JPH11504852A

JPH11504852A - 生物学的吸着支持体

Info

Publication number: JPH11504852A
Application number: JP8533302A
Authority: JP
Inventors: エル．コールマン，パトリック; ケー．デーブ，マーク; ビー．スタール，ジュリー
Original assignee: ミネソタマイニングアンドマニュファクチャリングカンパニー
Priority date: 1995-05-04
Filing date: 1996-04-01
Publication date: 1999-05-11
Also published as: EP0823857B1; EP0823857A1; WO1996034670A1; CA2218888A1; DE69622395T2; US5709943A; CN1100582C; DE69622395D1; KR19990008299A; CN1183735A; AU5531396A

Abstract

(57)【要約】本発明は、金属被覆され配向された離散したサブミクロンサイズのウイスカーを含むナノ構造表面を支持する不活性基材を含む生物学的アッセイおよび吸着支持体を提供する。場合に応じて、相似的に金属被覆されたウイスカーを第２の物質で部分的に包むか、または相似被覆することもできる。ナノ構造表面は、ボルテックスまたは撹拌なしに高レベルの堅固な結合で生体分子を迅速に吸着する。有利なことに結合した生体分子は、それらの生物学的活性を維持する。

Description

【発明の詳細な説明】生物学的吸着支持体技術分野本発明は、生物学的吸着支持体、より正確にはナノ構造表面形態に基づく生物学的吸着支持体に関する。発明の背景従来の生体分子吸着支持体は、顕性物理的ミクロ構造を持たない、すなわち支持体の平均的幾何学的形状により表面積が決まる、ポリマー、コポリマーまたは化学的機能付与ポリマー表面からなる。ミクロスケールでは、ポリマー表面は疎水性および親水性部位の不均一な混合物を提供し、異なる生体分子親和性レベル範囲が吸着体基材に生じる。平らな二次元表面上では、生体分子は基材に向かって、そして基材から遠ざかって等しい確率で拡散する。一般に吸着速度は、溶液のボルテックスおよび振盪によって加速される。発明の要約簡単には、本発明の一つの側面では、金属被覆され配向された離散した例えば３を超える高い縦横比と、１乃至 200/μm²の範囲の面積数密度を有するサブミクロンサイズ素子を含むナノ構造表面を支持する不活性基材を含む生物学的吸着支持体が提供される。表面特徴がナノメートルサイズ規模であるためここでナノ構造と称するナノ構造表面の物理的形態は、有利なことに、溶液中で表面と接触する生体分子に短い拡散経路距離内で高い比表面積を提供する。上に生体分子が吸着するナノ構造ウイスカーの被覆物質は容易に変更できるが、貴金属などの単純金属が好ましい。ナノ構造表面を担持する基材は、概して柔軟で不活性であり容易に切断または成形できる。支持体上の生体分子吸着は迅速であり、結果的に高レベル（85 乃至90％）の堅固な結合が得られ、大きな絶対的結合量（約 10 mg/cm²）を生じ、ボルテックスまたは撹拌を必用としない。さらに堅固に結合した生体分子は、その生物学的活性を維持することが示された。生物学的に活性な物質の性質が高度に不均一であること、すなわち生物学的に活性な物質（概して１１個以上の異なるモノマーを有する）と比較してターポリマーが単純（概して３個のみの異なるモノマーを有する）と考えられることを考慮すると、結合の密接さおよび生物学的活性の保持はどちらも特に驚くべきことである。本発明のナノ構造表面は、高い縦横比、好ましくは 40 乃至 50/μm²の範囲にある面積数密度を有し、その他の既知吸着支持体の 10 乃至 15 倍の二次元表面積を生体分子吸着のために提供できる。ナノ構造ウイスカー上の Pt などの純粋金属被覆は、吸着性が一様な表面を作り出す。さらに配向素子は、高い縦横比と高い充填密度（すなわち面積数密度）を有し、生体分子がナノ構造層内に拡散する際にそれらの一時的取込みを可能にし、ボルテックスまたは振盪する必用なしに多くの生体分子／吸着性表面衝突の機会を作る。本発明の別の側面では生物学的吸着支持体は、有利なことにフィルター、センサーなどの分離装置として使用できる。例えば生物学的に活性な物質を含む液体から、液体の流れの中の１つ以上の生物学的に活性な物質が抽出または分離されるように、生物学的吸着支持体の上または中に液体の流れを通過させることができる。抽出または分離された生物学的に活性な物質は、ナノ構造素子に単層として付着する。生物学的に活性な物質は、例えば所定レベルの物質が吸着されるまで、所定時間経過後、あるいは支持体の生物学的に活性な物質による飽和点などあらゆる任意の終点で除去できる。本発明のさらに別の側面では、生物学的吸着支持体を例えば触媒として、１つの化学種を別のものに変換する定常状態生物学的過程で使用できる。これらの特徴は、当業者の予想外である本発明のいくつかの側面を提供する。吸着支持体技術で知られたものと比較して、この物質表面上への生体分子結合速度は迅速であり、従来の二次元表面への生体分子結合について観察されたのよりもはるかに早い。意外なことに生体分子は、迅速に広い表面に結合する。本発明の別の長所は、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）処理による脱離に対する抵抗性が示す生体分子結合の密接さである。