JPH11504209A - アポパイン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 この発明は、単離精製されたアポパインと称される酵素、アポパインを用いてアポパイン活性を調節する化合物をスクリーニングする方法、及び該スクリーニングにより同定された化合物に関する。全長のアポパインをコードする合成ＤＮＡ分子は精製された酵素から合成される。アポパインをコードする合成ＤＮＡは、種々の組換え宿主中で最適な発現が得られるように構築される。該ＤＮＡのクローンは全長の組換えアポパイン及びその誘導体を産生させる。精製天然アポパイン及び組換えアポパインは、アポパイン活性の調節物質、従って、アポパインのプロ炎症作用又はプロアポトーシス作用に関連する病原性症状の改善剤の同定に有用である。アポパインアンチセンス分子は、治療上アポパインのプロ炎症作用又はプロアポトーシス作用の低減又は除去に有用であり、一方アポパインを用いた遺伝子移植又は遺伝子治療はアポパインのプロ炎症作用又はプロアポトーシス作用の増進に有用である。これらの療法は、免疫不全症候群（例えばエイズ）、自己免疫疾患、病原性感染症、心血管及び神経の損傷、脱毛症、老化、癌、パーキンソン病並びにアルツハイマー病を含む（但し、それらには限定されない）免疫、増殖及び変性疾患の治療に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称 アポパイン発明の背景 本発明はその一態様において、アポパインなどのプロアポトーシスシステイン プロテイナーゼ、このプロテイナーゼをコードするＤＮＡまたはそのアンチセン ス、及び前記プロテイナーゼを調節する物質を同定するアッセイに係わる。 第二の態様では本発明は、アポパインなどのプロアポトーシスシステインプロ テイナーゼの活性のモジュレーターであるペプチジル誘導体、並びに該誘導体の 、プロアポトーシスシステインプロテイナーゼ媒介疾患の治療に有用な療法への 使用及び前記治療に有用な物質の同定への使用に係わる。 アポトーシスは、正常な形態形成、組織再造形（ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）の間 に、また病原体感染に応答して生物内で生起する細胞自殺（ｃｅｌｌ ｓｕｉｃ ｉｄｅ）、または他の修復不能な細胞傷害の体系的手段である。不適当なアポト ーシスは、ヒトのアルツハイマー病、パーキンソン病及びハンチントン病、免疫 不全及び自己免疫障害、虚 血性心血管及び神経損傷、脱毛症、白血病、リンパ腫及び他の癌などの疾患の病 因の根源であり得、従ってアポトーシスの制御は治療介入（ｔｈｅｒａｐｅｕｔ ｉｃ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）の重要な潜在標的となる^{1 〜4}。 最近、アポトーシス型細胞死に寄与する生化学的事象が幾つか解明された。例 えば線虫における遺伝学的形跡からアポトーシスの、正と負との両方の調節因子 が同定されている⁵。重要なプロアポトーシス遺伝子であるｃｅｄ−３は哺乳動 物のインターロイキン−１β変換酵素（ＩＣＥ）に関連する推定のシステインプ ロテアーゼをコードし⁶、前記システインプロテアーゼはＳ₁サブサイトに位置す るアスパラギン酸に対するほぼ絶対的な特異性という際立った特徴を有する一群 の新規なシステインプロテアーゼのうちで最初に同定されたものである^7,8。ｃ ｅｄ−３遺伝子を欠失または突然変異させることによって、そうでない場合には 死ぬはずの細胞総てのアポトーシス型死を完全に防止でき、また様々な宿主細胞 をトランスフェクトしたところＣＥＤ−３もＩＣＥもアポトーシスを誘発した^{6, 9,10} 。更に、ＣＥＤ−３のプロアポトーシス作用は線虫死抑制遺伝子ｃｅｄ−９ での同時トランスフェクションによ って防止でき、また哺乳動物において前記遺伝子ｃｅｄ−９に相当するプロトオ ンコジーンｂｃｌ−２によっても或る程度防止できる。従って、真核細胞の生死 （ｆａｔｅ）は、ＩＣＥ／ＣＥＤ−３様プロテアーゼの対抗的なプロアポトーシ ス作用と、Ｂｃ１−２及び／またはその相同体を用いる上流調節機序との平衡に 帰着し得る。 アポトーシスの際のＩＣＥ／ＣＥＤ−３様プロテアーゼの潜在的基質の一つに ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）が有り、この物質はＤＮＡ 修復、ゲノムのサーベイランス及び一体性維持（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）において 重要な酵素である^{11 〜17}。ＰＡＲＰはアポトーシス開始時に、ＩＣＥのものに類 似する特性を有する、未だ同定されていないプロテアーゼによりタンパク質加水 分解によって切断される^18,19。ＰＡＲＰの切断部位（ＤＥＶＤ²¹⁶−Ｇ²¹⁷）は ｐｒｏＩＬ−１βの、ＩＣＥによって認識及び切断される二つの部位の一方（Ｆ ＥＡＤ²⁷−Ｇ²⁸）に類似する。上記部位におけるＰＡＲＰのタンパク質加水分解 切断によって、ＰＡＲＰのアミノ末端に位置する２個の亜鉛−フィンガーＤＮＡ 結合モチーフがこのポリペプチドのカルボキシ末端に位置する自己修飾及び ポリ（ＡＤＰ−リボシル）化［ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓ）ｙｌａｔｉｏｎ ］触媒ドメインから分離される。この切断はＰＡＲＰの触媒ドメインがＤＮＡ損 傷部位に結合するのを阻止し、おそらくはその後の修復及びゲノム保全事象を同 調させるＰＡＲＰの能力を無効にする。そのうえ、アポトーシスの特徴であるヌ クレオソーム間ＤＮＡ切断に関与するＣａ²⁺／Ｍｇ²⁺依存性エンドヌクレアーゼ はポリ（ＡＤＰ−リボシル）化によって負に調節される^{20 〜22}。従って、死に掛 けた細胞では正常なＰＡＲＰ機能の喪失によって上記ヌクレアーゼが高度に活性 化される。 インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）は、慢性及び急性炎症の主要な媒介因 子である。このインターロイキンは不活性な３１ｋＤａ前駆体（ｐＩＬ−１β） として合成され、この前駆体がシステインプロテイナーゼのインターロイキン− １β変換酵素（ＩＣＥ）によるプロセシングを受けてその成熟１７．５ｋＤａ形 態（ｍＩＬ−１β）となる。最近では、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｉｄｉｔｉｓ ｅｌ ｅｇａｎｓ、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｉｄｉｔｉｓ ｂｒｉｇｇｓａｅ及びＣａｅｎ ｏｒｈａｂｉｄｉｔｉｓ ｖｕｌｇａｒｉｓの線虫細胞死異常遺伝子（ＣＥＤ− ３）、マウスのニ ューロン前駆細胞の胚発生ダウンレギュレート化遺伝子（ＮＥＤＤ−２）とその ヒト相同体ＩＣＨ−１、及びＪｕｒｋａｔ細胞からクローン化されたＣＰＰ３２ を含めた一群の付加的ＩＣＥ様遺伝子も発見されはじめている。本発明者は、Ｉ ＣＥに関連する二つの新規な付加的ヒトチオールプロテイナーゼをクローン化し 、これらをＩＣＥ_rel−II（インターロイキン−１β変換酵素関連システインプ ロテイナーゼII； １９９４年４月８日付出願の米国特許出願第０８／２２５， ４８７号）及びＩＣＥ_rel−III（インターロイキン−１β変換酵素関連システイ ンプロテイナーゼIII； １９９４年４月８日付出願の米国特許出願第０８／２ ２４，９３０号）と名付けた。ＩＣＥ_rel−II及びＩＣＥ_rel−IIIのＩＣＥとの 配列同等率はそれぞれ６１％及び５６％である。ＩＣＥ、ＣＥＤ−３、及び上述 の新規なシステインプロテイナーゼ群に属する他の酵素の既知の配列は総て、Ｉ ＣＥでは触媒システインを包囲するペンタペプチド配列−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｃｙ ｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−、他の酵素では前記配列の同等物を含む。 ヒトに由来するシステインプロテアーゼのＩＣＥ／ＣＥＤ−３ファミリーに属 する五つの既知酵素（ＩＣＥ、ＩＣ Ｅ_rel−II、ＩＣＥ_rel−III、ＩＣＨ−１及びＣＰＰ３２^{23 〜26}）はいずれも、 宿主細胞のトランスフェクションによってアポトーシス応答を誘起し得る。しか し、任意のプロテアーゼの過剰発現によって細胞死が非特異的に誘発される場合 も有る。例えばトリプシン、キモトリプシン、プロテイナーゼＫまたはｇｒａｎ ｚｙｍｅ Ｂといった他のプロテアーゼの細胞質発現もアポトーシスを誘発する ことが判明している^27,28。 本明細書において本発明者は、アポパインと呼称される活性形態のＣＰＰ３２ がアポトーシス開始時に起こるＰＡＲＰの特異的タンパク質加水分解切断を惹起 する酵素であることを証明する。そのうえ、本発明者は、アポパインが媒介する ＰＡＲＰ切断を抑制するとｉｎ ｖｉｔｒｏでアポトーシスが減衰することを示 し、アポパインが哺乳動物細胞のアポトーシスにおいて果たす中心的役割を解明 する。 上段に示したように、本明細書中に用いた「アポパイン」という語は本明細書 の趣旨に副って、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの切断を惹起する酵素 活性形態のプロアポトーシスシステインプロテアーゼを意味する。本発 明は前記酵素の同定を初めて開示するものであり、そこで該酵素をＩ．Ｕ．Ｂ． 命名法ガイドラインに従い、アポトーシスに関与することを示す接頭辞「ａｐｏ ｐ」と、Ｉ．Ｕ．Ｂ．があらゆるシステインプロテアーゼの命名に好ましいとす る接尾辞「ａｉｎ」とを用いてアポパインと命名する。「ＣＰＰ３２（３２ｋＤ ａのシステインプロテアーゼタンパク質）」という語は、アポパインまたはこの 酵素に対応するｃＤＮＡをもたらす不活性なプロ酵素を指すのに用いてある。 チオールプロテイナーゼのＩＣＥファミリー、特にアポパインのタンパク質加 水分解活性がＰＡＲＰの無力化によって少なくとも部分的にアポトーシスを惹起 することは明示されている。従って、ＰＡＲＰの切断を選択的に抑制する治療薬 はＰＡＲＰ活性を持続させ、即ち未成熟段階でのアポトーシス型細胞死を妨害ま たは防止する。あるいはまた、アポパインなどのチオールプロテイナーゼのＰＡ ＲＰ切断活性を高める治療薬はアポトーシス型細胞死を誘発または加速する。発明の概要 本発明はその一態様において、単離及び精製されたアポ パインと呼称される酵素、アポパインの活性を調節する化合物をアポパインを用 いてスクリーニングする方法、及びスクリーニングによって同定された化合物に 係わる。完全長アポパインをコードする合成ＤＮＡ分子は精製酵素の一次アミノ 酸配列に基づき調製する。この合成アポパインコーディングＤＮＡは、様々な組 み換え宿主において最適に発現するように調製する。得られるＤＮＡクローンは 組み換え完全長アポパインとその誘導体を発現する。精製した天然アポパイン及 び組み換えアポパインはアポパイン活性のモジュレーターの同定に、従ってアポ パインのプロ炎症またはプロアポトーシス作用に関連する病理状態の改善因子（ ｍｏｄｉｆｉｅｒ）の同定に有用である。アポパインアンチセンス分子はアポパ インのプロ炎症またはプロアポトーシス作用を治療により低減または排除するの に有用であり、一方アポパインを用いる遺伝子移植または遺伝子療法はアポパイ ンのプロ炎症またはプロアポトーシス作用の増大に有用である。これらの治療法 は、免疫不全症候群（ＡＩＤＳなど）、自己免疫疾患、病原体感染、心血管及び 神経損傷、脱毛症、老化、癌、パーキンソン病及びアルツハイマー病を非限定的 に含む免疫疾患、増殖性疾患及び 変性疾患の治療に有益である。 第二の態様において本発明は、アポトーシスの分野において、及び上段に列挙 した疾患を非限定的に含む、アポトーシスの減少が有益であろう疾患の治療にお いて研究手段として有用である式Ｉ の置換ペプチジル誘導体に係わる。本発明は特に、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポ リメラーゼの正常な生物学的機能を無効にすることによって少なくとも部分的に アポトーシスを惹起するチオールプロテイナーゼのプロアポトーシスタンパク質 加水分解活性の阻害因子に係わる。図面の簡単な説明 図１は自然にアポトーシスを起こした骨肉腫細胞におけるＰＡＲＰ切断活性の 説明図である。 図２はアポトーシス骨肉腫細胞抽出物におけるＰＡＲＰ切断の抑制の説明図で ある。 図３はＴＨＰ−１細胞からのＰＡＲＰ切断プロテアーゼの精製の説明図である 。 図４は不活性なプロ酵素ＣＰＰ３２から得られたＰＡＲ Ｐ切断プロテアーゼであるアポパインの構造の説明図である。 図５は螢光原基質を用いるアポパイン及び強力な阻害因子の動力学的分析の説 明図である。 図６はＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯによるかまたはアポパイン／ＣＰＰ３２媒介Ｐ ＡＲＰ切断活性の欠如によるｉｎ ｖｉｔｒｏアポトーシス及び選択的阻害の説 明図である。発明の詳細な説明 本発明はその一態様において、単離及び精製されたアポパインと呼称される酵 素、アポパインの活性を調節する化合物をアポパインを用いてスクリーニングす る方法、及びスクリーニングによって同定された化合物に係わる。完全長アポパ インをコードする合成ＤＮＡ分子は精製酵素の一次アミノ酸配列に基づき調製す る。この合成アポパインコーディングＤＮＡは、様々な組み換え宿主において最 適に発現するように調製する。得られるＤＮＡクローンは組み換え完全長アポパ インとその誘導体を発現する。精製した天然アポパイン及び組み換えアポパイン はアポパイン活性のモジュレーターの同定に、従ってアポパインのプロ炎症また はプロアポトーシス作用に関連する病理状態の改善 因子の同定に有用である。アポパインアンチセンス分子はアポパインのプロ炎症 またはプロアポトーシス作用を治療により低減または排除するのに有用であり、 一方アポパインを用いる遺伝子移植または遺伝子療法はアポパインのプロ炎症ま たはプロアポトーシス作用の増大に有用である。これらの治療法は、免疫不全症 候群（ＡＩＤＳなど）、自己免疫疾患、病原体感染、心血管及び神経損傷、脱毛 症、老化、癌、パーキンソン病及びアルツハイマー病を非限定的に含む免疫疾患 、増殖性疾患及び変性疾患の治療に有益である。 アポトーシスは、正常な形態形成、組織再造形の間に、また病原体感染に応答 して生起する臓器内での細胞自殺、または他の修復不能な細胞傷害の体系的手段 である。不適当なアポトーシスは、ヒトのアルツハイマー病、パーキンソン病及 びハンチントン病、免疫不全及び自己免疫障害、虚血性心血管及び神経損傷、脱 毛症、白血病、リンパ腫及び他の癌などの疾患の病因論の根元を成し得、従って アポトーシスの制御は治療介入の重要な潜在標的となる^{1 〜4}。 最近、アポトーシス型細胞死に寄与する生化学的事象が 幾つか解明された。例えば線虫における遺伝学的形跡からアポトーシスの、正と 負との両方の調節因子が同定されている⁵。重要なプロアポトーシス遺伝子であ るｃｅｄ−３は哺乳動物のインターロイキン−１β変換酵素（ＩＣＥ）に関連す る推定のシステインプロテアーゼをコードし⁶、前記システインプロテアーゼは Ｓ₁サブサイトに位置するアスパラキン酸に対するほぼ絶対的な特異性という際 立った特徴を有する一群の新規なシステインプロテアーゼのうちで最初に同定さ れたものである^7,8。ｃｅｄ−３遺伝子を欠失または突然変異させることによっ て、そうでない場合には死ぬはずの細胞総てのアポトーシス型死を完全に防止で き、また様々な宿主細胞をトランスフェクトしたところＣＥＤ−３もＩＣＥもア ポトーシスを誘発した^6,9,10。更に、ＣＥＤ−３のプロアポトーシス作用は線虫 死抑制遺伝子ｃｅｄ−９での同時トランスフェクションによって防止でき、また 哺乳動物において前記遺伝子ｃｅｄ−９に相当するプロトオンコジーンｂｃｌ− ２によっても或る程度防止できる。従って、真核細胞の生死は、ＩＣＥ／ＣＥＤ −３様プロテアーゼの対抗的なプロアポトーシス作用と、Ｂｃ１−２及び／また はその相同体が関与する上流 調節機序との平衡に帰着する。 アポトーシスの際のＩＣＥ／ＣＥＤ−３様プロテアーゼの潜在的基質の一つに ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）が有り、この物質はＤＮＡ 修復、ゲノムのサーベイランス及び一体性維持において重要な酵素である^{11 〜17} 。ＰＡＲＰはアポトーシス開始時に、ＩＣＥのものに類似する特性を有する、未 だ同定されていないプロテアーゼによりタンパタ質加水分解によって切断される^18,19 。ＰＡＲＰの切断部位（ＤＥＶＤ²¹⁶−Ｇ²¹⁷）はｐｒｏＩＬ−１βの、Ｉ ＣＥによって認識及び切断される二つの部位の一方（ＦＥＡＤ²⁷−Ｇ²⁸）に類似 する。上記部位におけるＰＡＲＰのタンパタ質加水分解切断によって、ＰＡＲＰ のアミノ末端に位置する２個の亜鉛−フィンガーＤＮＡ結合モチーフがこのポリ ペプチドのカルボキシ末端に位置する自己修飾及びポリ（ＡＤＰ−リボシル）化 触媒ドメインから分離される。この切断はＰＡＲＰの触媒ドメインがＤＮＡ損傷 部位に結合するのを阻止し、おそらくはその後の修復及びゲノム保全事象を同調 させるＰＡＲＰの能力を無効にする。そのうえ、アポトーシスの特徴であるヌク レオソーム間ＤＮＡ切断に関与するＣａ²⁺／ Ｍｇ²⁺依存性エンドヌクレアーゼはポリ（ＡＤＰ−リボシル）化によって負に調 節される^{20 〜22}。従って、死に掛けた細胞では正常なＰＡＲＰ機能の喪失によっ て上記ヌクレアーゼが高度に活性化される。 ヒトに由来するシステインプロテアーゼのＩＣＥ／ＣＥＤ−３ファミリーに、 五つの既知酵素ＩＣＥ、ＩＣＥ_rel−II、ＩＣＥ_rel−III、ＩＣＨ−１及びＣＰ Ｐ３２が属する^{23 〜26}。これらはいずれも、宿主細胞のトランスフェクションに よってアポトーシス応答を誘起し得る。しかし、任意のプロテアーゼの過剰発現 によって細胞死が非特異的に誘発される場合も有る。例えばトリプシン、キモト リプシン、プロテイナーゼＫまたはｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂといった他のプロテア ーゼの細胞質発現もアポトーシスを誘発することが判明している^27.28。 本研究において本発明者は、アポパインと呼称される活性形態のＣＰＰ３２が アポトーシス開始時に起こるＰＡＲＰの特異的タンパク質加水分解切断を惹起す る酵素であることを証明する。そのうえ、本発明者は、アポパインが媒介するＰ ＡＲＰ切断を阻害するとｉｎ ｖｉｔｒｏでアポトーシスが減衰することを示し 、アポパインが哺乳動物細 胞のアポトーシスにおいて果たす中心的役割を解明する。 線虫Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓでは、ただ一つの遺伝子ｃｅｄ−３の欠失または突 然変異によってアポトーシス型死は起こらなくなる⁵。