PL183156B1 - Mutanty wytwarzające czynnik wzmacniający aktywności pestycydowe Bacillus - Google Patents
Mutanty wytwarzające czynnik wzmacniający aktywności pestycydowe BacillusInfo
- Publication number
- PL183156B1 PL183156B1 PL96323472A PL32347296A PL183156B1 PL 183156 B1 PL183156 B1 PL 183156B1 PL 96323472 A PL96323472 A PL 96323472A PL 32347296 A PL32347296 A PL 32347296A PL 183156 B1 PL183156 B1 PL 183156B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- bacillus thuringiensis
- bacillus
- thuringiensis subsp
- mutant
- subsp
- Prior art date
Links
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 title claims abstract description 54
- 230000000361 pesticidal effect Effects 0.000 title claims abstract description 39
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 claims abstract description 69
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 claims abstract description 69
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 claims abstract description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 34
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims abstract description 5
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 claims abstract description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 34
- 241001147758 Bacillus thuringiensis serovar kurstaki Species 0.000 claims description 16
- 108700003918 Bacillus Thuringiensis insecticidal crystal Proteins 0.000 claims description 14
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 12
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 8
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 6
- 241000193369 Bacillus thuringiensis serovar tenebrionis Species 0.000 claims description 5
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 claims description 5
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 claims description 5
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 claims description 5
- 241000193363 Bacillus thuringiensis serovar aizawai Species 0.000 claims description 3
- 241001147757 Bacillus thuringiensis serovar galleriae Species 0.000 claims description 3
- 241001050423 Bacillus thuringiensis serovar pondicheriensis Species 0.000 claims description 3
- 241000193370 Bacillus thuringiensis serovar tolworthi Species 0.000 claims description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 claims description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims description 3
- 241000193372 Bacillus thuringiensis serovar alesti Species 0.000 claims description 2
- 241001050373 Bacillus thuringiensis serovar colmeri Species 0.000 claims description 2
- 241001050339 Bacillus thuringiensis serovar coreanensis Species 0.000 claims description 2
- 241000905459 Bacillus thuringiensis serovar dakota Species 0.000 claims description 2
- 241000006438 Bacillus thuringiensis serovar dendrolimus Species 0.000 claims description 2
- 241001147756 Bacillus thuringiensis serovar finitimus Species 0.000 claims description 2
- 241000193365 Bacillus thuringiensis serovar israelensis Species 0.000 claims description 2
- 241001468252 Bacillus thuringiensis serovar kenyae Species 0.000 claims description 2
- 241000905453 Bacillus thuringiensis serovar kumamtoensis Species 0.000 claims description 2
- 241000178574 Bacillus thuringiensis serovar kyushuensis Species 0.000 claims description 2
- 241000193371 Bacillus thuringiensis serovar morrisoni Species 0.000 claims description 2
- 241001050402 Bacillus thuringiensis serovar ostriniae Species 0.000 claims description 2
- 241001050359 Bacillus thuringiensis serovar pakistani Species 0.000 claims description 2
- 241001147766 Bacillus thuringiensis serovar sotto Species 0.000 claims description 2
- 241000178575 Bacillus thuringiensis serovar thompsoni Species 0.000 claims description 2
- 241001050360 Bacillus thuringiensis serovar tochigiensis Species 0.000 claims description 2
- 241001050492 Bacillus thuringiensis serovar tohokuensis Species 0.000 claims description 2
- 241001050362 Bacillus thuringiensis serovar toumanoffi Species 0.000 claims description 2
- 241000508306 Bacillus thuringiensis serovar wuhanensis Species 0.000 claims description 2
- 241001283958 Bacillus thuringiensis serovar yunnanensis Species 0.000 claims description 2
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 claims description 2
- 241001050372 Bacillus thuringiensis serovar indiana Species 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 30
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 42
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 39
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 37
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 33
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 32
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 32
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 30
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 20
- -1 inert carrier Substances 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-4-phosphonooxyhexanedioic acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COC1C(CO)OC(OC(C(O)C(OP(O)(O)=O)C(O)C(O)=O)C(O)=O)C(O)C1O OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 241000256247 Spodoptera exigua Species 0.000 description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 11
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 11
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 11
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 11
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 11
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 10
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 10
- 241000701366 unidentified nuclear polyhedrosis viruses Species 0.000 description 10
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 9
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 8
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 8
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 8
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 8
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 241000257324 Glossina <genus> Species 0.000 description 7
- 241000256248 Spodoptera Species 0.000 description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 7
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 7
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 7
- 241000254173 Coleoptera Species 0.000 description 6
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 6
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 6
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 6
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 6
- RZSCFTDHFNHMOR-UHFFFAOYSA-N n-(2,4-difluorophenyl)-2-[3-(trifluoromethyl)phenoxy]pyridine-3-carboxamide;1,1-dimethyl-3-(4-propan-2-ylphenyl)urea Chemical compound CC(C)C1=CC=C(NC(=O)N(C)C)C=C1.FC1=CC(F)=CC=C1NC(=O)C1=CC=CN=C1OC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 RZSCFTDHFNHMOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 6
- 241000500437 Plutella xylostella Species 0.000 description 5
- 241000209149 Zea Species 0.000 description 5
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 5
- 230000000853 biopesticidal effect Effects 0.000 description 5
- 239000007859 condensation product Substances 0.000 description 5
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 5
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 5
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 5
- PECYZEOJVXMISF-UHFFFAOYSA-N 3-aminoalanine Chemical compound [NH3+]CC(N)C([O-])=O PECYZEOJVXMISF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 4
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 4
- 241000736122 Parastagonospora nodorum Species 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 4
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 4
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 4
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241001367803 Chrysodeixis includens Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000483001 Euproctis chrysorrhoea Species 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000255967 Helicoverpa zea Species 0.000 description 3
- 241001261102 Lobesia Species 0.000 description 3
- 241000555303 Mamestra brassicae Species 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 3
- 241001674048 Phthiraptera Species 0.000 description 3
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 3
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 3
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 3
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 3
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 3
- 238000010410 dusting Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 3
- NQWQIXGTZJXJFG-UHFFFAOYSA-N 1,2-dinitro-1-nitrosoguanidine Chemical compound [O-][N+](=O)NC(=N)N(N=O)[N+]([O-])=O NQWQIXGTZJXJFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241001198492 Anarsia Species 0.000 description 2
- 241000256186 Anopheles <genus> Species 0.000 description 2
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 2
- 235000000832 Ayote Nutrition 0.000 description 2
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 241000193364 Bacillus thuringiensis serovar thuringiensis Species 0.000 description 2
- 101100007616 Bacillus thuringiensis subsp. entomocidus cry1Ib gene Proteins 0.000 description 2
- 101100007615 Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki cry1Ia gene Proteins 0.000 description 2
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 description 2
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 description 2
- 229920002799 BoPET Polymers 0.000 description 2
- 241000219198 Brassica Species 0.000 description 2
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 2
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 2
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 description 2
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 2
- 235000017647 Brassica oleracea var italica Nutrition 0.000 description 2
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 2
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000001817 Cereus hexagonus Species 0.000 description 2
- 240000004244 Cucurbita moschata Species 0.000 description 2
- 235000009854 Cucurbita moschata Nutrition 0.000 description 2
- 235000009804 Cucurbita pepo subsp pepo Nutrition 0.000 description 2
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 description 2
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001466538 Gymnogyps Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000258916 Leptinotarsa decemlineata Species 0.000 description 2
- 235000011430 Malus pumila Nutrition 0.000 description 2
- 244000070406 Malus silvestris Species 0.000 description 2
- 235000015103 Malus silvestris Nutrition 0.000 description 2
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 2
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 2
- 241000257159 Musca domestica Species 0.000 description 2
- 239000005041 Mylar™ Substances 0.000 description 2
- SUZRRICLUFMAQD-UHFFFAOYSA-N N-Methyltaurine Chemical compound CNCCS(O)(=O)=O SUZRRICLUFMAQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N Naphthalene Chemical compound C1=CC=CC2=CC=CC=C21 UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 2
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KAESVJOAVNADME-UHFFFAOYSA-N Pyrrole Chemical compound C=1C=CNC=1 KAESVJOAVNADME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 2
- 241000255993 Trichoplusia ni Species 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical group N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 235000008504 concentrate Nutrition 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 150000002191 fatty alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 description 2
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002816 microbial assay Methods 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 2
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 2
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 2
- 235000015136 pumpkin Nutrition 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 2
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 150000003871 sulfonates Chemical class 0.000 description 2
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 2
- 241000701451 unidentified granulovirus Species 0.000 description 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 2
- 239000004563 wettable powder Substances 0.000 description 2
- OTLLEIBWKHEHGU-TUNUFRSWSA-N (2R,3S,4S,5S)-2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-5-[[(2R,3S,4R,5R)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-4-phosphonooxyhexanedioic acid Chemical compound C([C@H]1O[C@H]([C@@H]([C@@H]1O)O)N1C=2N=CN=C(C=2N=C1)N)O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O[C@H]([C@H](O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](O)C(O)=O)C(O)=O)[C@H](O)[C@H]1O OTLLEIBWKHEHGU-TUNUFRSWSA-N 0.000 description 1
- XUNYDVLIZWUPAW-UHFFFAOYSA-N (4-chlorophenyl) n-(4-methylphenyl)sulfonylcarbamate Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)NC(=O)OC1=CC=C(Cl)C=C1 XUNYDVLIZWUPAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DSSYKIVIOFKYAU-XCBNKYQSSA-N (R)-camphor Chemical compound C1C[C@@]2(C)C(=O)C[C@@H]1C2(C)C DSSYKIVIOFKYAU-XCBNKYQSSA-N 0.000 description 1
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- XILIYVSXLSWUAI-UHFFFAOYSA-N 2-(diethylamino)ethyl n'-phenylcarbamimidothioate;dihydrobromide Chemical compound Br.Br.CCN(CC)CCSC(N)=NC1=CC=CC=C1 XILIYVSXLSWUAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001143309 Acanthoscelides obtectus Species 0.000 description 1
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 1
- 241000589220 Acetobacter Species 0.000 description 1
- 241001351288 Achroia grisella Species 0.000 description 1
- 241001204086 Acleris Species 0.000 description 1
- 241000495828 Acleris gloverana Species 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- 241000175828 Adoxophyes orana Species 0.000 description 1
- 241001524031 Aedes sp. Species 0.000 description 1
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 241000566547 Agrotis ipsilon Species 0.000 description 1
- 241000449794 Alabama argillacea Species 0.000 description 1
- 244000291564 Allium cepa Species 0.000 description 1
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 1
- 241001124203 Alphitobius diaperinus Species 0.000 description 1
- 241001367806 Alsophila pometaria Species 0.000 description 1
- 239000005995 Aluminium silicate Substances 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 241000242266 Amphimallon majalis Species 0.000 description 1
- 241001259789 Amyelois transitella Species 0.000 description 1
- 244000144725 Amygdalus communis Species 0.000 description 1
- 235000011437 Amygdalus communis Nutrition 0.000 description 1
- 244000144730 Amygdalus persica Species 0.000 description 1
- 241000566553 Anagrapha falcifera Species 0.000 description 1
- 241001136525 Anastrepha ludens Species 0.000 description 1
- 241001136527 Anastrepha suspensa Species 0.000 description 1
- 241000554155 Andes Species 0.000 description 1
- 241000625764 Anticarsia gemmatalis Species 0.000 description 1
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 description 1
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 description 1
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 description 1
- 241001002469 Archips Species 0.000 description 1
- 241000557851 Armigeres subalbatus Species 0.000 description 1
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 description 1
- 244000003416 Asparagus officinalis Species 0.000 description 1
- 235000005340 Asparagus officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 241001367049 Autographa Species 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 1
- 241000589151 Azotobacter Species 0.000 description 1
- 241001467606 Bacillariophyceae Species 0.000 description 1
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 1
- 241000193366 Bacillus thuringiensis serovar entomocidus Species 0.000 description 1
- 241001050388 Bacillus thuringiensis serovar shandongiensis Species 0.000 description 1
- 241001490249 Bactrocera oleae Species 0.000 description 1
- 235000017166 Bambusa arundinacea Nutrition 0.000 description 1
- 235000017491 Bambusa tulda Nutrition 0.000 description 1
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000018185 Betula X alpestris Nutrition 0.000 description 1
- 235000018212 Betula X uliginosa Nutrition 0.000 description 1
- 241000219495 Betulaceae Species 0.000 description 1
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 1
- 239000011547 Bouin solution Substances 0.000 description 1
- 241000167854 Bourreria succulenta Species 0.000 description 1
- 235000011331 Brassica Nutrition 0.000 description 1
- 235000003351 Brassica cretica Nutrition 0.000 description 1
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 1
- 235000003343 Brassica rupestris Nutrition 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 241000726760 Cadra cautella Species 0.000 description 1
- 241000257160 Calliphora Species 0.000 description 1
- 241000257163 Calliphora vicina Species 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- 235000012766 Cannabis sativa ssp. sativa var. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 235000012765 Cannabis sativa ssp. sativa var. spontanea Nutrition 0.000 description 1
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M Carbamate Chemical compound NC([O-])=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000255579 Ceratitis capitata Species 0.000 description 1
- 241001098608 Ceratophyllus Species 0.000 description 1
- 241001609899 Ceratophyllus gallinae Species 0.000 description 1
- 241000256128 Chironomus <genus> Species 0.000 description 1
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 description 1
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000196319 Chlorophyceae Species 0.000 description 1
- 239000005944 Chlorpyrifos Substances 0.000 description 1
- 241000255945 Choristoneura Species 0.000 description 1
- 241000206751 Chrysophyceae Species 0.000 description 1
- 241001327638 Cimex lectularius Species 0.000 description 1
- 241000723346 Cinnamomum camphora Species 0.000 description 1
- 244000223760 Cinnamomum zeylanicum Species 0.000 description 1
- 235000005979 Citrus limon Nutrition 0.000 description 1
- 244000131522 Citrus pyriformis Species 0.000 description 1
- 241001672694 Citrus reticulata Species 0.000 description 1
- 240000000560 Citrus x paradisi Species 0.000 description 1
- 235000013162 Cocos nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 244000060011 Cocos nucifera Species 0.000 description 1
- 240000007154 Coffea arabica Species 0.000 description 1
- 241000143939 Colias eurytheme Species 0.000 description 1
- 241001509964 Coptotermes Species 0.000 description 1
- 240000000491 Corchorus aestuans Species 0.000 description 1
- 235000011777 Corchorus aestuans Nutrition 0.000 description 1
- 235000010862 Corchorus capsularis Nutrition 0.000 description 1
- 241000993412 Corcyra cephalonica Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 101710151559 Crystal protein Proteins 0.000 description 1
- 241000490513 Ctenocephalides canis Species 0.000 description 1
- 241000258924 Ctenocephalides felis Species 0.000 description 1
- 241000219112 Cucumis Species 0.000 description 1
- 235000015510 Cucumis melo subsp melo Nutrition 0.000 description 1
- 235000009849 Cucumis sativus Nutrition 0.000 description 1
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 1
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- 241001634817 Cydia Species 0.000 description 1
- 241001635274 Cydia pomonella Species 0.000 description 1
- 241001503766 Cylas formicarius Species 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 241000084475 Delia antiqua Species 0.000 description 1
- 241001609607 Delia platura Species 0.000 description 1
- 241001414892 Delia radicum Species 0.000 description 1
- 241001631715 Dendrolimus Species 0.000 description 1
- 241001012951 Diaphania nitidalis Species 0.000 description 1
- 241000879145 Diatraea grandiosella Species 0.000 description 1
- 241000122106 Diatraea saccharalis Species 0.000 description 1
- 108010082495 Dietary Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000005893 Diflubenzuron Substances 0.000 description 1
- 241000199914 Dinophyceae Species 0.000 description 1
- 229920005682 EO-PO block copolymer Polymers 0.000 description 1
- 241001608224 Ennomos subsignaria Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000661448 Eoreuma loftini Species 0.000 description 1
- 241001555556 Ephestia elutella Species 0.000 description 1
- 241000122098 Ephestia kuehniella Species 0.000 description 1
- 241000462639 Epilachna varivestis Species 0.000 description 1
- 241000473921 Erannis tiliaria Species 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 239000005895 Esfenvalerate Substances 0.000 description 1
- 241000567412 Estigmene acrea Species 0.000 description 1
- PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N Ethyl methanesulfonate Chemical compound CCOS(C)(=O)=O PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000195623 Euglenida Species 0.000 description 1