このような高い残留結合は、このような生体分子の表面への共有カップリングについてのみ観察されるのが一般的である。このように強固な結合が生物学的活性の保持と同時に存在できることも意外である。ナノ構造素子に特有の特徴を利用して、（a）金属被覆され配向された離散した高い縦横比と１乃至 200/μm²の範囲の面積数密度を有するサブミクロンサイズ素子を含むナノ構造表面を支持する不活性基材を含む生物学的吸着支持体と、（b）金属被覆された素子に付着した生物学的に活性な物質の単層であって、生物学的に活性な層とを含む複合材製品を製造できる。有利なことに複合材製品は、分離装置として使用することもでき、金属被覆された素子に付着した生物学的に活性な物質は、特定の生物学的に活性な物質に特異的である。代案として本発明のさらに別の側面では、 (a) 生体分子吸着性相似被覆され配向された離散した高い縦横比と、１乃至 200/μm²範囲の面積数密度とを有するサブミクロンサイズ素子を含むナノ構造表面を支持する不活性基材を含む生物学的吸着支持体と、 (b) 生体分子吸着性相似被覆された素子に付着した生物学的に活性な物質の第１の単層であって生物学的に活性な層と、 (c) 生物学的に活性な物質の第１の単層に付着する生物学的に活性な物質の第２の単層とを含む複合材製品が提供される。例えば、薬剤（生物学的に活性な物質の第２の単層）に一時的または恒久的に結合する生物学的に活性な物質の第１の単層で第１の複合材製品を被覆することで、飽和量または所定容量の薬剤を複合材製品の上に被覆できる。次にこの薬剤で被覆された複合材を使用して、特定部位において伝統的に吸着されたり目的領域から搬出されたりする薬剤が時限脱離あるいは持続的保持されるようにできる。この用途において、「生体分子」とも称される「生物学的に活性な物質」は、例えば生化学的、免疫化学的、生理学的、および／または薬学的に活性である、すなわち生物学的過程に影響するような反応を生じるタンパク質、抗体、抗原、酵素、補助因子、レシチン、ホルモン、脂質、メディエータ、受容体、凝固因子、ヒストン、細胞受容体、および細胞表面抗原などの物質、さらに（SDS ゲル電気泳動で測定した）分子量が少なくとも 1000 以上、好ましくは少なくとも 5000 以上である物質または生体分子を含めた分子を意味する。図の簡単な説明図 1A は、基材により支持された被覆されない離散したサブミクロンサイズのウイスカーの斜視図である。図 1B は、離散したサブミクロンサイズのウイスカーが相似被覆された後の図 1A の斜視図である。図２は、プロテインＡ吸着のためのナノ構造素子を形成するラテックスで部分的に包まれPt被覆されたウイスカーの拡大率10,000倍の走査電顕写真（SEM）である。図３は、Cu被覆されたポリアミド基材上に伸びる包まれないPt被覆されたウイスカーの拡大率150,000倍のSEMである。図４は、吸着されたプロテインＡの初期および堅固な結合質量を時間の関数としてグラフ表示したものである。図５は、吸着されたウシ血清アルブミン（BSA）の初期および堅固な結合質量を時間の関数としてグラフ表示したものである。図６は、吸着されたヒト免疫グロブリンＧ（IgG）の初期および堅固な結合質量を時間の関数としてグラフ表示したものである。図７は、プロテインＡ吸着後のPt被覆されたウイスカーの拡大率150,000倍のS EMである。好ましい実施例の説明本発明は、金属被覆され配向された離散したサブミクロンサイズのウイスカーを含むナノ構造表面を支持する不活性基材を含む生物学的吸着支持体を提供する。場合に応じて、相似的に金属被覆されたウイスカーを第２の物質で部分的に包むかまたは相似被覆することもできる。ナノ構造表面は、ボルテックスまたは撹拌なしに高レベルの堅固な結合で生体分子を迅速に吸着する。有利なことに、結合した生体分子は、それらの生物学的活性を維持する。この用法では「ナノ構造」とは、少なくとも１つの寸法が数十ナノメートル程度の空間規模である組成非均一性を含有する表面領域を意味する。２つの寸法において空間非均一性を有するこのようなナノ構造表面領域の例としては、迅速で堅固な結合のような望ましい特性を達成するために単位面積あたり十分な数があり、相互に接触することなく基材表面上に一様に配向した引き延ばされ金属被覆された素子（ナノ構造素子）を含むものが挙げられる。二次元空間的に非均一性のナノ構造表面領域は、３つの直交性の方向のいずれか２つに沿った領域を通過して、例えばナノ構造素子および空隙など少なくとも２つの異なる物質が観察される。このようなナノ構造物質については、例えばここに参考として含めた米国特許第 4,812,352 号で述べられている。簡単に述べると、以後 PR149 と称する顔料N,N'-ジ(3,5-キシリル)ペリレン-3 ,4:9,10 ビス（ジカルボキシイミド）などの本質的に二次元形状の分子および非局在化π-電子密度を有する有機物質をポリイミドウェブなどの柔軟な基材上に室温に近い温度で0.15μm程度の厚さに真空蒸着する。その後、初期の均一な顔料フィルムを高度なナノ構造のウイスカーに転換するのに十分な真空中で、基材および PR149 被覆をアニールする。図１（a）および１（b）について述べると、ナノ構造表面（10）は、基材（11）によって支持され、高さが１乃至２μmであり、高い側面比（幅に対する長さ）と、高い面積数密度（１乃至200/μm₂）を有し、直径が約0.05 μmで、ウイスカーとウイスカーの間隔が0.05 μm程度以下である離散し一様に配向された結晶性ウイスカー（12）からなる。結果的に得られる結晶性ウイスカー（12）の幾何学的表面は、このようにして二次元表面(10) を 10 乃至 15 倍増大することができる。