配列決定したところ、ｃ ｅｄ−３は哺乳動物のインターロイキン−１β変換酵素（ＩＣＥ）をコードする 遺伝子と相同であることが判明し、前記酵素は、不活性な３１ｋＤａｐｒｏＩＬ −１βサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）前駆体を切断して活性な１７ｋＤａ形 態とすることが唯一の既知機能であるプロテアーゼである。他の四つの哺乳動物 ＩＣＥ／ＣＥＤ−３様プロテアーゼ（ＩＣＥ_rel−II、ＩＣＥ_rel−III、ＩＣＨ −１及びＣＰＰ３２）が発見され^{23 〜26}、かつゲノムの構成及び一体性維持の同 調において重要な酵素であるポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ ）がアポトーシス開始時にＩＣＥに類似するプロテアーゼ（ｐｒＩＣＥ）によっ て機能的に不活性化されることが観察されて¹⁹、ＩＣＥがＩＬ−１β生成に関与 することと、ＩＣＥ欠乏マウスでは通常アポトーシスが起こるという発見²⁹とを 勘案しつつＩＣＥ様プロテアーゼが哺乳動物細胞のアポトーシスにおいて果たす 役割をどのように説明できるかが次第に明らか になってきた。本発明者は、ｐｒＩＣＥが実はアポパイン／ＣＰＰ３２であるこ と、及びアポパイン／ＣＰＰ３２は哺乳動物細胞においてＰＡＲＰを切断する特 異的ＩＣＥ／ＣＥＤ−３様システインプロテアーゼであることを証明した。アポ パイン／ＣＰＰ３２が哺乳動物の細胞死において果たす中心的役割は、ｉｎ ｖ ｉｔｒｏでアポトーシスが起こるのを防止する強力かつ選択的な阻害因子によっ ても立証される。このような発見は、アポパインプロ酵素ＣＰＰ３２とＣＥＤ− ３との配列関連性と相俟って、ＣＰＰ３２とそのタンパク質加水分解活性形態で あるアポパインとがＣＥＤ−３のヒト同等物であり得ることを示唆している。従 って、不適当なアポトーシスが顕著である病理状態では、アポパイン活性を薬理 学的に調節することが適当な治療介入点となり得る。 クローン化したアポパインｃＤＮＡの発現は、適当なプロモーター及び他の適 当な転写調節要素を有する発現ベクター中への分子クローニングと、原核または 真核宿主細胞への移入とにより組み換えアポパインの産生を実現する組み換え技 術によって達成し得る。 本明細書では「発現ベクター」を、適当な宿主における 遺伝子のクローン化コピーの転写及びそのｍＲＮＡの翻訳に必要なＤＮＡ配列と 定義する。このようなベクターは、真核生物遺伝子を細菌、酵母、藍藻類、植物 細胞、昆虫細胞及び動物細胞などの様々な宿主において発現させるのに用い得る 。 特別に設計されたベクターは、細菌−酵母、または細菌−動物細胞などの宿主 間でのＤＮＡのシャトル化を可能にする。適当に構築された発現ベクターは、宿 主細胞における自律複製のための複製開始点と、選択マーカーと、限られた数の 有用な制限酵素部位と、潜在的高コピー数領域と、活性なプロモーターとを有す る。プロモーターとはＲＮＡポリメラーゼを、ＤＮＡに結合してＲＮＡ合成を開 始するように導くＤＮＡ配列のことである。強いプロモーターは、ｍＲＮＡの合 成開始を高い頻度で惹起するプロモーターである。発現ベクターには、クローニ ングベクター、改変クローニングベクター、特別に設計されたプラスミドまたは ウイルスが非限定的に含まれ得る。 哺乳動物細胞における組み換えアポパインの発現には様々な哺乳動物発現ベク ターを用い得る。組み換えアポパイン発現に適し得る市販の哺乳動物発現ベクタ ーには、ｐＭ Ｃ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐ ＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７ ５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−Ｍ ＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴ ＣＣ ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄ ｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ ３７４６０）及び １ＺＤ３５（ＡＴＣＣ ３７５６５）が非限定的に含まれる。 アポパインをコードするＤＮＡも、組み換え宿主細胞において発現させるべく 発現ベクター中へクローン化し得る。組み換え宿主細胞は原核細胞であっても真 核細胞であってもよく、細菌、酵母、哺乳動物細胞及び昆虫細胞が非限定的に含 まれる。適当であり得る市販の哺乳動物種由来細胞系には、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−７（ ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、３ Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５ ８）、ＨｅＬａ（ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１６）、ＢＳ− Ｃ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２６）及びＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １７１ ）が非限定的に含まれる。 発現ベクターの宿主細胞内への導入は、形質転換、トランスフェクション、感 染、プロトプラスト融合及びエレクトロポレーションを非限定的に含む幾つかの 技術のうちのいずれかによって行ない得る。発現ベクター保有細胞をクローン化 により増殖させ、個々の細胞を分析してアポパインタンパク質を産生するかどう か確認する。アポパインを発現させる宿主細胞クローンは、抗アポパイン抗体と の免疫反応試験及び宿主細胞関連のアポパイン活性の測定を含めた幾つかの手段 によって同定し得る。 アポパインｃＤＮＡの発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで調製した合成ｍＲＮＡを用 いても実現可能である。合成ｍＲＮＡは、小麦胚抽出物及び網状赤血球抽出物を 非限定的に含む様々な無細胞系において効率的に翻訳され得、また蛙卵母細胞内 へのマイクロインジェクションを非限定的に含む細胞ベースの系においても効率 的に翻訳され得る。 最適レベルの酵素活性及び／またはアポパインタンパク 質をもたらす（一つ以上の）アポパインｃＤＮＡ配列を確認するには、改変アポ パインｃＤＮＡ分子を構築する。このｃＤＮＡ分子で宿主細胞を形質転換し、ア ポパインＲＮＡ及びタンパク質のレベルを測定する。 宿主細胞のアポパインタンパク質レベルは、免疫アフィニティー及び／または リガンドアフィニティー技術などの様々な方法で測定する。アポパイン特異的な アフィニティービーズまたはアポパイン特異的な抗体を用いて、³⁵Ｓ−メチオニ ンで標識したかまたは標識していないアポパインタンパタ質を単離する。標識し たアポパインタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。標識していないアポパ インタンパク質は、アポパイン特異的な抗体を用いるウェスタンブロッティング 、ＥＬＩＳＡまたはＲＴＡアッセイによって検出する。 組み換え宿主細胞におけるアポパイン発現後、アポパインタンパク質を回収し てその活性形態とし得る。幾つかのアポパイン精製操作が利用可能で、かつ使用 に適する。当業者に知られた分画やクロマトグラフィー技術を様々に組み合わせ てかまたは単独で適用することにより、組み換えアポパインを細胞溶解物または 馴らし培地から精製し得る 。 加えて、完全長新生アポパインまたはアポパインのポリペプチドフラグメント に対して特異的であるモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて製造し た免疫アフィニティーカラムを用いれば、組み換えアポパインを他の細胞タンパ ク質から分離することができる。 組み換えタンパク質は抗体産生に用い得る。本明細書中に用いた「抗体」とい う語は、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体との両方及びこれらの抗体の 、抗原またはハプテンと結合し得るＦｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）₂フラグメント などのフラグメントを包含する。 標準的な技術を用いて、アポパインに対する単一特異性抗体を、アポパインに 対して反応性である抗体を含有する哺乳動物抗血清から精製するかまたはアポパ インに対して反応性であるモノクローナル抗体として調製する。本明細書中に用 いた「単一特異性抗体」という語は、アポパインに対して均一の（ｈｏｍｏｇｅ ｎｏｕｓ）結合特性を有する単抗体種または多抗体種を意味する。本明細書中に 用いた「均一の結合」という語は抗体種の、先に述べたアポパインに関連する能 力のような、特定の抗原またはエピトー プと結合する能力を意味する。酵素特異的な抗体は、マウス、ラット、モルモッ ト、ウサギ、ヤギ、ウマ等のような動物、好ましくはウサギを、免疫アジュバン トを伴ったかまたは伴わない適当な濃度のアポパインで免疫することにより産生 させる。 アポパインと反応するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、近交系マウスをアポ パインで免疫するなどの通常方法で調製し得る。約０．１〜約１０ｍｇ、好まし くは約１ｍｇのアポパインを等量の許容可能なアジュバントと混合した約０．５ ｍｌの緩衝液または食塩液に加えたものでマウスを免疫する。アジュバントはフ ロイントの完全アジュバントが好ましい。第０日にマウスに初回免疫を施し、こ のマウスを約３〜約３０週間放置する。免疫済みのマウスにリン酸緩衝食塩液（ ＰＢＳ）などの緩衝液中の約０．１〜約１０ｍｇのアポパインでの追加免疫を１ 回以上、静脈内（ＩＶ）経路を介して施す。免疫したマウスから脾臓を、当業者 に知られた標準的な操作で取り出すことによって抗体陽性マウス由来のリンパ球 を得る。脾臓リンパ球を、安定なハイブリドーマの形成を可能にする条件下に適 当な融合相手と混合し、それによってハイブリドーマ細胞を作製す る。融合ハイブリドーマ細胞は当業者に知られた操作による、ヒポキサンチン、 チミジン及びアミノプテリンを補充したダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥ Ｍ）中での増殖によって選択する。第１４、１８及び２１日ごろに増殖陽性ウェ ルから上清を回収し、この上清を抗体産生に関して、抗原としてアポパインを用 いる固相ラジオイムノアッセイ（ＳＰＩＲＡ）などのイムノアッセイによってス クリーニングする。培養液もオクタロニー沈降アッセイで試験し、ｍＡｂのイソ タイプを決定する。抗体陽性ウェルから得たハイブリドーマ細胞を、ＭａｃＰｈ ｅｒｓｏｎ，“Ｓｏｆｔ Ａｇａｒ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，” Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｋ ｒｕｓｅ及びＰａｔｅｒｓｏｎ編， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９７ ３に記載された軟寒天技術などの技術によってクローン化する。 抗アポパイン抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ産生は、約２％のウシ胎児血清を含有す るＤＭＥＭ中でハイブリドーマを増殖させ、それによって十分な量の特異的ｍＡ ｂを得ることにより行なう。ｍＡｂは当業者に知られた技術で精製する 腹水またはハイブリドーマ培養液の抗体力価を、沈降、受動凝集、酵素結合イ ムノソルベント抗体（ＥＬＩＳＡ）技術及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）技 術を非限定的に含む様々な血清学的または免疫学的アッセイによって測定する。 体液または組織及び細胞抽出物においてアポパインの存在を検出するのにも同様 のアッセイを用いる。 上述のような方法は、アポパインポリペプチドフラグメントまたは完全長新生 アポパインポリペプチドに特異的な抗体の産生に用い得る単一特異性抗体の産生 に用い得る。 抗体がアガロースゲルビーズ支持体と共有結合するようにＮ−ヒドロキシスク シンイミドエステルで予め活性化したゲル支持体であるＡｆｆｉｇｅｌ−１０（ Ｂｉｏｒａｄ）などのゲル支持体に抗体を添加することにより、アポパイン抗体 アフィニティーカラムを作製する。次に、スペーサーアームが介在するアミド結 合によって抗体とゲルとを結合させる。その後、残存する活性化エステルを１Ｍ エタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８）で反応停止させる。カラムを水、次いで０． ２３ＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で洗浄して、結合しなかった抗体や生体外 タンパク質を除去 する。次に、カラムをリン酸緩衝食塩液（ｐＨ７．３）中で平衡させ、このカラ ムにアポパインまたはアポパインフラグメントを含有する細胞培養上清または細 胞抽出物をゆっくり通す。その後、カラムを洗浄し、タンパク質を溶離する。こ のように精製したアポパインタンパク質をリン酸緩衝食塩液に対して透析する。 アポパインｃＤＮＡ、アポパインに対する抗体、またはアポパインタンパク質 を含むキットを作製し得る。このようなキットは、アポパインＤＮＡとハイブリ ダイズするＤＮＡの検出、または試料におけるアポパインタンパク質またはペプ チドフラグメントの存在の検出に用いられる。このようなキットを用いての特性 解明は、法医学的分析及び疫学研究を非限定的に含む様々な目的のために有用で ある。 本発明のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、組み換えタンパク質及び抗体は、アポパイ ンＤＮＡ、アポパインＲＮＡまたはアポパインタンパク質のレベルに関するスク リーニング及び測定に用い得る。本発明の組み換えタンパク質、ＤＮＡ分子、Ｒ ＮＡ分子及び抗体は、アポパインの検出及び型分類に適したキットの作製に役立 つ。前記キットは、少なく とも１個の容器を厳重に固定して保持するのに適した仕切り付きの支持器（ｃａ ｒｒｉｅｒ）を含む。この支持器はアポパインの検出に適した組み換えアポパイ ンタンパク質または抗アポパイン抗体などの試薬も保持する。支持器は、標識し た抗原または酵素基質等といったものを検出する手段も具備し得る。 アポパインコーディングｃＤＮＡ配列と相補的であるヌクレオチド配列をアン チセンス療法用に合成し得る。得られるアンチセンス分子はＤＮＡ、ホスホロチ オエートやメチルホスホネートといった安定なＤＮＡ誘導体、ＲＮＡ、２′−Ｏ −アルキルＲＮＡなどの安定なＲＮＡ誘導体、または他のアポパインアンチセン スオリゴヌクレオチド模擬体（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）である。アポパインアンチセ ンス分子は、マイクロインジェクション、リポソーム封入、またはアンチセンス 配列を含む発現ベクターからの発現によって細胞内に導入し得る。アポパインア ンチセンス療法は、アポパイン活性の低下が有益である疾患の治療に特に有用で あり得る。 アポパインを標的臓器の細胞内に導入するのに、アポパイン遺伝子療法を用い 得る。アポパイン遺伝子はウイルス ベクター中に連結することができ、前記ベクターは受容宿主細胞に感染すること によってアポパインＤＮＡの移入を媒介する。適当なウイルスベクターに、レト ロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシ ニアウイルス、ポリオウイルス等が含まれる。あるいは他の場合には、リガンド −ＤＮＡ結合体またはアデノウイルス−リガンド−ＤＮＡ結合体を用いる受容体 媒介型標的指向性ＤＮＡ移入、リポフェクション、膜融合または直接マイクロイ ンジェクションを含めた、ウイルスベクターを用いない（ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ） 技術によってアポパインＤＮＡを遺伝子療法のために細胞内に移入し得る。これ らの操作とその改良型とは、ｅｘ ｖｉｖｏ並びにｉｎ ｖｉｖｏアポパイン遺 伝子療法に適している。アポパイン遺伝子療法は、アポパイン活性を高めること が有益である疾患の治療に特に有用であり得る。 アポパインＤＮＡまたはアポパインタンパク質を含有する、医薬に有用な組成 物を本出願に開示するようにして、または医薬に許容可能なキャリヤの混合によ るような公知方法に従って調製し得る。前記キャリヤや調製方法の例は、Ｒｅｍ ｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ ｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ中に見出され得る。有効な投与に適した、医薬に許容可能 な組成物を調製するべく、組成物には有効量の上記タンパク質またはＤＮＡを含 有させる。 本発明の治療または診断用組成物は、アポパイン関連疾患の治療または診断に 十分な量で個体に投与する。有効量は、個体の状態、体重、性別及び年齢などの 様々な要因に従って変化し得る。上記以外の要因に、投与モードが含まれる。 医薬組成物は個体に、皮下、局所的、経口及び筋肉内などの様々な経路で個体 に投与し得る。 特定のアミノ酸をコードする様々なコドンに相当量の重複が存在することが知 られている。従って本発明は、同じアミノ酸の究極的な翻訳をコードする代替コ ドンを含むＤＮＡ配列にも係わる。本明細書の趣旨に副って、１個以上の置換コ ドンを含む配列を縮重変異体（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）と 定義する。ＤＮＡ配列または翻訳されたタンパク質において生起する、発現され たタンパク質の最終的な物理特性を実質的に変更しない突然変異も本発明の範囲 内に含まれる。例えば、ロイシンがバリンに、リシンがアルギニンに、またはグ ルタミンがアスパ ラギンに置換されてもポリペプチドの機能に変化は生じない。 或るペプチドをコードするＤＮＡ配列が天然ペプチドのものとは異なる特性を 有するペプチドをコードするように改変され得ることが知られている。ＤＮＡ配 列を改変する方法には、位置特異的突然変異誘発が非限定的に含まれる。変更さ れる特性の例には、酵素の基質に対する親和性の変化が非限定的に含まれる。 本明細書中、アポパインの「機能性誘導体」とは、アポパインの生物活性と実 質的に同様の（機能上または構造上の）生物活性を有する化合物のことである。 