JPH11504209A

JPH11504209A - アポパイン

Info

Publication number: JPH11504209A
Application number: JP8531866A
Authority: JP
Inventors: ミラー，ダグラス・ケイ; ソーンベリイ，ナンシー・エイ; ニコルソン，ドナルド・ダブリユ; アリ，アンバレーン; バイランコート，ジヨン・ピイ
Original assignee: メルクエンドカンパニーインコーポレーテッド; メルクフロストカナダインコーポレーテツド
Priority date: 1995-04-21
Filing date: 1996-04-17
Publication date: 1999-04-20
Also published as: EP0822983A1; CA2218679A1; WO1996033268A1; EP0822983A4

Abstract

(57)【要約】この発明は、単離精製されたアポパインと称される酵素、アポパインを用いてアポパイン活性を調節する化合物をスクリーニングする方法、及び該スクリーニングにより同定された化合物に関する。全長のアポパインをコードする合成ＤＮＡ分子は精製された酵素から合成される。アポパインをコードする合成ＤＮＡは、種々の組換え宿主中で最適な発現が得られるように構築される。該ＤＮＡのクローンは全長の組換えアポパイン及びその誘導体を産生させる。精製天然アポパイン及び組換えアポパインは、アポパイン活性の調節物質、従って、アポパインのプロ炎症作用又はプロアポトーシス作用に関連する病原性症状の改善剤の同定に有用である。アポパインアンチセンス分子は、治療上アポパインのプロ炎症作用又はプロアポトーシス作用の低減又は除去に有用であり、一方アポパインを用いた遺伝子移植又は遺伝子治療はアポパインのプロ炎症作用又はプロアポトーシス作用の増進に有用である。これらの療法は、免疫不全症候群（例えばエイズ）、自己免疫疾患、病原性感染症、心血管及び神経の損傷、脱毛症、老化、癌、パーキンソン病並びにアルツハイマー病を含む（但し、それらには限定されない）免疫、増殖及び変性疾患の治療に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称アポパイン発明の背景本発明はその一態様において、アポパインなどのプロアポトーシスシステインプロテイナーゼ、このプロテイナーゼをコードするＤＮＡまたはそのアンチセンス、及び前記プロテイナーゼを調節する物質を同定するアッセイに係わる。第二の態様では本発明は、アポパインなどのプロアポトーシスシステインプロテイナーゼの活性のモジュレーターであるペプチジル誘導体、並びに該誘導体の、プロアポトーシスシステインプロテイナーゼ媒介疾患の治療に有用な療法への使用及び前記治療に有用な物質の同定への使用に係わる。アポトーシスは、正常な形態形成、組織再造形（ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）の間に、また病原体感染に応答して生物内で生起する細胞自殺（ｃｅｌｌｓｕｉｃｉｄｅ）、または他の修復不能な細胞傷害の体系的手段である。不適当なアポトーシスは、ヒトのアルツハイマー病、パーキンソン病及びハンチントン病、免疫不全及び自己免疫障害、虚血性心血管及び神経損傷、脱毛症、白血病、リンパ腫及び他の癌などの疾患の病因の根源であり得、従ってアポトーシスの制御は治療介入（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ）の重要な潜在標的となる¹ ^〜4。最近、アポトーシス型細胞死に寄与する生化学的事象が幾つか解明された。例えば線虫における遺伝学的形跡からアポトーシスの、正と負との両方の調節因子が同定されている⁵。