次にオリジナルの基材（11）に付着する結晶性ウイスカー（12）を金属、半金属、半導体、誘電体または有機物質で相似被覆できる。この用途では、スパッターまたは蒸着された金属被覆、特に Pt が生体分子の直接吸着のために望ましい表面であることが示される。金属被覆（ 13）は、被覆されたウイスカー（14）を強化し、溶液中への浸漬に十分耐える基材（11）への付着を維持する一助にもなる。場合に応じて、各ナノ構造素子の周囲に生物学的機能性を有する薄い相似被覆を塗布するように、上述の被覆されたナノ構造素子をさらに有機物質で相似被覆することもできる。この被覆の塗布方法としては、例えば自己組織化単層などが挙げられる。さらにウイスカー間の空隙を部分的にのみ満たし、固体状態に硬化するとオリジナル基材から離層できるプレポリマーなどの流動性物質をウイスカー構造（14 ）に上塗りすることで、上述のナノ構造表面を部分的に包むこともできる。固体化ポリマー部分的封入剤は、離層時にオリジナル基材からウイスカーを引き剥がし、ウイスカーが突出端を有するのでテクスチャ付きの表面が作り出される。この時点でこの表面が生体分子吸着表面となる。多くのポリマーが封入剤として使用でき、生体分子結合をさらに向上させるためにそれらを選択することもできる。好ましい基材物質としては、ポリマー、金属、セラミック、ガラス、および半導体などの有機または無機物質が挙げられる。好ましい有機基材は、金属被覆ポリイミドフィルム（DuPont Corp.から KAPTON^TMの商品名の元に市販される）である。本発明で適切な基材物質の追加例については、ここに参考として含めた米国特許第 4,812,352 号に記載されている。本発明を実証するために使用される生物学的吸着支持体のナノ構造表面領域を作るのに特に有用な方法は、ここに参考として含めた米国特許第 5,238,729 号に記載されている。ナノ構造表面領域を含むナノ構造素子については、ここに参考として含めた米国特許第 5,039,561 号および第 4,812,352 号に記載されている。ナノ構造表面を作り出すためのその他の手段としては、（1）加熱基材上への有機顔料の真空蒸着、（2）真空蒸着に代わる物理的蒸気輸送成長の使用（3）高入射角での無機物質の真空蒸着、（4）示差スパッター率を有するポリマー、半導体または合金のイオンまたは rfスパッターエッチング、（5）ミクロアイランドマスキングを使用したポリマーのスパッターエッチング、（6）写真平板（UV および X 線）、および電子ビーム平板印刷、（7）ベーマイトを製造するためのアルミニウムの加水分解、（8）金属の電気化学エッチングおよび粗面金属の電気めっき、（9）写真ポリマー表面上の写真成形加工、（10）共晶合金の方向性固化およびエッチング、および（11） VLS結晶成長が挙げられる。これらのいずれの方法でもナノ構造表面を製造できる。いくつかの技術または方法がウイスカー様の立体配置を製造するために有用である。無機、金属、または半導体ベースのミクロ構造層またはミクロ構造を作るための方法については、J．Vac．Sei．Tech．1983，1(3)，1398-1402 および米国特許第 4,812,352 号、第 5,039,561 号、第 5,238,729 号で述べられている。ウイスカーを調整するための有用な出発物質としては、有機および無機化合物が挙げられる。ウイスカーは実質的に、引き続く薄い金属被覆、オプションの相似被覆、およびオプションの封入剤のための非反応性または受動マトリックスである。好ましい有機物質は、多核の芳香族炭化水素および複素環式芳香族化合物として大まかに分類できる。特に有用な多核の芳香族炭化水素としては、例えばナフタレン、フェナントレン、ペリレン、アントラセン、コロネン、およびピレンなどが挙げられる。好ましい多核の芳香族炭化水素は、N,N'-ジ(3,5-キシリル）ペリレン-3,4:9,10 ビス（ジカルボキシイミド）である（Hoechst-Celanese C orp.から「C.I.Pigment Red 149」の商品名の元に市販され「PR149」とも称される）。真空蒸着、スパッターコーティング、化学的蒸着、スプレー塗装、溶液吸着、ラングミュア・ブロジェット法、またはナイフ塗布を含むがこれらに限定されない基材上に有機物質の層を塗布するための既知の技術を用いて、ウイスカーを製造するために使用される有機物質を基材上に被覆しても良い。好ましくは物理的真空蒸着によって有機層が塗布される（すなわち真空下における有機物質の昇華）。沈着中の基材の好ましい温度は、選択される有機物質に依存する。PR149 の場合、室温（すなわち約25℃）に近い基材温度で十分である。有機ウイスカーを作り出すための好ましい方法では、沈着有機層の厚さがアニールステップ中に形成するミクロ構造の主要寸法を定める。この好ましい方法には、室温またはそれに近い温度でウイスカー生成物質を沈着し、次にウイスカー生成物質を約 130 Pa 未満、好ましくは 10^-2 Pa 未満の真空中でアニールするために基材温度を上昇させることが含まれる。ウイスカーは、ここに参考として含めた米国特許第 5,039,561 号が述べる特徴および方法で、基材上に成長する。このウイスカーを得るための方法については、以下の実施例１に述べた。ウイスカー生成のための代案の過程には、高温のウイスカー生成物質を高温の基材上に沈着することが含まれる。高い縦横比の不規則配向ウイスカーが得られるまで、約 130 Pa 未満の真空で物質が真空沈着される。この代案の方法は、ここに参考として含めた米国特許第 5,352,651 号で述べられている。