「機能性誘導体」という語は、アポパインの「フラグメント」、「変異体」、「 縮重変異体」、「類似体」及び「相同体」、または「化学誘導体」を包含するも のとする。「フラグメント」という語は、アポパインの任意のポリペプチドサブ セットを意味する。「変異体」という語は、完全なアポパイン分子またはそのフ ラグメントと実質的に同様の構造及び機能を有する分子を意味する。アポパイン 分子と実質的に同様の構造を有するか、または同様の生物活性を有する分子をア ポパインと「実質的に同様」とする。従って、実質的 に同様の活性を有する二つの分子は、一方の分子の構造が他方において見出され なくても、あるいはまた両者のアミノ酸配列が同等でなくても変異体であると看 做される。 「類似体」という語は、完全なアポパイン分子またはそのフラグメントと実質 的に同様の機能を有する分子を意味する。 「化学誘導体」という語は、通常は基本分子の一部でない付加的な化学的部分 を有する分子を意味する。前記部分によって、基本分子の溶解度、半減期、吸収 性等を改善し得る。あるいは他の場合には、上記部分によって基本分子の望まし くない副作用を抑制したり、基本分子の毒性を低下させたりする。このような部 分の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅ ｎｃｅｓなどの様々な文献に記載されている。 本発明は、アポパインをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現及びアポパイン タンパク質の機能をｉｎ ｖｉｖｏで調節する化合物をスクリーニングする方法 にも係わる。上記のような活性を調節する化合物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド 、タンパク質、または非タンパク性有機分子であり得る。これらの化合物は、ア ポパインをコードするＤＮ ＡもしくはＲＮＡの発現、またはアポパインタンパク質の機能を促進または抑制 して調節し得る。アポパインをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現、または アポパインタンパク質の機能を調節する化合物は様々なアッセイによって検出で きる。前記アッセイは、発現または機能に変化が有るかどうかを確認する単純な 「はい／いいえ」アッセイであり得る。試験試料の発現または機能を標準試料の 発現または機能レベルと比較することによってアッセイを定量的に行なうことも 可能である。 第二の態様において本発明は、式Ｉ 〔式中 Ｙは −ＣＨ（ＣＨ₂ＣＯ₂Ｈ）（ＣＯ）_mＲ² であり、ここでｍは０、１または２であり、 Ｒ¹は （ａ）水素、Ｃ_{1 〜6}アルコキシ、ＮＲ¹⁰Ｒ¹¹、ベンジルオキシ、または置換基が メチル、ハロゲン、メトキシもしくはシアノである一置換もしくは二置換ベン ジルオキシであり、ここで、Ｒ¹⁰Ｒ¹¹は独立にＣ_{1 〜4}アルキル、Ｃ_{1 〜4}ペルフル オロアルキル、ベンジル、または置換基がハロゲン、メトキシもしくはシアノで ある一もしくは二置換ベンジルであり、またはＲ¹⁰とＲ¹¹は一緒になってピロリ ジン、ピペリジン、モルホリン、チアモルホリン、もしくはＮ−Ｒ¹²置換ピペラ ジンを形成し得、前記Ｒ¹²はＨまたはＣ_{1 〜3}アルキルであり、 （ｂ）Ｃ_{1 〜6}アルキルであるか、または置換基が （１）ヒドロキシ、 （２）ハロ、 （３）Ｃ_{1 〜3}アルキルオキシ、 （４）Ｃ_{1 〜3}アルキルチオ、 （５）フェニルＣ_{1 〜3}アルキルオキシ、 （６）フェニルＣ_{1 〜3}アルキルチオ、 （７）フェニルカルボキシ、及び （８）カルボキシ の中から選択された置換Ｃ_{1 〜6}アルキルであり、 （ｃ）アリールＣ_{1 〜6}アルキルであり、ここで、アリール基は （１） フェニル、 （２） ナフチル、 （３） ピリジル、 （４） フリル、 （５） チエニル、 （６） チアゾリル、 （７） イソチアゾリル、 （８） イミダゾリル、 （９） ベンゾイミダゾリル、 （１０）ピラジニル、 （１１）ピリミジル、 （１２）キノリル、 （１３）イソキノリル、 （１４）ベンゾフリル、 （１５）ベンゾチエニル、 （１６）ピラゾリル、 （１７）インドリル、 （１８）プリニル、 （１９）イソオキサゾリル、及び （２０）オキサゾリル、 並びに置換基が独立にＣ_{1 〜6}アルキル、ハロ、ヒドロキシ、Ｃ_{1 〜6}アルキ ルアミノ、Ｃ_{1 〜6}アルコキシ、Ｃ_{1 〜6}アルキルチオ、Ｃ_{1 〜6}アルキルカルボニル 、カルボキシ、Ｃ_{1 〜6}アルキルオキシカルボニルである一及び二置換の上記（１ ）〜（２０）のアリールの中から選択され、 Ｒ²は （ａ）水素、Ｃ_{1 〜6}アルキル、ＯＨ、Ｃ_{1 〜6}アルコキシ、 Ｃ_{1 〜6}アルキルチオ、Ｃ_{1 〜6}ペルフルオロアルキルまたはＮＲ¹³Ｒ¹⁴であ り、ここで、Ｒ¹³Ｒ¹⁴は独立にＣ_{1 〜4}アルキル、Ｃ_{1 〜4}ペルフルオロアルキル、 ベンジル、または置換基がハロゲン、メトキシもしくはシアノである一もしくは 二置換ベンジルであり、またはＲ¹³とＲ¹⁴は一緒になってピロリジン、ピペリジ ン、モルホリン、チアモルホリン、もしくはＮ−Ｒ¹⁵置換ピペラジンを形成し得 、前記Ｒ¹⁵はＨまたはＣ_{1 〜3}アルキルであり、 （ｂ）置換基が （１） Ｃ_{1 〜3}アルキルチオ、 （２） Ｃ_{1 〜3}アルコキシ、 （３） ハロ、 （４） ヒドロキシ、 （５） シアノ、 （６） カルボキシ、 （７） Ｃ_{1 〜3}アルキル、 （８） トリフルオロメチル、 （９） トリメチルアミノ、及び （１０）ベンジルオキシ の中から個別に選択された四または五置換フェニルであり、 （ｃ）フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、９−アントラシル及び２−、３ −または４−ピリジル並びにこれらのアリールの、置換基が （１） フェニル、 （２） ハロ、 （３） Ｃ_{1 〜3}アルキル、 （４） ペルフルオロＣ_{1 〜3}アルキル、 （５） ニトロ、 （６） シアノ、 （７） Ｃ_{1 〜3}アルキルカルボニル、 （８） フェニルカルボニル、 （９） カルボキシ、 （１０）アミノカルボニル、 （１１）モノ及びジＣ_{1 〜3}アルキルアミノカルボニル、 （１２）ホルミル、 （１３）ＳＯ₃Ｈ、 （１４）Ｃ_{1 〜3}アルキルスルホニル、 （１５）フェニルスルホニル、 （１６）ホルムアミド、 （１７）Ｃ_{1 〜3}アルキルカルボニルアミノ、 （１８）フェニルカルボニルアミノ、 （１９）Ｃ_{1 〜3}アルコキシカルボニル、 （２０）Ｃ_{1 〜3}アルキルスルホンアミドカルボニル、 （２１）フェニルスルホンアミドカルボニル、 （２２）Ｃ_{1 〜3}アルキルカルボニルアミノスルホニル、 （２３）フェニルカルボニルアミノスルホニル、 （２４）Ｃ_{1 〜3}アルキルアミノ、 （２５）モノ及びジＣ_{1 〜3}アルキルアミノ、 （２６）アミノ、 （２７）ヒドロキシ、 （２８）Ｃ_{1 〜3}アルキルオキシ、及び （２９）Ｃ_{1 〜3}アルキルチオ の中から個別に選択された一、二または三置換誘導体の中から選択された アリールであり、 ＡＡ¹は （ａ）単結合、及び （ｂ）式ＡＩ のアミノ酸 の中から独立に選択され、 ＡＡ²は式ＡII のアミノ酸であり、 ＡＡ³は式ＡIII のアミノ酸であり、 上記式中Ｒ⁷、Ｒ⁸及びＲ⁹は （ａ）水素、 （ｂ）Ｃ_{1 〜6}アルキル、または置換基が （１） ヒドロキシ、 （２） ハロ、 （３） −Ｓ−Ｃ_{1 〜4}アルキル、 （４） −ＳＨ、 （５） Ｃ_{1 〜6}アルキルカルボニル、 （６） ＣＯ₂Ｈ、 （７） ＣＯＮＨ₂、 （８） アミノカルボニルアミノ、 （９） アルキル部分がヒドロキシで任意に置換され、かつアミノが水素 またはＣＢＺで置換されたＣ_{1 〜4}アルキルアミノ、 （１０）グアニジノ、 （１１）Ｃ_{1 〜4}アルキルオキシ、 （１２）フェニルＣ_{1 〜4}アルキルオキシ、 （１３）フェニルＣ_{1 〜4}アルキルチオ、及び （１４）Ｃ_{1 〜6}アルキルオキシカルボニル の中から選択された置換Ｃ_{1 〜6}アルキル、及び （ｃ）アリールがフェニル、１−もしくは２−ナフチル、９−アントラシルまた は２−、３−もしくは４−ピリジルであり、当該アリールは置換基が互いに独立 にＣ_{1 〜6}アルキル、ハロ、ヒドロキシ、Ｃ_{1 〜6}アルキルアミノ、Ｃ_{1 〜6}アルコキ シ、Ｃ_{1 〜6}アルキルチオまたはＣ_{1 〜6}アルキルカルボニルである一または二置換 アリールであり得るアリールＣ_{1 〜6}アルキルの中から互いに独立に選択される〕 の化合物またはその医薬に許容可能な塩を包含する。 式Ｉの化合物に分類される或る化合物群では、 Ｒ¹は （ａ）水素、Ｃ_{1 〜6}アルコキシ、または置換基がメチル、 ハロゲン、メトキシもしくはシアノである一もしくは二置換ベンジルオキ シであり、 （ｂ）Ｃ_{1 〜6}アルキルであるか、または置換基が （１）ヒドロキシ、 （２）クロロ、フルオロ、 （３）Ｃ_{1 〜3}アルキルオキシ、 （４）フェニルＣ_{1 〜3}アルキルオキシ、 （５）フェニルカルボキシ、及び （６）カルボキシ の中から選択された置換Ｃ_{1 〜6}アルキルであり、 （ｃ）アリールＣ_{1 〜6}アルキルであり、ここで、アリール基は （１） フェニル、 （２） ナフチル、 （３） ピリジル、 （４） フリル、 （５） チエニル、 （６） チアゾリル、 （７） イソチアゾリル、 （８） ベンゾフリル、 （９） ベンゾチエニル、 （１０）インドリル、 （１１）イソオキサゾリル、及び （１２）オキサゾリル、 並びに置換基が独立にＣ_{1 〜4}アルキル、ヒドロキシ、カルボキシ、Ｃ_{1 〜6} アルキルオキシカルボニル、ハロである一及び二置換の上記（１）〜（１２）の アリールの中から選択され、 Ｒ²は水素、ＯＨ、Ｃ_{1 〜6}アルキルオキシまたはＣ_{1 〜6}ペルフルオロアルキルで あり、 Ｒ⁷、Ｒ⁸及びＲ⁹は （ａ）水素、 （ｂ）置換基が （１） 水素、 （２） ヒドロキシ、 （３） ハロ、 （４） −Ｓ−Ｃ_{1 〜4}アルキル、 （５） −ＳＨ、 （６） Ｃ_{1 〜6}アルキルカルボニル、 （７） ＣＯ₂Ｈ、 （８） −ＣＯＮＨ₂、 （９） アルキル部分がヒドロキシで任意に置換されたＣ_{1 〜4}アルキルア ミノ、及び （１０）グアニジノ の中から選択された置換Ｃ_{1 〜6}アルキル、及び （ｃ）アリールが先に挙げたアリールであり、当該アリールは置換基が互いに独 立にＣ_{1 〜6}アルキル、ハロ、ヒドロキシ、Ｃ_{1 〜6}アルキルアミノ、Ｃ_{1 〜6}アルコ キシ、Ｃ_{1 〜6}アルキルチオまたはＣ_{1 〜6}アルキルカルボニルである一または二置 換アリールであり得るアリールＣ_{1 〜6}アルキル の中から互いに独立に選択される。 上述の化合物群には、ＡＡ¹、ＡＡ²及びＡＡ³がＬ形及びＤ形のグリシン、ア ラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、アスパラギン 酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リシン、ヒドロキシリシン、ヒ スチジン、アルギニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システ イン、メチオニン、オル ニチン、β−アラニン、ホモセリン、ホモチロシン、ホモフェニルアラニン及び シトルリンを含めたアミノ酸の中から互いに独立に選択される化合物が含まれる 。 あるいは他の場合には、上述の化合物群中に、 Ｒ¹がＣ_{1 〜3}アルキル、Ｃ_{1 〜4}アルコキシであり、 Ｒ⁸及びＲ⁹は互いに独立に （ａ）水素、 （ｂ）Ｃ_{1 〜6}アルキル、または置換基が （１）ヒドロキシ、 （２）ＳＨ、 （３）ＣＯ₂Ｈ、 （４）ＣＯＮＨ₂、及び （５）グアニジノ の中から選択された置換Ｃ_{1 〜6}アルキルである化合物から成る亜群が構成 される。 本発明の化合物の例に次のようなものが有る。 （ａ） Ｎ−（Ｎ−アセチル−アスパルチル−グルタミル−バリニル）−３−ア ミノ−３−ホルミルプロピオン酸 （ｂ） Ｎ−（Ｎ−（１，１−ジメチルエトキシカルボニ ル）−アスパルチル−グルタミル−バリニル）−３−アミノ−ホルミルプロピオ ン酸 （ｃ） Ｎ−（Ｎ−（１，１−ジメチルエトキシカルボニル）−アスパルチル− グルタミル−バリニル）−３−アミノ−３−（トリフルオロメチルカルボニル） プロピオン酸 （ｄ） Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（１，１−ジメチルエトキシカルボニル）アントラニ リル）−アスパルチル−グルタミル−バリニル）−３−アミノ−３−ホルミルプ ロピオン酸 （ｅ） Ｎ−（Ｎ−（３−（２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３，４−ｄ］ イミダゾル−４−イル）ペンタノイル）−アスパルチル−グルタミル−バリニル ）−３−アミノ−３−ホルミルプロピオン酸 （ｆ） Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（５−（３ａ−（Ｓ）−６ａ−（Ｒ）−２−オキソ− ヘキサヒドロ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾル−４−イル）ペンタノイル）− ６−アミノヘキサノイル）−アスパルチル−グルタミル−バリニル）−３−アミ ノ−３−ホルミルプロピオン酸 本明細書の趣旨に副って、次の略号は表記の意味を有する。 ＢＯＣ ｔ−ブチルオキシカルボニル ＣＢＺ カルボベンゾキシ ＤＣＣ １，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド ＤＩＢＡＬ 水素化ジイソブチルアルミニウム ＤＭＡＰ ４−（ジメチルアミノ）ピリジン ＤＭＦ Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド ＥＤＣＩ １−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチル カルホジイミド塩酸塩 Ｅｔ₃Ｎ トリエチルアミン ＥｔＯＡｃ 酢酸エチル Ｅｔ₂Ｏ エチルエーテル ＦＡＢ 高速原子衝撃 ＨＭＰＡ ヘキサメチルホスホルアミド ＨＯＢｔ １−ヒドロキシベンゾトリアゾール ＨＲＭＳ 高分解質量分析法 ＫＨＭＤＳ カリウムヘキサメチルジシラザン ＬＤＡ リチウムジイソプロピルアミド ＭＣＰＢＡ メタクロロ過安息香酸 Ｍｓ メタンスルホニル＝メシル ＭｓＯ メタンスルホネート＝メシレート ＮＢＳ Ｎ−ブロモスクシンイミド ＰＣＣ クロロクロム酸ピリジニウム ＰＤＣ 二クロム酸ピリジニウム Ｐｈ フェニル ＰＰＴＳ ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム ｐＴＳＡ ｐ−トルエンスルホン酸 Ｐｙｅ ピリジンジイル ｒ．ｔ． 室温 ｒａｃ． ラセミ体 Ｔｆ トリフルオロメタンスルホニル＝トリフリル ＴｆＯ トリフルオロメタンスルホネート＝トリフレート ＴＨＦ テトラヒドロフラン ＴＨＰ テトラヒドロピラン−２−イル ＴＬＣ 薄層クロマトグラフィー Ｔｓ ｐ−トルエンスルホニル＝トシル ＴｓＯ ｐ−トルエンスルホネート＝トシレート Ｔｚ １Ｈ（または２Ｈ）−テトラゾル−５−イル アルキル基略号 Ｍｅ メチル Ｅｔ エチル ｎ−Ｐｒ ノルマルプロピル ｉ−Ｐｒ イソプロピル ｎ−Ｂｕ ノルマルブチル ｉ−Ｂｕ イソブチル ｓ−Ｂｕ 第二級ブチル ｔ−Ｂｕ 第三級ブチル 「アルキル」という語は、前に付した記号によって示した数の炭素原子を有す る直鎖状、分枝鎖状及び環状構造並 びにこれらの組み合わせを意味する。 「アルコキシ」という語は、直鎖状、分枝鎖状または環状に配置された、示し た数の炭素原子を有するアルコキシ基を意味する。アルコキシ基の例には、メト キシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、シクロプロピルオキシ、シクロ ヘキシルオキシ等が含まれる。 「アルキルチオ」という語は、直鎖状、分枝鎖状または環状に配置された、示 した数の炭素原子を有するアルキルチオ基を意味する。アルキルチオ基の例には 、メチルチオ、プロピルチオ、イソプロピルチオ、シクロヘプチルチオ等が含ま れる。一例として、プロピルチオ基を記号で表わすと−ＳＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₃とな る。 ハロにはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩが含まれる。光学異性体−ジアステレオマー−幾何異性体 本明細書に開示した化合物のうちの幾つかは一つ以上の不斉中心を有し、即ち ジアステレオマー及び光学異性体を生成させ得る。本発明は、生成し得るジアス テレオマーとそのラセミ体、及び分割によって得られる、エナンチオマーとして 純粋な形態、並びにこれらの医薬に許容可能な塩を包含するものとする。 本明細書に開示した化合物のうちの幾つかはオレフィン性二重結合を有し、こ のような化合物は特に断わらないかぎりＥ型とＺ型との両方の幾何異性体を包含 するものとする。塩 本発明の医薬組成物は活性成分として式Ｉの化合物またはその医薬に許容可能 な塩を含有し、また医薬に許容可能なキャリヤ、及び場合によっては他の治療薬 成分も含有し得る。「医薬に許容可能な塩」という語は、無機塩基及び有機塩基 を含めた医薬に許容可能な無毒塩基から形成された塩を意味する。無機塩基から 得られる塩には、アルミニウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、銅塩、第二 鉄塩、第一鉄塩、リチウム塩、マグネシウム塩、第二マンガン塩、第一マンガン 塩、アンモニウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、亜鉛塩等が含まれる。特に好 ましいのはカルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩及びナトリウム塩である 。医薬に許容可能な有機無毒塩基から得られる塩には、第一級、第二級及び第三 級アミン、天然置換アミンを含めた置換アミン、環状（ｃｙｃｌｉｃ）アミン、 並びにアルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ´−ジ ベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、 ２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エ チルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジ ン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リシン、メチルグルカミン、モルホリ ン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロ ミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミ ン等といった塩基性イオン交換樹脂の塩が含まれる。 