重要なプロアポトーシス遺伝子であるｃｅｄ−３は哺乳動物のインターロイキン−１β変換酵素（ＩＣＥ）に関連する推定のシステインプロテアーゼをコードし⁶、前記システインプロテアーゼはＳ₁サブサイトに位置するアスパラギン酸に対するほぼ絶対的な特異性という際立った特徴を有する一群の新規なシステインプロテアーゼのうちで最初に同定されたものである^7,8。ｃｅｄ−３遺伝子を欠失または突然変異させることによって、そうでない場合には死ぬはずの細胞総てのアポトーシス型死を完全に防止でき、また様々な宿主細胞をトランスフェクトしたところＣＥＤ−３もＩＣＥもアポトーシスを誘発した^6, ^9,10 。更に、ＣＥＤ−３のプロアポトーシス作用は線虫死抑制遺伝子ｃｅｄ−９での同時トランスフェクションによって防止でき、また哺乳動物において前記遺伝子ｃｅｄ−９に相当するプロトオンコジーンｂｃｌ−２によっても或る程度防止できる。従って、真核細胞の生死（ｆａｔｅ）は、ＩＣＥ／ＣＥＤ−３様プロテアーゼの対抗的なプロアポトーシス作用と、Ｂｃ１−２及び／またはその相同体を用いる上流調節機序との平衡に帰着し得る。アポトーシスの際のＩＣＥ／ＣＥＤ−３様プロテアーゼの潜在的基質の一つにポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）が有り、この物質はＤＮＡ修復、ゲノムのサーベイランス及び一体性維持（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）において重要な酵素である¹¹ ^〜17。ＰＡＲＰはアポトーシス開始時に、ＩＣＥのものに類似する特性を有する、未だ同定されていないプロテアーゼによりタンパク質加水分解によって切断される^18,19。ＰＡＲＰの切断部位（ＤＥＶＤ²¹⁶−Ｇ²¹⁷）はｐｒｏＩＬ−１βの、ＩＣＥによって認識及び切断される二つの部位の一方（ＦＥＡＤ²⁷−Ｇ²⁸）に類似する。上記部位におけるＰＡＲＰのタンパク質加水分解切断によって、ＰＡＲＰのアミノ末端に位置する２個の亜鉛−フィンガーＤＮＡ結合モチーフがこのポリペプチドのカルボキシ末端に位置する自己修飾及びポリ（ＡＤＰ−リボシル）化［ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓ）ｙｌａｔｉｏｎ］触媒ドメインから分離される。この切断はＰＡＲＰの触媒ドメインがＤＮＡ損傷部位に結合するのを阻止し、おそらくはその後の修復及びゲノム保全事象を同調させるＰＡＲＰの能力を無効にする。そのうえ、アポトーシスの特徴であるヌクレオソーム間ＤＮＡ切断に関与するＣａ²⁺／Ｍｇ²⁺依存性エンドヌクレアーゼはポリ（ＡＤＰ−リボシル）化によって負に調節される²⁰ ^〜22。従って、死に掛けた細胞では正常なＰＡＲＰ機能の喪失によって上記ヌクレアーゼが高度に活性化される。インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）は、慢性及び急性炎症の主要な媒介因子である。このインターロイキンは不活性な３１ｋＤａ前駆体（ｐＩＬ−１β）として合成され、この前駆体がシステインプロテイナーゼのインターロイキン− １β変換酵素（ＩＣＥ）によるプロセシングを受けてその成熟１７．５ｋＤａ形態（ｍＩＬ−１β）となる。最近では、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｉｄｉｔｉｓｅｌｅｇａｎｓ、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｉｄｉｔｉｓｂｒｉｇｇｓａｅ及びＣａｅｎｏｒｈａｂｉｄｉｔｉｓｖｕｌｇａｒｉｓの線虫細胞死異常遺伝子（ＣＥＤ− ３）、マウスのニューロン前駆細胞の胚発生ダウンレギュレート化遺伝子（ＮＥＤＤ−２）とそのヒト相同体ＩＣＨ−１、及びＪｕｒｋａｔ細胞からクローン化されたＣＰＰ３２を含めた一群の付加的ＩＣＥ様遺伝子も発見されはじめている。