どちらの場合も PR149 が好ましい有機物質である。アニール前の PR149 層の厚さは、概して約 0.05 乃至約 0.3 μm の範囲、好ましくは 0.05 乃至 0.15 μmの範囲、最も好ましくは 0.1 乃至 0.15 μm の範囲である。有機物質を例えば、約 250℃で30分間 1.0 x 10^-2 Paでアニールすると、ウイスカーが製造される。好ましくはウイスカーは、非晶質でなく単結晶性または複結晶性である。ミクロ構造の結晶性および均一な配向性のために、ウイスカー層の化学的および物理的双方の特性は不等方性である。ウイスカーの配向性は、概して基材表面に対して一様に垂直である。各ウイスカーの好ましい長さは、0.1 乃至３μmの範囲にあり、より好ましくは 0.5乃至 2.5μmの範囲にある。各ウイスカーの横断面の幅は、好ましくは 0.1 μm未満である。ウイスカーは、好ましくは高い縦横比を有する（すなわちウイスカーの直径に対するウイスカーの長さの比が約 3:1 乃至約 100:1 の範囲にある）。相似被覆されたナノ構造素子の面積数密度は、好ましくは１乃至 200/μm²の範囲、好ましくは５乃至 50/μm²の範囲にある。さらにナノ構造素子が一軸配向でもあるいは不規則配向でも、各ナノ構造素子が少なくとも１点で、あらゆるナノ構造素子に共通の二次元表面と接触することが好ましい。図 1B について述べると、幅が 1μm未満で長さが２から 3μmのナノ構造素子（14）は、有機コアウイスカー（12）および少なくとも１つの相似被覆（13）を含む複合材である。相似被覆物質は、バイオマテリアル、自己組織化単層などの有機物質、フタロシアニンなどの有機顔料、または複素環式芳香族化合物あるいは無機物質からなる群より選択される。一般に相似被覆物質は、生体分子の吸着および結合を最適化するために選択される。好ましくは、無機被覆物質は、金属、半金属、誘電体および半導体からなる群より選択される。好ましい金属相似被覆物質としては、Pt、Pd、Ag、Cu、Au、およびCrCo、NiCr、および PtIr などの合金が挙げられる。ウイスカーを取り巻く相似被覆物質壁の厚さは、約 0.5 nm 乃至約 50 nm の範囲である。例えば米国特許第 5,039,561 号に述べられたような従来技術を使用して、ウイスカー上に相似被覆を沈着させても良い。好ましくは相似被覆は、機械力または機械様の力によるナノ構造表面領域の撹乱を避ける方法で沈着される。より好ましくは無機相似被覆は、真空昇華、スパッター、蒸気輸送、および化学的蒸着などの真空蒸着法によって沈着される。さらに第２、第３またはそれ以上の相似被覆をナノ構造素子に塗布できる。追加的な相似被覆を塗布するための特に有用な方法は、例えばチオ末端オリゴマーなどの溶液からの有機物質の吸着である。（上述したような）複数部材ナノ構造素子が好ましいが、本発明では単一部材ナノ構造素子も考察する。単一部材素子は、複数部材素子と類似した寸法を有するが、単一部材素子は金属相似被覆に関して上述したような金属などの単一物質のみからなる。場合に応じて、好ましくはないが、封入剤がナノ構造素子を全部または部分的に包むように、有機または無機封入剤をナノ構造表面領域の露出表面に塗布しても良い。封入剤は、液体、蒸気、または固体状態から、特有の封入剤に適切な手段でナノ構造表面領域に塗布しても良い。塗布した封入剤は、特有の物質に適切な手段で固化、縮合または重合しても良い。ナノ構造素子が包まれた後、結果的に得られる複合材製品、すなわち本発明の包まれた生物学的吸着支持体は、基材とナノ構造層の界面で、例えば包まれた生物学的吸着支持体を基材から引き剥がす、基材を包まれた生物学的吸着支持体から引き剥がす、あるいはその両方などの機械的手段によって基材から離層される。場合によっては、包まれた生物学的吸着支持体は、封入剤が固化する間に自己離層する。代案のそして好ましい方法は、包まれた生物学的吸着支持体を製造するための無溶剤的方法であり、いかなるナノ構造表面部材、すなわち様々な物質組成、形状、配向性、および充填密度のナノ構造素子を含むものにも概念において応用できる。ナノ構造素子は、米国特許番号第 5,352,651 号に述べられたように、あらゆる所定深度のポリマーウェブに熱間圧延しても良い。生物学的吸着支持体は、概して 25 乃至 50 μm 厚さで、多数の小型サンプル片を裁断または打ち抜くのに適した基材上で広いシートに製造される。例えば小さい直径の円盤（約６ mm）を打ち抜いて、ナノ構造表面がウェル内部を向くように微量定量ウェルの底に置いても良い。有利なことに、ナノ構造表面の有用さと生物学的活性への特異性を増大させるために、化学的および生物学的機能性をウイスカーの相似被覆へ組み込んでも、ナノ構造表面の大きな表面積と小さな規模は、損なわれない。実施例で示されたナノ構造表面の表面積が 10 乃至 15 倍増大する結果、本発明の生物学的吸着支持体上への結合タンパク質は、ほぼ累乗的に増大すると考えられる。 SDS 抵抗性によって測定される堅固に結合した生体分子の割合は、一様に、特に Pt で高く、従来の支持体からの改善が示される。理論による拘束および従来の生物学的吸着支持体との比較は意図しないが、自然に酸化した純粋金属基材上では、小規模な疎水性および親水性領域の均一性がより良好であることが予期され、より高い SDS 抵抗性ならびに質量結合レベルをある程度説明する。理論による拘束は意図しないが、絶縁（ポリマー）物質と比較して金属基材（吸着体）上で電荷が容易に再分布できることも、拡散および静電気的鏡像力が生じる吸着体と水との界面に溶解した生体分子が接近する際、結合を促進すると考えられる。