本発明の化合物が塩基性である場合、塩は無機及び有機酸を含めた医薬に許容 可能な無毒酸から形成され得る。前記のような酸には、酢酸、ベンゼンスルホン 酸、安息香酸、樟脳スルホン酸、クエン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グル コン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、 リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、硝酸、パモ酸、パントテン 酸、リン酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸等が含まれる。特 に好ましいのはクエン酸、臭化水素酸、塩酸、マレイン酸、リン酸、硫酸及び酒 石酸である。 後段での治療方法の検討において、式Ｉの化合物に言及する時はその医薬に許 容可能な塩も含めてのことと理解されたい。 式Ｉの化合物は、アポパインの作用を阻害する能力を有することから、アポト ーシスの分野において研究手段として有用である。この化合物はまた、哺乳動物 、特にヒトにおいて １．免疫不全症候群（ＡＩＤＳを含む）、 ２．Ｉ型糖尿病、 ３．病原体感染、 ４．心血管及び神経損傷、 ５．脱毛症、 ６．老化、 ７．パーキンソン病、 ８．アルツハイマー病 を非限定的に含めた疾患の治療、予防及び改善にも有用である。用量範囲 式Ｉの化合物の治療用量の多寡は当然ながら、治療するべき状態の性質及び重 篤度、並びに用いる特定の式Ｉの化 合物とその投与経路に応じて様々となり、臨床医の判断によっても変化する。上 記用量はまた個々の患者の年齢、体重及び応答次第でも変化する。即ち、活性成 分の有効用量は臨床医が、あらゆる規準を考慮した後患者にとって最良の判断を 下して決定し得る。 眼球への投与には、許容可能な眼科用薬剤（ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ｆｏｒｍ ｕｌａｔｉｏｎ）中の式Ｉの化合物の０．００１〜１重量％溶液または懸濁液を 含む眼用製剤を用い得る。医薬組成物 哺乳動物、特にヒトに有効量の本発明の化合物を与えることは、いずれか適当 な投与経路を用いて可能である。例えば、経口、非経口及び局所的経路を用い得 る。投与形態には錠剤、トローチ剤、分散液剤、懸濁液剤、溶液剤、カプセル剤 、クリーム剤、軟膏剤、エアゾル剤等が含まれる。 本発明の医薬組成物は活性成分として式Ｉの化合物またはその医薬に許容可能 な塩を含有し、また医薬に許容可能なキャリヤ、及び場合によっては他の治療薬 成分も含有し得る。「医薬に許容可能な塩」という語は、無機塩基また は酸及び有機塩基または酸を含めた医薬に許容可能な無毒塩基または酸から形成 された塩を意味する。 本発明の組成物は、経口投与、非経口投与及び眼球（眼内）投与に適した組成 物を包含する。本発明の組成物は便利な単位投与形態で提供でき、かつ調剤の分 野で良く知られた任意の方法で調製できる。 実用に際して、式Ｉの化合物は通常の医薬配合技術に従い、医薬用キャリヤと 十分混和した活性成分として配合し得る。キャリヤは、投与のために望ましい剤 形に応じてきわめて様々な形態を有し得る。経口投与形態の組成物の調製ではい ずれか普通の医薬用媒体を用い得、それは例えば懸濁液剤、エリキシル剤及び溶 液剤などの経口液体製剤であれば例えば水、アルコール、油、香味付与剤、防腐 剤、着色剤等であり、例えば散剤、カプセル剤及び錠剤などの経口固体製剤であ れば澱粉、糖、微晶質セルロース、稀釈剤、顆粒化剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤 等のキャリヤであり、その際固体の経口製剤の方が液体製剤よりも好ましい。投 与の容易さから、錠剤及びカプセル剤が最も有利な経口投与単位形態であり、こ れらの形態では明らかに固体の医薬用キャリヤが用いられる。所望であれば、錠 剤を標準 的な水性または非水性技術によって被覆してもよい。 経口投与に適する本発明の医薬組成物はカプセル剤、カシェ剤または錠剤とい った、各剤粒が粉末もしくは顆粒状、または水性液体、非水性液体、水中油型乳 濁液もしくは油中水型乳濁液を媒体とした溶液もしくは懸濁液状の活性成分を所 定量ずつ含有する個別的単位投与形態として提供し得る。このような組成物は任 意の調剤方法で調製可能であるが、それらの方法はいずれも活性成分を１種以上 の必要成分から成るキャリヤと混合するステップを含む。上記組成物は通常、活 性成分を液体キャリヤもしくは微粉状固体キャリヤまたはこれらの両方と均一か つ十分に混合し、その後必要であれば混合物を所望の形状に成形することによっ て調製する。例えば、場合によっては１種以上の付加的成分を加えての圧縮成形 または擦り込み成形（ｍｏｌｄｉｎｇ）によって錠剤を製造し得る。圧縮錠剤は 、場合によっては結合剤、滑沢剤、不活性稀釈剤、界面活性剤または分散剤と混 合した粉末または顆粒などの自由流動形態の活性成分を適当な機械で圧縮成形す ることによって製造し得る。擦り込み錠剤は、不活性稀釈液で湿した粉末状化合 物の混合物を適当な機械で擦り込み成形することにより製 造し得る。望ましくは、錠剤は１錠当たり約１〜約５００ｍｇの活性成分を含有 し、カシェ剤またはカプセル剤も１錠当たり約１〜約５００ｍｇの活性成分を含 有する。合成方法 本発明の化合物は、以下に概説し、かつ後出の実施例においてより詳細に説明 した操作を用いると好ましく製造できる。方法Ａ ＢＯＣ、ＣＢＺまたは他の任意の適当な窒素保護基などの基でＮ保護したアミ ノ酸１を、アリルアルコール存在下に０℃においてＣＨ₂Ｃｌ₂またはＣＨＣｌ₃ といった不活性溶媒中で１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカル ボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ）とのカップリング反応によりアリルエステルに変 換して２を得る。このアミノ酸を、窒素をＢＯＣ基で保護した場合はＭｅＯＨ中 でＨＢｒなどの酸でＮ脱保護して遊離アミンを得る。異なる基を用いた場合の脱 保護については、“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉ ｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，” ２ｎｄ ｅｄ．， Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎ ｓ， Ｎ．Ｙ．， １９９１に記載が有る。上記アミ ンを３と、先に述べたようにしてカップリングさせ、それによってジペプチド４ を得る。先の条件に従ってのアミン脱保護後、アミンを５とカップリングさせて トリペプチド６を得る。５上のＢＯＣ基は、２−ｔ−ブチルオキシカルボニルア ミノベンゾエートなどの螢光原基質（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ ｓｕｂｓｔａｔ ｅ）によって置き換えることも可能である。アリル基のパラジウム（０）及びピ ロリジンでの脱保護（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２８， ｐ．４３７ １， １９８７）によって酸を得、この酸をＢｉｏ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． ２， ｐ．６１３， １９９２に従ってｎ−アリルオキシカルボニ ル−４−アミノ−５−ベンジルオキシ−２−オキソテトラヒドロフラン７とカッ プリングさせることにより、還元条件下でのベンジル脱保護後に８を得る。７の Ｒ²はＨ、ＣＨ₃、ＣＦ₃、ＯＭｅ及びＳＭｅであり得る。 生物活性測定アッセイ ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの タンパク質分解性切断の測定 （ａ）［³⁵Ｓ］放射性標識ＰＡＲＰの調製 ヒトポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼをコードするｃＤＮＡ（クローン ｐＣＤ−１２； ＧｅｎＢａｎｋ受託番号第Ｍ３２７２１号； ＮＣＢＩ ｇｉ １９０２６６）をそのクローニングベクターからＸｈｏＩ制限消化によって切 り出し、その後ＸｈｏＩ切断したＣＩＰ処理済みのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に連結した。コンピテント大腸菌細胞を形 質転換し、コロニーを精製し、得られた形質転換細胞を培養液中で増殖させた後 プラスミドＤＮＡを精製し、ＰＡＲＰｃＤＮＡの向きを制限酵素分析によって確 認した。Ｔ７方向及びＴ３方向への向きを有するクローンが得られ、これらのプ ラスミドＤＮＡを用いて、［³⁵Ｓ］メチオニン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕ ｃｌｅａｒ）の存在下にＴｎＴ網状赤血球溶解物（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いる共 役ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳により［³⁵Ｓ］ＰＡＲＰの合成を行なった。得ら れた［³⁵Ｓ］ＰＡＲＰポリペプチド を、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１ ％ ＣＨＡＰＳ、５ｍＭジチオトレイトール中で平衡させたＳｕｐｅｒｄｅｘ− ７５ ＨＲ１０／３０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上でのゲル濾過クロマトグ ラフィーによって網状赤血球溶解物混合物の諸成分から精製単離した。 （ｂ）ＰＡＲＰ切断の測定 １０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、２ｍＭＥＤＴＡ、０．１％ ＣＨＡＰＳ、５ｍＭジチオトレイトールから成る緩衝液に５μｌの精製［³⁵Ｓ］ ＰＡＲＰ及び０〜１０μｌのＰＡＲＰ切断活性（例えばアポトーシスを起こした 骨肉腫細胞、ＴＨＰ−１細胞または他の細胞から得た画分や、精製アポパインま たは組み換えアポパイン）プラス薬剤（指示した場合）または賦形剤を加えてイ ンキュベーション混合物（最終体積２５μｌ）を製造した。混合物を３７℃で６ ０分間インキュベートしてから６．５μｌの５倍濃縮ＳＤＳ含有ＰＡＧＥ試料緩 衝液を添加し、その後９５℃で５分間変性を生起させた。試料を１０％ポリアク リルアミドゲル上で分離し、エレクトロブロッティングによってポリ（二フッ化 ビニリデン）膜に移し取り 、その後［³⁵Ｓ］ＰＡＲＰ切断生成物をオートラジオグラフィーによって可視化 した。ＰＡＲＰ切断を、１１３．１ｋＤａのＰＡＲＰポリペプチドの２４．１ｋ Ｄａ及び８９．１ｋＤａフラグメントへの分裂として測定した。得られたオート ラジオグラムのレーザー濃度測定により測定した２４．１ｋＤａフラグメントの 体積−密度によってＰＡＲＰ切断活性を定量した。 （ｃ）螢光原基質の切断によるＰＡＲＰ切断の測定 アポパインによって認識される、ＰＡＲＰ切断部位のＰ_{1 〜}Ｐ₄アミノ酸に対応 するテトラペプチドの螢光原誘導体であるＡｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ（ＡＭＣはア ミノ−４−メチルクマリン）を、ｉ）Ｎ−Ａｃ−Ａｓｐ（ＯＢｎ）−Ｇｌｕ（Ｏ Ｂｎ）−Ｖａｌ−ＣＯ₂Ｈの合成、ｉｉ）Ａｓｐ（ＯＢｎ）−７−アミノ−４− メチルクマリンとのカップリング、ｉｉｉ）ベンジル基の除去によって製造した 。 １００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１０％（ｗ／ｖ）スクロー ス、０．１％（ｗ／ｖ） ＣＨＡＰＳ、１０ｍＭジチオトレイトールにＡｃ−Ｄ ＥＶＤ−ＡＭＣ及び精製したかまたは粗なままのＰＡＲＰ切断アポパイン／ＣＰ Ｐ３２酵素を加えて標準反応混合物（最終体積３００μｌ）を製造し、これを２ ５℃でインキュベートした。反応を、励起波長３８０ｎｍ、発光波長４６０ｎｍ の分光螢光光度計で連続的に監視した。 本発明を以下の実施例によって詳述するが、これらの実施例は本発明を限定す るものではない。図面の詳細な説明 図１は、自然にアポトーシスを起こした骨肉腫細胞におけるＰＡＲＰ切断活性 を示している。（ａ）ＰＡＲＰの構造及びタンパク質分解酵素による切断によっ て生じた断片。ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼは、３つの機能性ドメイ ン：一本鎖又は二本鎖ＤＮＡの切断を選択的に認識する２つの亜鉛フィンガーモ チーフを含むアミノ末端ＤＮＡ結合ドメインと、カルボキシ末端触媒ドメインと 、自己修飾を起こしてＤＮＡの結合親和性を変化させる中央領域とからなる１１ ３ｋＤａの核タンパク質である³⁷。ア ポトーシス発生時に生起するタンパク質分解酵素による切断部位は矢印で示され ている。（ｂ）細胞抽出物によるＰＡＲＰのｉｎ ｖｉｔｒｏ切断。ｉｎ ｖｉ ｔｒｏ転写／翻訳により［³⁵Ｓ］ＰＡＲＰを生成させ、次いで、集密前のアポト ーシスを起こしていない骨肉腫細胞のシトソール抽出物（レーン２）、集密後の アポトーシスを起こした骨肉腫細胞のシトソール抽出物（レーン３）、新たに分 離したＴＨＰ−１細胞のシトソール抽出物（レーン４）、３７℃で６０分間予備 インキュベートして活性化したＴＨＰ−１細胞抽出物（レーン５）又はアポトー シスを起こしたニワトリＳ／Ｍ抽出物（レーン６）と合わせた。（ｃ）アポトー シスが進行している骨肉腫細胞におけるヌクレオソーム内のＤＮＡの切断。骨肉 腫細胞を指示された日数培養してから回収した。ＤＮＡを抽出し、アガロースゲ ル上で分離した。アスタリスクは集密に達した時点（６日目）を示す。（ｄ）ア ポトーシスが進行している骨肉腫細胞におけるＰＡＲＰ切断活性の評価。パネル （ｃ）に記載のアポトーシスが進行している骨肉腫細胞からシトソール画分を分 離し、次いで、ＰＡＲＰ切断活性（白丸）及びｐｒｏＩＬ−１β切断活性（白四 角）についてアッセイした。方法 （ｂ）シトソール抽出物は、培養したヒト骨肉腫細胞（１４３．９８．２ ：ＡＴＣＣ ＣＲＬ １１２２６）及びＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ ２ ０２）から、ＰＢＳで洗浄した細胞ペレットを、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ／ＫＯＨ （ｐＨ７．４）、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％（ｗ／ｖ）のＣＨＡＰＳ、５ｍＭ のジチオトレイトール、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド、１０μ ｇ／ｍｌのペプスタチンＡ、２０μｇ／ｍｌのロイペプチン、１０μｇ／ｍｌの アプロチニン（１×１０⁸細胞／ｍｌ）中でホモジナイズし、１，０００×ｇ、 １０，０００×ｇ、次いで１００，０００×ｇで連続遠心した後上清を回収して 調製した。ニワトリＳ／Ｍ抽出物は、先に記載のように³⁵、Ｓ期アフィジコリン 停止次いでＭ期ノコダゾール蓄積によりアポトーシスを起こさせたＤＵ２４９ヘ パトーマ細胞³⁸から調製した。ＰＡＲＰの全長ｃＤＮＡクローン（ｐｃＤ−１２ ）³⁹を切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−II ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ）のＸｈｏＩ部位に連結し、次いで、転写（Ｔ７ポリメラーゼ）／翻訳（ウサギ 網状赤血球溶解物）（Ｐｒｏｍｅｇａ）による［³⁵Ｓ］メチオニン標識ＰＡＲＰ の合成の推進に用いた。 ［³⁵Ｓ］ＰＡＲＰは、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ／ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、２ｍＭの ＥＤＴＡ、０．１％（ｗ／ｖ）のＣＨＡＰＳ、５ｍＭのジチオトレイトール中の Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５ ＦＰＬＣカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ；１×３０ｃｍ ）上のゲル濾過クロマトグラフィーにより、転写／翻訳混合物の構成成分から分 離した。［³⁵Ｓ］ＰＡＲＰ〔５０ｍＭのＰｉｐｅｓ／ＫＯＨ（ｐＨ６．５）、２ ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％（ｗ／ｖ）のＣＨＡＰＳ、５ｍＭのジチオトレイトー ル中２５μｌの最終容量〕を含む反応混合物を、アポトーシスを起こしていない 骨肉腫細胞（３日目の集密前培養物）のシトソール画分由来のタンパク質４．５ μｇ（レーン２）、アポトーシスを起こした骨肉腫細胞（７日目の集密後培養物 ）のシトソール画分由来のタンパク質４．５μｇ（レーン３）、ＴＨＰ−１細胞 のシトソール画分由来のタンパク質３０μｇ（レーン４）、３７℃で６０分間予 備インキュベートして活性化したＴＨＰ−１細胞のシトソール画分由来のタンパ ク質３０μｇ（レーン５）又はニワトリＳ／Ｍ抽出物由来のタンパク質０．６μ ｇ（レーン６）を含むシトソール抽出物の不在下（レーン１）又は存在下（レー ン２〜６）に、３７℃で１時 間インキュベートした。試料を１０％ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル上で分離 し、［³⁵Ｓ］ＰＡＲＰ切断産物をフルオログラフィーにより視覚化した。（ｃ） 骨肉腫細胞を４，０００細胞／ｃｍ²の密度で培地に接種し、指示された期間培 養した。各時点でフェノール／クロロホルム抽出により、１×１０⁶個の細胞か らＤＮＡを分離し、ＤＮアーゼを含まないＲＮアーゼで消化し、アルコール沈降 させ、次いで、１．２％アガロース／ＴＡＥゲル上で分離した後、臭化エチジウ ムで染色した。（ｄ）上記（ｃ）に記載の細胞からシトソール画分を分離し、次 いで（ｂ）に記載の方法で、［³⁵Ｓ］ＰＡＲＰ（白丸）を用いてＰＡＲＰ切断活 性についてアッセイした。ＰＡＲＰの切断は、得られたフルオログラム上の２４ ｋＤａに対応するバンドをレーザーデンシトメトリーにより定量した。