本発明者は、ＩＣＥに関連する二つの新規な付加的ヒトチオールプロテイナーゼをクローン化し、これらをＩＣＥ_rel−II（インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼII；１９９４年４月８日付出願の米国特許出願第０８／２２５，４８７号）及びＩＣＥ_rel−III（インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIII；１９９４年４月８日付出願の米国特許出願第０８／２２４，９３０号）と名付けた。ＩＣＥ_rel−II及びＩＣＥ_rel−IIIのＩＣＥとの配列同等率はそれぞれ６１％及び５６％である。ＩＣＥ、ＣＥＤ−３、及び上述の新規なシステインプロテイナーゼ群に属する他の酵素の既知の配列は総て、ＩＣＥでは触媒システインを包囲するペンタペプチド配列−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−、他の酵素では前記配列の同等物を含む。ヒトに由来するシステインプロテアーゼのＩＣＥ／ＣＥＤ−３ファミリーに属する五つの既知酵素（ＩＣＥ、ＩＣＥ_rel−II、ＩＣＥ_rel−III、ＩＣＨ−１及びＣＰＰ３２²³ ^〜26）はいずれも、宿主細胞のトランスフェクションによってアポトーシス応答を誘起し得る。しかし、任意のプロテアーゼの過剰発現によって細胞死が非特異的に誘発される場合も有る。例えばトリプシン、キモトリプシン、プロテイナーゼＫまたはｇｒａｎｚｙｍｅＢといった他のプロテアーゼの細胞質発現もアポトーシスを誘発することが判明している^27,28。本明細書において本発明者は、アポパインと呼称される活性形態のＣＰＰ３２がアポトーシス開始時に起こるＰＡＲＰの特異的タンパク質加水分解切断を惹起する酵素であることを証明する。そのうえ、本発明者は、アポパインが媒介するＰＡＲＰ切断を抑制するとｉｎｖｉｔｒｏでアポトーシスが減衰することを示し、アポパインが哺乳動物細胞のアポトーシスにおいて果たす中心的役割を解明する。上段に示したように、本明細書中に用いた「アポパイン」という語は本明細書の趣旨に副って、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの切断を惹起する酵素活性形態のプロアポトーシスシステインプロテアーゼを意味する。本発明は前記酵素の同定を初めて開示するものであり、そこで該酵素をＩ．Ｕ．Ｂ．命名法ガイドラインに従い、アポトーシスに関与することを示す接頭辞「ａｐｏｐ」と、Ｉ．Ｕ．Ｂ．があらゆるシステインプロテアーゼの命名に好ましいとする接尾辞「ａｉｎ」とを用いてアポパインと命名する。「ＣＰＰ３２（３２ｋＤａのシステインプロテアーゼタンパク質）」という語は、アポパインまたはこの酵素に対応するｃＤＮＡをもたらす不活性なプロ酵素を指すのに用いてある。チオールプロテイナーゼのＩＣＥファミリー、特にアポパインのタンパク質加水分解活性がＰＡＲＰの無力化によって少なくとも部分的にアポトーシスを惹起することは明示されている。従って、ＰＡＲＰの切断を選択的に抑制する治療薬はＰＡＲＰ活性を持続させ、即ち未成熟段階でのアポトーシス型細胞死を妨害または防止する。あるいはまた、アポパインなどのチオールプロテイナーゼのＰＡＲＰ切断活性を高める治療薬はアポトーシス型細胞死を誘発または加速する。発明の概要本発明はその一態様において、単離及び精製されたアポパインと呼称される酵素、アポパインの活性を調節する化合物をアポパインを用いてスクリーニングする方法、及びスクリーニングによって同定された化合物に係わる。完全長アポパインをコードする合成ＤＮＡ分子は精製酵素の一次アミノ酸配列に基づき調製する。この合成アポパインコーディングＤＮＡは、様々な組み換え宿主において最適に発現するように調製する。得られるＤＮＡクローンは組み換え完全長アポパインとその誘導体を発現する。精製した天然アポパイン及び組み換えアポパインはアポパイン活性のモジュレーターの同定に、従ってアポパインのプロ炎症またはプロアポトーシス作用に関連する病理状態の改善因子（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）の同定に有用である。