- 241001201696 Eulia Species 0.000 description 1
- 241001110910 Eupeodes corollae Species 0.000 description 1
- 241000224472 Eustigmatophyceae Species 0.000 description 1
- 244000286663 Ficus elastica Species 0.000 description 1
- 235000016623 Fragaria vesca Nutrition 0.000 description 1
- 240000009088 Fragaria x ananassa Species 0.000 description 1
- 235000011363 Fragaria x ananassa Nutrition 0.000 description 1
- 241000287227 Fringillidae Species 0.000 description 1
- 241000237858 Gastropoda Species 0.000 description 1
- 241000257328 Glossina austeni Species 0.000 description 1
- 241001502121 Glossina brevipalpis Species 0.000 description 1
- 241000932745 Glossina morsitans centralis Species 0.000 description 1
- 241001521257 Glossina morsitans morsitans Species 0.000 description 1
- 241001502124 Glossina tachinoides Species 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 description 1
- 241000256069 Haemagogus <genus> Species 0.000 description 1
- 241000257232 Haematobia irritans Species 0.000 description 1
- 241000206759 Haptophyceae Species 0.000 description 1
- 241001352379 Harrisina Species 0.000 description 1
- 241000208818 Helianthus Species 0.000 description 1
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 1
- 241000256257 Heliothis Species 0.000 description 1
- 241000256244 Heliothis virescens Species 0.000 description 1
- 241000413128 Hemileuca oliviae Species 0.000 description 1
- 241000630740 Homoeosoma electellum Species 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 235000008694 Humulus lupulus Nutrition 0.000 description 1
- 244000025221 Humulus lupulus Species 0.000 description 1
- 241001531327 Hyphantria cunea Species 0.000 description 1
- 241000543830 Hypoderma bovis Species 0.000 description 1
- 241000257174 Hypoderma lineatum Species 0.000 description 1
- 241001497708 Incisitermes immigrans Species 0.000 description 1
- 241000173801 Incisitermes minor Species 0.000 description 1
- 241000256602 Isoptera Species 0.000 description 1
- 240000007049 Juglans regia Species 0.000 description 1
- 235000009496 Juglans regia Nutrition 0.000 description 1
- 241000400431 Keiferia lycopersicella Species 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 1
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 1
- 241001658022 Lambdina fiscellaria fiscellaria Species 0.000 description 1
- 241001658020 Lambdina fiscellaria lugubrosa Species 0.000 description 1
- 241000218652 Larix Species 0.000 description 1
- 235000005590 Larix decidua Nutrition 0.000 description 1
- 240000004322 Lens culinaris Species 0.000 description 1
- 235000014647 Lens culinaris subsp culinaris Nutrition 0.000 description 1
- 241000258915 Leptinotarsa Species 0.000 description 1
- 241001397515 Leptopsylla segnis Species 0.000 description 1
- 241001352367 Leucoma salicis Species 0.000 description 1
- 241000192132 Leuconostoc Species 0.000 description 1
- 241000267752 Leucopis Species 0.000 description 1
- 229920001732 Lignosulfonate Polymers 0.000 description 1
- 235000004431 Linum usitatissimum Nutrition 0.000 description 1
- 240000006240 Linum usitatissimum Species 0.000 description 1
- 241000532832 Listronotus Species 0.000 description 1
- 241001261104 Lobesia botrana Species 0.000 description 1
- 241000193982 Loxostege Species 0.000 description 1
- 241000736227 Lucilia sericata Species 0.000 description 1
- 241000255134 Lutzomyia <genus> Species 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 241000681687 Lycoriella mali Species 0.000 description 1
- 241000721703 Lymantria dispar Species 0.000 description 1
- 241001155765 Macrodactylus Species 0.000 description 1
- 239000005913 Maltodextrin Substances 0.000 description 1
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 description 1
- 241000732113 Mamestra configurata Species 0.000 description 1
- 241000255908 Manduca sexta Species 0.000 description 1
- 241001232130 Maruca testulalis Species 0.000 description 1
- 241001585527 Melanchra Species 0.000 description 1
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N Metaphosphoric acid Chemical compound OP(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005916 Methomyl Substances 0.000 description 1
- 240000005561 Musa balbisiana Species 0.000 description 1
- 241001477931 Mythimna unipuncta Species 0.000 description 1
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002274 Nalgene Polymers 0.000 description 1
- 241000123035 Neotermes connexus Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 241001036422 Nosopsyllus fasciatus Species 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 241000207836 Olea <angiosperm> Species 0.000 description 1
- 241001491877 Operophtera brumata Species 0.000 description 1
- 241001465800 Orgyia Species 0.000 description 1
- 241001465803 Orgyia pseudotsugata Species 0.000 description 1
- 241001147398 Ostrinia nubilalis Species 0.000 description 1
- 241000283898 Ovis Species 0.000 description 1
- 241001585670 Paleacrita Species 0.000 description 1
- 241000255739 Palorus ratzeburgii Species 0.000 description 1
- 240000001090 Papaver somniferum Species 0.000 description 1
- 235000008753 Papaver somniferum Nutrition 0.000 description 1
- 241001300993 Papilio cresphontes Species 0.000 description 1
- 241000497111 Paralobesia viteana Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000721451 Pectinophora gossypiella Species 0.000 description 1
- 241000364057 Peoria Species 0.000 description 1
- 244000025272 Persea americana Species 0.000 description 1
- 235000008673 Persea americana Nutrition 0.000 description 1
- 241000722350 Phlebotomus <genus> Species 0.000 description 1
- 241000257186 Phormia regina Species 0.000 description 1
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 241001190492 Phryganidia californica Species 0.000 description 1
- 241001517955 Phyllonorycter blancardella Species 0.000 description 1
- 235000015334 Phyllostachys viridis Nutrition 0.000 description 1
- 244000082204 Phyllostachys viridis Species 0.000 description 1
- 235000008331 Pinus X rigitaeda Nutrition 0.000 description 1
- 241000018646 Pinus brutia Species 0.000 description 1
- 235000011613 Pinus brutia Nutrition 0.000 description 1
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 1
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 1
- 241000595629 Plodia interpunctella Species 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 229920001214 Polysorbate 60 Polymers 0.000 description 1
- 241000143945 Pontia protodice Species 0.000 description 1
- 241000254101 Popillia japonica Species 0.000 description 1
- 241000219000 Populus Species 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001657916 Proxenus mindara Species 0.000 description 1
- 235000006040 Prunus persica var persica Nutrition 0.000 description 1
- 241000202335 Psathyromyia shannoni Species 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000718000 Pulex irritans Species 0.000 description 1
- 235000014443 Pyrus communis Nutrition 0.000 description 1
- 244000305267 Quercus macrolepis Species 0.000 description 1
- 241001518925 Raphidophyceae Species 0.000 description 1
- 241001509967 Reticulitermes flavipes Species 0.000 description 1
- 241001152954 Reticulitermes hesperus Species 0.000 description 1
- 241000589180 Rhizobium Species 0.000 description 1
- 241000206572 Rhodophyta Species 0.000 description 1
- 241000190932 Rhodopseudomonas Species 0.000 description 1
- 235000004443 Ricinus communis Nutrition 0.000 description 1
- 241001092459 Rubus Species 0.000 description 1
- 235000017848 Rubus fruticosus Nutrition 0.000 description 1
- 240000007651 Rubus glaucus Species 0.000 description 1
- 235000011034 Rubus glaucus Nutrition 0.000 description 1
- 235000009122 Rubus idaeus Nutrition 0.000 description 1
- 241000521279 Sabethes cyaneus Species 0.000 description 1
- 241000004261 Sabulodes Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 1
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 1
- 241000371385 Scathophaga stercoraria Species 0.000 description 1
- 241001351292 Schizura concinna Species 0.000 description 1
- 241000209056 Secale Species 0.000 description 1
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 description 1
- 241000894243 Sericata Species 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 241000258242 Siphonaptera Species 0.000 description 1
- 241000753145 Sitotroga cerealella Species 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 241000736128 Solenopsis invicta Species 0.000 description 1
- 240000003829 Sorghum propinquum Species 0.000 description 1
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 1
- 241001201846 Spilonota ocellana Species 0.000 description 1
- 235000009337 Spinacia oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 244000300264 Spinacia oleracea Species 0.000 description 1
- 240000003949 Sporobolus virginicus Species 0.000 description 1
- 241001494115 Stomoxys calcitrans Species 0.000 description 1
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 1
- ULUAUXLGCMPNKK-UHFFFAOYSA-N Sulfobutanedioic acid Chemical class OC(=O)CC(C(O)=O)S(O)(=O)=O ULUAUXLGCMPNKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001116498 Taxus baccata Species 0.000 description 1
- 241000254109 Tenebrio molitor Species 0.000 description 1
- 241001124191 Tenebrio obscurus Species 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- 235000009470 Theobroma cacao Nutrition 0.000 description 1
- 244000299461 Theobroma cacao Species 0.000 description 1
- 240000007313 Tilia cordata Species 0.000 description 1
- 241000202380 Toxorhynchites amboinensis Species 0.000 description 1
- 241000869417 Trematodes Species 0.000 description 1
- 241000254113 Tribolium castaneum Species 0.000 description 1
- 241000254112 Tribolium confusum Species 0.000 description 1
- 241000255985 Trichoplusia Species 0.000 description 1
- 241000521175 Tripteroides <genus> Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000256856 Vespidae Species 0.000 description 1
- 241000219094 Vitaceae Species 0.000 description 1
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 1
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 1
- 241001143315 Xanthogaleruca luteola Species 0.000 description 1
- 241000589634 Xanthomonas Species 0.000 description 1
- 241000206764 Xanthophyceae Species 0.000 description 1
- 241000353224 Xenopsylla Species 0.000 description 1
- 241000353223 Xenopsylla cheopis Species 0.000 description 1
- 241000482268 Zea mays subsp. mays Species 0.000 description 1
- 241000258236 Zootermopsis angusticollis Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000008055 alkyl aryl sulfonates Chemical class 0.000 description 1
- 150000004996 alkyl benzenes Chemical class 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000020224 almond Nutrition 0.000 description 1
- HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N alpha-acetylene Natural products C#C HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000012211 aluminium silicate Nutrition 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 150000001449 anionic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229960005475 antiinfective agent Drugs 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 235000021405 artificial diet Nutrition 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005667 attractant Substances 0.000 description 1
- 239000011425 bamboo Substances 0.000 description 1
- 235000021015 bananas Nutrition 0.000 description 1
- 229910052788 barium Inorganic materials 0.000 description 1
- DSAJWYNOEDNPEQ-UHFFFAOYSA-N barium atom Chemical compound [Ba] DSAJWYNOEDNPEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229940077388 benzenesulfonate Drugs 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N bis(2-chloroethyl) sulfide Chemical compound ClCCSCCCl QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021029 blackberry Nutrition 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- JIJAYWGYIDJVJI-UHFFFAOYSA-N butyl naphthalene-1-sulfonate Chemical compound C1=CC=C2C(S(=O)(=O)OCCCC)=CC=CC2=C1 JIJAYWGYIDJVJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 235000009120 camo Nutrition 0.000 description 1
- 229960000846 camphor Drugs 0.000 description 1
- 229930008380 camphor Natural products 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 1
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000001734 carboxylic acid salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003093 cationic surfactant Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 235000005607 chanvre indien Nutrition 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000002962 chemical mutagen Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000031902 chemoattractant activity Effects 0.000 description 1
- 235000019693 cherries Nutrition 0.000 description 1
- SBPBAQFWLVIOKP-UHFFFAOYSA-N chlorpyrifos Chemical compound CCOP(=S)(OCC)OC1=NC(Cl)=C(Cl)C=C1Cl SBPBAQFWLVIOKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 235000017803 cinnamon Nutrition 0.000 description 1
- 235000020971 citrus fruits Nutrition 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 235000016213 coffee Nutrition 0.000 description 1
- 235000013353 coffee beverage Nutrition 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000007799 cork Substances 0.000 description 1
- 229910001610 cryolite Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940097362 cyclodextrins Drugs 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 150000005690 diesters Chemical class 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 229940019503 diflubenzuron Drugs 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 1
- 230000035622 drinking Effects 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 239000004495 emulsifiable concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000008393 encapsulating agent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- NYPJDWWKZLNGGM-RPWUZVMVSA-N esfenvalerate Chemical compound C=1C([C@@H](C#N)OC(=O)[C@@H](C(C)C)C=2C=CC(Cl)=CC=2)=CC=CC=1OC1=CC=CC=C1 NYPJDWWKZLNGGM-RPWUZVMVSA-N 0.000 description 1
- BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N ethenylcyclopentane Chemical compound C=CC1CCCC1 BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- NYPJDWWKZLNGGM-UHFFFAOYSA-N fenvalerate Aalpha Natural products C=1C=C(Cl)C=CC=1C(C(C)C)C(=O)OC(C#N)C(C=1)=CC=CC=1OC1=CC=CC=C1 NYPJDWWKZLNGGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 150000002222 fluorine compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 235000021021 grapes Nutrition 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000003630 growth substance Substances 0.000 description 1
- 239000010440 gypsum Substances 0.000 description 1
- 229910052602 gypsum Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002140 halogenating effect Effects 0.000 description 1
- 239000011487 hemp Substances 0.000 description 1
- 238000003919 heteronuclear multiple bond coherence Methods 0.000 description 1
- 239000003906 humectant Substances 0.000 description 1
- 239000010903 husk Substances 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 1
- 239000008274 jelly Substances 0.000 description 1
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical compound O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- 230000007653 larval development Effects 0.000 description 1
- 230000001418 larval effect Effects 0.000 description 1
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 description 1
- 239000000944 linseed oil Substances 0.000 description 1
- 235000021388 linseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 235000014666 liquid concentrate Nutrition 0.000 description 1
- 235000021056 liquid food Nutrition 0.000 description 1
- 150000004668 long chain fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 1
- 229940035034 maltodextrin Drugs 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical class O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 125000001434 methanylylidene group Chemical group [H]C#[*] 0.000 description 1
- UHXUZOCRWCRNSJ-QPJJXVBHSA-N methomyl Chemical compound CNC(=O)O\N=C(/C)SC UHXUZOCRWCRNSJ-QPJJXVBHSA-N 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 125000001570 methylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])[*:2] 0.000 description 1
- 229960002216 methylparaben Drugs 0.000 description 1
- 239000010445 mica Substances 0.000 description 1
- 229910052618 mica group Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011785 micronutrient Substances 0.000 description 1
- 235000013369 micronutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 235000010460 mustard Nutrition 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 150000002790 naphthalenes Chemical class 0.000 description 1
- 125000005609 naphthenate group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 238000012587 nuclear overhauser effect experiment Methods 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000014571 nuts Nutrition 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 229940049964 oleate Drugs 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 150000002888 oleic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000011368 organic material Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010422 painting Methods 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical group 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229910052615 phyllosilicate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 244000000003 plant pathogen Species 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 241000196307 prasinophytes Species 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 1
- PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N pseudouridine Chemical group O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N 0.000 description 1
- 239000002728 pyrethroid Substances 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229940080236 sodium cetyl sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- APSBXTVYXVQYAB-UHFFFAOYSA-M sodium docusate Chemical group [Na+].CCCCC(CC)COC(=O)CC(S([O-])(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC APSBXTVYXVQYAB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940074404 sodium succinate Drugs 0.000 description 1
- ZDQYSKICYIVCPN-UHFFFAOYSA-L sodium succinate (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)CCC([O-])=O ZDQYSKICYIVCPN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- GGHPAKFFUZUEKL-UHFFFAOYSA-M sodium;hexadecyl sulfate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O GGHPAKFFUZUEKL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- NWZBFJYXRGSRGD-UHFFFAOYSA-M sodium;octadecyl sulfate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O NWZBFJYXRGSRGD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004334 sorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000010199 sorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940075582 sorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 1
- IIACRCGMVDHOTQ-UHFFFAOYSA-N sulfamic acid Chemical class NS(O)(=O)=O IIACRCGMVDHOTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000013616 tea Nutrition 0.000 description 1
- BAKXBZPQTXCKRR-UHFFFAOYSA-N thiodicarb Chemical compound CSC(C)=NOC(=O)NSNC(=O)ON=C(C)SC BAKXBZPQTXCKRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940074152 thuringiensin Drugs 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007160 ty medium Substances 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000020234 walnut Nutrition 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
- 210000002268 wool Anatomy 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N47/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid
- A01N47/08—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid the carbon atom having one or more single bonds to nitrogen atoms
- A01N47/28—Ureas or thioureas containing the groups >N—CO—N< or >N—CS—N<
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
- A01N63/22—Bacillus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
- A01N63/22—Bacillus
- A01N63/23—B. thuringiensis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Fertilizers (AREA)
Abstract
1. Mutant szczepu Bacillus, znamienny tym, ze wytwarza sie czynnik wzmacniajacy aktywnosc pestycydowapestycydu zwiazanego z Bacillus, przy czym ilosc czynnika wytwa- rzanego przez mutanta jest co najmniej 2 razy wieksza niz ilosc czynnika wytwarzanego przez odpowiadajacy szczep rodzicielski, zas szczep Bacillus wybrany jest z grupy skladajacej sie z Bacillus licheniformis, Bacillus subtilus i Bacillus thuringiensis. 12. Mutant wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze pestycyd zwiazany z Bacillus obejmu- je przetrwalniki Bacillus thuringiensis. PL PL PL PL PL
Description
1. ZAKRES WYNALAZKU
Wynalazek dotyczy zmutowanego szczepu Bacillus, który wytwarza czynnik wzmacniający aktywność pestycydową pestycydu związanego z Bacillus, pestycydu chemicznego i/lub wirusa o właściwościach pestycydowych, w którym czynnik taki otrzymuje się w większych ilościach lub posiada on wyższą aktywność wzmacniającą w porównaniu ze szczepem macierzystym oraz metod wytwarzania takich zmutowanych szczepów. Wynalazek dotyczy także metod otrzymywania czynnika.