データは 、２回の別個の実験の平均値である。ｐＨ７．４で行うこと以外は、上記に［³⁵ Ｓ］ＰＡＲＰの切断について記載のものと実質的に同じ方法で、［³⁵Ｓ］ｐｒｏ ＩＬ−１βの切断によりＩＣＥ活性（白四角）を測定した。 図２は、アポトーシスを起こした骨肉腫細胞抽出物におけるＰＡＲＰ切断の阻 害を示している。（ａ）種々のプロ テアーゼ阻害剤による阻害。指示された種々のプロテアーゼ阻害剤の存在下に、 アポトーシスを起こした骨肉腫細胞のシトソール画分を（ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写 ／翻訳により誘導された）［³⁵Ｓ］ＰＡＲＰと共にインキュベートした。得られ たフルオログラムからの２４ｋＤａの切断産物を示す。（ｂ）合成テトラペプチ ドアルデヒドによる阻害。それぞれＰＡＲＰ切断部位及びｐｒｏＩＬ−１β切断 部位のＰ₁−Ｐ₄アミノ酸をモデルとした、指示濃度のテトラペプチドアルデヒド Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ（白丸）又はＡｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯ（黒四角）の存 在下に、アポトーシスを起こした骨肉腫細胞のシトソール画分を［³⁵Ｓ］ＰＡＲ Ｐと共にインキュベートした。Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯの構造は図中のインセッ ト（はめ込み部）に示されている。方法 （ａ）図１ｂに示されているように［³⁵Ｓ］ＰＡＲＰの切断を測定したが 、但し、（ｉ）転写／翻訳混合物のクロマトグラフィー、細胞溶解緩衝液及び［³⁵ Ｓ］ＰＡＲＰ切断インキュベーション緩衝液のジチオトレイトールの濃度を５ ｍＭから１ｍＭに低減させ、（ii）細胞溶解緩衝液はプロテアーゼ阻害剤を含ん でいなかった。アポ トーシスを起こした骨肉腫細胞（７日目の集密後培養物）のシトソール画分由来 のタンパク質１０μｇを含むインキュベーション混合物を、指示されたプロテア ーゼ阻害剤と共に３７℃で２０分間予備インキュベートしてから［³⁵Ｓ］ＰＡＲ Ｐを加えた。３７℃で６０分間インキュベートした後、試料を１０％ＳＤＳ／ポ リアクリルアミドゲル上で分離した。得られた乾燥ゲルのフルオログラフィーに より切断産物を視覚化し、２４ｋＤａ産物に対応する領域を示す。シトソール画 分の不在下（レーン１及びレーン１６）又はシトソールの存在下且つプロテアー ゼ阻害剤の不在下（レーン２及びレーン１７）に対照試料をインキュベートした 。インキュベーション混合物は、１００μＭの４−アミジノ−フェニル−メタン −スルホニルフルオリド（ｐＡＰＭＳＦ；レーン３）、２μｇ／ｍｌのアプロチ ニン（レーン４）、１００μＭのエラスチナール（レーン５）、１ｍＭのフェニ ルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ；レーン６）、１００μＭのＬ−１− クロロ−３−［４−トシルアミド］−７−アミノ−２−ヘプタノン（ＴＬＣＫ； レーン７）、１００μＭのＬ−１−クロロ−３−［４−トシルアミド］−４−フ ェニル−２−ブタノン（ＴＰＣＫ ；レーン８）、１ｍｇ／ｍｌのダイズトリプシン阻害剤（ＳＢ−ＴＩ；レーン９ ）、１０μＭのアマスタチン（レーン１０）、１０μＭのベスタチン（レーン１ １）、５０μＭのジプロチンＡ（レーン１２）、８．５μＭのホスホラミドン（ レーン１３）、１μＭのペプスタチン（レーン１４）、５ｍＭのＥＤＴＡ（レー ン１５）、１ｍｇ／ｍｌのａ₂マクログロブリン（レーン１８）、１００μＭの アンチパイン（レーン１９）、１００μＭのキモトリプシン（レーン２０）、１ ００μＭのロイペプチン（レーン２１）、１０μＭのＥ−６４（レーン２２）、 ５ｍＭのヨードアセトアミド（レーン２３）、５ｍＭのＮ−エチルマレイミド（ レーン２４）、１μＭのＡｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯ（レーン２５）、１００ｎＭの Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ（レーン２６）又は１００ｎＭのＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＯ ＯＨ（レーン２７）を含んでいた。別の対照は、阻害剤を反応混合物（新鮮な５ ０×ストックとして調製した）に導入するために用いた溶媒を含んでいた。該溶 媒は、水（レーン２８；試料３に使用）、メタノール（レーン２９；試料７、８ 、１１、１４に使用）、エタノール（レーン３０；試料６、１０に使用）及びジ メチルスルホキシド（レーン３ １；試料２０、２５〜２７に使用）であった。その他の試料用のストックはイン キュベーション緩衝液中で調製した。（ｂ）テトラペプチドアルデヒド Ａｃ− ＹＶＡＤ−ＣＨＯは先に記載のように合成し⁴⁰、それと実質的に同じ手順でＡｃ −ＤＥＶＤ−ＣＨＯ（インセット）を合成した。図１ｂに記載のように［³⁵Ｓ］ ＰＡＲＰ切断活性を測定した。アポトーシスを起こした骨肉腫細胞（７日目の集 密後培養物）のシトソール画分由来のタンパク質１０μｇを含むインキュベーシ ョン混合物を、指示濃度のＡｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯ（黒四角）又はＡｃ−ＤＥＶ Ｄ−ＣＨＯ（白丸）と共に３７℃で２０分間予備インキュベートしてから［³⁵Ｓ ］ＰＡＲＰを加えた。３７℃で６０分間インキュベートした後、１０％ＳＤＳ／ ポリアクリルアミドゲル上で試料を分離した。得られた乾燥ゲルのフルオログラ フィーにより切断産物を視覚化し、２４ｋＤａの切断産物に対応するバンドをレ ーザーデンシトメトリーで定量した。データは、阻害剤を加えなかった対照の百 分率として表し、２回の別個の実験の平均値である。 図３はＴＨＰ−１細胞由来のＰＡＲＰ切断プロテアーゼの精製を示している。 （ａ）ＤＥＡＥアニオン交換クロマ トグラフィー。（ｂ）ビオチニル化テトラペプチド−アルデヒド親和性リガンド の構造。（ｃ）ＴＨＰ−１細胞のシトソール画分（レーン１）、アフィニティー クロマトグラフィー前のＤＥＡＥピータ活性画分（画分１１４）（レーン２）及 びアフィニティークロマトグラフィー後の該画分（レーン３）、ビオチン−ＤＥ ＶＤ−ＣＨＯアフィニティーカラムからの溶離液（レーン５）及びビオチン−［ Ｘ］−ＤＥＶＤ−ＣＨＯアフィニティーカラムからの溶離液（レーン６）のＳＤ Ｓ／ポリアクリルアミドゲル電気泳動。方法 （ａ）先に記載のように⁴¹、培養したＴＨＰ−１細胞からシトソール画分 を分離し、透析、濃縮し、次いで、２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．８） 、１０％（ｗ／ｖ）のスクロース、０．１％（ｗ／ｖ）のＣＨＡＰＳ、２ｍＭの ジチオトレイトール中４℃で予備平衡させておいたＤＥＡＥ−５ＰＷ ＨＰＬＣ カラム（ＴｏｓｏＨａａｓ，５．５×２０ｃｍ；１．４×１０¹¹細胞由来のタン パク質３〜５ｇｍ）に加えた。タンパク質を、線形勾配の０．４ＭのＮａＣｌ、 ２４０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１０％（ｗ／ｖ）のスクロース 、０．１％（ ｗ／ｖ）のＣＨＡＰＳ、２ｍＭのジチオトレイトールで溶離した。ＩＣＥ活性を 含む画分の直前の約９０〜１２０ｍＭのＮａＣｌに対応する画分をプールし、２ ５ ＤＥＡＥクロマトグラフィー実施で得たプールと合わせ（３．５×１０¹²Ｔ ＨＰ−１細胞由来のタンパク質１．６ｇ）、同一条件下に再実施した。図１ｂに 示されているように各画分のＰＡＲＰ切断活性をアッセイし、図２ｂに記載のよ うにレーザーデンシトメトリーで定量した。あるいは、図５に詳細に記載されて いる合成蛍光性テトラペプチドアミノメチルクマリン（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ ）を用いて活性を測定した。（ｂ）ビオチン−ＤＥＶＤ−ＣＨＯとビオチン−［ Ｘ］−ＤＥＶＤ−ＣＨＯとは、０．９ｎｍのスペーサーアーム（白四角で示され ている）がビオチン−［Ｘ］−ＤＥＶＤ−ＣＨＯには存在するがピオチン−ＤＥ ＶＤ−ＣＨＯには存在しないという点で異なっている。これらのリガンドは、（ ｉ）アルデヒドでベンジル化ラクトールとして保護されたｔ−Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ ＯＢｎ）−Ｇｌｕ（ＯＢｎ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨＯの合成、（ii）ｔ−Ｂｏ ｃ基の除去、（iii）ＥＤＣＩ及びＨＯＢｔを用いたビオチン（ビオチン−ＤＥ ＶＤ−ＣＨＯの場合）又はビオチン アミドカプロン酸（ビオチン−［Ｘ］−ＤＥＶＤ−ＣＨＯの場合）による遊離ア ミンのアシル化によって調製した。後続段階でストレプトアビジン−アガロース （インセットに示されている）上で固定化し得るビオチニル化親和性リガンドを 用いるこの方法を選択した理由は、（ｉ）スペーサーアームの長さが容易に変え られ、（ii）アガロースビーズ上のリガンドの濃度を正確に制御することができ 、且つ（iii）ビオチニル化リガンドを酵素と共に予備インキュベートして完全 平衡を得た後でストレプトアビジンアガロースとの複合体を回収することができ るからであり、この種のリガンドがＰＡＲＰ切断酵素を加えると時間依存性平衡 に達する（ｋ_on＞１０⁵Ｍ^-1ｓ^-1）という特定の利点のためである。（ｃ）ＤＥ ＡＥクロマトグラフィーから得たＰＡＲＰ切断活性のピークに対応する画分（画 分１１４；タンパク質３ｍｇを含む２．５ｍｌ）を、５０ｍＭのＰＩＰＥＳ／Ｋ ＯＨ（ｐＨ６．８）、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％（ｗ／ｖ）のＣＨＡＰＳ、５ ｍＭのジチオトレイトールからなる総量１０ｍｌ中２０ｎｍｏｌのビオチン−［ Ｘ］−ＤＥＶＤ−ＣＨＯと共に室温で３０分間インキュベートした。次いで、混 合物をストレプトアビジンアガ ロースカラム〔ベッド容量１ｍｌ；５０ｍＭのＰＩＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ６．８ ）、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％（ｗ／ｖ）のＣＨＡＰＳ、５ｍＭのジチオトレ イトール中で予備平衡化；結合能＝６３ｎｍｏｌ ビオチン／ｍｌ〕に通し、２ ０カラム容量の同じ緩衝液で洗浄した。カラムを同一緩衝液中で２ｍＭのＤ−ビ オチンと共に灌流させて酵素を溶離し、数時間放置してから、精製されたＰＡＲ Ｐ切断酵素を回収した。ビオチン−ＤＥＶＤ−ＣＨＯを用いて同一アフィニティ ークロマトグラフィーを行い、同等の結果を得た。試料を１４％ＳＤＳ／ポリア クリルアミドゲル上で分離し、タンパク質バンドを銀染色して視覚化した。試料 は、ＴＨＰ−１細胞のシトソール画分由来のタンパク質９μｇ（レーン１）、ビ オチン−［Ｘ］−ＤＥＶＤ−ＣＨＯアフィニティークロマトグラフィー前のＤＥ ＡＥ画分１１４（レーン２）及び該クロマトグラフィーの後の該画分（レーン３ ）由来のタンパク質６μｇ、並びにビオチン−ＤＥＶＤ−ＣＨＯアフィニティー カラムの溶離液（レーン５）及びビオチン−［Ｘ］−ＤＥＶＤ−ＣＨＯアフィニ ティーカラムの溶離液（レーン６）由来のタンパク質０．１μｇを含んでいた。 図４は、ＰＡＲＰ切断プロテアーゼ；不活性プロ酵素ＣＰＰ３２からプロセシ ングされるアポパインの構造を示している。（ａ、ｂ）精製ＰＡＲＰ切断プロテ アーゼの１７ｋＤａサブユニット（左）と１２ｋＤａのサブユニット（右）のエ レクトロスプレー質量分光分析。括弧内の数字は（ｃ）に記載の配列に基づいて 計算されたサブユニットの質量を示す。（ｃ）アポパイン／ＣＰＰ３２の初期構 造。ＣＰＰ３２β ｃＤＮＡクローンから推定されたアミノ酸配列²⁵を示してい る。斜線部は精製酵素サブユニットについて決定されたアミノ末端配列を示して いる。矢印は、ＣＰＰ３２プロ酵素からｐ１７及びｐ１２サブユニットを生成し たＡｓｐ²⁸−Ｓｅｒ²⁹及びＡｓｐ¹⁷⁵−Ｓｅｒ¹⁷⁶切断部位を示している。推定触 媒システイン（星印）を含む保存されたＧｌｎ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌ ｙペンタペプチドもボックスで囲まれている。（ｄ）ＩＣＥ及びＣＰＰ３２プロ 酵素構造の比較。横バーは、それぞれＩＣＥ及びＣＰＰ３２のＰ４５及びｐ３２ プロ酵素を表す。推定触媒システイン残基を含む大きい方のサブユニットと、小 さい方のサブユニットはそれぞれ横バーの黒く塗りつぶされた部分と斜線の部分 で示されている。（ｅ）シ ステインプロテアーゼのＩＣＥ／ＣＥＤ−３ファミリーの全ての既知メンバーの 系統関係。（ｆ）全ての既知ヒトＩＣＥ／ＣＥＤ−３様プロテアーゼ（上から５ つの配列）及びネマトーダＣＥＤ−３（一番下の配列）の多重配列の整列。番号 はヒトＩＣＥ内の残基の位置に対応する。Ｘ線結晶構造^33,34に基づく、ヒトＩ ＣＥに結合する基質に包含される領域が示されている。黒丸は触媒領域、白丸は Ｐ₁Ａｓｐのカルボキシレート結合ポケット、白三角はＰ₂−Ｐ₄残基に対する近 接度（＜０．４ｎｍ）である。矢印はＩＣＥ及びＣＰＰ３２の既知プロ酵素切断 部位を示している。方法 （ａ、ｂ）図３ｃに記載の精製ＰＡＲＰ切断酵素のアリコートを内径の狭 いＣ４逆相ＨＰＬＣカラム上で分離し、実質的に先に記載の方法⁷で、エレクト ロスプレーイオン源を備えた３重セクター四重極質量分析計に接続したキャピラ リー液体クロマトグラフィーにより個々のサブユニットを分析した。トリプシン ペプチドも精製アポパインサブユニットからも産生され⁴⁰、同定をさらに確実に するためにエレクトロスプレー質量分光法により分析した。ペプチドとそれらの 予測及び実測質量は以下の通りであっ た： ＩＰＶＥＡＤＦＬＹＡＹＳＴＡＰＧＹＹＳＷＲ²⁰⁷、２４７０.８、２４７０.２ ； ＶＡＴＥＦＥＳＦＳＦＤＡＴＦＨＡＫ²⁵⁹、１９３５.１、１９３４.７； ＬＥＦＭＨＩＬＴＲ²³⁸、１１６０.４、１１６１.０； ＥＬＹＦＹＨ²⁷⁷、８７２.０、８７２.０。 （ｃ）図３ｃに記載の精製ＰＡＲＰ切断酵素約１００ｐｍｏｌを１４％ＳＤＳ／ ポリアクリルアミド上で分離し、エレクトロブロッティングによりポリビニリデ ンジフルオリド膜に移した。膜のｐ１７サブユニットを含む領域とｐ１２サブユ ニットを含む領域を切り出し、連続フローリアクター（Ｓｈｅｌｄｏｎ Ｂｉｏ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）を用 い、慣用のエドマン分解により配列決定した。横バーの斜線部は、得られたアミ ノ末端配列がＣＰＰ３２βの推定アミノ酸配列と完全に一致する部分を表す。（ ｄ）及び（ｅ）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓ ｏｎ ＷＩ）ＰＩＬＥＵＰアルゴリズム⁴²（ギャップ重量＝３．０；ギャップ長 重量＝０．１）を用いて指示されたｃＤＮＡの推定ポリペプチド配列（全読み取 り枠）即ち遺伝子配列を整列させ、系統樹（ｅ）又はアミノ酸配列 の整列（ｆ）として提示する。ｈＩＣＥ_rel−II及びｈＩＣＥ_rel−IIIはそれぞ れヒトＩＣＥ関連システインプロテアーゼII及びIIIであり；ｍＩＣＥ、ｒＩＣ Ｅ及びｈＩＣＥはそれぞれ、マウス、ラット及びヒトのＩＣＥ（インターロイキ ン−１β変換酵素）であり；ｍＮｅｄｄ２及びｈＩＣＨ−１はそれぞれ、Ｎｅｄ ｄ２／ＩＣＨ−１_Lのマウス及びヒト形態であり；ｃｂＣＥＤ−３、ｃｖＣＥＤ −３及びｃｅＣＥＤ−３はそれぞれ、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｂｒｉｇ ｇｓａｅ、ｖｕｌｇａｒｉｓ及びｅｌｅｇａｎｓのＣＥＤ−３（細胞−死−異常 ｃｅｄ−３遺伝子産物）であり；ｈＣＰＰ３２はヒトＣＰＰ３２βである。 図５は蛍光性基質を用いたアポパイン及び有効な阻害剤の動力学的分析を示す 。（ａ）Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ（インセット中の構造）のＫ_mの決定。（ｂ） ペプチドアルデヒド Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯによるＣＰＰ３２阻害の動力学。 （ｃ）ＴＨＰ−１細胞、骨肉腫細胞及びニワトリＳ／Ｍ抽出物におけるＰＡＲＰ 切断活性及びＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯによる阻害の比較。方法 （ａ）Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ（インセット）（ＡＭＣ；アミノ−４−メ チルクマリン）を以下のように調製 した：（ｉ）Ｎ−Ａｃ−Ａｓｐ（ＯＢｎ）−Ｇｌｕ（ＯＢｎ）−Ｖａｌ−ＣＯ₂ Ｈの合成；（ii）Ａｓｐ（ＯＢｎ）−７−アミノ−４−メチルクマリンとの結合 ；（iii）ベンジル基の除去。１００ｍＭのＨｅｐｅｓ／ＫＯＨ（ｐＨ７．５） 、１０％（ｗ／ｖ）のスクロース、０．１％（ｗ／ｖ）のＣＨＡＰＳ、１０ｍＭ のジチオトレイトール中の指示濃度のＡｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ及び３５Ｕの精製 ＰＡＲＰ切断アポパイン／ＣＰＰ３２酵素（１Ｕ＝２５℃、飽和基質濃度で１分 間に遊離したＡＭＣ１ｐｍｏｌ）を含む標準反応混合物（最終容量：３００μｌ ）を２５℃でインキュベートした。励起波長３８０ｎｍ、発光波長４６０ｎｍの 分光ケイ光光度計で反応を連続的にモニターした。初速度及び基質濃度を非線形 回帰によりミカエリス−メンテンの式（実線）に当てはめた。数回の実験の結果 、アポパインによる該基質の切断のＫ_mは、９．７±１．０μＭであることが示 された。（ｂ）図２ｂに示されているように、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯを調製し た。反応体（３００μｌ）は、（ａ）に記載の緩衝液中の１×Ｋ_mのＡｃ−ＤＥ ＶＤ−ＡＭＣ（１０μＭ）及び精製ＰＡＲＰ切断アポパイン酵素（１２０Ｕ）を 含んでいた。この反応混合物にテトラ ペプチドアルデヒド（５０ｎＭ）を加えると、酵素活性の時間依存性損失が生じ た（黒丸）が、阻害剤を含まない反応体は完全に線形であった（白丸）。遅結合 性阻害剤及び密着結合性阻害剤を分析するためにＭｏｒｉｉｓｏｎによって開発 された式⁴³に従って、いくつかの結合進行（progress）曲線から結合速度定数（ ｋ_on）を計算した。活性の完全阻害は５０ｎＭのＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯにより 無限時間で観察されたが、これは、この阻害剤のＫ_iが１ｎＭ未満であることを 示している。