アポパインアンチセンス分子はアポパインのプロ炎症またはプロアポトーシス作用を治療により低減または排除するのに有用であり、一方アポパインを用いる遺伝子移植または遺伝子療法はアポパインのプロ炎症またはプロアポトーシス作用の増大に有用である。これらの治療法は、免疫不全症候群（ＡＩＤＳなど）、自己免疫疾患、病原体感染、心血管及び神経損傷、脱毛症、老化、癌、パーキンソン病及びアルツハイマー病を非限定的に含む免疫疾患、増殖性疾患及び変性疾患の治療に有益である。第二の態様において本発明は、アポトーシスの分野において、及び上段に列挙した疾患を非限定的に含む、アポトーシスの減少が有益であろう疾患の治療において研究手段として有用である式Ｉの置換ペプチジル誘導体に係わる。本発明は特に、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの正常な生物学的機能を無効にすることによって少なくとも部分的にアポトーシスを惹起するチオールプロテイナーゼのプロアポトーシスタンパク質加水分解活性の阻害因子に係わる。図面の簡単な説明図１は自然にアポトーシスを起こした骨肉腫細胞におけるＰＡＲＰ切断活性の説明図である。図２はアポトーシス骨肉腫細胞抽出物におけるＰＡＲＰ切断の抑制の説明図である。図３はＴＨＰ−１細胞からのＰＡＲＰ切断プロテアーゼの精製の説明図である。図４は不活性なプロ酵素ＣＰＰ３２から得られたＰＡＲＰ切断プロテアーゼであるアポパインの構造の説明図である。図５は螢光原基質を用いるアポパイン及び強力な阻害因子の動力学的分析の説明図である。図６はＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯによるかまたはアポパイン／ＣＰＰ３２媒介ＰＡＲＰ切断活性の欠如によるｉｎｖｉｔｒｏアポトーシス及び選択的阻害の説明図である。発明の詳細な説明本発明はその一態様において、単離及び精製されたアポパインと呼称される酵素、アポパインの活性を調節する化合物をアポパインを用いてスクリーニングする方法、及びスクリーニングによって同定された化合物に係わる。完全長アポパインをコードする合成ＤＮＡ分子は精製酵素の一次アミノ酸配列に基づき調製する。この合成アポパインコーディングＤＮＡは、様々な組み換え宿主において最適に発現するように調製する。得られるＤＮＡクローンは組み換え完全長アポパインとその誘導体を発現する。精製した天然アポパイン及び組み換えアポパインはアポパイン活性のモジュレーターの同定に、従ってアポパインのプロ炎症またはプロアポトーシス作用に関連する病理状態の改善因子の同定に有用である。アポパインアンチセンス分子はアポパインのプロ炎症またはプロアポトーシス作用を治療により低減または排除するのに有用であり、一方アポパインを用いる遺伝子移植または遺伝子療法はアポパインのプロ炎症またはプロアポトーシス作用の増大に有用である。これらの治療法は、免疫不全症候群（ＡＩＤＳなど）、自己免疫疾患、病原体感染、心血管及び神経損傷、脱毛症、老化、癌、パーキンソン病及びアルツハイマー病を非限定的に含む免疫疾患、増殖性疾患及び変性疾患の治療に有益である。アポトーシスは、正常な形態形成、組織再造形の間に、また病原体感染に応答して生起する臓器内での細胞自殺、または他の修復不能な細胞傷害の体系的手段である。不適当なアポトーシスは、ヒトのアルツハイマー病、パーキンソン病及びハンチントン病、免疫不全及び自己免疫障害、虚血性心血管及び神経損傷、脱毛症、白血病、リンパ腫及び他の癌などの疾患の病因論の根元を成し得、従ってアポトーシスの制御は治療介入の重要な潜在標的となる¹ ^〜4。最近、アポトーシス型細胞死に寄与する生化学的事象が幾つか解明された。例えば線虫における遺伝学的形跡からアポトーシスの、正と負との両方の調節因子が同定されている⁵。重要なプロアポトーシス遺伝子であるｃｅｄ−３は哺乳動物のインターロイキン−１β変換酵素（ＩＣＥ）に関連する推定のシステインプロテアーゼをコードし⁶、前記システインプロテアーゼはＳ₁サブサイトに位置するアスパラキン酸に対するほぼ絶対的な特異性という際立った特徴を有する一群の新規なシステインプロテアーゼのうちで最初に同定されたものである^7,8。