2. PODSTAWA WYNALAZKU
Co roku szkodniki powodują straty milionów dolarów w rolnictwie, leśnictwie i w dziedzinie zdrowia publicznego. Do zwalczania takich szkodników stosowano różne strategie.
Jedną ze strategii jest stosowanie pestycydów chemicznych o szerokim zakresie lub spektrum aktywności. Jednakże, stosowanie pestycydów chemicznych ma różne wady. Szczególnie, z powodu ich szerokiego spektrum aktywności, pestycydy te mogą niszczyć organizmy, które nie są celem działania, takie jak owady pożyteczne i pasożyty destrukcyjnych szkodników. Ponadto, pestycydy chemiczne są często toksyczne dla zwierząt i ludzi. Co więcej, u będących celem szkodników często rozwija się oporność, jeśli powtarzalnie wystawia się je na działanie takich substancji.
Inna strategia obejmuje stosowanie biopestycydów do zwalczania plag owadów, grzybów i chwastów. Biopestycydy są naturalnie występującymi patogenami i/lub substancjami wytwarzanymi przez te patogeny. Zaletą stosowania biopestycydów jest to, że w porównaniu z pestycy4
183 156 darni chemicznymi, są one generalnie mniej szkodliwe dla organizmów, które nie są celem działania i środowiska jako całości.
2.1. Bacillus thuringiensis
Najpowszechniej stosowanym biopestycydem jest BaczY/us thuringiensis. Bacillus thuringiensis jest ruchliwą, Gram-dodatnią bakterią o kształcie pałeczki, która jest szeroko rozpowszechniona w przyrodzie, zwłaszcza w glebie i środowiskach bogatych w owady. Podczas wytwarzania przetrwalników Bacillus thuringiensis wytwarza paraprzetrwalnikowe krystaliczne inkluzje, które są owadobójcze po spożyciu przez podatne larwy owadów z rzędów motyli, muchówek i chrząszczy. Inkluzje mogą różnić się kształtem, liczbą i składem. Składają się one z jednego lub więcej białek związanych endotoksynami delta, których wielkość może pozostawać w zakresie 27-140 kDa. Owadobójcze endotoksyny delta sąna ogół przekształcane przez proteazy w jelicie larwy na mniejsze (skrócone) polipeptydy toksyczne, powodujące uszkodzenie jelita środkowego i, ostatecznie, śmierć owada (Hófte i Whiteley, 1989, Microbiological Reviews 53: 242:255).
Istnieje kilka szczepów Bacillus thuringiensis, które są powszechnie stosowane jako biopestycydy w leśnictwie, rolnictwie i w dziedzinie zdrowia publicznego. Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki i Bacillus thuringiensis subsp. aizawi wytwarzająendotoksyny delta specyficzne wobec motyli. Endotoksynę delta specyficzną wobec chrząszczy wytwarza Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis (Krieg i in., 1988, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 766 203). Ponadto, Bacillus thuringiensis subsp. israelenensis wytwarza endotoksyny delta specyficzne wobec muchówek (Goldberg, 1979, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 166 112).
Opisano również inne szczepy Bacillus thuringiensis specyficzne wobec szkodników należących do muchówek. Ujawniono izolat Bacillus thuringiensis, który jest toksyczny wobec muchówek i motyli (Hodgman i in., 1993,FEMSMicrobiologyLetters 114:17-22). Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym z SDS oczyszczonej krystalicznej endotoksyny delta z tego izolatu ujawniła trzy rodzaje białek, które odpowiadają toksynom CryIA(b), CrylB i CryllA. Ujawniono również izolat Bacillus thuringiensis, który wytwarza aktywny wobec muchówek kryształ złożony z białek o masach cząsteczkowych 140,122,76,72 i 38 kDa (Payne, 1994, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 275 815). Europejski opis patentowy nr 480 762 ujawnia pięć szczepów B.t.,z których każdy jest aktywny wobec szkodników należących do muchówek; każdy z nich posiada także unikalny wzór endotoksyn delta kryształów.
Opisano kilka szczepów Bacillus thuringiensis, które posiadają aktywność pestycydową wobec szkodników innych ni motyle, chrząszcze i muchówki. Ujawniono pięć szczepów Bacillus thuringiensis, które wytwarzają endotoksyny delta toksyczne dla nicieni (Edwards, Payne i Soares, 1988, europejskie zgłoszenie patentowe nr 0 303 426 BI). Ujawniono również szczep PS81F Bacillus thuringiensis, który można stosować do leczenia ludzi i zwierząt będących żywicielami pasożytniczych pierwotniaków (Thompson i Gaertner, 1991, europejskie zgłoszenie patentowe nr 0 461 799 A2). Ujawniono także kilka izolatów Bacillus thuringiensis o aktywności wobec szkodników zjadliwych. Izolaty te wytwarzają kryształy składające się z białek o masach cząsteczkowych w (szerokim) zakresie od 35 kDa do 155 kDa (Pyne, Cannon i Bagley, 1992, zgłoszenie PCT światowego opisu patentowego nr 92/19106. Ujawniono również szczepy Bacillus thuringiensis o aktywności wobec szkodników z rzędu błonkówek (Payne, Kennedy, Randall, Meier i Uick, 1992, europejskie zgłoszenie patentowe nr 0 516 306 A2); o aktywności wobec szkodników z rzędu pluskiwaków (Payne i Cannon, 1993, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 262 159); o aktywności wobec szkodników należących do przywr (Hickle, Sick, Schwab, Narva i Payne, 1993, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 262 399) oraz o aktywności wobec szkodników z rzędu wszy zwierzęcych (Payne i Hickle, 1993, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 273 746). Ponadto ujawniono, że inny szczep Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, WB3 S-16, wyizolowany z wełny po strzyży owiec australijskich, jest toksyczny dla wszy Damalinia ovis, szkodnika z rzędu wszy zwierzęcych (Drummond, Miller i Pinnock, 1992, J. Invert. Path. 60: 102-103).
183 156
Endotoksyny delta kodowane są przez geny ery (białek kryształów), które na ogół zlokalizowane sąw plazmidach. Geny ery podzielono w oparciu o względnąhomologię aminokwasową i specyficzność wobec szkodników na sześć klas i kilka podklas. Główne klasy są specyficzne wobec motyli (cryl); motyli i muchówek (cryll); chrząszczy (eryIII); muchówek (cryIV) (Hófte i Whiteley, 1989, Microbiological Reviews 53: 242-255); chrząszczy i motyli (określane jako geny cryV przez Taylora i in., 1992, Molecular Microbiology 6: 1211-1217) oraz nicieni (określane jako geny cryV i cryVI przez Feitelsona i in., 1992, Bio/Technology 10: 271-275).
Endotoksyny delta wytwarzano metodami rekombinacji DNA. Endotoksyny delta wytwarzane metodami rekombinacji DNA mogą mieć lub nie mieć postaci kryształów.
Wykazano, że niektóre szczepy Bacillus thuringiensis wytwarzają termostabilny pestycydowy analog nukleotydów adenylowych, znany jako egzotoksyna β typu I lub turyngiensyna, która sama ma właściwości pestycydowe (Sebesta i in., w: H.D. Burges (red.), Microbial Control of Pests and Plant Diseases, Academic Press, Nowy Jork, 1980, str. 249-281). Egzotoksynę β typu I stwierdzono w supematantach niektórych hodowli Bacillus thuringiensis. Posiada ona masę cząsteczkową 701 i składa się z adenozyny, glukozy i kwasu alarynowego (Farkas i in., 1977, Coli. Czechosslowak Chem. Comm. 42:909-929; Liithy i in., w: Kurstak (red.) Microbial and Viral Pesticides, Marcel Dekker, Nowy Jork, 1982, str. 35-72). Zakres podatnych gatunków obejmuje, ale nie ogranicza się do Musca domestica, Mamestra configurata Walker, Tetranychus urticae, Drosophila melanogaster i Tetranychus cinnabarinus. Uważa się, że toksyczność egzotoksyny β typu I powodowana jest hamowaniem zależnej od DNA polimerazy DNA poprzez współzawodnictwo z ATP. Wykazano, że egzotoksynę β typu I koduje plazmid ery w pięciu szczepach Bacillus thuringiensis i in., 1990, J. Bacteriol. 172:3172-3179). Stwierdzono, że egzotoksynę β typu I wytwarzają serotyp 1 Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis, serotyop 9 Bacillus thuringiensis subsp. tolworthi i serotyp 10 Bacillus thuringiensis subsp. darmstadiensis.
Opisano inną egzotoksynę β, sklasyfikowaną jako egzotoksynę β typu II (Levinson i in., 1990, J. Bacteriol. 172: 3172-3179). Stwierdzono, że egzotoksynę β typu II wytwarza serotyp 8 abBacillus thuringiensis subsp. morrisoni oraz, że jest ona aktywna wobec Leptinotarsa decemlineata. Struktura egzotoksyny β typu II nie jest w pełni znana, ale znacząco różni się ona od struktury egzotoksyny β typu I pod tym względem, że w miejscu adeniny znajduje się reszta pseudourydyny, w której przyłączenie do pierścienia rybozy znajduje się w pozycji, która w innym wypadku byłaby zajęta przez proton (Levinson w: Hinckle i Finch (red.), Analytical Chemistry of Bacillus thuringiensis, ACS Symposium Series, Waszyngton, D.C., 1990, str. 114-136). Ponadto, wprotonowym widmie NMR występuje tylko jeden sygnał odpowiadający zasadzie nukleozydu (przy 7,95 ppm) i brak jest sygnału anomerycznego protonu typu rybozy (5,78 ppm).
Inne rozpuszczalne w wodzie substancje, które wyizolowano zBacillus thuringiensis, obejmują egzotoksynę alfa, która jest toksyczna dla larw Musca domestica (Luthy, 1980, FEMS Microbiol. Lett. 8: 1-7), egzotoksyny gamma, które są różnymi enzymami, obejmującego lecytynazy, chitynazy i proteazy, których toksyczne wpływy przej awiaj ą się tylko łącznie z egzotoksynami beta i endotoksynami delta (Forsberg i in., 1976, Bacillus thuringiensis: Its effects on Environmental Quality, National Research Council of Canada, NRC Associate Committee on Scientific Criteria for Environmental Quality, Subcommittees on Pesticides and Related Compounds and Biological Phenomena); egzotoksynę sigma, która posiada strukturę podobną do egzotoksyny beta i która również jest aktywna wobec Leptinotarsa decemlineata (Argauer i in., 1991, J. Entomol. Sci. 26: 206-213: oraz anhydroturyngiensynę (Prystas i in., 1975, Coli. Czechosslowak Chem. Comm. 40: 1775).
2.2. ZWITTERMYCYNA
Z Bacillus cereus wyizolowano substancję, która hamuje wzrost patogenu roślinnego Phytophora medicaginis i zmniejsza infekcję lucerny (patrz na przykład opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach 4 877 738 i 4 878 936). Nie ujawniono żadnej innej aktywności. Dla zwittermycyny A ustalono następującą strukturę (He i in., Tet. Lett. 35:2499-2502):
183 156
3. PRZEDMIOT WYNALAZKU
W nauce dąży się do uzyskania wyższej śmiercionośności preparatów B. t. Wykorzystane sposoby obejmowały poszukiwania nowych szczepów o zwiększonej śmiercionośności, próby modyfikowania istniejących szczepów oraz próby zaprojektowania bardziej skutecznych preparatów przez łączenie przetrwalników i kryształów B. t. z nowymi nośnikami pestycydowymi, pestycydami chemicznymi lub czynnikami wzmacniającymi (patrz na przykład opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5 250 515, inhibitor trypsyny). Dlatego też, przedmiotem niniejszego wynalazku jest wzmocnienie aktywności pestycydowej pestycydów. Przedmiotem wynalazku jest również wyizolowanie szczepów, które wytwarzająduże ilości czynnika wzmacniającego.
4. PODSUMOWANIE WYNALAZKU
Wynalazek dotyczy zmutowanego szczepu Bacillus, który wytwarza czynnik wzmacniający aktywność pestycydowąpestycydu związanego z Bacillus, przy czym ilość czynnika wytwarzanego przez mutanta jest wyższa niż ilość czynnika wytwarzanego przez odpowiedni szczep macierzysty. W specyficznym rozwiązaniu, szczep Bacillus wybiera się z grupy składającej się z Bacillus subtilus, Bacillus licheniformis i Bacillus thuringiensis.
Czynnik wytwarzany przez rzeczonego mutanta j est czynnikiem wzmacniaj ącym. Jak zdefiniowano w niniejszym opisie, „czynnik wzmacniający” jest substancją, która nie posiada znaczącej aktywności pestycydowej, np. jej LC50 wynosi (LC50 jest stężeniem substancji wymaganym do zabicia 50% szkodników) powyżej około 3000 gg/g, jak określono w oznaczeniu biologicznym (patrz część 6), ale działa zwiększając aktywność pestycydową pestycydu związanego z Bacillus o przynajmniej około 50% i nie powoduje zahamowania rozwoju larwalnego. Jak stwierdzono w części 2, inne znane w nauce substancje zdolne do wzmacniania aktywności pestycydowej, takie jak endotoksyny delta, inhibitory trypsyny i egzotoksyny, posiadają aktywność pestycydową.
W szczególnym rozwiązaniu, czynnik jest rozpuszczalny w wodzie. Jak zdefiniowano w niniejszym opisie, substancja lub związek jest „rozpuszczalny w wodzie”, jeśli przynajmniej około 1 mg substancji można rozpuścić w 1 ml wody. Czynnik może również wzmacniać aktywność pestycydowąpestycydu chemicznego i/lub wirusa o właściwościach pestycydowych.
Jak zdefiniowano w niniejszym opisie, „pestycydem związanym z Bacillus” jest szczep, przetrwalnik lub substancja Bacillus (np. Bacillus thuringiensis lub Bacillus subtilis), np. białko lub jego fragment posiadający aktywność wobec lub zabijający szkodniki, bądź mikroorganizm zdolny do ekspresji genu Bacillus kodującego białko Bacillus lub jego fragment posiadający aktywność wobec lub zabijający szkodniki (np. endotoksynę delta Bacillus thuringiensis) oraz odpowiedni nośnik (dla przykładów takich nośników patrz część 5.2, infra). Szkodnikiem może być, na przykład, owad, nicień, roztocze lub ślimak. Mikroorganizm zdolny do ekspresji genu Bacillus kodującego białko Bacillus lub jego fragment posiadający aktywność wobec lub zabijający szkodniki zasiedla filosferę (powierzchnię liści roślin) i/lub ryzosferę (glebę otaczającą korzenie roślinne) i/lub środowiska wodne i jest zdolny do uwieńczonego sukcesem współzawodniczenia z określonym środowisku (rośliny uprawne i inne naturalne siedliska owadów) z mikroorganizmami typu dzikiego oraz zapewnia stabilne utrzymywanie i ekspresję genu Bacillus kodującego białko Bacillus lub jego fragment posiadający aktywność wobec lub zabijający szkodniki. Przykłady takich mikroorganizmów obejmują, ale nie ograniczają się do bakterii, np.
183 156 z rodzajów Bacillus, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Sterptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter,Azotobacter,Leuconostoc,Alcaligenes i Clostridiunr, glonów, np. z rodzin Cyanophyceae, Prochlorophyceae, Rhodophyceae, Dinophyceae, Chrysophyceae, Prymnesiophyceae, Xanthophyceae, Raphidophyceae, Bacillariophyceae, Eustigmatophyceae, Cryptophyceae, Euglenophyceae, Prasinophyceae i Chlorophyceae·, oraz grzybów, szczególnie drożdży, np. z rodzajów Saccharomyces, Cryptococus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula i Aureobasidium.
Jak zdefiniowano w niniejszym opisie, „aktywność pestycydowa” określa wysokość aktywności wobec szkodnika mierzoną poprzez zabijanie lub hamowanie wzrostu szkodnika, bądź ochronę rośliny przed zarażeniem szkodnikami.
Wynalazek dotyczy także metody otrzymywania mutanta według niniejszego wynalazku, obejmującej:
(a) traktowanie szczepu Bacillus mutagenem;
(b) hodowlę zmutowanego szczepu Bacillus z etapu (a) w warunkach odpowiednich do selekcji mutanta; i (c) selekcjonowanie mutanta z etapu (b).
Zasadniczo czysty czynnik można otrzymać z mutanta przez:
(a) hodowlę zmutowanego szczepu Bacillus w odpowiednich warunkach;
(b) odzyskanie supemtantu hodowli mutanta z etapu (a); i (c) wyizolowanie czynnika z supemtantu z etapu (b) w celu otrzymania zasadniczo czystego czynnika.