（ｃ）図１ｂに記載のように、ＴＨＰ−１細胞、アポトーシスを起 こした骨肉腫細胞及びアポトーシスを起こしたニワトリＤＵ２４９細胞から抽出 物を調製した。合成蛍光性テトラペプチド Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣの切断のＫ_m 並びにテトラペプチドアルデヒド阻害剤 Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯのｋ_on及び Ｋ_i値をそれぞれ上記（ａ）及び（ｂ）に記載の方法で測定した。 図６は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアポトーシス及びＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ又はアポ パイン仲介ＰＡＲＰ切断活性の除去による選択的阻害を示している。（ａ）アポ トーシスが進行している骨肉腫細胞のシトソールはアポトーシスを起こ していない健康な細胞の核にアポトーシス性変化を起こさせる。アポトーシスに よる細胞死の種々の段階の骨肉腫細胞から分離したシトソール画分をアポトーシ スを起こしていない骨肉腫細胞から分離した核と共にインキュベートし、Ｈｏｅ ｃｈｓｔ ３３３４２で染色した後、蛍光顕微鏡により形態学的な変化を評価し た。（ｂ）アポパインの阻害又は除去によるｉｎ ｖｉｔｒｏアポトーシスの減 弱化（attenuation）。縦列（column）２〜９：種々の濃度のＣＰＰ３２阻害剤 Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ（縦列３〜８）又はＩＣＥ阻害剤 Ａｃ−ＹＶＡＤ− ＣＨＯ（縦列９）の存在下に、アポトーシスを起こした骨肉腫細胞のシトソール 画分をアポトーシスを起こしていない健康な骨肉腫細胞の核と合わせた。縦列１ ０〜１５：活性化されるとアポトーシスを起こす骨肉腫細胞のシトソールからＰ ＡＲＰ切断活性を除去し（縦列１１〜１５）、次いで、種々の量の精製アポパイ ン（縦列１２〜１４）又は精製ＩＣＥ（縦列１５）の存在下にアポトーシスを起 こしていない健康な骨肉腫細胞の核と共にインキュベートした。方法 図１に記載のように、アポトーシスの種々の段階における骨肉腫細胞及び 該細胞のシトソール抽出物を調製し た。実質的に先に記載のように³⁶（但し、核を分離するための緩衝液は、１０ｍ ＭのＰｉｐｅｓ／ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ₂ 、１ｍＭのジチオトレイトール、１０μＭのサイトカラシンＢ、１ｍＭのフェ ニルメチルスルホニルフルオリド、１０μｇ／ｍｌのペプスタチンＡ、２０μｇ ／ｍｌのロイペプチン、１０μｇ／ｍｌのアプロチニンであった）、アポトーシ スを起こしていない（３日目の）細胞から核を分離した。（ａ）２×１０⁶個の ３日目細胞から分離した核を、指示された時間培養した細胞からのシトソール画 分（２．５×１０⁶細胞当量）２５μｌと合わせ、次いで、１０ｍＭのＨｅｐｅ ｓ／ＫＯＨ（ｐＨ７．０）、５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．１ ｍＭのＣａＣｌ₂、４０ｍＭのβ−グリセロホスフェート、１ｍＭのジチオトレ イトール、２ｍＭのＡＴＰ、１０ｍＭのクレアチンホスフェート及び５０μｇ／ ｍｌのクレアチンキナーゼを含む混合物１００μｌ（最終容量）中でインキュベ ートした。３７℃で２時間後、核クロマチンを５μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ３ ３３４２で染色し、蛍光顕微鏡（励起波長 ３３０ｎｍ；発光波長 ４５０ｎｍ ）で調べた。鮮やかな蛍光の疑縮 ・断片化クロマチンを有する核をアポトーシスを起こしたものと同定し、蛍光が 弱く、均一にクロマチン染色された核をアポトーシスを起こしていないものと同 定した。各条件に関して、５つの別個のフィールドで最低２５０個の核を同定し た。データは２回の別個の実験の平均値である。（ｂ）縦列１〜９：指示濃度の Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ（３〜８）又はＡｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯ（９）の存在下 に、アポトーシスを起こした７日目の骨肉腫細胞のシトソール画分（２〜９）と 合わせたアポトーシスを起こしていない３日目の骨肉腫細胞の分離した核を用い て、（ａ）に記載の方法でｉｎ ｖｉｔｒｏアポトーシスを測定した。データは ３回の別個の実験の平均値±ＳＥＭである。縦列１０〜１５：アポトーシスを起 こした７日目の細胞（Ｄ７_dep）のシトソール画分１ｍｌを１００ｎＭのビオチ ン−［Ｘ］−ＤＥＶＤ−ＣＨＯと共に２０分間インキュベートし、次いで５０μ ｌのストレプトアビジンアガロースを用いて回収し、該画分からＰＡＲＰ切断活 性を除去した（ビオチン結合能＝６３ｎｍｏｌ／ｍｌ）。次いで、同じ画分につ いて除去手順を繰り返した。種々の濃度の精製アポパイン／ＣＰＰ３２（１２〜 １５）又は精製ＩＣＥ（１５） を加えた、処理していない７日目のシトソール（１０）又は切断活性を除去した ７日目のシトソール（１１〜１５）と合わせた、アポトーシスを起こしていない ３日目の骨肉腫細胞（１０〜１５）の核を用い、（ａ）に記載の方法で、ｉｎ ｖｉｔｒｏアポトーシスを測定した。低濃度のＩＣＥも作用しなかった（図示せ ず）。 実施例１ アポトーシスが進行している骨肉腫細胞におけるＰＡＲＰ切断活性 アポトーシスの発生に付随して生起する初期事象は、ＩＣＥ（ｐｒＩＣＥ）と 類似の特性を有する未同定プロテアーゼによるＰＡＲＰのタンパク質分解性切断 である¹⁹。（Ａｓｐ²¹⁶とＧｌｙ²¹⁷の間の）切断により、ＰＡＲＰのアミノ末端 ＤＮＡニックセンサーがそのカルボキシ末端触媒ドメインから分離する（図１ａ ）。このタンパク質分解活性を測定するために、全長のヒトＰＡＲＰ ｃＤＮＡ クローンのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳により［³⁵Ｓ］ＰＡＲＰを基質として生 成させ、次いで、種々の細胞抽出物と合わせた（図１ｂ）。自発性アポトーシス 死傾向を有するヒト骨肉腫細胞系は、アポトーシスを起こした細胞 からの抽出物ではアポトーシスを起こしていない細胞からの抽出物に比べて（レ ーン２対レーン３）著しく高い実質的ＰＡＲＰ切断活性を有していた。骨肉腫細 胞はアポトーシス発生中に生起する事象の研究における良好なモデル系である。 骨肉腫細胞は、培養中に集密に達すると、細胞の収縮、膜の気胞形成（blebbing ）、クロマチンの凝縮及び断片化（図示せず）並びにヌクレオソーム間のＤＮＡ の切断を含むアポトーシス死に特徴的な形態学的・生化学的変化を起こす（図１ ｃ）。集密後の骨肉腫細胞培養物に発生するアポトーシスの進行に伴って、該細 胞抽出物中で測定されたＰＡＲＰ切断活性が１０倍以上も上昇した（図１ｄ）。 イムノブロッティング、逆転写酵素ＰＣＲ（図示せず）やｐｒｏＩＬ−１βのプ ロセシングの不在から判断すると、これらの抽出物中には検出可能なＩＣＥが存 在せず、それは、ＩＣＥがアポトーシス又はＰＡＲＰ切断には必要とされないこ とを示している。ＩＣＥがアポトーシスに関与しないということは、正常にアポ トーシスを起こしたＩＣＥ欠失マウスで確認された²⁹。 ＰＡＲＰ切断活性は、ＴＨＰ−１細胞の細胞質抽出物、特に３７℃で予備イン キュベートした後の、初期にＩＣＥ が精製されたヒト単球白血病細胞系でも測定可能であった（図１ｂ、レーン４対 レーン５）。これは、この細胞系のＩＣＥに関して記載されているように³⁰、Ｐ ＡＲＰ切断酵素は潜伏形態の活性化を必要とすることを示唆している。アポトー シスを起こした骨肉腫細胞抽出物及び活性化ＴＨＰ−１細胞抽出物におけるＰＡ ＲＰの切断は、このタンパク質分解活性が初期に同定されたアポトーシスを起こ したニワトリＳ／Ｍ抽出物¹⁹（レーン６）のものと同等であった。 実施例２ ＰＡＲＰ切断阻害剤 アポトーシスを起こした骨肉腫細胞のシトソール抽出物におけるＰＡＲＰのタ ンパク質分解性切断は、システイン−アルキル化試薬 Ｎ−エチルマレイミド及 びヨードアセトアミドによって阻止されたが、Ｅ−６４（これもシステインプロ テアーゼ阻害剤である）又はセリンプロテアーゼ、アスパルテートプロテアーゼ 若しくはメタロプロテアーゼによっては阻止されなかった（図２ａ）。この阻害 剤プロフィールは、新生のＩＣＥ様システインプロテアーゼファミリーのメンバ ーであるＰＡＲＰ切断酵素と一致する。 より有効且つ特異的なＰＡＲＰ切断阻害剤を開発するために、切断可能な結合に 隣接する配列を阻害剤設計用のテンプレートとして用いた。テトラペプチドアル デヒド Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯに対するＩＣＥの感受性（Ｋ_i＝０．７６ｎＭ ）によって示されるように、適切なペプチドアルデヒドはシステインプロテアー ゼの有効な阻害剤であり得る。従って、ＰＡＲＰ切断部位（ＤＥＶＤ²¹⁶−Ｇ²¹⁷ ）のＰ₁−Ｐ₄アミノ酸配列を含むテトラペプチドアルデヒドを合成し、該アルデ ヒドがＰＡＲＰ切断の有効な阻害剤（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ；図２ｂ インセ ット）であることを見出した。Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯは、アポトーシスを起こ した骨肉腫細胞抽出物のＰＡＲＰ切断活性を０．２ｎＭのＩＣ₅₀値をもって阻害 した。それに対し、対応カルボン酸（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＯＯＨ）及びＩＣＥの ｐｒｏＩＬ−１β認識配列を含むテトラペプチドアルデヒド（Ａｃ−ＹＶＡＤ− ＣＨＯ）のＩＣ₅₀値は１０μＭ超であった（図２ａ及び図２ｂ）。活性化ＴＨＰ −１細胞抽出物でもアポトーシスを起こしたニワトリＳ／Ｍ抽出物でもＰＡＲＰ 切断活性に関して同じ阻害剤プロフィールが見出された（図示せず）。ＩＣＥの 有効な阻害剤（Ｋ_i＜４ ｐＭ）である牛痘ウイルス セルピン ＣｒｍＡ〔サイトカイン応答モディファ イアーＡ（ｃｒｍＡ）遺伝子産物〕³¹は、０．６μＭまでのレベルでテストした 場合、ＰＡＲＰ切断に対する阻害作用は有していなかった（図示せず）。従って 、ＰＡＲＰの切断は、低濃度のテトラペプチドアルデヒド Ａｃ−ＤＥＶＤ−Ｃ ＨＯによって阻害され得るが、有効なＩＣＥ阻害剤では高レベルでも阻害し得な いＥ−６４非感受性システインプロテアーゼによって仲介される。 実施例３ ＰＡＲＰ切断プロテアーゼ、アポパインの精製 アポトーシスを起こしている哺乳動物細胞におけるＰＡＲＰの不活化に関与す る酵素を同定するために、該酵素を培養したヒト細胞から精製して均質とした。 集密に達してからアポトーシスに進行するにつれ、骨肉腫細胞のＰＡＲＰ切断活 性は高度に増大した。しかし、該プロテアーゼを精製するのに十分な量の付着細 胞系が得られないために、ＴＨＰ−１細胞を用いた。２つの証拠から、ＴＨＰ− １細胞でＰＡＲＰを切断したシステインプロテアーゼはアポトーシスを起こした 骨肉腫細胞のものと同一であることが 示唆された。第１の最も説得力のある証拠として、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯによ る触媒及び阻害の動力学的パラメーターが両細胞系からの抽出物の酵素と実質的 に同一であることが知見された（以下参照）。第２の証拠として、逆転写酵素Ｐ ＣＲ分析により、（転写体がＴＨＰ−１細胞でのみ検出可能であった）ＩＣＥを 除いて、ＴＨＰ−１細胞もアポトーシスを起こした骨肉腫細胞も、ＩＣＥ／ＣＥ Ｄ−３様酵素の同じ相補体の転写体（即ち、ＩＣＥｒｅ１−II、ＩＣＨ−１及び ＣＰＰ３２、但しＩＣＥｒｅ１−IIIは除く）を含んでいることが示された（図 示せず）。 ＤＥＡＥアニオン交換クロマトグラフィーによりＴＨＰ−１細胞からシトソー ル画分を分離すると、ＰＡＲＰ切断活性は、低塩濃度（ＩＣＥ及びＰＡＲＰ切断 活性に関してそれぞれ約８０ｍＭ及び１３５ｍＭ）でカラムから同時溶離された ＩＣＥ免疫反応性及びｐｒｏＩＬ−１β切断活性から分離された。数回のクロマ トグラフィーにより得られたＰＡＲＰ切断活性を含む画分をプールし、同一条件 下に再度クロマトグラフィーにかけた（図３ａ）。この活性を選択的に精製する ために、ＰＡＲＰ切断酵素用の親和性リガンドとしてＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯテ トラペプチドアル デヒド阻害剤の２種のビオチニル化誘導体を合成した（図３ｂ）。何故ビオチニ ル化親和性リガンドを用いたかというと、それは、該リガンドが、回収前に完全 平衡させることにより、遅リガンド結合性（以下参照）を克服するために酵素と 共に予備インキュベートし得るからである。どちらのビオチニル化テトラペプチ ドアルデヒドもＰＡＲＰ切断酵素の阻害に関して、非ビオチニル化親化合物のも のと同等のＩＣ₅₀値（０．２ｎＭ；図示せず）を有していた。ＰＡＲＰ切断活性 のピーク時のＤＥＡＥクロマトグラフィー画分をビオチニル化テトラペプチドア ルデヒドと共にインキュベートし、次いで、ストレプトアビジンアガロース上で 回収した。十分に洗浄した後、２ｍＭのビオチンを用いてカラムから精製ＰＡＲ Ｐ切断酵素を溶離した。得られた試料をＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル電気泳 動にかけると、精製ＰＡＲＰ切断酵素が約１７ｋＤａと１２ｋＤａの２種の主要 ポリペプチドからなることが示された（図３ｃ）。 実施例４ ＰＡＲＰ切断プロテアーゼ：アポパイン／ＣＰＰ３２の構造 精製ＰＡＲＰ切断酵素をエレクトロスプレー質量分光分析にかけると、大きい 方のポリペプチドの質量は１６，６１７．１±３．１であり、小さい方のポリペ プチドの質量は１１，８９６．２±１．２であることが示された（図４ａ）。精 製アポパイン酵素のアミノ末端配列決定及びトリプシンマップにより、該酵素が 、最近Ｊｕｒｋａｔ細胞²⁵からクローン化された、機能が未解明のシステインプ ロテアーゼのＩＣＥ／ＣＥＤ−３ファミリーのメンバーである不活性ＣＰＰ３２ プロ酵素のタンパク質分解産物であると同定された。クローン化ＣＰＰ３２は、 もともと、単一の保存アミノ酸置換（ＣＰＰ３２α及びＣＰＰ３２βに関してそ れぞれＡｓｐ¹⁹⁰対Ｇｌｕ¹⁹⁰）が異なる２種のアイソフォーム（ＣＰＰ３２α及 びＣＰＰ３２β）として同定された。精製アポパインＰＡＲＰ切断酵素の１２ｋ Ｄａサブユニットのアミノ末端配列は、胎盤、肺及び腎臓からクローン化された ヒトＣＰＰ３２のｃＤＮＡ配列（図示せず）と同じように、ＣＰＰ３２βと一致 した（図４ｂ）。 上記２つのサブユニットの質量測定及びアミノ末端配列は一致しており、両ポ リペプチドがＡｓｐ²⁸−Ｓｅｒ²⁹ とＡｓｐ¹⁷⁵−Ｓｅｒ¹⁷⁶の間で切断された同じ３２ｋＤａのＣＰＰ３２前駆体ポ リペプチドから誘導されたことが証明された（図４ｂ）。ＣＰＰ３２プロ酵素の 構造はＩＣＥのものと類似している（図４ｃ）。ＩＣＥと同様、ＣＰＰ３２プロ 酵素も、アミノ末端プロドメイン、その後の推定活性部位システイン及びヒスチ ジン残基を含む大きいサブユニット（ｐ１７）と、その後の小さいサブユニット （ｐ１２）から構成されている。ＩＣＥプロ酵素とＣＰＰ３２プロ酵素の主要な 違いは、（ａ）ＣＰＰ３２のプロドメインの方が実質的に短く、（ｂ）ＣＰＰ３ ２プロ酵素にはアポパインの大きい（ｐ１７）サブユニットと小さい（ｐ１２） サブユニットを分離するリンカーペプチドが存在しないことである。ＣＰＰ３２ のプロドメイン／ｐ１７結合部及びｐ１７／ｐ１２結合部の両方のＰ₁位置にＡ ｓｐ残基が存在するということは、ＩＣＥに関して示されているように^7,32,33 、プロ酵素の活性化に自触作用が重要な役割を果たすことを示唆している。 システインプロテアーゼのＩＣＥ／ＣＥＤ−３ファミリーの全ての既知メンバ ーの配列を整列させると、アポパイン／ＣＰＰ３２がプロアポトーシス性線虫細 胞−死−異 常ｃｅｄ−３遺伝子産物に最も近縁の哺乳動物酵素であることが示される（図４ ｄ）。このファミリーの５つの既知ヒト酵素及びＣＥＤ−３を整列させると、基 質Ｐ₁アスパラギン酸のカルボキシレート側鎖の触媒作用に関与する残基及び該 側鎖の結合に関与する残基の絶対保存^33,34が存在することが示される（図４ｅ ）。保存は、ＩＣＥのｐ２０サブユニット（Ａｓｐ²⁹⁶−Ｓｅｒ²⁹⁷）及びＣＰＰ ３２のｐ１７サブユニット（Ａｓｐ¹⁷⁵−Ｓｅｒ¹⁷⁶）のカルボキシ末端のＡｓｐ ／Ｓｅｒ切断部位近傍でも高度であり、これは、このファミリーの他のメンバー の活性形態もプロ酵素から誘導されるヘテロダイマーであることを示唆している 。しかし、Ｐ₂−Ｐ₄結合ポケットを形成し得る残基は広く保存されてはおらず、 これは、基質特異性が１個以上のこれらアミノ酸により決定され得ることを示し ている。 実施例５ アポパイン及びその阻害剤の動力学的特性 基質Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ（ＡＭＣ；アミノ−４−メチルクマリン）を用い てアポパインの連続蛍光分析アッセイを行った。この基質の設計は、ＰＡＲＰ切 断部位Ｐ₁− Ｐ₄テトラペプチドを用いること以外は、ＩＣＥと共に用いて成功を治めたテト ラペプチド−ＡＭＣモチーフ⁷をベースとした（図５Ａ インセット）。アポパ インでこの基質を切断することにより、ミカエリス−メンテン動力学がＫ_m＝９ ．７±１．０μＭであることが示された（図５ａ）。このアッセイにより、テト ラペプチドアルデヒドＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯによる酵素阻害機構の詳細な研究 が容易になった。 ペプチドアルデヒドは、触媒システインの求核付加を受けてチオヘミアセター ルを形成するシステインプロテアーゼの有効な可逆性阻害剤である。アルデヒド 阻害剤の効力は、本来、該阻害剤が有するアミド結合加水分解における遷移状態 を真似るその能力によるものであったが³⁵、最近、テトラペプチドアルデヒド Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯを用いて決定されたＩＣＥの結晶構造から、非遷移状態 の構造中でチオヘミアセタールのオキシアニオンと結合したこの阻害剤が活性部 位ヒスチジンにより安定化されていることが明らかに示される³³。アポパイン、 Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯに関する適切な認識配列を含むテトラペプチドアルデヒ ドはこの酵素の有効な拮抗的阻害剤である。該ア ルデヒドは、阻害剤（５０ｎＭ）及び１×Ｋ_mの基質を含む反応混合物に酵素を 加えたときに認められた時間依存性平衡度により示されるように、遅結合性であ る（図５ｂ）。