ｃｅｄ−３遺伝子を欠失または突然変異させることによって、そうでない場合には死ぬはずの細胞総てのアポトーシス型死を完全に防止でき、また様々な宿主細胞をトランスフェクトしたところＣＥＤ−３もＩＣＥもアポトーシスを誘発した^6,9,10。更に、ＣＥＤ−３のプロアポトーシス作用は線虫死抑制遺伝子ｃｅｄ−９での同時トランスフェクションによって防止でき、また哺乳動物において前記遺伝子ｃｅｄ−９に相当するプロトオンコジーンｂｃｌ− ２によっても或る程度防止できる。従って、真核細胞の生死は、ＩＣＥ／ＣＥＤ −３様プロテアーゼの対抗的なプロアポトーシス作用と、Ｂｃ１−２及び／またはその相同体が関与する上流調節機序との平衡に帰着する。アポトーシスの際のＩＣＥ／ＣＥＤ−３様プロテアーゼの潜在的基質の一つにポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）が有り、この物質はＤＮＡ修復、ゲノムのサーベイランス及び一体性維持において重要な酵素である¹¹ ^〜17 。ＰＡＲＰはアポトーシス開始時に、ＩＣＥのものに類似する特性を有する、未だ同定されていないプロテアーゼによりタンパタ質加水分解によって切断される^18,19 。ＰＡＲＰの切断部位（ＤＥＶＤ²¹⁶−Ｇ²¹⁷）はｐｒｏＩＬ−１βの、ＩＣＥによって認識及び切断される二つの部位の一方（ＦＥＡＤ²⁷−Ｇ²⁸）に類似する。上記部位におけるＰＡＲＰのタンパタ質加水分解切断によって、ＰＡＲＰのアミノ末端に位置する２個の亜鉛−フィンガーＤＮＡ結合モチーフがこのポリペプチドのカルボキシ末端に位置する自己修飾及びポリ（ＡＤＰ−リボシル）化触媒ドメインから分離される。この切断はＰＡＲＰの触媒ドメインがＤＮＡ損傷部位に結合するのを阻止し、おそらくはその後の修復及びゲノム保全事象を同調させるＰＡＲＰの能力を無効にする。そのうえ、アポトーシスの特徴であるヌクレオソーム間ＤＮＡ切断に関与するＣａ²⁺／Ｍｇ²⁺依存性エンドヌクレアーゼはポリ（ＡＤＰ−リボシル）化によって負に調節される²⁰ ^〜22。従って、死に掛けた細胞では正常なＰＡＲＰ機能の喪失によって上記ヌクレアーゼが高度に活性化される。ヒトに由来するシステインプロテアーゼのＩＣＥ／ＣＥＤ−３ファミリーに、五つの既知酵素ＩＣＥ、ＩＣＥ_rel−II、ＩＣＥ_rel−III、ＩＣＨ−１及びＣＰＰ３２が属する²³ ^〜26。これらはいずれも、宿主細胞のトランスフェクションによってアポトーシス応答を誘起し得る。しかし、任意のプロテアーゼの過剰発現によって細胞死が非特異的に誘発される場合も有る。例えばトリプシン、キモトリプシン、プロテイナーゼＫまたはｇｒａｎｚｙｍｅＢといった他のプロテアーゼの細胞質発現もアポトーシスを誘発することが判明している^27.28。本研究において本発明者は、アポパインと呼称される活性形態のＣＰＰ３２がアポトーシス開始時に起こるＰＡＲＰの特異的タンパク質加水分解切断を惹起する酵素であることを証明する。そのうえ、本発明者は、アポパインが媒介するＰＡＲＰ切断を阻害するとｉｎｖｉｔｒｏでアポトーシスが減衰することを示し、アポパインが哺乳動物細胞のアポトーシスにおいて果たす中心的役割を解明する。線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓでは、ただ一つの遺伝子ｃｅｄ−３の欠失または突然変異によってアポトーシス型死は起こらなくなる⁵。配列決定したところ、ｃｅｄ−３は哺乳動物のインターロイキン−１β変換酵素（ＩＣＥ）をコードする遺伝子と相同であることが判明し、前記酵素は、不活性な３１ｋＤａｐｒｏＩＬ −１βサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）前駆体を切断して活性な１７ｋＤａ形態とすることが唯一の既知機能であるプロテアーゼである。