Czynnikowi otrzymanemu z rzeczonego mutanta można nadawać postać kompozycji zawierającej czynnik i nośnik pestycydowy, jak również czynnik i pestycyd związany z Bacillus, pestycyd chemiczny i/lub wirus o właściwościach pestycydowych. Kompozycje te można stosować do zwalczania szkodnika, zmniejszania odporności szkodnika na pestycyd związany z Bacillus poprzez wystawienie szkodnika na działanie kompozycji zawierającej czynnik i pestycydowe dopuszczalny nośnik lub do wzmacniania aktywności pestycydowej pestycydu związanego z Bacillus.
5. KRÓTKI OPIS FIGUR
Figura 1 schematycznie przedstawia ogólną procedurę stosowaną do oczyszczania la.
Figura 2 przedstawia widmo l3C NMR la.
Figura 3 przedstawia widmo protonowe NMR la.
Figura 4 przedstawia wyniki doświadczeń z acetylowaną pochodną la.
6. SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU
Macierzystym szczepem Bacillus może być, na przykład, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis lub Bacillus thuringiensis. Macierzystym Bacillus thuringiensis może być szczep typu dzikiego, który obejmuje, ale nie ogranicza się doBacillus thuringiensis subsp. kurstaki, Bacillus thuringiensis subsp. aizawai, Bacillus thuringiensis subsp. galleriae, Bacillus thuringiensis subsp. entomocidus, Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis, Bacillus thuringiensis subsp. alesti, Bacillus thuringiensis subsp. canadiensis, Bacillus thuringiensis subsp. darmstadiensis, Bacillus thuringiensis subsp. dendrolimus, Bacillus thuringiensis subsp. finitimus, Bacillus thuringiensis subsp. kenyae, Bacillus thuringiensis subsp. morrisoni, Bacillus thuringiensis subsp. subtoxicus, Bacillus thuringiensis subsp. toumanffi, Bacillus thuringiensis subsp. toumanoffi, Bacillus thuringiensis subsp. pondicheriensis, Bacillus thuringiensis subsp. shandongiensis, Bacillus thuringiensis subsp. sotto, Bacillus thuringiensis subsp. nigeriae, Bacillus thuringiensis subsp. yunnanensis, Bacillus thuringiensis subsp. dakota, Bacillus thuringiensis subsp. nidiana, Bacillus thuringiensis subsp. tohokuensis, Bacillus thuringiensis subsp. kumamotoensis, Bacillus thuringiensis subsp. tochigiensis, Bacillus thuringiensis subsp. thompsoni, Bacillus thuringiensis subsp. wuhanensis, Bacillus thuringiensis subsp. kyushuensis, Bacillus thuringiensis subsp. ostriniae, Bacillus thuringiensis subsp. tolworthi, Bacillus thuringiensis subsp. pakistani, Bacillus thuringiensis sdhsp.japonesis, Bacillus thuringiensis subsp. colmeri, Bacillus thuringiensis subsp. pondicheriensis, Bacillus thurin
183 156 giensis subsp. shandogienis, Bacillus thuringiensis subsp. neoleonensis, Bacillus thuringiensis subsp. coreanensis, Bacillus thuringiensis subsp. siło, Bacillus thuringiensis subsp. mexcanensis i Bacillus thuringiensis subsp. israelenensis.
W szczególnym rozwiązaniu, macierzystym szczepem Bacillus thuringiensis jest Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki. W najbardziej specyficznym rozwiązaniu, szczepem macierzystym jest szczep EMCC0086 Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki (zdeponowany w NRRL jako NRRL B-21147). Mutant w jeszcze innym szczególnym rozwiązaniu posiada cechy charakterystyczne EMCC0129, zdeponowanego w NRRL i posiadającego numer dostępu NRRL B-21445 lub cechy charakterystyczne EMCC0130, zdeponowanego w NRRL i posiadającego numer dostępu NRRL B-2144.
6.1. METODY OTRZYMYWANIA MUTANTA
Szczep macierzysty można traktować mutagenem w celu indukcji mutacji. Szczególnie, w metodzie imitowania szczepów Bacillus thuringiensis i selekcjonowania takich mutantów, które są zdolne do wytwarzania zasadniczo większych ilości czynnika, niż ich szczepy macierzyste, szczep macierzysty:
i) traktuje się mutagenem;
ii) traktowane komórki hoduje się w odpowiednim podłożu hodowlanym (np. podłożu NSMP); i iii) selekcjonuje się komórki, które wytwarzają większą ilość czynnika.
W etapie (i) mutagenem może być na przykład chemiczny mutagen N-metylo-N'-nitroN-nitrozoguanidyna, N,N'-dinitro-N'-nitrozoguanidyna lub metanosulfonian etylu, promieniowanie gamma, promieniowanie X i promieniowanie UV.
Komórki selekcjonuje się przez oznaczanie wytwarzania czynnika, na przykład przez elektroforezę kapilarną lub oznaczenie immunologiczne z zastosowaniem przeciwciała skierowanego przeciw czynnikowi.
Można rozważać inną metodę otrzymywania mutantów o wysokiej produktywności według wynalazku, taką jak namnażanie szczepu macierzystego w podłożu płynnym i selekcjonowanie spontanicznych mutantów po wysianiu hodowli bulionowej na podłożu agarowym odpowiednim do selekcji mutantów.
Można rozważać inne metody przeszukiwania pod kątem mutantów o wysokiej produktywności według wynalazku, takie jak oddzielenie mutantów od innego materiału w oparciu o różnice mas, bezpośrednio przez wirowanie lub innymi sposobami rozdzielania pod względem masy.
6.2. OTRZYMYWANIE CZYNNIKA
Mutanty Bacillus według niniejszego wynalazku można hodować stosując podłoża i techniki hodowlane znane w tej dziedzinie (patrz, na przykład, Rogoff i in., 1969, J. Invertebrate Path. 14:122-129; Dulmage i in., w: Microbial Control of Pests and Plant Diseases, H.D. Burges, red., Academic Press, N.Y., 1980). W szczególnym rozwiązaniu podłoża fermentacyjne mogą zawierać zhydrolizowane białko, zhydrolizowany węglowodan, sole i metale śladowe. Podłoża fermentacyjne mogą także ewentualnie zawierać jeden lub więcej aminokwasów. Po zakończeniu cyklu fermentacyjnego, supematant można odzyskać przez oddzielenie przetrwalników i kryształów B.t. od brzeczki fermentacyjnej sposobami dobrze znanymi w tej dziedzinie, na przykład przez wirowanie i/lub ultrafiltrację. Czynnik zawarty jest w supematancie, który można odzyskać sposobami dobrze znanymi w tej dziedzinie, np. przez ultrafiltrację, odparowanie i suszenie rozpyłowe. Procedurę opisano bardziej szczegółowo w poniższych częściach.
Oczyszczanie czynnika można przeprowadzić stosując różne procedury znane w nauce, obejmujące, ale nie ograniczone do chromatografii (np. jonowymiennej, powinowactwa i sączenia molekularnego), procedur elektroforetycznych, różnicowej rozpuszczalności, ekstrakcji lub jakiejkolwiek innej standardowej techniki znanej w nauce.
Wzmacniającą aktywność czynnika na aktywność pestycydową pestycydu związanego z Bacillus, wirusa posiadającego aktywność pestycydową lub pestycydu chemicznego, wobec różnych szkodników można oznaczać stosując procedury znane w nauce, takie jak wprowadzanie
183 156 sztucznej diety dla owadów, pokrywanie sztuczną dietą, malowanie liści, zanurzanie liści i spryskiwanie listowia. Szczegółowe przykłady takich oznaczeń podano w części 7 infra. Ilość wytwarzanego czynnika można ocenić ilościowo przez, na przykład, elektroforezę kapilarną.
Czynnik może mieć masę cząsteczkową od około 350 do około 1200 lub, w szczególnym rozwiązaniu, od około 350 do około 700.
Czynnik wzmacnia aktywność pestycydową pestycydu związanego z Bacillus przynajmniej około 1,5 raza do nawet około 1000 razy, korzystnie od około 100 razy do około 400 razy. W szczególnym rozwiązaniu czynnik wzmacnia aktywność pestycydową białka endotoksyny delta Bacillus thuringiensis, obejmującej, ale nie ograniczonej do Cryl (obejmującej, ale nie ograniczonej do CrylA, CrylB i CrylC), Cryll, Crylll, CryIV, CryV lub CryVI w postaci o pełnej długości lub postaci proteolitycznie zmodyfikowanej, skróconej od około 1,5 raza do około 1000 razy. W najbardziej specyficznym rozwiązaniu, czynnik wzmacnia endotoksynę delta B.t. od około 100 razy do 400 razy. Czynnik może również wzmacniać aktywność pestycydową pestycydu chemicznego i/lub wirusa o właściwościach pestycydowych.
Czynnik może również być rozpuszczalny w wodzie, stabilny w wodzie do temperatury około 100°C w ciągu przynajmniej 5 minut, stabilny przy poddawaniu bezpośredniemu działaniu światła słonecznego w ciągu przynajmniej około 10 godzin i/lub stabilny w pH około 2 w ciągu około 10 dni. Czynnik może posiadać 13 atomów węgla. Ponadto, czynnik może posiadać w widmie *H NMR przesunięcia przy około δ 1,5, 3,22, 3,29, 3,35, 3,43, 3,58, 3,73, 3,98,4,07, 4,15, 4,25,4,35 i w widmie 13C przesunięcia przy około 31,6, 37,2, 51,1, 53,3,54,0, 54,4, 61,5,61,6, 64,1,65,6, 158,3, 170,7 i 171,3.
W najbardziej specyficznym rozwiązaniu rzeczony czynnik posiada strukturę la lub jego soli. Sól powinna być zdolna do wzmacniania pestycydu związanego z Bacillus.
6.3. KOMPOZYCJE ZAWIERAJĄCE CZYNNIK
Kompozycję(e) pestycydową(e), to jest na przykład zawiesinę, roztwór, emulsję, proszek do opylania, granulki dyspergowalne, proszek zwilżalny, koncentrat emulgujący, aerozol lub impregnowane granulki można tworzyć z samego czynnika otrzymanego z mutantów według niniejszego wynalazku; z pestycydem związanym z Bacillus, którym jak zdefiniowano supra, jest szczep Bacillus, przetrwalnik, białko lub jego fragment, lub inna substancja pochodząca z nich o aktywności wobec owadów lub zabijająca szkodniki, lub chroniąca rośliny przed szkodnikiem; z pestycydem chemicznym i/lub wirusem patogennym wobec owadów oraz dopuszczalnym nośnikiem. Przykłady takich szczepów Bacillus obejmują, ale nie ograniczają się do Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki (sprzedawany jako DIPEL™ przez Abbot Laboratories, Inc., JAVELIN™ przez Sandoz, BIOBIT™ przez Novo Nordisk A/S, FORAY™ przez Novo Nordisk A/S, BIOCOT™ przez Novo Nordisk A/S, MVP™ przez Mycogen, BACTOSPEINE™ przez Novo Nordisk A/S i THURICIDE™ przez Sandoz); Bacillus thuringiensis subsp. aizawai (sprzedawany jako FLORBAC™ przez Novo Nordisk A/S i XENTARI™ przez Abbott Laboratories, Inc.); Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis (sprzedawany jako NOVODOR™ przez Novo Nordisk A/S, TRIDENT™ przez Sandoz, M-TRAK™ i M-ONE™ przez Mycogen i DITERRA™ przez Abbott Laboratories, Inc.); Bacillus thuringiensis subsp. israelensis (sprzedawany jako BACTIMOS™ albo SKEETAL™ przez Novo Nordisk A/S, TEKNAR™ przez Sandoz i VECTOBAC™ przez Abbott Laboratories, Inc.); Bacillus thuringiensis kurstaki/tenebrionis (sprzedawany jako FOIL™ przez Ecogen); Bacillus thuringiensis kurstaki/aizawi (sprzedawany jako CONDOR™ przez Ecogen i AGREE™ przez Ciba-Geigy) oraz Bacillus thu
183 156 ringiensis kurstaki/kurstaki (sprzedawany jako CUTLASS™ przez Ecogen). Związane z Bacillus białko można wybrać z grupy obejmującej, ale nie ograniczonej do Cryl, Cryll, Crylll, CryIV, CryV i CryVI. Pestycydem chemicznym może być, na przykład, regulator wzrostu owadów, taki jak diflubenzuron, karbaminian, taki jak tiodikarb i metomyl, preparat fosforoorganiczny, taki jak chlorpyrifos, piretroid, taki jak cypermetrin i walerianian esfenu, nieorganiczny związek fluoru, taki jak kriolit oraz pirol. Wirusem patogennym wobec owadów może być bakulowirus, np. wirus jądrowej poliedrozy (NPV) Autographa califomica, NPV Syngrapha falcifera, GV (wirus granulozy) Cydia pomonella, NPV Heliothis zea, NPV Lymantria dispar, NPV Orgyia pseudotsugata, NPV Spodoptera exigua, NP V Neodipron lecontei, NPV Neodipron sertifer, NPV Harrisina brillians i NPV Clemens Endopiza viteana.
W kompozycjach zawierających substancję i pestycyd związany z Bacillus, substancja może występować w ilości co najmniej około 0,1 g/BIU lub 0,05 g czynnika na g endotoksyny delta i przetrwalników Bacillus, ewentualnie do około 300 g BIU lub 150 g substancji na g endotoksyny delta i przetrwalników Bacillus, korzystnie 2 g/BIU lub 1 g substancji na g endotoksyny delta i przetrwalników Bacillus. Jak zdefiniowano w niniejszym opisie, “BIU” jest to miliard jednostek międzynarodowych określanych w oznaczeniu biologicznym. W oznaczeniu biologicznym porównuje się próbkę ze standardowym materiałem odniesienia Bacillus, jako standardowego owada testowego stosując Trichoplusia ni lub innego szkodnika. Siłę działania określa się przez podzielenie LC50 materiału odniesienia, następnie mnożąc przez siłę działania standardu odniesienia.
W innym rozwiązaniu, kompozycja może zawierać czynnik w zasadniczo czystej postaci lub supematant pochodzący z hodowli Bacillus w suchej, zatężonej lub płynnej postaci oraz pestycydowe dopuszczalny nośnik, którego przykłady ujawniono infra. Kompozycję tę można stosować odrębnie na roślinę, np. rośliny transgeniczne. W szczególności, kompozycję można stosować na roślinę wcześniej zawierającą i eksprymującągen Bacillus thuringiensis. W innym rozwiązaniu, kompozycję można stosować na roślinę wcześniej wystawioną na działanie kompozycji Bacillus thuringiensis. W innym rozwiązaniu, kompozycję można stosować w innych środowiskach szkodliwych muchówek, np. w wodzie lub glebie. Substancja występuje w kompozycji w stężeniu od około 0,001% do około 60% (w/w).
Kompozycję zawierającą substancję i pestycydowo dopuszczalny nośnik, poza zwalczaniem szkodnika, można również stosować do obniżania odporności szkodnika na pestycyd. Alternatywnie, kompozycję można również stosować do wzmacniania pestycydu związanego z Bacillus. W jednym rozwiązaniu, kompozycję można stosować w tym samym czasie, co pestycyd, w ilości co najmniej około 2 g substancji/BIU do ewentualnie około 300 g substancji/ BIU. W innym rozwiązaniu, kompozycję można stosować do około 24 godzin po pestycydzie, jako adiuwant dla zwiększenia skuteczności pozostałego pestycydu.
Takie ujawnione powyżej kompozycje można otrzymać przez dodanie czynnika powierzchniowo czynnego, obojętnego nośnika, środka konserwującego, środka pochłaniającego wilgoć, środka pobudzającego żerowanie, środka wabiącego, czynnika kapsułkującego, lepiszcza, emulgatora, barwnika, czynnika zabezpieczającego przed UV, buforu, środka poprawiającego płynność lub innego składnika dla manipulowania i stosowania produktu wobec konkretnych szkodników docelowych.
Odpowiednie czynniki powierzchniowo czynne obejmują związki anionowe, takie jak sole kwasów karboksylowych, na przykład sól długolańcuchowego kwasu tłuszczowego z metalem; N-acylosarkozynian; mono- lub diestry kwasu fosforowego z etoksylanami alkoholi tłuszczowych lub sole takich estrów; siarczany alkoholi tłuszczowych, takie jak siarczan sodowy dodecylu, siarczan sodowy oktadecylu lub siarczan sodowy cetylu; siarczany etoksylowanych alkoholi tłuszczowych; siarczany etoksylowanych alkilofenoli; sulfoniany ligniny; sulfoniany naftowe; sulfoniany alkiloarylowe, takie jak sulfonian alkilobenzenowy lub sulfoniany alkilonaftalenu o krótkim łańcuchu alkilowym, np. sulfonian butylonafłalenu; sole sulfonowanych produktów kondensacji naftalenu z formaldehydem; sole sulfonowanych produktów kondensacji naftalenu z formaldehydem, sole sulfonowanych produktów kondensacji fenolu z formaldehydem lub bar
183 156 dziej złożone sulfoniany, takie jak amidosulfoniany, np. sulfonowany produkt kondensacji kwasu oleinowego i N-metylotauryny lub sulfobursztyniany dialkilowe, np. sulfonian sodowy bursztynianu dioktylowego. Czynniki niejonowe obejmują produkty kondensacji estrów kwasów tłuszczowych, alkoholi tłuszczowych, amidów kwasów tłuszczowych lub fenoli podstawionych tłuszczową grupą alkilową lub alkenylową z tlenkiem etylenu, estry kwasów tłuszczowych i polihydroksylowych alkoholoeterów, np. estry kwasów tłuszczowych i sorbitanu, produkty kondensacji takich estrów z tlenkiem etylenu, np. estry kwasów tłuszczowych i polioksyetylenosorbitanu, kopolimery blokowe tlenku etylenu i tlenku propylenu, glikole acetylenowe, takie jak 2,4,7,9-tetraetylo-5-decyno-4,7-diol lub etoksylowane glikole acetylenowe. Przykłady kationowych czynników powierzchniowo czynnych obejmują, na przykład, alifatyczną mono-, dilub poliaminę, takąjak octan, naftenian lub oleinian; aminę zawierającą tlen, takąjak tlenek aminy polioksyetylenowanej alkiloaminy; aminę z wiązaniem amidowym przygotowanąprzez kondensację kwasu karboksylowego z di- lub poliaminą, bądź czwartorzędową sól amonową.