図５ｂの実線（黒丸）は、理論的結合速度定数ｋ_on＝１．３×１ ０⁵ Ｍ^-1ｓ^-1である。拡散律速反応速度の理論的予測値（１０⁸−１０¹⁰Ｍ^-1ｓ^{- 1} ）を大きく下回るこの速度定数は、対応する、ＩＣＥとそのテトラペプチドア ルデヒド阻害剤との結合速度定数に類似している（ｋ_on Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨ Ｏ＝３．８×１０⁵Ｍ^-1ｓ^-1）。５０ｎＭのＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯを用いて無 限時間で認められた該活性のほぼ完全な抑制により、アポパイン阻害のＫ_iが１ ｎＭ未満であることが明らかになり、それによって、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯは システインプロテアーゼに関して知られている最も有効なペプチドアルデヒドの １つとなっている。 テトラペプチドアルデヒド Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯがアポパインの有効な阻 害剤であると認められたのとは対照的に、ＩＣＥ阻害剤 Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨ Ｏ（Ｋ_i ＩＣＥ＝０．７６ｎＭ）は極めて効力の低いアポパイン阻害剤であり、 これらの酵素が別個の拡大された基質特異性を有 することがさらに証明された。効力の差は、ＩＣＥの主要決定基であるｐｒｏＩ Ｌ−１βのＰ₄ Ｔｙｒの結合に関与する残基がアポパイン／ＣＰＰ３２には保 存されていないという事実に起因すると考えられる。例えば、活性ＩＣＥの結晶 構造は、ｐｒｏＩＬ−１βのＰ₄ Ｔｙｒと相互作用する２つの主要アミノ酸が アポパイン／ＣＰＰ３２及びＣＥＤ−３のいずれにおいても、それぞれＡｓｎ及 びＳｅｒで置換されたＨｉｓ³⁴²及びＰｒｏ³⁴³であることを示している（図４ｅ ）。アポパイン／ＣＰＰ３２のこれら後者の残基はＰＡＲＰのＰ₄ Ａｓｐのカ ルボキシレート側鎖との相互作用に必要な水素結合をより完全に形成し得る。該 酵素が異なる巨大分子基質特異性を有していることも明らかである。精製ＩＣＥ はＰＡＲＰを切断し得なかったし、精製アポパインはＦＥＡＤ²⁷−Ｇ²⁸切断部位 でもＤＥＶＤ²¹⁶−Ｇ²¹⁷切断部位でもｐｒｏＩＬ−１βを切断しなかった（５， ０００倍過剰の各酵素をテスト；図示せず）。該酵素は、ＩＣＥに対して１０， ０００倍以上もの親和性を示す牛痘セルピン（ＣｒｍＡ）に関する挙動とも異な っている。 ＴＨＰ−１細胞、アポトーシスを起こした骨肉腫細胞抽 出物及びアポトーシスを起こしたニワトリＳ／Ｍ抽出物におけるＰＡＲＰ切断活 性の触媒及び阻害定数は実質的に同じであり（図５ｃ）、これは、３種の細胞全 てにおいて同じ酵素（アポパイン）がＰＡＲＰを切断することを示唆している。 実施例６ アポパイン仲介ＰＡＲＰ切断阻害剤によるアポトーシスの減弱化 アポトーシス事象はｉｎ ｖｉｔｒｏで再構成し得る。健康な細胞から分離し た核は、アポトーシスを起こした細胞から分離されたシトソール画分と共にイン キュベートすると、アポトーシスに特徴的な形態学的変化（例えば、クロマチン の凝縮、断片化及び周縁化（marignation）並びにヌクレオソーム間のＤＮＡの 切断）を起こす³⁶。最も有効且つ選択的なアポパイン仲介ＰＡＲＰ切断阻害剤（ Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ）は膜不浸透性であり、従って無傷の細胞においては不 活性なので、この系をヒト細胞を用いて作製し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでアポトーシ スに及ぼすアポパインの阻害又は除去作用の実験に用いた。アポトーシスを起こ していない骨肉腫細胞のシトソールは核の形態には 殆ど作用を及ぼさなかったが、アポトーシスが進行している細胞のシトソールは 受容体核にアポトーシス様変化を誘発させた（図６ａ）。さもなければ健康な核 に付与されたアポトーシス形態への変化の程度は、シトソールを抽出した細胞で 起こっているアポトーシスの進行度（図１ｃ参照）及びＰＡＲＰ切断活性のレベ ル（図１ｄ）と一致した。 ＰＡＲＰを切断するアポパインシステインプロテアーゼがアポトーシスにおい て重要な役割を果たすとすれば、その活性を阻害又は除去するとこれらの核変化 は起こらない筈である。アポトーシスを起こした骨肉腫細胞のシトソール画分を アポトーシスを起こしていない健康な細胞の核と共にインキュベートしたときに 生じた形態学的変化は、アポパイン仲介ＰＡＲＰ切断のテトラペプチドアルデヒ ド阻害剤、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ（ＩＣ₅₀＝１０〜１００ｎＭ）により減弱化 させることができるが、ＩＣＥ阻害剤、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯでは減弱化し得 なかった（図６ｂ；縦列２〜９）。同様に、ビオチニル化親和性リガンドを用い て、アポトーシスを起こした骨肉腫細胞のシトソール画分からアポパイン／ＣＰ Ｐ３２を除去すると、これらのＰＡＲＰ切断活性欠失抽出物はおおむね、健康な 受容体 核にアポトーシス性変化を起こさせることができなかった。活性を除去された抽 出物のプロアポトーシス能は、該抽出物に精製アポパイン／ＣＰＰ３２を加える と回復したが、精製ＩＣＥを加えても回復しなかった（縦列１０〜１５）。また 、これら全てを総合すると、アポパインがアポトーシスにおいて主要な事象を開 始させ、その活性を阻害又は除去するとアポトーシスの発生が阻止されることが 示唆される。 実施例７ ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳及び宿主細胞へのトランスフエクションによるアポ パインポリペプチドの発現 アポパインをコードするＤＮＡ配列を含むベクターを用いて、ウサギ網状赤血 球溶解物、哺乳動物宿主細胞及びバキュロウイルス感染昆虫細胞でアポパインポ リペプチドの翻訳を推進させた。実験手順は主として製造業者の指示に従った。 （ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳 ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ＋アポパインプラスミドＤＮＡ（アポパイン はＴ７配向）をアポパイン挿入物の下流でＢａｍＨＩ消化により線状化する。線 状化プラスミ ドを精製し、ｍ７Ｇ（５′）ｐｐｐ（５′）Ｇの存在下にＴ７ ＲＮＡポリメラ ーゼを用いたランオフ転写用のテンプレートとして用いた。得られたキャップ付 きアポパイン転写体を塩化リチウム沈殿により精製し、Ｌ−［³⁵Ｓ］メチオニン の存在下ヌクレアーゼで予備処理したウサギ網状赤血球溶解物中でのアポパイン の翻訳の推進に用いる。 （ｂ）哺乳動物細胞における発現 アポパインタンパク質を哺乳動物宿主細胞で発現させ、次いで、ｐｃＤＮＡ Ｉ／Ａｍｐ：アポパイン（ＣＭＶプロモーターの制御下）又はｐＳＺ９０１６− １：アポパイン（ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターの制御下）を用いてトランスフェ クトする。後者（ｐＳＺ９０１６−１：アポパイン）の場合、細胞をＴＡＴ発現 プラスミドｐＳＺ９０１６１：ＴＡＴと同時にトランスフェクトする。どちらの アポパイン発現プラスミドの場合も、ＣＯＳ−７細胞を、ＤＥＡＥ−デキストラ ンを用いてトランスフェクトするか又はリポフェクタミン（ＢＲＬ）を用いてリ ポフェクトする。 （ｃ）昆虫細胞における発現 アポパイン含有バキュロウイルストランスファーベクターｐＶＬ１３９３：Ｔ ７アポパインＨＡを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ相同組換えにより組換えバキュロウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）を産生させる。次いで、エピトープ標識したアポパイ ンを、懸濁培養中で増殖させたＳｆ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅ ｒｄａ）昆虫細胞中で発現させた後、アポパイン含有組換えバキュロウイルスに 感染させる。 実施例８ 他の宿主細胞系中でアポパインポリペプチドを発現させるためのアポパインのク ローニング （ａ）アポパインｃＤＮＡの細菌発現ベクターへのクローニング 最適なアポパインｃＤＮＡ配列を異種タンパク質の発現を誘導するように設計 した発現ベクターに挿入して、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌中で組換えアポパイン を産生させる。これらのベクターは、組換えアポパインが単独で合成されるか又 はその後の操作用の融合タンパク質として合成されるように構築する。組換えア ポパインが可溶性タンパク質又は不溶性内包体として回収されるように発現を制 御し得る。ｐＢＲ３２２、ｐＳＫＦ、ｐＵＲ、ｐＡＴＨ、ｐＧＥＸ、ｐＴ７−５ 、ｐＴ７−６、ｐＴ７−７、ｐＥＴ、ｐ ＩＢＩ（ＩＢＩ）、ｐＳＰ６／Ｔ７−１９（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、ｐＢｌｕｅ ｓｃｒｉｐｔII（Ｓｔａｒｔａｇｅｎｅ）、ｐＴＺ１８Ｒ、ｐＴＺ１９Ｒ（ＵＳ Ｂ）、ｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などのようなベクターはこらの目 的に適している。 （ｂ）アポパインｃＤＮＡの酵母発現ベクターへのクローニング 最適なアポパインｃＤＮＡシストロンを異種タンパク質の細胞内又は細胞外発 現を誘発するように設計した発現ベクターに挿入して、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵母中で組換えアポパインを産生させる。 細胞内で発現させる場合、ＥｍＢＬｙｅｘ４などのようなベクターをアポパイン シストロンに連結する〔Ｒｉｎａｓ，Ｕ．ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８ ：５４３−５４５（１９９０）；Ｈｏｒｏｗｉｔｚ Ｂ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ ｈｅｍ．２６５：４１８９−４１９２（１９８９）〕。細胞外で発現させる場合 、分泌シグナル（酵母又は哺乳動物ペプチド）とアポパインタンパク質のアミノ 末端を融合させる酵母発現ベクターにアポパインシストロンを連結する〔Ｊａｃ ｏｂｓｏｎ，Ｍ．Ａ．，Ｇｅｎ ｅ ８５：５１１−５１６（１９８９）；Ｒｉｅｔｔ Ｌ．及びＢｅｌｌｏｎ Ｎ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８：２９４１−２９４９（１９８９）〕 。 （ｃ）アポパインｃＤＮＡのウイルス発現ベクターへのクローニング アポパインｃＤＮＡ配列を含むワクシニアウイルスに感染させた後、ＨｅＬａ Ｓ３細胞のような哺乳動物宿主細胞中で組換えアポパインを産生させる。アポ パイン：ワクシニアウイルスを産生させるために、先ず、アポパインｃＤＮＡを 、ｐＳＣ１１、ｐＴＫｇｐｔＦ１ｓ、ｐＭＪ６０１のようなトランスファーベク ター又は他の適当なベクターに連結し、次いで、同種組換えによりワクシニアウ イルスにトランスファーする。プラークを精製し、ウイルスを増幅させた後、ア ポパイン：ワクシニアウイルスを用いて、哺乳動物宿主細胞に感染させて、組換 えアポパインタンパク質を産生させる。 実施例９ アポパインポリペプチドを産生させる方法 組換えアポパインは、 （ａ）アポパインタンパク質をコードするＤＮＡで宿主細 胞を形質転換して組換え宿主細胞を産生させるステップ； （ｂ）アポパインを産生させる条件下に組換え宿主細胞を培養するステップ；及 び （ｃ）アポパインを回収するステップ に従って産生させる。 組換えアポパインを精製し、標準法に従って特性決定する。 実施例１０ アポパイン活性を調節する化合物は、種々の方法で検出し得る。アポパインに 影響を与える化合物を同定する方法は： （ａ）テスト化合物とアポパインを含む溶液とを混合して混合物を形成するステ ップ； （ｂ）混合物のアポパイン活性を測定するステップ；及び （ｃ）混合物のアポパイン活性を標準と比較するステップを含む。 アポパイン活性を調節する化合物は医薬組成物中に配合し得る。そのような医 薬組成物は、アポパイン活性が変化していることを特徴とする疾患又は症状の治 療に有用であり得る。アポパイン活性が増大している疾患の例には、免 疫不全症候群、病原性感染症、心血管及び神経の損傷、脱毛症、老化、パーキン ソン病並びにアルツハイマー病が含まれる。これらの疾患の治療には、アポパイ ン活性を低下させる化合物を用いた治療が含まれる。アポパイン活性が低下して いる疾患の例としては、自己免疫疾患、白血病、リンパ腫及び他のガンが挙げら れる。これらの疾患の治療には、アポパイン活性を高める化合物を用いた治療が 含まれる。 実施例１１ Ｎ−アセチル−アスパルチル−グルタミル−バリニル−アスパラギン酸 ステップ１ Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−アスパラギン酸ジベン ジルエステル ０℃に冷却した、２４ｍｌのＣＨＣｌ₃及び２ｍｌのＤＭＦ中のＮ−ｔ−ＢＯ Ｃ−Ｌ−アスパラギン酸ベンジルエステル（４．００ｇ，１２．３ｍｍｏｌ）、 ベンジルアルコール（１．４６ｇ，１３．５ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（２．１６ ｇ，１６．０ｍｍｏｌ）の混合物に、ＥＤＣＩ（３．５４ｇ，１８．４ｍｍｏｌ ）を加えた。５℃で３時間半攪拌した後、混合物をＨ₂Ｏ（２５ｍｌ）中に注ぎ 、有 機相を分離し、Ｈ₂Ｏ（１０ｍｌ）で１回洗浄、Ｎａ₂ＳＯ₄で脱水し、溶媒を除 去した。シリカゲル（ヘキサン中１０％ＥｔＯＡｃで溶離）上のクロマトグラフ ィーにかけ、２．１０ｇ（４１％）の標記化合物を得た。¹ Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，４００ＭＨｚ）δ１．４１（ｓ，９Ｈ），２．９５（ ＡＢ，２Ｈ），４．６２（ｍ，１Ｈ），５．０５（ｓ，２Ｈ），５．１１（ｓ， ２Ｈ），５．４９（ｄ，１Ｈ），７．３２（ｍ，１０Ｈ）。ステップ２ Ｌ−アスパラギン酸ジベンジルエステル ２．７ｍｌのＣＨＣｌ₃及び０．３ｍｌのＭｅＯＨ中のＨＢｒ飽和溶液に−７ ８℃で１．５ｍｌのＣＨＣｌ₃中の実施例１１、ステップ１のＮ−ｔ−Ｂｏｃ（ ０．３００ｇ，０．７２ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を−２０℃にし、１５分間放 置してから飽和ＮａＨＣＯ₃中に注いだ。有機相を分離した。水性相をＣＨ₂Ｃｌ₂ （１０ｍｌ）で抽出し、有機相を合わせ、Ｎａ₂ＳＯ₄で脱水した。溶媒を除去 して、粗標記化合物０．２１２ｇ（９３％）を得た。¹ Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，４００ＭＨｚ）δ２．７−３．０（ｍ，４Ｈ），３． ９５（ｄｄ，１Ｈ），５．０５（ｓ，２Ｈ），５．１０（ｓ，２Ｈ），７．３（ ｓ，１０Ｈ） 。ステップ３ Ｎ−Ａｃ−Ａｓｐ−（Ｂｚ）−Ｇｌｕ（Ｂｚ ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ジ−ｂｚ） ０．５ｍｌのＣＨＣｌ₃中の実施例１１、ステップ２のアミン（０．０４３ｇ ，０．１３ｍｍｏｌ）、実施例１２のステップ６の酸（０．０７４ｇ，０．１２ ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（０．０２１ｇ，０．１５ｍｍｏｌ）の混合物にＥＤＣ Ｉ（０．０３４ｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を加えた。実施例１１のステップ１と同 様な処理をし、シリカゲル（ＣＨＣｌ₃中５％ＭｅＯＨで溶離）上のクロマトグ ラフィーにかけ、標記化合物０．１０５ｇ（９４％）を得た。¹ Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，４００ＭＨｚ）δ０．８５（ｄｄ，６Ｈ），１．９８ （ｓ，３Ｈ），２．０−２．２（ｍ，３Ｈ），２．４−２．５（ｍ，２Ｈ），２ ．７−２．９（ｍ，２Ｈ），３．０−３．１（ｍ，２Ｈ），４．２３（ｄｄ，１ Ｈ），４．３３（ｍ，１Ｈ），４．７５（ｍ，１Ｈ），４．８５（ｍ，１Ｈ）， ５．０−５．１（ｍ，８Ｈ），６．６２（ｄ，１Ｈ），６．８６（ｍ，２Ｈ）， ７．３０（ｍ，２０Ｈ），７．４７（ｄ，１Ｈ）。ステップ４ Ｎ−Ａｃ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ １．５ｍｌのＨＯＡｃ及び０．５ｍｌのＭｅＯＨ中の実施例１１、ステップ３ の保護テトラペプチド（２４ｍｇ）と２０ｍｇのＰｄ−Ｃ（５％）をＨ₂で２時 間処理した。混合物を濾過し、溶媒を除去した。粗生成物をＨ₂Ｏに溶解、凍結 乾燥して、標記化合物１３ｍｇ（９３％）を得た。¹ Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆−ＣＤＣｌ₃，４００ＭＨｚ）δ０．８２（ｄｄ， ６Ｈ），１．７７（ｍ，１Ｈ），１．８５（ｓ，３Ｈ），２．０（ｍ，２Ｈ）， ２．２（ｍ，２Ｈ），２．５−２．７（ｍ，４Ｈ），４．１５（ｄｄ，１Ｈ）， ４．３９（ｍ，１Ｈ），４．５２（ｍ，２Ｈ），７．５７（ｄ，１Ｈ），７．８ ８（ｍ，２Ｈ），８．０５（ｄ，１Ｈ）。 Ｃ₂₀Ｈ₃₁Ｎ₄Ｏ₁₂のＦＡＢ ＨＲＭＳ： 計算値＝５１９．１９３８５； 実測値＝５１９．１９３８３。 実施例１２ ステップ１ Ｎ−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｌ− バリンアリルエステル １５ｍｌのＣＨＣｌ₃中のＮ−（ｔ−ブチルオキシカル ボニル）−Ｌ−バリン（１０．５３ｇ，４８．５ｍｍｏｌ）及びアリルアルコー ル（３３ｍｌ，４９ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃で、ＨＯＢｔ（８．５３ｇ，６３ ．１ｍｍｏｌ）次いでＥＤＣＩ（１３．８８ｇ，７２．４ｍｍｏｌ）を加えた。 最終混合物を４℃で１２時間攪拌し、次いで１００ｍｌのＮＨ₄ＯＡｃ（２５％ ）中に注いだ。有機相を分離し、水性相を５０ｍｌのＣＨＣｌ₃で洗浄した。有 機相を合わせ、Ｎａ₂ＳＯ₄で脱水、濃縮し、シリカゲル（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ ９：１）上のフラッシュクロマトグラフィーにかけ、標記化合物５．