他の四つの哺乳動物ＩＣＥ／ＣＥＤ−３様プロテアーゼ（ＩＣＥ_rel−II、ＩＣＥ_rel−III、ＩＣＨ −１及びＣＰＰ３２）が発見され²³ ^〜26、かつゲノムの構成及び一体性維持の同調において重要な酵素であるポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）がアポトーシス開始時にＩＣＥに類似するプロテアーゼ（ｐｒＩＣＥ）によって機能的に不活性化されることが観察されて¹⁹、ＩＣＥがＩＬ−１β生成に関与することと、ＩＣＥ欠乏マウスでは通常アポトーシスが起こるという発見²⁹とを勘案しつつＩＣＥ様プロテアーゼが哺乳動物細胞のアポトーシスにおいて果たす役割をどのように説明できるかが次第に明らかになってきた。本発明者は、ｐｒＩＣＥが実はアポパイン／ＣＰＰ３２であること、及びアポパイン／ＣＰＰ３２は哺乳動物細胞においてＰＡＲＰを切断する特異的ＩＣＥ／ＣＥＤ−３様システインプロテアーゼであることを証明した。アポパイン／ＣＰＰ３２が哺乳動物の細胞死において果たす中心的役割は、ｉｎｖｉｔｒｏでアポトーシスが起こるのを防止する強力かつ選択的な阻害因子によっても立証される。このような発見は、アポパインプロ酵素ＣＰＰ３２とＣＥＤ− ３との配列関連性と相俟って、ＣＰＰ３２とそのタンパク質加水分解活性形態であるアポパインとがＣＥＤ−３のヒト同等物であり得ることを示唆している。従って、不適当なアポトーシスが顕著である病理状態では、アポパイン活性を薬理学的に調節することが適当な治療介入点となり得る。クローン化したアポパインｃＤＮＡの発現は、適当なプロモーター及び他の適当な転写調節要素を有する発現ベクター中への分子クローニングと、原核または真核宿主細胞への移入とにより組み換えアポパインの産生を実現する組み換え技術によって達成し得る。本明細書では「発現ベクター」を、適当な宿主における遺伝子のクローン化コピーの転写及びそのｍＲＮＡの翻訳に必要なＤＮＡ配列と定義する。このようなベクターは、真核生物遺伝子を細菌、酵母、藍藻類、植物細胞、昆虫細胞及び動物細胞などの様々な宿主において発現させるのに用い得る。特別に設計されたベクターは、細菌−酵母、または細菌−動物細胞などの宿主間でのＤＮＡのシャトル化を可能にする。適当に構築された発現ベクターは、宿主細胞における自律複製のための複製開始点と、選択マーカーと、限られた数の有用な制限酵素部位と、潜在的高コピー数領域と、活性なプロモーターとを有する。プロモーターとはＲＮＡポリメラーゼを、ＤＮＡに結合してＲＮＡ合成を開始するように導くＤＮＡ配列のことである。強いプロモーターは、ｍＲＮＡの合成開始を高い頻度で惹起するプロモーターである。発現ベクターには、クローニングベクター、改変クローニングベクター、特別に設計されたプラスミドまたはウイルスが非限定的に含まれ得る。哺乳動物細胞における組み換えアポパインの発現には様々な哺乳動物発現ベクターを用い得る。組み換えアポパイン発現に適し得る市販の哺乳動物発現ベクターには、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ３７４６０）及び１ＺＤ３５（ＡＴＣＣ３７５６５）が非限定的に含まれる。アポパインをコードするＤＮＡも、組み換え宿主細胞において発現させるべく発現ベクター中へクローン化し得る。組み換え宿主細胞は原核細胞であっても真核細胞であってもよく、細菌、酵母、哺乳動物細胞及び昆虫細胞が非限定的に含まれる。適当であり得る市販の哺乳動物種由来細胞系には、ＣＶ−１（ＡＴＣＣＣＣＬ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣＣＣＬ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣＣＣＬ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣＣＣＬ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣＣＲＬ１６１６）、ＢＳ− Ｃ−１（ＡＴＣＣＣＣＬ２６）及びＭＲＣ−５（ＡＴＣＣＣＣＬ１７１）が非限定的に含まれる。