Przykłady obojętnych materiałów obejmują mineralne substancje nieorganiczne, takie jak kaolin, mika, gips, nawóz sztuczny, filokrzemiany, węglany, siarczany lub fosforany; materiały organiczne, takie jak cukier, skrobie lub cyklodekstryny; lub materiały botaniczne, takie jak produkty z drewna, korek, sproszkowane kaczany kukurydzy, łuski ryżu, łupiny orzechów ziemnych i łupiny orzechów włoskich.
Kompozycje według niniejszego wynalazku mogą mieć postać odpowiednią do bezpośredniego stosowania lub koncentracji bądź pierwotnej kompozycji, która przed zastosowaniem wymaga rozcieńczenia odpowiednią ilością wody lub innego rozcieńczalnika. Stężenie pestycydu będzie różne w zależności od charakteru konkretnej postaci, szczególnie od tego, czy jest ona koncentratem, czy jest przeznaczona do bezpośredniego stosowania. Kompozycja zawiera 1 do 98% stałego lub płynnego obojętnego nośnika i od 0 do 50%, korzystnie od 0,1 do 50% środka powierzchniowo czynnego. Kompozycje te będą stosowane w ilości określonej dla produktu komercyjnego, korzystnie od około 0,01 funta do 5 funtów na akr, jeśli są w postaci stałej i od około 0,01 pinta do 25 pint na akr, jeśli mają postać płynną.
W dalszym rozwiązaniu, krystalicznąendotoksynę delta Bacillus thuringiensiis i/lub czynnik można, przed utworzeniem z nich preparatu, poddawać działaniu maj ącemu na celu wydłużenie aktywności pestycydowej po zastosowaniu w środowisku docelowego szkodnika, pod warunkiem, że to działanie wstępne nie wywiera ujemnego wpływu na właściwości kompozycji. Przykłady odczynników chemicznych obejmują, ale nie ograniczają się do czynników chlorowcujących, aldehydów, takich jak formaldehyd i glutaraldehyd; przeciwinfekcyjnych, takich jak chlorek zefirami; alkoholi, takich jak izopropanol i etanol; oraz utrwalaczy histologicznych, takich jak utrwalacz Bouina i utrwalacz Heli/ego (patrz, na przykład, Humason, Animal Tissue Techniques, W.H. Freeman and Co., 1967).
Kompozycje według wynalazku można stosować bezpośrednio na rośliny przez, na przykład, rozpylanie lub opylanie, w czasie, gdy szkodnik zaczyna pojawiać się na roślinie lub ochronie przed pojawieniem się szkodników. Rośliny, które mogąbyć chronione według niniejszego wynalazku obejmują, ale nie ograniczają się do zbóż (pszenicy, jęczmienia, żyta, owsa, ryżu, sorgo i zbliżonych roślin uprawnych), buraków (buraka cukrowego i buraka pastewnego), pestkowców, drzew jabłkowatych i owoców miękkich (jabłoni, gruszy, śliw, brzoskiwni, migdałowców, wiśni, truskawek, malin i jeżyn), roślin strączkowych (lucerny, fasoli, soczewicy, grochu, soi), roślin oleistych (rzepaku, gorczycy, maku, oliwek, słoneczników, palm kokosowych, rącznika, kakaowców, orzechów ziemnych), dyniowatych (ogórków, dyni, melonów), roślin włóknistych (bawełny, lnu, konopi, juty), owoców cytrusowych (pomarańczy, cytryn, grejpfrutów, mandarynek), warzyw (szpinaku, sałaty, szparagów, kapusty i innych kapustnych, marchwi, cebuli, pomidorów, ziemniaków), warzywnowatych (awokado, cynamonowca, kamforowca), drzew liściastych i iglastych (lip, cisów, dębów, olszy, topoli, brzóz, jodeł, modrzewi, sosen) lub takich roślin jak kukurydza, rośliny darniowe, tytoń, orzechy, kawa, trzcina cukrowa, herbata, winorośl, chmiel, banany i rośliny kauczukowe, jak również rośliny ozdobne. Kompozycje można stosować na liście, do bruzd, w postaci granulek do rozsiewania rzutowego, „bocznicowo” lub
183 156 przez drenaż gleby. Ogólnie rzecz biorąc ważne jest uzyskanie skutecznego zwalczania szkodników na wczesnych etapach wzrostu roślin, ponieważ jest to czas, w którym rośliny mogą ulec najsilniejszym uszkodzeniom. Jeżeli uważa się to za konieczne, dogodne może być, aby substancja do rozpylania lub opylania zawierała inny pestycyd. W korzystnym rozwiązaniu, kompozycję według wynalazku stosuje się bezpośrednio na roślinę.
Kompozycję według niniejszego wynalazku można również stosować bezpośrednio do stawów, jezior, strumieni, rzek, wód stojących i innych obszarów zagrożonych plagą szkodliwych muchówek, a zwłaszcza szkodnikami mającymi związek ze zdrowiem publicznym. Kompozycję można stosować przez rozpylanie, opylanie, zraszanie lub podobne.
Kompozycje według niniejszego wynalazku mogą być skuteczne wobec szkodliwych owadów z rzędu motyli, np. Achroia grisella, Acleris gloverana, Acleris yariana, Adoxophyes orana, Agrotis ipsilon, Alabama argillacea, Alsophila pometaria, Amyelois transitella, Anagasta kuehniella, Anarsia lineatella, Anisota senatoria, Antheraeapernyi, Anticarsia gemmatalis, Archips sp., Argyrotaeniasp., Athetis mindara, Bombyxmori, Bacculatrix thurberiella, Cadra cautella, Choristoneura sp., Cichylis hospes, Colias eurytheme, Corcyra cephalonica, Cydia latiferreanus, Cydiapomonella, Datana integerrima, Dendrolimus sibericus, Desmia funeralis, Diaphania hyalineata, Diaphanianitidalis, Diatraea grandiosella, Diatraea saccharalis, Ennomos subsignaria, Eoreuma loftini, Ephestia elutella, Erannis tiliaria, Estigmene acrea, Eulia salubricola, Eupoeclia ambiguella, Euproctis chrysorrhoea, Euxoa messoria, Galleria mellonella, Grapholita molesta, Harrisina americana, Helicoyerpa subflexa, Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Hemileuca oliviae, Homoeosoma electellum, Hyphantria cunea, Keiferia lycopersicella, Lambdina fiscellaria fiscellaria, Lambdina fiscellaria lugubrosa, Leucoma salicis, Lobesia botrana, Loxostege sticticalis, Lymantria dispar, Macalla thyrsisalis, Malacosoma sp., Mamestra brassicae, Mamestra configurata, Manduca quinquemaculata, Manduca sexta, Maruca testulalis, Melanchra pieta, Operophtera brumata, Orgyia sp., Ostrinia nubilalis, Paleacrita yernata, Papilio cresphontes, Pectinophora gossypiella, Phryganidia californica, Phyllonorycter blancardella, Pieris napi, Pieris rapae, Plathypena scabra, Platynotaflouendana, Platynota sułtana, Platyptilia carduidactyla, Plodia interpunctella, Plutella xylostella, Pontia protodice, Pseudaletia unipuncta, Pseudoplusia includens, Sabulodes aegrotata, Schizura concinna, Sitotroga cerealella, Spilonota ocellana, Spodopterasp., Thaumstopoeapityocampa, Tineolabisselliella, Trichoplusia ni, Udea rubigalis, Xylomyges curialis, Yponomeuta padella; rzędu muchówek, np. Aedes sp., Andes yittatus, Anastrepha ludens, Anastrepha suspensa, Anopheles barberi, Anopheles guadrimaculatus, Armigeres subalbatus, Calliphora stygian, Calliphora vicina, Ceratitis capitata, Chironomus tentans, Chrysomya rufifacies, Cochliomyia macellaria, Culexsp., Culiseta inornata, Dacus oleae, Delia antiqua, Deliaplatura, Delia radicum, Drosophila melanogaster, Eupeodes corollae, Glossina austeni, Glossina brevipalpis, Glossina fiiscipes, Glossina morsitans centralis, Glossina morsitans morsitans, Glossina morsitans submorsitans, Glossina pallidipes, Glossina palpalis gambiensis, Glossina palpalis palpalis, Glossina tachinoides, Haemagogus eguinus, Haematobia irritans, Hypoderma bovis, Hypoderma lineatum, Leucopis ninae, Lucilla cuprina, Lucilla sericata, Lutzomyia longlpaipis, Lutzomyia shannoni, Lycoriella mali, Mayetiola destructor, Musca autumnalis, Musca domestica, Neobellieria sp., Nephrotoma suturalis, Ophyra aenescens, Phaenicia sericata, Phlebotomus sp., Phormia regina, Sabethes cyaneus, Sacrophaga bullata, Scatophaga stercoraria, Stomoxys calcitrans, Toxorhynchites amboinensis, Tripteroides bambusa. Jednakże, kompozycje według wynalazku mogą również być aktywne wobec szkodliwych owadów z rzędu chrząszczy, np. Leptinotarsa sp., Acanthoscelides obtectus, Callosobrunchus chinensis, Epilachna varivestis, Pyrrhalta luteola, Cylas formicarius elegantulus, Listronotus oregonensis, Sitophilus sp., Cyclocephala borealis, Cyclocephala immaculata, Macrodactylus subspinosus, Popilliajaponica, Rhizotrogus majalis, Alphitobius diaperinus, Palorus ratzeburgi, Tenebrio molitor, Tenebrio obscurus, Tribolium castaneum, Tribolium confusum, Tribolius destructor, roztoczy, np. Oligonychuspratensis, Panonychus ulmi, Tetranychus urticae·, błonkówek, np. Iridomyrmex humilis, Solenopsis invicta; termitów, np. Reticulitermes hesperus, Reticulitermesflavipes, Coptotermes
183 156 formosanus, Zootermopsis angusticollis, Neotermes connexus, Incisitermes minor, Incisitermes immigrans; pcheł, np. Ceratophyllus gallinae, Ceratophyllus niger, Nosopsyllus fasciatus, Leptopsylla segnis, Ctenocephalides canis, Ctenocephalides felis, Echicnophaga gallinacea, Pulex irritans, Xenopsylla cheopis, Xenopsylla vexabilis, Tunga penetrans oraz nicieni z rodziny węgorkowatych, np. Melodidogyne incognito, Pratylenchus penetrans.
Poniższe przykłady przedstawiono w celu ilustracji, ale nie ograniczania.
7. PRZYKŁAD: CHARAKTERYSTYKA la
Jak to wyszczególniono w niniejszym opisie, la odzyskuje się i oczyszcza. Charakterystykę la przedstawiono szczegółowo infra.
7.1. ODZYSKIWANIE I OCZYSZCZANIE la
Fermentację szczepu EMCC0086 B. thuringiensis subsp. kurstaki (zdeponowanego w NRRL jako B-21147) prowadzi się w ciągu 72 godzin w temperaturze 30°C w podłożu składającym się ze źródła węgla, takiego jak skrobia, hydrolizat skrobiowy lub glukoza i źródła azotu, takiego jak białko, hydrolizat białkowy namok kukurydziany. Wytwarzanie la wykrywa się w 13 godzinie fermentacji. Najwyższą aktywność stwierdza się w około 30 godzinie.
Supematant z fermentacji B. thuringiensis subsp. kurstaki odzyskuje się przez wirowanie, a następnie klaruje przez ultrafiltrację przez membranę MW-CO o przepuszczalności do 30 kDa, stosując w tym celu układ UF Rhone Poulenc. Filtracja przez membrany o przepuszczalności do 30 kDa prowadziła do usunięcia pozostałych szczątków komórek, krystalicznej delta-endotoksyny, przetrwalników i białek rozpuszczalnych o masie cząsteczkowej wyższej niż 30 kDa. Przesącz zagęszcza się 10-krotnie przez odparowanie. Przesącz wiruje się, a następnie filtruje przez membranę o średnicy porów 0,2 μ w celu dalszego usunięcia nierozpuszczalnych składników brzeczki, otrzymując klarowną brzeczkę zawierającą la.
Oczyszczanie la do homogenności uzyskuje się stosując wieloetapową procedurę oczyszczania przedstawioną schematycznie na figurze 1. W odniesieniu do procesu otrzymywania opisanego powyżej, oczyszczanie prowadzono z etapem ultrafiltracji przez membranę o przepuszczalności do 5 kDa. Przesącz otrzymany w wyniku ultrafiltracji przez membranę o przepuszczalności do 5 kDa adsorbuje się na złożu kationowymiennym Sulphopropyl (SP) i eluuje roztworem octanu amonu. Związek zagęszcza się następnie około 30-krotnie przez liofilizację, a sól i inne zanieczyszczenia usuwa się stosując kolumnę do sączenia molekularnego P2 BioRad. Połączone frakcje z kolumny P2 rozdziela się na kolumnie SP HPLC do wysokorozdzielczej chromatografii kationowymiennej, co prowadzi do uzyskania homogennego związku. Zanieczyszczającą sól usuwa się przez powtarzalną liofilizację.
Aktywność mierzy się stosując mikrooznaczanie biologiczne wykorzystując Spodoptera exigua, a czystość oznacza się przez elektroforezę kapilarną. Próbki zawierające 50 μΐ la i 50 μΐ białka CrylA(c) (15 μg/ml) oczyszczonego z BIOBIT™ FC (100 μΐ) nanosi się do pojedynczych studzienek w galaretowatej podstawce zawierających 500 μΐ zestalonej, sztucznej diety dla owada. Podstawki zawierające różne próbki suszy się na powietrzu. Do studzienek zawierających wysuszone próbki dodaje się dwa do czterech owadów Spodoptera exigua w fazie drugiej lub wczesnej trzeciej wylinki. Studzienki zamyka się stosując mylar z otworami i inkubuje w ciągu 2-3 dni w temperaturze 30°C. Następnie rejestruje się stopień zahamowania rozwoju oraz procent śmiertelności. Zazwyczaj prowadzi się 5 powtórzeń identycznych studzienek dla każdej próbki.
7.2. OKREŚLENIE STRUKTURY
Stwierdzono, że aktywny związek jest rozpuszczalny w wodzie, a nierozpuszczalny w rozpuszczalnikach organicznych. Jest on dodatnio naładowany i reaguje z ninhydryną, co udowodniono stosując chromatografię cienkowarstwową na krzemionce. NMR 13C i protonowy związek przedstawiono odpowiednio na figurach 2 i 3. Badania 13C NMR wykazały obecność 13 atomów węgla (odnoszące się do kwasu 3-(trimetylosililopropionowego). Doświadczenie DEPT wykazało, że w związku tym występują trzy czwartorzędowe atomy węgla (C), siedem grup metinowych (CH), trzy grupy metylenowe (CH2) i żadnej grupy metylowej (CH3). Stosując doświadczenia odsprzęgania protonów, takie jak odsprzęganie 1-D i COSY, zidentyfikowano jeden
183 156 duży układ spinowy zawierający osiem atomów węgla. Ponadto, obecny jest mniejszy układ spinowy zawierający dwa atomy węgla. Eksperyment korelacyjny węglowo-protonowy (HMBC) umożliwił 'wyznaczenie rezonansu każdego protonu w cząsteczce do związanego z nim atomu węgla.
W wyniku traktowania aktywnego związku (13 mg) bewodnikiem octowym w pirydynie powstaje acetylowana pochodna, która jest znacznie mniej polarna. Pochodną tę oczyszczono przez HPLC, uzyskując 3 mg czystej zacetylowanej pochodnej. Analiza z wykorzystaniem spektroskopii masowej wykazała, że pochodna ta posiada 7 grup acetylowych i masę cząsteczkową 690, co daje masę cząsteczkową aktywnego związku 396 i wskazuje, że obecna jest parzysta liczba atomów azotu. Wykryto również fragmenty zawierające 6 grup acetylowych i 5 grup acetylowych. Dane o wysokiej rozdzielczości dla jonów potomnych zawierających 5 i 6 grup acetylowych wynoszą645,2594 (6 grup acetylowych) i 607,2519 (5 grup acetylowych), co wskazuje na następujący wzór cząsteczkowy la: C13H28N6O8.