生体分子が吸着体に向かってまたは吸着体から遠ざかって拡散する際、それらが比較的長い円柱状ウイスカー間で効果的に取り込まれることで、一様に平らな吸着性表面で見られるのよりも多くの単位ランダムウォーク距離あたりの生体分子／吸着体衝突が生じる。すなわちウイスカーを持つ表面積のほとんどはウイスカーの側面が占めるので、生体分子がウイスカー表面に近づくが吸着されないで拡散する場合、大部分はわずかな「フィックの拡散距離」を隔てた別のウイスカー表面に向かって進む。構造化されない平坦な基材上では、生体分子は統計的に２回の内１回は拡散して遠ざかる。この衝突頻度の増大が吸着過程の改善された動態を説明するかもしれない。本発明の生物学的吸着支持体は、生体分子の結合が有用なあらゆる場合に使用できる。支持体は、例えば結合した生体分子量が反応速度を制限する場合など、より堅固な、あるいはより高い密度の、あるいはより高い吸着速度の生体分子結合が必用な場合に特に有利である。概してこのような状況は、反応速度が一般に酵素濃度の一次反応である酵素反応体で生じる。別の例は、親和性精製システムにおける結合した生体分子のようないくつかの機能性グループの量に、システムの容量が概して比例する精製システムである。別の例は、試験感度が検知分子（リガンド）感度の高さに比例し、検知分子数に制限されることが多い分析試験である。結合する検知分子（多くは生体分子）密度が増大すると、結合する分析物量が増大してシグナルが増大する。さらに別の例は、検出感度が結合した生体分子数の関数である結合した生体分子のバイオセンサーとしての使用である。本発明の目的および利点を以下の実施例でさらに詳しく説明するが、これらの実施例で述べる特有の物質およびそれらの量、ならびに条件と詳細は、本発明を不当に制限するものではない。あらゆる物質は、特に断りのない限り市販されているかまたは技術分野で既知である。全サンプルは、特に断りのない限り三連で調整して分析し、平均は標準偏差と共に以下の表にまとめて記載した。実施例 SDS 抵抗性以下に述べる%SDS 抵抗性は、次のようにして計算した。 [[堅固な結合タンパク質]÷[初期結合タンパク質]] x 100 ＝ %SDS 抵抗性。これが SDS 処理による可溶化に抵抗するタンパク質の百分率である。実施例 1-2 ３cm x 10cmのガラス顕微鏡スライドを約 100 nm 厚さに Cu で rf スパッターコーティングした。有機顔料 N,N'-ジ(3,5-キシリル)ペリレン-3,4:9,10 ビス（ジカルボキシイミド）（PR149）を Cu 被覆した顕微鏡スライド上に厚さ 146 nm に平均沈着速度 20 nm/分で真空蒸着した（ベース圧力約 2.0 x 10^-4 Pa）。次に米国特許第 4,812,352 号が述べるように、有機顔料層を有するスライドを最高温度 200℃で真空アニールし、有機顔料層を離散した垂直に配向する結晶性ウイスカーのナノ構造層に転換した。次にウイスカーを持つ有機顔料層の約半分を Cu で rf スパッターコーティングし、二次元相当厚が約 100 nm である相似被覆をウイスカー上に提供した。ウイスカーの表面積は平らな表面と比較してはるかに大きかったので、Cu 被覆の実効厚は 100 nm よりもきわめて薄かった。ウイスカーの約３分の１を Pt でスパッターコーティングし、二次元相当厚が約 100 nm の相似的 Pt 被覆を提供した。残る約６分の１のスライド領域は、上記のようにして調整した露出 PR149 ウイスカーのままにした。従来の加圧空気塗料吹付け器を使用して、封入ラテックス前駆物質（3M Co.から「STRIPPABLE MASKANT YR-43」の商品名の元に市販されている）の層を相似被覆されたナノ構造層の上にスプレーし、濡れ厚さ約 0.157 乃至 0.165 mm を提供した。次に封入層を従来の空気乾燥器中で約 20 分間、温度約 66℃で乾燥した。複合被覆製品の３領域からそれぞれ５ mm 四方のサンプル３枚のセットを裁断し、ピンセットでガラススライドを剥がした。ガラススライド上のオリジナルの Cu 被覆は、スライド上に残った。第１のサンプルセットは、可剥性マスキング剤に包まれ、Cu で相似被覆されたウイスカーを含有した（実施例 1）。３個のサンプルの第２のセットは、可剥性マスキング剤に包まれ、Pt で相似被覆されたウイスカーを含有した（実施例 2 ）。第１の対照は、可剥性マスキング剤に包まれた（相似被覆されない）露出ウイスカーを含有する５ mm の四角形のセットであった。第２の対照としては、鋼板上に吹き付けられて乾燥し、包まれたナノ構造のない表面を提供する可剥性マスキング剤の層から３個の５ mm 四角形のセットを裁断した。金属被覆されたウイスカーを有するサンプル片のナノ構造表面は、光拘束高率が高いため、非常に黒っぽく見えた。可剥性マスキング剤中に部分的に包埋され Pt で相似被覆されたウイスカーの表面を図２の SEM 写真に示したが、Cu で相似被覆されたウイスカーよりも表面テクスチャがさらに際だっているようであった。タンパク質結合測定については、個々のサンプル四角形をそれぞれ、以下 PBS と称する pH 7.5 のリン酸緩衝食塩水（25 mM のリン酸ナトリウム中0.15 M の NaCl）（J．Chromatog.，vol．512,p．345-363，1990）中 250 μg/mLの¹²⁵I-放射能標識プロテインＡ（マサチューセッツ州ボストンの Genzyme Corp.）溶液中で振盪しながら 18 時間インキュベートした。次に表面を pH 9.0の 3.0 M エタノールアミンで１時間処理し、PBSで４回洗浄した。