pesticidal activity
US6277624B1 (en) Mutants which produce a potentiator of Bacillus pesticidal activity
CZ400497A3 (cs) Nová pesticidní substance Bacillus thuringiensis
US6406691B1 (en) Potentiator of Bacillus pesticidal activity
MXPA97000326A (en) Novedous active compound and dipters and cepa debacillus thuringien
MXPA97007017A (en) Novedous pesticide composition and bacillus thuringien seed