Działanie na aktywny związek (13 mg) 6 N HC1 prowadzi do wytworzenia pochodnej dającej dodatnią reakcję z ninhydryną. Wyniki te wskazująna obecność wiązań amidowych. Pochodna ma taką samą wartość Rf, jaką wyznaczono przez chromatografię cienkowarstwową dla kwasu 2,3-diaminopropionowego. Wyniki te wraz z danymi NMR sugerują obecność kwasu 2,3 -diaminopropionowego.
Inną techniką wykorzystywaną do analizy la jest nOe (jądrowy efekt Overhausera), dzięki której można wyznaczyć wzajemną bliskość protonów w przestrzeni. nOe zastosowano wobec zacetylowanej pochodnej la. W dwukierunkowym doświadczeniu nOe (NOES Y), nOe obserwuje się pomiędzy protonem N-H przy 8,06 ppm i protonem 5,17 (figura 4).
Ustalono następującą strukturę la:
Związek ten można zaliczyć do ureidoamidów. Jego składniki obejmują2 grupy amidowe, mocznik, dwie aminy i pięć grup hydroksylowych. Zawiera on siedem centrów chirałnych.
7.3. WŁAŚCIWOŚCI la
Stwierdzono, że wyizolowany la wzmacnia aktywność białek pestycydowych krystalicznej delta-endotoksyny5ć7cz7/us thuringiensis subsp. kurstaki'}. Bacillus thuringiensis subsp. aizawi wobec Spodoptera exigua bez względu na postać białek pestycydowych. Wzmacniana jest aktywność pestycydowa preparatów B. t. k., wyizolowanych kryształów i białek CrylA o pełnej długości (masa cząsteczkowa 130 kDa) lub skróconych (masa cząsteczkowa około 65 kDa). Wzmocniona jest również aktywność inkluzji Cryll i CrylC. Stwierdzano również wzmacnianie aktywności pojedynczych, skróconych białek CrylA(a), (b) i (c). Nie stwierdzono, aby czas inkubacji la z białkiem Cry miał zasadnicze znaczenie dla aktywności biologicznej. Jednakże, sam la jest nieaktywny. Stwierdzono, że poziom wzmocnienia wynosi 100-200 razy dla skróconych białek CrylA oraz inkluzji CryllC i Cryl i około 320 razy dla pełnej długości CrylA(c) (patrz odpowiednio tabela I i II). Śzczególnie w przypadku białka o pełnej długości 0,75 gg/ml CrylA(c) powodowało taką samą śmiertelność owadów/stopień zahamowania rozwoju, gdy dodano la, jak 240 gg/ml samego białka CrylA(c). W przypadku skróconego CrylA(c), przy OD280 wynoszącym 0,0006 w połączeniu z la otrzymano taki sam stopień zahamowania rozwoju, jak dla próbki samego CrylA(c) przy OD280 wynoszącym 0,075. Inkluzje Cryll w stężeniu 0,6 gg/ml w połączeniu z la dawały taki sam stopień zahamowania rozwoju i podobną śmiertelność jak samo białko Cryll w stężeniu 0,75 gg/ml, co stanowi 125-krotne wzmocnienie. Inkluzje CrylC przy stężeniu 0,3 gg/ml z dodatkiem la dają podobną śmiertelność i stopień zahamowania rozwoju, jak samo
183 156 białko CrylC w stężeniu 75 pg/ml, co odzwierciedla 250-krotny poziom wzmocnienia. Stężenie białka CrylA, które powodowało zahamowanie rozwoju, po dodaniu la prowadziło do śmierci.
Stwierdzono, że la zachowuje stabilność po utrzymywaniu temperatury wrzenia w ciągu 5 minut, ale traci całą aktywność podczas autoklawowania (>190°C). Ponadto, jest on stabilny po poddaniu bezpośredniemu działaniu światła słonecznego w ciągu co najmniej 10 godzin. la jest stabilny w pH 2 w ciągu 3 dni, ale niestabilny w pH 12. Stwierdzono, że traci całą aktywność po wystawieniu na działanie kwasu nadjodowego lub stężonego HC1.
Tabela I
Wzmacniający wpływ la na oczyszczone skrócone białka Bt
Białko Bt | Spodoptera exigua | |||
Typ | OD280 | la | Śmiertelność | Stopień zahamowania rozwoju |
Cryla(a) | 0,055 | - | 0/5 | 2,2 |
0,040 | - | 0/5 | 2,2 | |
0,020 | - | 0/5 | 2,0 | |
0,020 | + | 0/5 | 0,0 | |
0,010 | + | 0/5 | 0,2 | |
0,005 | + | 0/5 | 0,0 | |
0,0025 | + | 0/5 | 0,4 | |
0,0012 | + | 0/5 | 1,8 | |
0,0006 | + | 0/5 | 1,6 | |
CrylA(c) | 0,075 | - | 0/5 | 3,4 |
0,040 | - | 0/5 | 2,6 | |
0,020 | - | 0/5 | 2,8 | |
0,020 | + | 1/5 | 0,0 | |
0,010 | + | 0/5 | 0,2 | |
0,005 | + | 1/5 | 0,0 | |
0,0025 | + | 2/5 | 2,0 | |
0,0012 | + | 0/5 | 1,0 | |
0,0006 | + | 1/5 | 1,0 | |
brak | + | 0/5 | 4,0 | |
brak | - | 0/5 | 4,0 |
Śmiertelność = liczba owadów martwych/liczba wszystkich owadów po 2 dniach;
Stopień zahamowania rozwoju zdefiniowano jako średnią wielkość żywej larwy owada pod koniec oznaczenia biologicznego: 4,0 =kontrola nietraktowana, 3,0 = 75% wielkości kontroli, 2,0 = 50% wielkości kontroli, 1,0 = 25% wielkości kontroli, 0,0 = brak wzrostu lub wielkość niezmieniona od rozpoczęcia doświadczenia.
Tabela Π
Wzmacniający wpływ la na białko Bt
Białko Bt | Spodoptera exip.ua | |||
Typ | OD280 | la | Śmiertelność | Stopień zahamowania rozwoju |
1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
CtylA(c) | 240 | - | 1/5 | 0,5 |
120 | - | 0/5 | 2,2 | |
60 | - | 0/5 | 2,2 |
183 156 ciąg dalszy tabeli II
1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
30 | - | 0/5 | 4,0 | |
60 | + | 5/5 | — | |
30 | + | 5/5 | — | |
15 | + | 4/5 | 0,0 | |
3 | + | 4/5 | 1,0 | |
0,8 | + | 2/5 | 1,6 | |
Cryll | 300 | - | 1/5 | 0,8 |
150 | - | 2/5 | 0,7 | |
75 | - | 1/5 | 0,2 | |
38 | - | 0/5 | 0,8 | |
19 | - | 0/5 | 1,6 | |
9 | - | 0/5 | 1,8 | |
5 | - | 1/5 | 4,0 | |
38 | + | 3/5 | 1,0 | |
19 | + | 2/5 | 0,5 | |
9 | + | 3/5 | 0,0 | |
5 | + | 1/5 | 0,5 | |
2,4 | + | 1/5 | 0,0 | |
1,2 | + | 3/5 | 0,5 | |
0,6 | + | 2/5 | 0,3 | |
Cryll | 300 | - | 2/5 | 0,3 |
150 | - | 2/5 | 0,0 | |
75 | - | 1/5 | 0,8 | |
38 | - | 0/5 | 3,2 | |
38 | + | 5/5 | — | |
19 | + | 5/5 | — | |
9 | + | 5/5 | — | |
5 | + | 4/5 | 0,0 | |
2,4 | + | 1/5 | 0,0 | |
1,2 | + | 5/5 | — | |
0,6 | + | 3/5 | 1,5 | |
0,3 | + | 2/5 | 1,3 | |
brak | - | 0/5 | 4,0 | |
brak | + | 0/5 | 4,0 |
*Śmiertelność = liczba owadów martwych/liczba wszystkich owadów po 2 dniach;
Stopień zahamowania rozwoju zdefiniowano jako średnią wielkość żywej larwy owada pod koniec oznaczenia biologicznego: 4,0 = kontrola nietraktowana, 3,0 = 75% wielkości kontroli, 2,0 = 50% wielkości kontroli, 1,0 = 25% wielkości kontroli, 0,0 = brak wzrostu lub wielkość niezmieniona od rozpoczęcia doświadczenia.
7.4. OCENA INNYCH PODGATUNKÓW Bacillus thuringiensis I INNYCH GATUNKÓW Bacilli
Kilka gatunków Bacilli oceniono pod kątem wytwarzania la. Szczepy poddawano fermentacji w ciągu 72 godzin w temperaturze 30°C w podłożu zawierającym źródło węgla, takie jak skrobia, hydrolizat skrobiowy lub glukoza oraz źródło azotu, takie jak białko, hydrolizat
183 156 białkowy lub namok kukurydziany. Supematanty testowano pod kątem wytwarzania la stosując opisane powyżej mikrooznaczenie biologiczne z wykorzystaniem Spodoptera exigua. Stwierdzono, że szczepy B. thuringiensis subsp. aizawi EMCC0087 (zdeponowany w NRRL jako NRRL B-21148) i B. thuringiensis subsp. galleriae (zdeponowany w NRRL) wytwarzają la w przybliżeniu w takim samym stężeniu, jak Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki.
Jak określono przez elektroforezę kapilarną, la wytwarzają również B. subitilis, B. cereus, B. t. subsp. alesti,B. t. subsp. canadiensis,B. t. subsp. darmstadiensis,B. t. subsp. dendrolimus,B. t. subsp. entomocidus, B. t. subsp. finitimus, B. t. subsp. israelensis, B. t. subsp. kenyae, B. t. subsp. morrisoni, B. t. subsp. subtoxicus, B. t. subsp. tenebrionis, B. t. subsp. thuringiensis, B. t. subsp. toumanoffi, B. cereus, B. subitilis i mutant ery- spo- B. thuringiensis subsp. kurstaki.
Do ilościowego oznaczania la stosuje się zwłaszcza Beckman P/ACE Capillary Electrophories System wyposażony w nieopłaszczonąkapilarę o wymiarach 50 pm x 57 cm, 0,2 M bufor fosforanowy pH 6,8, napięcie 15 KV i detekcję przy długości fali 200 nm. Objętości próbek wynoszą 20 nl, a czas rozdziału 25 minut.
Krzywą standardową tworzy się jako standard stosując oczyszczony la o stężeniach 1,25 mg/ml, 0,625 mg/ml, 0,3125 mg/ml, 0,156 mg/ml oraz 0,078 mg/ml. Tworzy się liniowąkrzywą kalibracyjną. Otrzymane równanie y - mx + b stosuje się do obliczania stężenia la w każdej próbce.
Przed każdym rozdziałem kapilarę przemywa się buforem do elektroforezy (0,2 M bufor fosforanowy pEl 6,8) w ciągu trzech minut. Po każdym trwającym 25 minut rozdziale kapilarę przemywa się 1N NaOH w ciągu 1 minuty, wodąfiltrowanąprzez HPLC w ciągu 1 minuty, 0,5 M kwasem fosforowym w ciągu 3 minut i wodąfiltrowanąprzez HPLC w ciągu 1 minuty. Pole powierzchni pod każdym pikiem całkuje się i określa się pole powierzchni piku oraz oblicza się stężenie końcowe na podstawie krzywej standardowej.
7.5. OCENA PRODUKTÓW B. t.
Ilość la obecnego w różnych komercyjnie dostępnych produktach określono przez elektroforezę kapilamąopisanąpowyżej w części 6.4, supra. BACTOSEPINE™, JAVELIN™, NOVODOR™, SPHERIMOS™, BACTIMOS™, FORAY™, FLORBAC™ i BIOBIT™ Novo Nordisk A/S . XENTARI™ i DIPEL™ uzyskano z Abbot Laboratories. AGREE™ uzyskano z Ciba-Geigy; MVP™ uzyskano z Mycogen i CUTLASS™ uzyskano z Ecogen.
Wyniki przedstawione w tabeli III, infra, wskazują, że la występuje w zróżnicowanych ilościach, w zakresie od mniej niż 0,001 g la/BIU do 0,071 g la/BIU.
Tabela III la w produktach Bacillus thuringiensis
Produkt | Typ | Numer serii | Siła działania | la g/BIU |
1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
JAVELINl WG | Btk | 9942281 | 32000 lU/mg | 0,071 |
XENTARI™ | Bta | 58715PG | 15000IU/mg | 0,06 |
AGREE™ | B ta/Btk | RA2080 | 25000 TU/mg | 0,033 |
BIOBIT™ HPWP | Btk | 5012 | 48950 U/mgPIA | 0,018 |
BIOBIT™ FC | Btk | AG46669071 | 8 BIU/L | 0,013 |
FORAY™ 48B | Btk | BBN7018 | 12,6 BIU/L | 0,012 |
DIPEL™ | Btk | 58739PG | 32000 lU/mg | 0,011 |
TM FORAY 76B | Btk | 20,0 BIU/L | 0,007 | |
BACTOSPEINE™ | Btk | BOB001 | 123653 lU/mg | 0,003 |
BACTOSPEINE™ | Btk | ΚΧ02Α | 100000 lU/mg | 0,003 |
BACTOSPEINE™ | Btk | WP | 16000 lU/mg | <0,001 |
NOYODOR™ | Btt | 9024 | 16,3 miliona LTU/qt | O 9,5 x 10 g/LTU |
183 156 ciąg dalszy tabeli III
1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
FLORBAC™ | Bia | 082-31-1 | 30000 U/mg E | <0,001 |
SPHERIMOS™ | Bsphr | BSN006 | brak | |
MVP™ | Btk | 21193542 | brak | |
CUTLASS™ | Btk/Btk | brak | ||
BACTIMOS™ | Bń | BIB0024 | 11700IU/mg | brak |
7.6. OZNACZENIA BIOLOGICZNE WPROWADZANIA DO POKARMU
Aktywność B. t. k. określa się przez oznaczenie biologiczne wprowadzania do sztucznego pokarmu z zastosowaniem larw Spodoptera exigua w stadium trzeciej wylinki, larw Helicoverpa zea w stadium drugiej wylinki, larw Spodopterafrugiperda w stadium trzeciej wylinki, larw Heliothis yirecens w stadium drugiej wylinki, larw Trichoplusia ni w stadium trzeciej wylinki, larw Pseudoplusia includens w stadium trzeciej wylinki, larw Plutella xylostella w stadium trzeciej wylinki, larw Spodoptera littorialis w stadium trzeciej wylinki i larw Mamestra brassicae w stadium trzeciej wylinki.
W celu określenia poziomu wzmocnienia pod wpływem dodania la do produktów B. t. i ustalenia zakresu podlegających wpływowi owadów, przeprowadzono oznaczenia biologiczne prowadzania do pokarmu. W doświadczeniach z wysokimi stężeniami la wobec Spodoptera exigua (7,4-23,7 g la/BIU), oczyszczony la (70% składnika aktywnego, 30% octanowego jonu o przeciwnym ładunku) stosuje się do wzmocnienia BIOBIT™ FC (FC oznacza koncentrat do uzyskiwania postaci płynnej). Pozostałe dane podane w tabeli IV przedstawiają wzmocnienie BIOBIT™ HPWP (zwilżalny proszek o wysokiej sile działania) przez la (0,658% aktywnego czynnika). S. Littoralis i M. Brassicae testowano stosując FLORBAC™HPWP i la.
Różne produkty B. t. waży się i dodaje la w ilości odpowiadającej 0,1 do 237 g la/BIU. Objętość doprowadza się 0,1 % Tween™. Próbki sonikuje się w ciągu 1 minuty, a następnie rozcieńcza do objętości końcowej. Przygotowuje się również próbki samego pestycydu (bez la) i substancji odniesienia. Substancje odniesienia obejmują B. t. k. HD-1S-1980 (otrzymany z NRRL) o oznaczonej sile działania 16000 jednostek międzynarodowych (IU) na miligram i JAVELIN™ WG o oznaczonej sile działania 53000 jednostek Spodoptera (SU)/mg.
Standardowy sztuczny pokarm złożony z wody, agaru, cukru, kazeiny, kiełków pszenicy, parabenu metylowego, kwasu sorbinowego, oleju lnianego, celulozy, soli i witamin przygotowuje się w ogrzewanym kotle o pojemności 20 litrów. Zapewnia to wystarczającą ilość pokarmu do przetestowania 10 do 12 próbek dla siedmiu różnych stężeń każdej testowanej substancji. Roztwory B. t. poddaje się kolejnym rozcieńczeniom uzyskując próbki o objętości 16 ml. Każdą próbkę dodaje się do 184 g płynnego pokarmu. Mieszaninę następnie homogenizuje się, a potem wlewa do plastikowej płytki zawierającej 40 pojedynczych komór. Dla każdej partii pokarmu przygotowuje się po trzy płytki kontrolne. Po schłodzeniu i zestaleniu, do każdej komory dodaje się jednego owada o znanym wieku (stadium 2-3 wylinki) i płytki przykrywa się arkuszem przejrzystego mylar z otworami. Płytki umieszcza się w statywach i inkubuje w ciągu czterech dni w temperaturze 28°C i 65% wilgotności względnej.