Packard自動γ放射線計数管 Model 5230（コネチカット州メリデンの Canberra Industries Inc./Packard In strument Co.）中で残留放射能を測定して、初期結合タンパク質レベルを求めた。Pt 被覆、Cu 被覆、および被覆されないサンプルセットをそれぞれ三連で調製し分析した。ラテックス対照も三連で調製し分析した。３個の被覆されないウイスカーサンプル、ptおよび Cu 相似被覆ウイスカーサンプルならびにラテックス対照についてのサンプル平均および単位面積取り込み当たりタンパク質質量の平均偏差は、表１にまとめた。次にサンプルを SDS の１％水溶液中でさらに４時間、37℃でインキュベートし、次に SDS で３回洗浄して緩く結合したタンパク質を除去した。残る放射能を再度測定して、残留する堅固な結合タンパク質を求めた。SDS 抵抗性および堅固な結合タンパク質密度に関する三連のサンプルの平均および平均偏差は表１にまとめた。注意すべきことに、Pt 相似被覆ウイスカーのサンプルは、その他のサンプルタイプと比較して、有意により高い結合および SDS 抵抗性を有した。ラテックス対照サンプルおよび Cu 被覆ウイスカーサンプルは、SDS 処理後に裂け、被覆されないサンプルは破壊されたが、サンプルに分析処理を施し、表１に掲載した。Pt 相似被覆ウイスカーは、原型を保つようであった。実施例 3-4 これらの実施例では、実施例１および２で調製したのと同じ部分的封入ナノ構造サンプルタイプを使用したが、より短いインキュベーション時間と異なる緩衝液溶液を使用した。実施例１および２に述べるようにして調製された、ラテックス封入ウイスカーを持つサンプルから１辺が５ mm のサンプル四角形を裁断し、Cu 被覆ガラススライドから離層した。Pt および Cu 被覆領域、およびプレーンラテックス対照からそれぞれ６個の四角形を裁断した。露出ウイスカーを持つ対照領域からは、３個のサンプルのみが入手できた。初期タンパク質インキュベーション時間が 18 時間でなく２時間であり、２つの異なる緩衝溶液を試験したこと以外は、実施例１および２で述べたのと同一のプロテインＡ結合法および測定法を使用した。各タイプのサンプル四角形３個を pH 7.5の PB S 中のプロテインＡで被覆し、その他の３個の四角形を以下「硫酸緩衝液」と称する pH 7.5 のリン酸ナトリウム緩衝液中 1.5 モルの硫酸ナトリウム中のプロテインＡで被覆した。封入露出ウイスカーサンプル領域からの５ mm 四角形３個は、PBS 緩衝液中のプロテインＡのみで被覆した。エタノールアミンと共にインキュベートした後、全サンプルを PBS 緩衝液で３回洗浄した。表２には、三連サンプルについて初期結合、SDS 抵抗性および堅固な結合タンパク質濃度を標準偏差と共に、各サンプルタイプおよび緩衝液条件についてまとめた。表２中の結果では、Pt 被覆サンプルは、Cu 被覆または露出ウイスカータイプのどちらよりもかなり良いタンパク質吸着を示し、SDS 抵抗性が非常に高い傾向も継続し、実施例１および２の結果が裏付けられた。Pt では、硫酸緩衝液がより多くの結合タンパク質を生じた。実施例 5-8 実施例 5-8 では、封入されないウイスカーのナノ構造表面域がはるかに短い露出時間ではるかに大量のタンパク質を吸着することが実証され、表面形態とは独立した様々な金属の相対効果が明らかにされた。これらの実施例では、それぞれのウイスカーミクロ構造が確実に同じになるように、全て同一サンプルの異なる四分円上に被覆された４種類の異なる金属タイプが特に比較されている。図３では、実施例 9-12に特有であるが、この実施例で使用されたものの特色を示す Pt 相似被覆ウイスカーの SEM 写真が示されている。 0.050 mm（２ミル）厚さのボリイミドシート（ICI Films）を２個のステンレス鋼環の間に引っ張り固定して、直径 8.3 cm の円盤を形成した。このポリイミド基材円盤上に、Cu をおよそ 180 nm厚さに rf スパッターコーティングした。実施例 1-2 で述べたように、Cu 被覆ポリイミド上に PR149赤色顔料をおよそ15 0 nm 厚さに真空蒸着し、真空（ベース圧力 2.5 x 10^-5 Pa）中、温度 280℃で4 0分間アニールした。赤色顔料被覆ポリイミドを 1-2 μm長さの配向結晶性ウイスカーに転換した。別の従来の（13.47 MHz）rfスパッター真空チャンバー内で、基材円盤の四分円を一度に１つだけ露出する金属マスクを使用して、Cu（実施例 5）、CoCr（86 :14）（実施例 6）、および Fe（実施例 7）を別々に３つの四分円のそれぞれに連続してスパッター沈着し、ウイスカーを相似被覆した。20 cm ターゲットは、サンプルの10 cm 上にあり、基材は水冷され、スパッターは3.2 Pa の Ar 中、5 00Ｗの順電流および 1200 乃至 1600Ｖのターゲットバイヤスで10分間行われた。Cu、CoCrおよび Fe の質量相当厚は、それぞれ約 350 nm、250 nm および250 nm であった。別の類似したスパッターチャンバー内で、円盤の四分円の４つめに Pt を質量相当厚 120 nm にスパッターした（実施例 8）。対照として、第２の Cu 被覆ポリイミド円盤を PR149 で蒸気被覆したが、アニールはしなかった（すなわちウイスカーなし）。実施例5-8 と同様にして、この転換されない顔料層にFe、Cu、CoCr および pt 被覆をスパッター沈着した。ナノ構造サンプル円盤、および対照サンプル円盤の各四分円から１辺が５ mm の四角形６個を裁断した（合計 48 個の四角形）。