１０ｇ（ ４１％）を得た。¹ Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，４００ＭＨｚ）δ５．８９（ｍ，１Ｈ），５．３１（ ｄ，１Ｈ），５．２２（ｄ，１Ｈ），４．９９（ｄ，ＮＨ）．４．６０（ｍ，２ Ｈ），４．２２（ｍ，１Ｈ），２．１３（ｍ，１Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ）， ０．９６（ｄ，３Ｈ），０．８７（ｄ，３Ｈ）。ステップ２ Ｌ−バリンアリルエステル −２０℃でＨＢｒガスで飽和した１００ｍｌのＣＨＣｌ₃／１０％ＭｅＯＨ溶 液を−７８℃に冷却した。この溶液に、１０ｍｌのＣＨＣｌ₃に溶解したＮ−（ ｔ−ブチルオ キシカルボニル）−Ｌ−バリンアリルエステル（５．１０ｇ，１９．８ｍｍｏｌ ）を加えた。混合物を−２０℃に加温し、１５分間攪拌し、次いで、氷冷飽和Ｎ ａＨＣＯ₃（３００ｍｌ）中に注いだ。有機相を分離し、水性相を５０ｍｌのＣ ＨＣｌ₃で洗浄した。有機相を合わせ、Ｎａ₂ＳＯ₄で脱水、濃縮して、標記化合 物３．１０ｇ（９９％）を得、これをさらに精製せずに次のステップに用いた。¹ Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ５．９１−５．８７（ｍ，１Ｈ）， ５．３２（ｄｑ，１Ｈ），５．２２（ｄｑ，１Ｈ），４．６１−４．６８（ｍ， ２Ｈ），３．３０（ｄ，１Ｈ），２．０２（ｍ，１Ｈ），０．９６（ｄ，３Ｈ） ，０．８８（ｄ，３Ｈ）。ステップ３ Ｎ−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｌ− グルタミル−ｇ−ベンジルエステル−Ｌ−バ リンアリルエステル ６０ｍｌのＣＨＣｌ₃中のＮ−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｌ−グルタ ミル−ｇ−ベンジルエステル（８．０２ｇ，２３．８ｍｍｏｌ）及びＬ−バリン アリルエステル（３．１０ｇ，１９．７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＨＯＢｔ（４．１ ７ｇ，３０．９ｍｍｏｌ）次いでＥＤＣＩ（６． ８５ｇ，３５．７ｍｍｏｌ）を加えた。最終混合物を４℃で１２時間攪拌し、次 いで、１００ｍｌの水性ＮＨ₄ＯＡｃ（５％）中に注いだ。有機相を分離し、１ ００ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ₃で洗浄、Ｎａ₂ＳＯ₄で脱水、濃縮し、シリカゲル（ ヘキサン／ＥｔＯＡｃ ４：１）上のフラッシュクロマトグラフィーにかけ、標 記化合物６．３６ｇ（６８％）を得た。¹ Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，４００ＭＨｚ）δ７．３６−７．２８（ｍ，５Ｈ）， ６．７６（ｄ，ＮＨ），５．９２−５．８２（ｍ，１Ｈ），５．３０（ｄｑ，１ Ｈ），５．２２（ｄｑ，１Ｈ），５．１１（ｓ，２Ｈ），４．６５−４．５５（ ｍ，２Ｈ），４．５０（ｄｄ，１Ｈ），４．１９（ｄ，ＮＨ），２．５７−２． ４６（ｍ，２Ｈ），２．２１−２．０４（ｍ，２Ｈ），１．９７−１．８８（ｍ ，１Ｈ），１．４１（ｓ，９Ｈ），０．９２（ｄ，３Ｈ），０．８９（ｄ，３Ｈ ）。ステップ４ Ｌ−グルタミル−ｇ−ベンジルエステル−Ｌ −バリンアリルエステル −２０℃でＨＢｒガスで飽和した２００ｍｌのＣＨＣｌ₃／１０％ＭｅＯＨ溶 液を−７８℃に冷却した。この溶液 に、２０ｍｌのＣＨＣｌ₃に溶解したＮ−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｌ −グルタミル−ｇ−ベンジルエステル−Ｌ−バリンアリルエステル（６．３６ｇ ，１３．３ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を−２０℃に加温し、１５分間攪拌し、 次いで氷冷飽和ＮａＨＣＯ₃（５００ｍｌ）中に注いだ。有機相を分離し、水性 相を１００ｍｌのＣＨＣｌ₃で洗浄した。有機相を合わせ、Ｎａ₂ＳＯ₄で脱水、 濃縮して、標記化合物５．００ｇ（９９％）を得、これをさらに精製せずに次の ステップに用いた。¹ Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，４００ＭＨｚ）δ７．６７（ｄ，ＮＨ），７．３６− ７．２８（ｍ，５Ｈ），５．９３−５．８４（ｍ，１Ｈ），５．３１（ｄｑ，２ Ｈ），５．２２（ｄｑ，２Ｈ），５．１１（ｓ，２Ｈ），４．６８−４．５６（ ｍ，２Ｈ），４．５０（ｄｄ，１Ｈ），３．５（ｄ，ＮＨ２），２．５２（ｔ， ２Ｈ），２．２１−２．１０（ｍ，２Ｈ），１．９４−１．８９（ｍ，１Ｈ）， ０．９３（ｄ，３Ｈ），０．８８（ｄ，３Ｈ）。ステップ５ Ｎ−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｌ− アスパルチル−ｂ−ベンジルエステル−Ｌ− グルタミル−ｂ−ベンジルエステル−Ｌ−バ リンアリルエステル ５０ｍｌのＣＨＣｌ₃中のＬ−グルタミル−ｇ−ベンジルエステル−Ｌ−バリ ンアリルエステル（５．００ｇ，１３．３ｍｍｏｌ）及びＮ−（ｔ−ブチルオキ シカルボニル）−Ｌ−アスパルチル−β−ベンジルエステル（５．２３ｇ，１６ ．２ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃で、ＨＯＢｔ（４．１７ｇ，３０．９ｍｍｏｌ） 次いでＥＤＣＩ（６．８５ｇ，３５．７ｍｍｏｌ）を加えた。最終混合物を４℃ で５時間攪拌し、次いで、１００ｍｌの水性ＮＨ₄ＯＡｃ（５％）中に注いだ。 有機相を分離し、１００ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ₃で洗浄、Ｎａ₂ＳＯ₄で脱水、濃 縮し、シリカゲル（ＣＨＣｌ₃／ＭｅＯＨ ２％）上のクロマトグラフィーにか け、標記化合物８．８４ｇ（９８％）を得た。¹ Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ７．３５−７．２４（ｍ，１１Ｈ） ，６．８４（ｄ，ＮＨ），５．９２−５．８２（ｍ，１Ｈ），５．５４（ｄ，Ｎ Ｈ），５．３０（ｄｑ，１Ｈ），５．２２（ｄｑ，１Ｈ），５．１２（ｄｄ，２ Ｈ），５．０６（ｄｄ，２Ｈ），４．６４−４．５４（ｍ，２Ｈ），４．５１− ４．４５（ｍ，２Ｈ），３．０４（ｄｄ，１Ｈ），２．７３（ｄｄ，１Ｈ），２ ．６ ０−２．４３（ｍ，２Ｈ），２．２２−２．１２（ｍ，２Ｈ），２．０１−１． ９２（ｍ，１Ｈ），１．４２（ｓ，９Ｈ），０．９１（ｄ，３Ｈ），０．８８（ ｄ，３Ｈ）。ステップ６ Ｎ−アセチル−Ｌ−（β−ベンジルアスパル チル）−Ｌ−（ｇ−ベンジルグルタミル）− Ｌ−バリン ６ｍｌのＤＭＦ中のＮ−アセチル−Ｌ−（β−ベンジルアスパルチル）−Ｌ− （ｇ−ベンジルグルタミル）−Ｌ−バリンアリルエステル（０．５３０ｇ，０． ８４ｍｍｏｌ）及びテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．９ ２ｇ，０．０８ｍｍｏｌ）の０℃懸濁液に、ピロリジン（０．０７２ｍｌ，０． ８６ｍｍｏｌ）を滴下した。２５分後、ＥｔＯＡｃ（４０ｍｌ）及びＮＨ₄ＯＡ ｃ２５％（２０ｍｌ）を加えた。有機相を分離し、水性相を追加のＥｔＯＡｃ（ ２０ｍｌ）で抽出した。有機相を合わせ、Ｎａ₂ＳＯ₄で脱水、濃縮し、シリカゲ ル（ＣＨＣｌ₃／ＭｅＯＨ／ＨＯＡｃ、９４／４．５／０．５）上のフラッシュ クロマトグラフィーにかけ、標記化合物０．４２ｇ（８６％）を得た。¹ Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，４００ＭＨｚ）δ０．９２（ｔ ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，６Ｈ），１．９９（ｓ，３Ｈ），２．０３（ｍ，１Ｈ），２ ．１−２．２（ｍ，２Ｈ），２．５０（ｍ，２Ｈ），２．７０−３．００（２Ｈ ，ＡＢ），４．３９（ｄｄ，Ｊ＝５．３０，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），４．４８ （ｍ，１Ｈ），４．８０（ｍ，１Ｈ），５．０６（ｓ，２Ｈ），５．１０（ｓ， ２Ｈ），６．８４（ｍ，１Ｈ），７．０９（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），７． ３０（ｍ，１０Ｈ），７．６１（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ）。ステップ７ Ｎ−（Ｎ−アセチル−Ｌ−アスパルチル−β −ベンジルエステル−Ｌ−グルタミル−ｇ− ベンジルエステル−Ｌ−バリン）−４−アミ ノ−５−ベンジルオキシ−２−オキソテトラ ヒドロフラン ５ｍｌのＣＨＣｌ₃及び０．７ｍｌのＤＭＦ中のＮ−アセチル−Ｌ−（β−ベ ンジルアスパルチル）−Ｌ−（ｇ−ベンジルグルタミル）−Ｌ−バリン（６０８ ｍｇ，１．０４ｍｍｏｌ）及びＮ−アリルオキシカルボニル−４−アミノ−５− ベンジルオキシ−２−オキソテトラヒドロフラン（３３５ｍｇ，１．１５ｍｍｏ ｌ）の溶液に、ＰｄＣｌ₂ （ＰＰｈ₃）₂（４３ｍｇ，０．０６０ｍｍｏｌ）次いでＢｕ₃ＳｎＨ（３１０ｍ ｌ，１．１５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１０分間攪拌すると、ＣＯ₂の発生 が認められた。追加量のＢｕ₃ＳｎＨ（３１０ｍｌ，１．１５ｍｍｏｌ）を加え 、次いで溶液を０℃に冷却した。ＨＯＢｔ（２８４ｍｇ，２．１０ｍｍｏｌ）次 いでＥＤＣＩ（２４５ｍｇ，１．２８ｍｍｏｌ）を加えた。最終混合物を０℃で ４時間攪拌し、次いで、１００ｍｌのＣＨＣｌ₃で稀釈し、２０ｍｌのＮＨ₄ＯＡ ｃ（２５％）中に注いだ。有機相を分離し、２０ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ₃で洗浄 、Ｎａ₂ＳＯ₄で脱水、濃縮し、シリカゲル（ＣＨＣｌ₃／ＭｅＯＨ５％）上のフ ラッシュクロマトグラフィーにかけ、ジアステレオ異性体混合物（１：１）とし て標記化合物７９０ｍｇ（９８％）を得た。¹ Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，４００ＭＨｚ）δ８．２２（ｄ，ＮＨ），７．７３（ ｄ，ＮＨ），７．３７−７．２５（ｍ，１５Ｈ），６．９８−６．８２（ｍ，Ｎ Ｈ），６．５２（ｄ，ＮＨ），５．５８（ｓ），５．４８（ｄ），５．１２−５ ．００（ｍ），４．８５（ｄ），４．７９（ｄ），４．７４−４．５９（ｍ）， ４．５２（ｄｄ），４．３ １−４．２４（ｍ），４．１７（ｄｄ），３．０７（ｄｄ），２．９４（ｄｄ） ，２．９１−２．８５（ｍ），２．７７（ｄｄ），２．７４−２．３８（ｍ）， ２．２８−２．２３（ｍ），２．１６−２．０１（ｍ），２．０７（ｓ，ＣＨ₃ ＣＯＮＨ），１．９９（ｓ，ＣＨ₃ＣＯＮＨ），０．８９−０．８（ｍ）。ステップ８ Ｎ−（Ｎ−アセチル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ −グルタミル−Ｌ−バリニル）−３−アミノ −３−ホルミルプロピオン酸 ５ｍｌのＭｅＯＨ中のステップ７の生成物（５１ｍｇ，６６ｍｍｏｌ）の懸濁 液に、５０ｍｇのＰｄ（ＯＨ）₂（炭上２０％）を加えた。混合物をＨ₂雰囲気下 に２４時間攪拌した。触媒をセライト上で濾過し、１０ｍｌのＭｅＯＨで洗浄し た。ＭｅＯＨ抽出物を濃縮し、シリカゲル（ＣＨＣｌ₃／ＭｅＯＨ ５％）上の フラッシュクロマトグラフィーにかけ、５ｍｌのＨ₂Ｏ及び１０ｍｌのＡｃＯＨ から残留物を凍結乾燥して、標記化合物１７ｍｇ（４７％）を得た。¹ Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ₃ＯＤ，４００ＭＨｚ）δ４．６７（ｔ，１Ｈ），４．５５（ ｄｄ，１Ｈ），４．４０−４．３５ （ｍ，１Ｈ），４．３１−４．２４（ｍ，１Ｈ），４．０９−４．１５（ｍ，１ Ｈ），２．８５（ｄｄ，１Ｈ），２．７１（ｄｄ，１Ｈ），２．７０−２．６０ （ｍ，１Ｈ），２．５４−２．４６（ｍ，１Ｈ），２．４３−２．３８（ｍ，２ Ｈ），２．１９−２．０４（ｍ，２Ｈ），１．９９（ｓ，３Ｈ），１．９７−１ ．９１（ｍ，１Ｈ），０．９５（ｄ，３Ｈ），０．９３（ｄ，３Ｈ）。 Ｃ₂₀Ｈ₃₀Ｎ₄Ｏ₁₁＋Ｈ⁺のＨＲＭＳ ＦＡＢ： 計算値＝５０３．１９８８９； 実測値＝５０３．１９８９３。 本明細書に関する参考文献には以下のものが含まれる：

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年５月３０日 【補正内容】請求の範囲 １． 図４ｃのアミノ酸１７６−２７７と合わせるとＡｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣを 切断し得るアポパイン酵素が産生される、図４ｃに示されているアミノ酸２９− １７５のアミノ酸配列の少なくとも一部を有する単離精製されたアポパインサブ ユニット。 ２． 図４ｃのアミノ酸２９−１７５と合わせるとＡｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣを切 断し得るアポパイン酵素が産生される、図４ｃに示されているアミノ酸１７６− ２７７のアミノ酸配列の少なくとも一部を有する単離精製されたアポパインサブ ユニット。 ３． （ａ）請求項１に記載のサブユニット；及び （ｂ）請求項２に記載のサブユニット を含む、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣを切断し得る単離精製されたアポパイン。 ４． 請求項１、２又は３に記載のアポパインをコードする合成ＤＮＡ分子。 ５． 請求項１、２又は３に記載のアポパインを認識する抗体。 ６． アポパインを調節する化合物を同定する方法であって、 （ａ）テスト化合物と請求項３に記載のアポパインを含む溶液とを混合して混合 物を形成すること； （ｂ）該混合物中のアポパイン活性を測定すること；及び （ｃ）該混合物中のアポパイン活性を標準と比較することを含む方法。 ７． 請求項６に記載の方法により同定された化合物。 ８． 請求項７に記載の化合物を含む医薬組成物。 ９． 請求項１、２又は３に記載のアポパイン、請求項５に記載の抗体、請求項 ４に記載の合成ＤＮＡ及び請求項４に記載の合成ＤＮＡから誘導されたアンチセ ンス分子から選択される試薬を含むキット。 １０． 請求項７に記載の化合物を非ヒト動物に投与することを含む、ｉｎ ｖ ｉｖｏでアポパイン活性を変化させる方法。 １１． 請求項４に記載のＤＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子移 植を含む、遺伝子治療によりアポパイン活性を変化させる方法。 １２． アポパイン活性を増強又は低下させることを含む 、アポパイン活性が変化していることを特徴とする症状の治療を要する非ヒト動 物を治療する方法。 １３． 前記方法が、アルツハイマー病、パーキンソン病、癌、老化、脱毛症、 心血管又は神経の損傷、感染症、自己免疫疾患及び免疫不全症候群から選択され る、請求項１２に記載の方法。 １４． 前記症状が、アルツハイマー病、パーキンソン病、癌、老化、脱毛症、 心血管又は神経の損傷、感染症、自己免疫疾患及び免疫不全症候群から選択され る、請求項１４に記載の方法。 １５． 請求項４に記載のＤＮＡ分子から誘導されたアンチセンス分子。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 48/00 ＡＢＮ Ａ６１Ｋ 48/00 ＡＢＮ ＡＤＵ ＡＤＵ ＡＤＷ ＡＤＷ ＡＧＺ ＡＧＺ Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ // Ａ６１Ｋ 31/70 Ａ６１Ｋ 31/70 Ｃ０７Ｂ 61/00 Ｃ０７Ｂ 61/00 Ｚ (72)発明者 ミラー，ダグラス・ケイ アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 (72)発明者 ソーンベリイ，ナンシー・エイ アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 (72)発明者 ニコルソン，ドナルド・ダブリユ カナダ国、ケベツク・アシユ・９・アシ ユ・３・エル・１、カークランド、トラン ス・カナダ・ハイウエイ・16711 (72)発明者 アリ，アンバレーン カナダ国、ケベツク・アシユ・９・アシ ユ・３・エル・１、カークランド、トラン ス・カナダ・ハイウエイ・16711 (72)発明者 バイランコート，ジヨン・ピイ カナダ国、ケベツク・アシユ・９・アシ ユ・３・エル・１、カークランド、トラン ス・カナダ・ハイウエイ・16711

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 単離精製されたアポパイン又はその機能性誘導体。 ２． 組換え宿主により認識される転写終結配列を含まない、請求項１に記載の アポパインをコードする合成ＤＮＡ分子。 ３． 請求項１に記載の精製されたアポパインに対する抗体。 ４． アポパインを調節する化合物を同定する方法であって、 （ａ）テスト化合物とアポパインを含む溶液とを混合して混合物を形成すること ； （ｂ）混合物中のアポパイン活性を測定すること；及び （ｃ）混合物中のアポパイン活性を標準と比較することを含む方法。 ５． 請求項４に記載の方法により同定された化合物。 ６． 請求項５に記載の化合物を含む医薬組成物。 ７． 請求項１に記載のアポパイン、請求項１に記載のアポパインに対する抗体 、請求項１に記載のアポパインをコードする合成ＤＮＡ及び請求項１に記載のア ポパインを コードする合成ＤＮＡから誘導されたアンチセンス分子から選択される試薬を含 むキット。 ８． 請求項５に記載の化合物を動物に投与することを含む、ｉｎ ｖｉｖｏで アポパイン活性を変化させる方法。 ９． 請求項２に記載のＤＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘｖｉｖｏ遺伝子移植を 含む、遺伝子治療によりアポパイン活性を変化させる方法。 １０． アポパイン活性を増大又は低下させることを含む、アポパイン活性が変 化していることを特徴とする症状の治療を要する動物を治療する方法。 １１． 前記症状が、アルツハイマー病、パーキンソン病、癌、老化、脱毛症、 心血管又は神経の損傷、感染症、自己免疫疾患及び免疫不全症候群から選択され る、請求項１０に記載の方法。 １２． アポパインをコードするＤＮＡを増大又は減少させることを含む、アポ パイン活性が変化していることを特徴とする症状の治療を要する動物を治療する 方法。 １３． 前記症状が、アルツハイマー病、パーキンソン病、癌、老化、脱毛症、 心血管又は神経の損傷、感染症、自己免疫疾患及び免疫不全症候群から選択され る、請求項１ ２に記載の方法。 １４． 請求項２に記載のＤＮＡ分子から誘導されたアンチセンス分子。