Po czterech dniach określa się śmiertelność owadów. Każdąpłytkę uderza się mocno o blat stołu i larwy, które się nie poruszają, liczy się jako martwe. Oblicza się procent śmiertelności i dane analizuje się wykorzystując równoległą analizę probit. Ocenia się LC50, LC90, nachylenie linii regresji, współczynnik wariacji i siły działania. Próbki analizowano minimum trzy razy lub dopóki trzy wartości siły działania nie różniły się o więcej niż 20% od obliczonej średniej dla każdej próbki. W celu obliczenia wzrostu aktywności związanego z każdym stężeniem la, w LC50 próbki B. t./Ia uwzględnia się poprawkę, tak aby odzwierciedlało ilość B. t. w próbce. LC50 sparowanych próbek la dzieli się przez poprawione wartości LC50 otrzymując wielokrotność obniżenia LC50 związaną z la.
183 156
W oznaczeniu z Lobesia bothrana stosuje się następującą procedurę. Winoroślą zaatakowane Lobesia bothrana zbiera się z nieopryskiwanych upraw i usuwa larwy. Wykonuje się szereg rozcieńczeń la (250 pg/ml, 500 pg/ml i 1000 gg/ml) w wodzie. Jednąlarwę umieszcza się na środku szalki Petri'ego. Po zaobserwowaniu picia przez larwę, przenosi się ją na świeżo ścięte winogrona. Larwy utrzymywano w temperaturze 22°C w ciągu 3-4 dni.
Jak przedstawiono w tabeli IV, obserwowano znaczące obniżenia LC50 dla wszystkich gatunków.
Tabela IV
Oznaczenia biologiczne wprowadzania do pokarmu
Owad | g la na BIU | Wzrost aktywności Wielokrotność obniżenia LC50 |
1 | 2 | 3 |
Spodoptera exigua (BIOBIT™ HPWP) | 0,1 | 1,5 |
0,2 | 1,7 | |
2,0 | 4,3 | |
4,0 | 7,5 | |
Spodoptera exigua (BIOBIT™ FC) | 7,4 | 13 |
15 | 26 | |
30 | 34 | |
118 | 59 | |
237 | 79 | |
Spodopterafrugiperda (BIOBIT™HPWP) | 0,2 | 2,2 |
0,8 | 3,9 | |
2,0 | 7,2 | |
4,0 | 11,6 | |
Trichoplusia ni TM (BIOBIT HPWP) | 0,1 | 1,1 |
0,2 | 1,2 | |
2,0 | 2,0 | |
4,0 | 3,1 | |
Pseudoplusia includens TM (BIOBIT HPWP) | 0,1 | 0 |
0,2 | 1,2 | |
0,8 | 2,1 | |
2,0 | 2,4 | |
4,0 | 3,4 | |
Plutella xylostella TM (BIOBIT HPWP) | 0,2 | 1,6 |
0,8 | 1,3 | |
2,0 | 1,4 | |
4,0 | 1,9 | |
Helicoverpa zea (BIOBIT™ HPWP) | 3,2 | 12,6 |
Hehothis virescens | 3,2 | 4,2 |
(BIOBIT™ HPWP) |
183 156 ciąg dalszy tabeli IV
1 | 2 | 3 |
Lobesia bothrana (BIOBIT™ HPWP) | 2,0 | 3,0 |
Spodoptera littorialis (FLORBAC™ ) | 2,0 | 8,6 |
Mamestra brassicae TM (FLORBAC ) | 2,0 | 4,9 |
Wzmocnienie przez la różnych produktów wobec Spodoptera exigua określa się stosując opisane supra oznaczenie biologiczne wprowadzania do pokarmu. Ilość la dodanego/BIU produktu przedstawiono w tabeli V infra. Mieszaninę la/produkt B. t. wprowadza się do opartego na agarze pokarmu zawierającego kiełki pszenicy i kazeinę. Owady umieszcza się na pokarmie na cztery dni w temperaturze 28°C. Śmiertelność rejestruje się i analizuje wykorzystując analizę probit. LC50, LC90 i siłę działania oblicza się przez porównanie z produktem nie zawierającym la. Wyniki przedstawione w tabeli V wskazują że la wzmacnia różne produkty B. t. k. i B. t. a. uzyskane z różnych źródeł. Szczepy B. t. zawarte w tych produktach opisano w części 5.2., supra.
Tabela V
Wzmacnianie produktów B. t. wobec Spodoptera exigua
Owad | g la na BIU | Wzrost aktywności Wielokrotność obniżenia LC50 |
TM BACTOSPEINE WP | 0,4 1,7 | 1,04 2,3 |
CONDOR™ | 0,4 1,7 | 2,4 5,1 |
AGREE™ | 0,4 1,7 | 1,1 1,6 |
TM CUTLASS | 0,4 1,7 | 1,1 2,5 |
MVP™ | 0,4 1,7 2,0 | 6,0 7,7 12,1 |
FLORBAC™ HPWP | 0,2 0,8 | 1,1 2,0 |
TM DIPEL 2x | 0,2 0,8 2,0 | 1,2 2,3 3,9 |
JAVELIN™ WG | 0,2 0,8 2,0 | 0 1,08 2,9 |
XENTARI™ | 0,2 0,8 2,0 | 1,2 1,6 2,4 |
183 156
7.7. OZNACZENIA BIOLOGICZNE NA LIŚCIACH
Oznaczenia biologiczne na liściach prowadzi się z larwami Spodoptera exiguana w stadium drugiej wylinki na brokułach, stosując BIOBIT™ FC i la. Stosunek la do BIOBIT™ FC jest taki sam, 2 g la/BIU BIOBIT™ FC. Brokuły poddaje się traktowaniu w objętości nośnika 20 galonów na akr stosując rozpylacz gąsienicowy. Po wyschnięciu rozpylonego środka liście usuwa się, a następnie infekuje larwami Spodoptera exigua w stadium drugiej wylinki. Wyniki przedstawiono w tabeli VI infra. 100% śmiertelności obserwuje się przy ilości 8,7 BIU/hektar BIOBIT™ FC + la, podczas gdy sam BIOBIT™ FC zabija 92% larw w ilości 58,8 BIU/hektar i 8% w ilości 17,6 BIU/hektar. Traktowane rośliny wystawia się również na bezpośrednie działanie światła słonecznego w ciągu ośmiu godzin, po czym liście wycina się i infekuje. Po ośmiu godzinach na świetle, sam BIOBIT™ FC w ilości 58,8 BIU/hektar powoduje 27% śmiertelności, podczas gdy BIOBIT™ FC + la powodują 100% śmiertelności w ilości 8,7 BIU/hektar.
W oznaczeniu na liściach wykonanym z larwami we wczesnym stadium czwartej wylinki stwierdzono 75% śmiertelności dla samego BIOBIT™ FC w ilości 52 BIU/hektar i 100% śmiertelności dla BIOBIT™ FC (FC oznacza koncentrat do uzyskiwania postaci płynnej) + la w ilości 13 BIU/hektar.
Tabela VI
Oznaczenia biologiczne na liściach
Traktowanie | BIU/hektar | % śmiertelności | Wylinka larwalna |
BIOBIT™ FC | 58,8 | 92% | 2 |
TM BIOBIT FC | 17,6 | 8% | 2 |
BIOBIT™ FC + la | 8,7 | 100% | 2 |
BIOBIT™ FC + 8 h światła słonecznego | 58,8 | 27% | 2 |
BIOBIT™ FC + la + 8 h światła słonecznego | 8,7 | 100% | 2 |
BIOBIT™ FC | 52 | 75% | 4 |
BIOBIT™ FC + la | 13 | 100% | 4 |
7.8. PRÓBY POLOWE
Próby połowę wobec fasoli odmiany garbonzo (Spodoptera exigua) wykazały, że sam BIOBIT™ FC w ilości 70 BIU/hektar zapewnia 51% zwalczania szkodnika, podczas gdy 2 g la/BIU BIOBIT™ FC w ilości 40 BIU/hektar zapewnia 89% zwalczania (w odniesieniu do braku traktowania). JAVELIN™ WG w ilości 45 BIU/hektar zapewnia 51% zwalczania.
Próby połowę wobec kukurydzy cukrowej (Spodoptera frugiperdd) wykazały, że przy ilości 39,5 BIU/hektar, 2 g la/BIU BIOBIT™ FC zapewnia 84% zwalczania.
7.9. STOSUNKI OPORNOŚCI
Oznaczeniu biologicznemu poddano wrażliwe i oporne kolonie Plutella xylostella. Próbki opornych ciem zebrano z pól z Florydy, gdzie rozwinęła się oporność na B.t.,^ wyniku intensywnej ekspozycji na JAVELIN™ WG. BIOBIT™ HPWP z la poddaje się analizie stosując oznaczenie biologiczne z zanurzaniem liści. Oporność na JAVELIN™ i XENTARI™ określa się bez la. Krążki liści kapusty o średnicy sześciu centymetrów zanurza się na 10 sekund w jednym z ośmiu różnych stężeń produktów B. t. preparatów B. ń/Ia. Stosuje się stężenia w zakresie od 1 do 1000 ppm. Krążki liściowe pozostawia się na dwie godziny do wyschnięcia na powietrzu, a następnie umieszcza się w plastikowych szalkach Petri'ego z larwami w stadium drugiej wylinki (0,2 do 0,4 mg). Dwadzieścia pięć owadów/dawkę/dzień podwojono otrzymując 50 owadów/dawkę. Po 72 godzinach w temperaturze 27°C rejestruje się śmiertelność. Regresję zależności dawka-śmiertelność analizuje się wykorzystując analizę probit. Stosunki oporności oblicza się dzieląc wartości LC50i LC90 dla wrażliwych ciem. Wyniki przedstawiono w tabeli VII i wykazują one, że BIOBIT™ HPWP ulega wzmocnieniu dla 2 g la/BIU i 4 g la/Biu. Szczególnie dla 4 g
183 156 la/BIU występuje 2-krotne obniżenie stosunku oporności LC50 i 10-krotne obniżenie stosunku oporności LC90.
Tabela VII
Stosunki oporności Plutella xylostella (opornych na B. t. k.)
Testowany produkt | Stosunek oporności LC50 | Stosunek oporności LC90 |
TM JAVELIN WG | 302,6 | 3829,7 |
BIOBIT™ HPWP | 20,5 | 98,5 |
TM 2,0 g la/BIU BIOBIT HPWP | 23,2 | 88,0 |
4,0 g la/BIU BIOBIT™ HPWP | 10,4 | 11,5 |
TM XENTARI | 9,7 | 8,2 |
7.10. MUTANTY
7.10.1. Szczep
Stosuje się szczepy Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki EMCC0086 (NRRL B-21147), Septoria nodorum (A04119) i Altenaria altemata (szczep 6, IM-SMP).
7.10.2. Oznaczenie hamowania wzrostu grzybów
Mutanty szczepu Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, które wytwarzają czynnik, identyfikuje się stosując agarowe płytki z grzybami Septoria nodorum i Altenaria altemata. Czynnik hamuje wzrost obu grzybów.
Oba grzyby hoduje się na płytkach z podłożem PDA (agarowe podłoże ziemniaczanodekstrozowe) w temperaturze 26°C w ciągu 10-14 dni, aż do uzyskania wystarczającego zarodnikowania. Altenaria altemata inkubuje się stosując naprzemiennie okresy światła UV i ciemności (po 12 godzin). Zarodniki usuwa się z płytek i zawiesza w jałowej wodzie. Zarodniki grzybami Septoria nodorum sączy się przez jałowy sączek Gl. Stężenie zarodników Altenaria altemata doprowadza się do około 2 x 105 na ml, a stężenie zarodników Septoria nodorum doprowadza się do około 2 x 106 na ml używając licznika Bruker-Turka lub Fuchsa-Rosenthala. Zawiesinę zarodników o objętości 1,5 ml miesza się z 1,5 ml jałowego 40% glicerolu w wodzie, mrozi w ciągu 1 dnia w temperaturze -20°C, a następnie przechowuje się w temperaturze -80°C do czasu zastosowania.
Płytki testowe dla czynnika przygotowuje się mieszając w temperaturze 46°C 1,5 ml próbki zarodników (jak to opisano powyżej) ze 115 ml podłoża agarowego z antybiotykiem numer 2 (22,5 g na litr) zawierającego streptomycynę w końcowym stężeniu 100 pg na ml, a następnie przenosi się tę mieszaninę do jałowych, plastikowych podstawek (Nunc, numer katalogowy 101875). Po zastygnięciu agaru, robi się w nim otwory o wielkości mm (120 otworów na podstawkę).
Próbki hodowli rozcieńcza się kolejno w jałowej wodzie zawierającej 100 pg streptomycyny na ml i rozcieńczone próbki o objętości lOpl nanosi się na płytki przygotowane jak opisano powyżej. Płytki inkubuje się w temperaturze 26°C w ciągu 2 dni. Analizowano również rozcieńczenia czynnika jako kontrolę pozytywną.
Czułość oznaczenia hamowania wzrostu grzybów pozostaje w zakresie od 0,05 grama czynnika na litr (ledwo widoczne) do 0,1 grama czynnika na litr (klarowna strefa) dla obu gatunków grzybów.
7.10.3. Pomiar czynnika z zastosowaniem strefowej elektroforezy kapilarnej
Komórki i inne cząstki nierozpuszczalne usuwa się przed analizą z pełnej próbki brzeczki hodowlanej przez wirowanie łub sączenie przez nylonowe membrany o średnicy porów 0,2 pm. Do ilościowego oznaczania czynnika stosuje się Beckman P/ACE Capillary Electrophoresis System wyposażony w nieopłaszczoną kapilarę o wymiarach 50 pm x 47 cm; bufor rozdzielający zawierający 0,1 M fosforan, pH 6,6, napięcie 15 KV i detekcję przy długości fali 200 nm. Przed każdym rozdziałem kapilarę przemywa się buforem rozdzielającym w ciągu 2 minut. Objętość nakładanej próbki wynosi 20 nl.
183 156
Czas rozdziału dla analizy wynosi 12 minut, gdzie czynnik ulega elucji w około 8,5 minucie. Stężenie czynnika określa się w odniesieniu do krzywej standardowej otrzymanej dla czystego związku.
Pomiędzy każdym trwającym 12 minut rozdziałem kapilarę przemywa się kolejno 1 N wodorotlenkiem sodowym w ciągu 0,5 minuty, 0,1 N wodorotlenkiem sodowym w ciągu 0,5 minuty, wodąHPLC w ciągu 0,5 minuty i 1,5 M kwasem fosforowym w ciągu 0,5 minuty.
7.10.4. Mutageneza szczepu B. thuringiensis subsp. kurstaki
Przetrwalniki szczepu NB75 Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki poddaje się najpierw działaniu promieni gamma w dawce 700 Kradów. Napromieniowane przetrwalniki poddaje się kolejnym rozcieńczeniom, rozpyla się na płytki agarowe TY i inkubuje w temperaturze 30°C w ciągu 2 dni. Uzyskane w ten sposób 80 mutantów oczyszcza się przez rozprowadzenie pojedynczych kolonii na agarowych płytkach TY, a następnie przenosi się do kolb do wytrząsania o objętości 500 ml zawierających po 100 ml podłoża o następującym składzie:
Namok kukurydziany 15 g/litr
Maltodekstryna 40 g/litr
Białko ziemniaka 30 g/litr
KH2PO4 1,77 g/litr
K2HPO4 4,53 g/litr
Kolby do wytrząsania inkubuje się w temperaturze 30°C, przy 250 obrotach na minutę w ciągu 3 dni.
Codziennie z każdej wytrząsanej kolby pobiera się próbki hodowli o objętości 5 ml i odwirowuje się je w celu osadzania komórek. Supematant rozcieńcza się 2-10 krotnie w wodzie dejonizowanej zawierającej streptomycynę w stężeniu 0,1 mg/ml, a następnie testuje się pod kątem aktywności przeciwgrzybowej, jak opisano w części 8.2. Próbki hodowli tych mutantów, które powodują największe zahamowanie wzrostu grzybów analizuje się następnie pod kątem ilości czynnika stosując strefową elektroforezę kapilarną, jak opisano w części 8.3. Mutantem o najwyższej produktywności, uzyskanym z pierwszej rundy mutacji, jest NBB-76.