PBS または硫酸緩衝液中 250 mg/mlの ¹²⁵I-プロテインＡ溶液中でボルテックスまたは振盪なしに、四角形を三連で２時間インキュベートした。全サンプルを適切な緩衝液で洗浄した。振盪またはボルテックスなしに、放射能非標識 BSA （ウシ血清アルブミン）溶液（PBS 緩衝液中 2.5 mg/mL）で１時間インキュベートまたは反応して、残留空表面を保護した。 PBS 緩衝液溶液で３回洗浄後、実施例 1-2 で述べたようにして残る放射能から全結合プロテイン A を求めた。次に実施例１で述べたように振盪せずに SDS 処理によって、緩く結合したタンパク質を除去した。放射能測定を繰り返して、堅固な結合タンパク質濃度を求めた。表３では、各緩衝液溶液について４種の金属被覆ウイスカーサンプルタイプの初期結合、SDS 抵抗性、および堅固な結合タンパク質質量をまとめた。ウイスカー構造を持たないあらゆる金属被覆 PR149 参照サンプルは、洗浄または SDS 処理後に崩壊したので、対照サンプルからはデータは得られなかった。すなわち金属上塗層を有するペリレン被覆は、ポリイミド基材から離層した。金属被覆ウイスカーを持った全サンプルは、実験中ずっと原形を保った。表 3a および 3b の結果は、非常に高い質量濃度のプロテインＡがいかなる段階でもサンプルを振盪またはボルテックスすることなく、封入されず金属被覆されたウイスカーにわずか２時間で堅固に吸着されることを示す。これらの量は、実施例 3-4 の封入ウイスカーで得られたのよりも累乗的に大きかった。実施例 9-14 ２種の追加的タンパク質、BSA およびヒト IgG抗体を含むこれらの実施例では、封入されない pt 相似被覆ウイスカー上の吸着動態が調べられ、顕著な結合のためには7.5分程度の短いインキュベーション時間で十分であることが示された。実施例 3.8 で述べたようにして、直径 8.3 cmの Cu 被覆ポリイミド円盤を P R149 で蒸気被覆し、アニールした。実施例 5-8 で述べたように、rf スパッター圧 1.3 Pa の Ar および200Ｗ使の順電流を使用して、結果的に得られたナノ構造ウイスカーを Pt で質量相当厚120 nm に相似被覆した。図３は、拡大率 15 0,000 倍での Pt 被覆ウイスカーの高解像度 SEM 写真を示す。ウイスカー上の Pt 被覆において高レベルの非常に微細な結節構造がはっきりと示される。円盤から十分な数の５ mm 四角形サンプル片を裁断し、三連で PBS および硫酸緩衝液双方のシステム中の３種のタンパク質（プロテインＡ、ヒト IgG 抗体および BSA）について、7.5、15、30、60および120分の５種類のインキュベーション時間で結合試験をした。¹²⁵I-プロテインＡ溶液は、実施例 1-8 で使用したものと同じであった。３種のタンパク質の濃度は、全て 250 mg/mL であった（B SA およびヒト IgG はどちらも Sigma Chemical Co.から非放射性形態で市販されている）。３種のタンパク質全てにおいて塩素濃度0.15Ｍ、pH7.5であった。プロテインＡおよび BSA では硫酸濃度 1.5Ｍ、pH 7.5であり、ヒト IgG では硫酸濃度0.75 Ｍ、pH 7.5であった。あらゆる未反応結合部位は、放射能非標識 BSA 溶液（2.5 mg/mL）で１時間不活性化した後、１回めは30分間、２回めと３回めは各 10 分間、PBS で３回洗浄した。実施例１で述べた SDS 処理を使用して、あらゆる緩く結合したタンパク質を変質および除去した。最後に、プレーンな被覆されないポリイミドフィルムを使用して、対照サンプルの同一セットを試験した。表４および６では、三連の測定について初期結合質量濃度、SDS 抵抗性および堅固な結合質量濃度を標準偏差と共にまとめ、２種の緩衝液システムそれぞれについてタンパク質タイプおよび露出時間に従って掲載した。表５および７では、露出ポリイミド対照から３種のタンパク質および２種の緩衝溶液について、時間の関数として初期結合質量濃度、SDS 抵抗性および堅固な結合質量濃度をまとめた。図 4-6（曲線 A-D）は、それぞれ２種の緩衝液について吸着時間の関数としての初期および堅固な結合タンパク質のグラフである。Ａ PBS Ｂ PBS（SDS 後）Ｃ硫酸緩衝液Ｄ硫酸緩衝液（SDS 後）Ｅ硫酸緩衝液中の対照Ｆ PBS 中の対照Ｇ PBS（SDS 後）中の対照Ｈ硫酸緩衝液（SDS 後）中の対照第一に結合レベルは、ここでも非常に高く実施例 5-8 に一致し、プロテインＡよりもヒト IgG および BSA でさらに高い。第二に結合レベルは 15 分間でほぼ水平状態に達し、7.5 分の最短観察時間で時々顕著に高いことがある。第三に実施例 5-8 とは対照的に、ヒト IgG（ヒト IgG）およびプロテインＡに対する結合レベルは、硫酸緩衝液中よりも PBS 中でより高い。第四に SDS 抵抗性は、ここでも非常に高く顕著に均一である。このような二次元ポリマー表面上の比較的に非常に低いタンパク質取り込み値は、プレーンな被覆されないポリイミド対照サンプルからの結果によってさらに例証される。対照サンプル（曲線 E-H）からの堅固な結合タンパク質量平均も図 4-6にプロットしたが、ナノ構造フィルムが２時間で、露出ポリイミドの最高 7 0 倍のタンパク質を吸着することが示される。実施例 15 タンパク質吸着の前に撮影した図３との比較で、図７は同一の Pt 被覆ウイスカーサンプルを振盪なしに PBS 中のプロテインＡ（250 mg/mL）を１時間吸着させて、水で 10 分間３回洗浄した後の拡大率 150,000 倍の高解像度走査電顕写真を示す。