Mutanta z pierwszej rundy mutacji NBB-76 poddaje się następnie drugiej mutacji z zastosowaniem N,N'-dinitro-N'-nitrozoguanidyny (NTG). Szczegółowo, szczep mutanta hoduje się przez noc w temperaturze 30°C, przy 240 obrotach na minutę, w kolbie do wytrząsania o objętości 500 ml zawierającej 100 ml bulionu TY o następującym składzie, doprowadzonej do pH 7,3 przed autoklawowaniem:
Trypton 20 g/litr
Ekstrakt drożdżowy 5 g/litr
FeCl2-4H2O 6 g/litr
MnCl2-4H2O 1 g/litr
MgSO4-7H2O 15 g/litr
Całonocną hodowlę rozcieńcza się 100-krotnie w nowej kolbie do wytrząsania zawierającej podłoże TY i hoduje się w temperaturze 30°C, przy 240 obrotach na minutę, aż do osiągnięcia przez hodowlę fazy wzrostu logarytmicznego (około 4 godziny. Z kolby pobiera się próbkę hodowli o objętości 10 ml, a następnie bakterie odsącza się stosując jednostkę filtrującą Nalgene o średnicy porów 0,45 pm. Komórki na sączku ponownie się zawiesza w 10 ml buforu TM zawierającego 100 pg NTG na ml. Bufor TM zawiera 6,05 g Trisu i 5,08 g kwasu maleinowego na litr wody dejonizowanej doprowadzonych do pH 6 wodorotlenkiem sodowym. Zawieszone komórki inkubuje się w temperaturze 37°C w ciągu 30 minut, a następnie przyłącza się do źródła zmniejszonego ciśnienia w celu usunięcia NTG z komórek. Komórki przemywa się dwa razy 20 ml buforu M9 przed zawieszeniem w 10 ml buforu M9, rozcieńcza się kolejno, rozprowadza na płytki z podłożem agarowym TY i inkubuje w temperaturze 30°C w ciągu 2 dni. Bufor M9
183 156 zawiera 8,78 g Na2HPO4-2H2O,3 g KH2PO4,4 g NaCl i 0,2 g MgSO4-7H2O na litr wody dejonizowanej. Mutanty izoluje się i testuje, jak opisano powyżej. Mutantem o najwyższej produktywności uzyskanym z drugiej rundy mutacji jest EMCC0130.
Mutanta EMCC0130 uzyskanego w drugiej rundzie mutacji poddaje się następnie trzeciej rundzie mutacji stosując NTG, jak opisano powyżej. Mutantem o najwyższej produktywności uzyskanym z trzeciej rundy mutacji jest NBC-217.
Mutanta NBC-217 uzyskanego w drugiej rundzie mutacji poddaje się następnie czwartej rundzie mutacji stosując NTG, jak opisano powyżej. Mutantem o najwyższej produktywności uzyskanym z czwartej rundy mutacji jest EMCC0129.
7.10.5. Wytwarzanie czynnika przez mutanty i szczep rodzicielski
Mutanty EMCC0130, NBC-217 i EMCC0129 oraz szczep rodzicielski Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki EMCC0086 hoduje się w kolbach do wytrząsania o objętości 250 ml zawierających 50 ml podłoża obejmującego następujące składniki wzbogacone w mikroelementy w ilości 0,2 ml na litr, doprowadzonego do pH 7 H3PO4, bezpośrednio przed sterylizacją:
Hydrolizat białka roślinnego 30 g/litr
Hydrolizat skrobiowy 40 g/litr
KH2PO4 5 g/litr
MgSO4 0,3 g/litr
Hodowle w kolbach do wytrząsania inkubuje się w temperaturze 30°C, przy 250 obrotach na minutę w ciągu 3 dni.
Ilościową analizę czynnika wytwarzanego przez mutanty i szczep rodzicielski przeprowadza sięprzez strefową elektroforezę kapilamą,jak opisano w części 8.3. Analiza ilościowa wykazuje, że mutant EMCC0129 wytwarza około 0,9 g czynnika na litr brzeczki hodowlanej po 3 dniach w wytrząsanych kolbach, podczas gdy szczep rodzicielski wytwarza około 0,15 g na litr. Mutant EMCC0129 wytwarza około 6-krotnie więcej czynnika niż szczep rodzicielski.
Tabela VIII
Wytwarzanie czynnika przez mutanty Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki
Mutant | Czynnik (g/litr) |
Szczep rodzicielski | 0,15 |
EMCC0130 | 0,65 |
NBC-217 | 0,65 |
EMCC0129 | 0,75 |
Zakres opisanego i zastrzeganego tu wynalazku nie jest ograniczony przez ujawnione tu szczegółowe rozwiązania, ponieważ rozwiązania te mają na celu zilustrowanie kilku aspektów wynalazku. Jest zamiarem, aby wszelkie równoważniki rozwiązań wchodziły w zakres tego wynalazku. W rzeczywistości, różne modyfikacje wynalazku poza tymi przedstawionymi i opisanymi w niniejszym opisie, staną się oczywiste na podstawie tego opisu dla specjalistów w tej dziedzinie. Jest również zamiarem, aby takie modyfikacje wchodziły w zakres dołączonych zastrzeżeń.
W niniej szym opisie cytowano różne odnośniki literaturowe, ujawnienia których włączono w całości poprzez odnośniki.
8. DEPOZYT MIKROORGANIZMÓW
Następujące szczepy Bacillus thuringiensis zdeponowano na warunkach Porozumienia Budepesztańskiego w Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604, USA.
183 156
Szczep | Numer dostępu | Data depozytu |
EMCC0086 | NRRL B-21147 | 6 października 1993 |
EMCC0129 | NRRL B-21445 | 23 maja 1995 |
EMCC0130 | NRRL B-21444 | 23 maja 1995 |
Szczepy zdeponowano na warunkach, które zapewniają, że dostęp do kultur podczas trwania postępowania patentowego tego zgłoszenia patentowego będzie możliwy dla osób określonych przez kierownika Biura Patentowego i Znaków Towarowych, upoważnionego do tego na podstawie 37 C.F.R. § 1.14 i 35 U.S.C. § 122. Depozyt stanowi zasadniczo czystą kulturę każdego ze zdeponowanych szczepów. Depozyt jest dostępny, zgodnie z wymaganiami zagranicznego prawa patentowego, w krajach, w których złożono kopie niniejszego zgłoszenia lub jego odpowiedniki. Jednakże, powinno być zrozumiałe, że dostępność depozytu nie stanowi licencji na praktykowanie niniejszego wynalazku z naruszeniem praw patentowych przyznawanych w wyniku działań rządowych.
181156
181 156
181156
181 156
Obserwowane nOe : 8.2
8.06
5.17
5.17,5.34
9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 5.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0
FIG.4
181156
10-krotnie zatężony supernatant po fermentacji Btk NB75
Wirowanie ł
Sączek o średnicy porów 0,2 pm Nieoczyszczony supernatant po sączeniu przez sączek o średnicy porów 0,2 pm
Ultrafiltracja przez błonę o przepuszczalności do 5 kDa ł
Permeat do 5 kDa
Wymiana kationowa na SP 4
Połączone zebrane frakcje
Zatężanie przez liofilizację
I
Sączenie molekularne na P2
Ψ
Połączone zebrane frakcje
SP HPLC
I
Zebrane frakcje po SP HPLC
I
Wielokrotne liofolizacja
Claims (15)
- Zastrzeżenia patentowe1. Mutant szczepu Bacillus, znamienny tym, że wytwarza się czynnik wzmacniający aktywność pestycydową pestycydu związanego z Bacillus, przy czym ilość czynnika wytwarzanego przez mutanta jest co najmniej 2 razy większa niż ilość czynnika wytwarzanego przez odpowiadający szczep rodzicielski, zaś szczep Bacillus wybrany jest z grupy składającej się z Bacillus licheniformis, Bacillus subtilus i Bacillus thuringiensis.
- 2. Mutant według zastrz. 1, znamienny tym, że czynnik posiada w widmie 'H NMR przesunięcia przy około δ 1,5,3,22,3,29,3,35,3,43,3,58,3,73,3,98,4,07,4,15,4,25,4,35 i widmie 13C przesunięcia przy około 31,6,37,2,51,1,53,3,54,0,54,4,61,5,61,6,64,1,65,6,158,3,170,7 i 171,3.
- 3. Mutant według zastrz. 1, znamienny tym, że wytwarza czynnik posiadaj ący strukturę Ilub jego sól.
- 4. Mutant według zastrz. 1, znamienny tym, że szczep Bacillus jest szczepem Bacillus thuringiensis.
- 5. Mutant według zastrz. 4, znamienny tym, że szczep Bacillus thuringiensis wybiera się z grupy składajcej się ze szczepów Bacillus thuringiensis subsp. aizawai, Bacillus thuringiensis subsp. alesti, Bacillus thuringiensis subsp. canadiensis, Bacillus thuringiensis subsp. colmeri, Bacillus thuringiensis subsp. coreanensis, Bacillus thuringiensis subsp. dakota, Bacillus thuringiensis subsp. darmstadiensis, Bacillus thuringiensis subsp. dendrolimus, Bacillus thuringiensis subsp. entemocidus, Bacillus thuringiensis subsp. finitimus, Bacillus thuringiensis subsp. galleriae, Bacillus thuringiensis subsp. indiana, Bacillus thuringiensis subsp. israelensis, Bacillus thuringiensis subsp. kenyae, Bacillus thuringiensis subsp. kumamotoensis, Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, Bacillus thuringiensis subsp. kyushuensis, Bacillus thuringiensis schsp.japonensis, Bacillus thuringiensis subsp. mexcanensis, Bacillus thuringiensis subsp. morrisoni, Bacillus thuringiensis subsp. neoleonensis, Bacillus thuringiensis subsp. nigeriae, Bacillus thuringiensis subsp. ostriniae, Bacillus thuringiensis subsp. pakistani, Bacillus thuringiensis subsp. pondicheriensis, Bacillus thuringiensis subsp. shandonginensis, Bacillus thuringiensis subsp. siło, Bacillus thuringiensis subsp. sotto, Bacillus thuringiensis subsp. subtoxicus, Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, Bacillus thuringiensis subsp. thompsoni, Bacillus thuringiensis subsp. tochigiensis, Bacillus thuringiensis subsp. tohokuensis, Bacillus thuringiensis subsp. tolworthi, Bacillus thuringiensis subsp. toumanoffi, Bacillus thuringiensis subsp. wuhanensis i Bacillus thuringiensis subsp. yunnanensis.
- 6. Mutant według zastrz. 4, znamienny tym, że szczepem Bacillus thuringiensis jest szczep Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki.
- 7. Mutant według zastrz. 1, znamienny tym, że mutant posiada cechy charakterystyczne EMCC0129, zdeponowanego w NRRL i posiadającego numer dostępu NRRL B-wwww lub cechy charakterystyczne EMCC0130, zdeponowanego w NRRL i posiadającego numer dostępu NRRL Β-χχχχ.183 156
- 8. Mutant według zastrz. 1, znamienny tym, że pestycyd związany z Bacillus obejmuje endotoksynę delta Bacillus thuringiensis lub jej aktywny pestycydowe fragment.
- 9. Mutant według zastrz. 9, znamienny tym, że endotoksynę delta Bacillus thuringiensis lub jej aktywny pestycydowe fragment wybiera się z grupy składającej się z Cryl, Cryll, Crylll, CryIV, CryV i CryVI.
- 10. Mutant według zastrz. 9, znamienny tym, że endotoksyną delta Bacillus thuringiensis lub jej aktywnym pestycydowe fragmentem jest endotoksyna delta CrylABacillus thuringiensis lub jej aktywny pestycydowe fragment.
- 11. Mutant według zastrz. 9, znamienny tym, że endotoksyną delta Bacillus thuringiensis lub jej aktywnym pestycydowe fragmentem jest endotoksyna delta CrylC Bacillus thuringiensis lub jej aktywny pestycydowe fragment.
- 12. Mutant według zastrz. 1, znamienny tym, że pestycyd związany z Bacillus obejmuje przetrwalniki Bacillus thuringiensis.
- 13. Mutant według zastrz. 1, znamienny tym, że czynnik otrzymany został przez (a) hodowlę mutanta szczepu Bacillus w odpowiednich warunkach; (b) odzyskiwanie supematantu z hodowli mutanta z hodowli mutanta z etapu (a); i (c) izolowanie czynnika z supematantu z etapu (b).
- 14. Mutant według zastrz. 13, znamienny tym, że czynnik otrzymuje się z supematantu hodowli szczepu Bacillus thuringiensis.
- 15. Sposób otrzymywania mutanta według zastrz. 1, znamienny tym, że (a) traktuje się szczep Bacillus mutagenem;(b) namnaża się zmutowany szczep Bacillus z etapu (a) w warunkach odpowiednich do selekcji mutanta; i (c) przeprowadza się selekcję mutanta z etapu (b).
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US45496795A | 1995-05-30 | 1995-05-30 | |
PCT/US1996/007136 WO1996038539A1 (en) | 1995-05-30 | 1996-05-17 | Mutants which produce a potentiator of bacillus pesticidal activity |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PL323472A1 PL323472A1 (en) | 1998-03-30 |
PL183156B1 true PL183156B1 (pl) | 2002-05-31 |
Family
ID=23806816
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL96323472A PL183156B1 (pl) | 1995-05-30 | 1996-05-17 | Mutanty wytwarzające czynnik wzmacniający aktywności pestycydowe Bacillus |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0828819B1 (pl) |
JP (1) | JP3794705B2 (pl) |
AT (1) | ATE221912T1 (pl) |
AU (1) | AU717681B2 (pl) |
CA (1) | CA2222801A1 (pl) |
CZ (1) | CZ362597A3 (pl) |
DE (1) | DE69622859T2 (pl) |
DK (1) | DK0828819T3 (pl) |
ES (1) | ES2183947T3 (pl) |
HU (1) | HUP9802569A3 (pl) |
PL (1) | PL183156B1 (pl) |
PT (1) | PT828819E (pl) |
WO (1) | WO1996038539A1 (pl) |
ZA (1) | ZA963315B (pl) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2866202B1 (fr) * | 2004-02-12 | 2006-08-18 | Getade Agri Concept | Procede de traitement phytosanitaire biologique des vegetaux, notamment de la vigne et compositions adaptees |
AR122093A1 (es) * | 2020-05-13 | 2022-08-10 | Bayer Cropscience Lp | Cepas de bacillus thuringiensis y métodos para el control de plagas |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ZA938163B (en) * | 1992-11-05 | 1994-06-06 | Novo Nordisk Entotech Inc | Potentiator of bacillus pesticidal activity |
-
1996
- 1996-04-25 ZA ZA9603315A patent/ZA963315B/xx unknown
- 1996-05-17 CA CA002222801A patent/CA2222801A1/en not_active Abandoned
- 1996-05-17 AU AU57970/96A patent/AU717681B2/en not_active Ceased
- 1996-05-17 JP JP53651996A patent/JP3794705B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-05-17 ES ES96914686T patent/ES2183947T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-17 CZ CZ973625A patent/CZ362597A3/cs unknown
- 1996-05-17 DE DE69622859T patent/DE69622859T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-17 AT AT96914686T patent/ATE221912T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-05-17 PL PL96323472A patent/PL183156B1/pl unknown
- 1996-05-17 DK DK96914686T patent/DK0828819T3/da active
- 1996-05-17 EP EP96914686A patent/EP0828819B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-17 HU HU9802569A patent/HUP9802569A3/hu unknown
- 1996-05-17 PT PT96914686T patent/PT828819E/pt unknown
- 1996-05-17 WO PCT/US1996/007136 patent/WO1996038539A1/en not_active Application Discontinuation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
PT828819E (pt) | 2002-12-31 |
EP0828819A1 (en) | 1998-03-18 |
ZA963315B (en) | 1997-10-27 |
EP0828819B1 (en) | 2002-08-07 |
JPH11506004A (ja) | 1999-06-02 |
ATE221912T1 (de) | 2002-08-15 |
WO1996038539A1 (en) | 1996-12-05 |
DK0828819T3 (da) | 2002-12-02 |
CZ362597A3 (cs) | 1998-02-18 |
DE69622859T2 (de) | 2003-04-30 |
AU717681B2 (en) | 2000-03-30 |
HUP9802569A2 (hu) | 1999-02-01 |
CA2222801A1 (en) | 1996-12-05 |
JP3794705B2 (ja) | 2006-07-12 |
HUP9802569A3 (en) | 2002-07-29 |
DE69622859D1 (de) | 2002-09-12 |
ES2183947T3 (es) | 2003-04-01 |
AU5797096A (en) | 1996-12-18 |
PL323472A1 (en) | 1998-03-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU683859B2 (en) | Potentiator of (bacillus) pesticidal activity | |
US5859235A (en) | Dipteran-active uracil derivative | |
DE69531731T2 (de) | Neue pestizid-zusammenstellungen und bacillus thuringiensis stämme | |
CA2223034C (en) | Methods for producing a potentiator of bacillus pesticidal activity | |
US6268181B1 (en) | Methods for producing a potentiator of Bacillus pesticidal activity | |
US5976563A (en) | Pesticidal composition and Bacillus thuringiensis strain | |
US5976564A (en) | Pesticidal composition and bacillus thurigiensis strain | |
CZ291438B6 (cs) | Kmen Bacillus thuringiensis s pesticidním účinkem | |
EP0828819B1 (en) | Mutants which produce a potentiator of bacillus pesticidal activity | |
US6277624B1 (en) | Mutants which produce a potentiator of Bacillus pesticidal activity | |
CZ400497A3 (cs) | Nová pesticidní substance Bacillus thuringiensis | |
US6406691B1 (en) | Potentiator of Bacillus pesticidal activity | |
MXPA97000326A (en) | Novedous active compound and dipters and cepa debacillus thuringien | |
MXPA97007017A (en) | Novedous pesticide composition and bacillus thuringien seed |