図３と同様に、ウイスカー上の Pt 相似被覆に同一の超微細テクスチャが見られるが、テクスチャはあたかも解像度が落ちたかのように視覚的にはっきり際だたない。図７のタンパク質被覆 Pt ウイスカーからの二次電子放出は、高くない。すなわち概して非露出ウイスカー程、明るくないようである。これらの観察は、スパッターされた Pt の明白な凹凸表面テクスチャの窪みや裂け目の中に横たわるタンパク質分子などの Pt 上の二次非導電被覆に一致する。非露出およびタンパク質露出ウイスカー上のこの Pt 被覆の粗さの外観差は、あらゆるウイスカー上に見られ、すなわち図３および７の顕微鏡写真は、珍しくはない。実施例 16 この実施例では、ナノ構造フィルムへの結合したタンパク質がその生物学的活性を維持し、タンパク質吸着支持体として有用なことが例証される。実施例 9-14 に述べたようにして、Cu 被覆 0.050 μm厚さポリイミドの直径 8.3 cmの円盤を PR149 で蒸気被覆し、アニールした。再度実施例 9-14に述べたように rfスパッター圧 1.3Paの Arおよび200Ｗの順電流を使用して、結果的に得られたナノ構造ウイスカーを Pt で質量相当厚 120 nm に相似被覆した。図３は、Pt 被覆ウイスカーの高解像度 SEM 写真を示す。ナノ構造サンプル円盤および被覆されないポリイミド対照フィルムからそれぞれ３個の５ mm四角形片の同一セット２つを裁断した。１つのセット（Set I）を pH 7.5の PBS 中濃度 250 mg/mLの¹²⁵IプロテインＡ 300 μLと60分間、周囲温度で反応させた。同時に第２のセット（Set II）を同一であるが非標識のプロテインＡ溶液と同一条件で反応させた。次に双方のセットを pH 7.5の PBS 中 2.5 mg/mL の BSA 500 mL で 19時間、周囲温度で処理した。表面の完全なブロッキングを確実にするために長い処理時間が必用であった。前出の実施例と同じく、ボルテックスまたは振盪せず、サンプルが沈むまでそっと旋回したのみである。双方のセットを 500 μL の精製水（Millipore から Milli-Q water の商品名で入手可能）でそれぞれ 15分ずつ４回洗浄した。セットＩを放射能について測定し、他方セットIIを周囲真空乾燥器内で５時間乾燥した。セットIIを pH 7.5 の PBS 中 250 mg/mL の¹²⁵I-ヒト IgG 300 mL と共に周囲温度で18時間インキュベートした。次にこのセットを放射能の測定前に PBS 500 mL で４回それぞれ 15 分ずつ洗浄した。表８では、表面へのプロテインＡ結合量、結合プロテインＡあたりの抗体結合比、および単位表面積あたりの抗体結合量をまとめた。表８は、ナノ構造表面へのプロテインＡ結合がポリイミド対照フィルムよりも単位面積あたり 50 倍であることを示す。結合したヒト IgG 量は 33 倍に増加し、その生物学的活性の本質的な保持が示唆される。結果は、溶液から IgG を精製して固体支持体上に濃縮するのにナノ構造表面が有効に用いられることを例証する。本発明の範囲と精神を逸脱することなく本発明の様々な修正および変更ができることは、当業者には明らかであり、本発明は上述の実施例により不当に制限されないものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者デーブ，マークケー. アメリカ合衆国，ミネソタ 55133−3427, セントポール，ポストオフィスボックス 33427 (72)発明者スタール，ジュリービー. アメリカ合衆国，ミネソタ 55133−3427, セントポール，ポストオフィスボックス 33427

Claims

【特許請求の範囲】１．金属被覆され１乃至 200 μm²の範囲の面積数密度を有する離散したナノ構造素子を含むナノ構造表面を支持する不活性基材を含む生物学的吸着支持体を分離装置として使用する方法。２．各ナノ構造素子が２部材素子であり、第１の部材が配向ウイスカーであり、第２の部材が生体分子吸着性相似被覆であり、前記相似被覆が前記第１の部材を覆う請求項１に記載の方法。３．生物学的に活性な物質が生物学的吸着支持体上に吸着される請求項１に記載の方法。４．ナノ構造素子の縦横比が３を超える請求項１に記載の方法。５． (a) 生体分子吸着性相似被覆され配向された離散した１乃至 200/μm² の範囲の面積数密度を有するサブミクロンサイズ素子を含むナノ構造表面を支持する不活性基材を含む生物学的吸着支持体と、 (b) 生体分子吸着性相似被覆された素子に付着した生物学的に活性な物質の単層であって生物学的に活性な層とを含む複合材製品。６．生体分子吸着性相似被覆が貴金属である請求項５に記載の複合材製品。７．請求項５に記載の複合材製品を分離装置、センサー、イムノアッセイ、抽出装置、またはフィルターの少なくとも１つとして使用する方法。８． (a) 生体分子吸着性相似被覆され配向された離散した１乃至 200/μm² の範囲の面積数密度を有するサブミクロンサイズ素子を含むナノ構造表面を支持する不活性基材を含む生物学的吸着支持体と、 (b) 生体分子吸着性相似被覆された素子に付着した生物学的に活性な物質の第１の単層であって生物学的に活性な層と、 (c) 生物学的に活性な物質の第１の単層に付着した生物学的に活性な物質の第２の単層とを含む複合材製品。９．請求項８に記載の複合材製品を分離装置、センサー、イムノアッセイ、抽出装置、またはフィルターの少なくとも１つとして使用する方法。１０．請求項８に記載の複合材製品を触媒反応体として使用する方法。