発現ベクターの宿主細胞内への導入は、形質転換、トランスフェクション、感染、プロトプラスト融合及びエレクトロポレーションを非限定的に含む幾つかの技術のうちのいずれかによって行ない得る。発現ベクター保有細胞をクローン化により増殖させ、個々の細胞を分析してアポパインタンパク質を産生するかどうか確認する。アポパインを発現させる宿主細胞クローンは、抗アポパイン抗体との免疫反応試験及び宿主細胞関連のアポパイン活性の測定を含めた幾つかの手段によって同定し得る。アポパインｃＤＮＡの発現は、ｉｎｖｉｔｒｏで調製した合成ｍＲＮＡを用いても実現可能である。合成ｍＲＮＡは、小麦胚抽出物及び網状赤血球抽出物を非限定的に含む様々な無細胞系において効率的に翻訳され得、また蛙卵母細胞内へのマイクロインジェクションを非限定的に含む細胞ベースの系においても効率的に翻訳され得る。最適レベルの酵素活性及び／またはアポパインタンパク質をもたらす（一つ以上の）アポパインｃＤＮＡ配列を確認するには、改変アポパインｃＤＮＡ分子を構築する。このｃＤＮＡ分子で宿主細胞を形質転換し、アポパインＲＮＡ及びタンパク質のレベルを測定する。宿主細胞のアポパインタンパク質レベルは、免疫アフィニティー及び／またはリガンドアフィニティー技術などの様々な方法で測定する。アポパイン特異的なアフィニティービーズまたはアポパイン特異的な抗体を用いて、³⁵Ｓ−メチオニンで標識したかまたは標識していないアポパインタンパタ質を単離する。標識したアポパインタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。標識していないアポパインタンパク質は、アポパイン特異的な抗体を用いるウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡまたはＲＴＡアッセイによって検出する。組み換え宿主細胞におけるアポパイン発現後、アポパインタンパク質を回収してその活性形態とし得る。幾つかのアポパイン精製操作が利用可能で、かつ使用に適する。当業者に知られた分画やクロマトグラフィー技術を様々に組み合わせてかまたは単独で適用することにより、組み換えアポパインを細胞溶解物または馴らし培地から精製し得る。加えて、完全長新生アポパインまたはアポパインのポリペプチドフラグメントに対して特異的であるモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて製造した免疫アフィニティーカラムを用いれば、組み換えアポパインを他の細胞タンパク質から分離することができる。組み換えタンパク質は抗体産生に用い得る。本明細書中に用いた「抗体」という語は、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体との両方及びこれらの抗体の、抗原またはハプテンと結合し得るＦｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）₂フラグメントなどのフラグメントを包含する。標準的な技術を用いて、アポパインに対する単一特異性抗体を、アポパインに対して反応性である抗体を含有する哺乳動物抗血清から精製するかまたはアポパインに対して反応性であるモノクローナル抗体として調製する。本明細書中に用いた「単一特異性抗体」という語は、アポパインに対して均一の（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）結合特性を有する単抗体種または多抗体種を意味する。本明細書中に用いた「均一の結合」という語は抗体種の、先に述べたアポパインに関連する能力のような、特定の抗原またはエピトープと結合する能力を意味する。酵素特異的な抗体は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウマ等のような動物、好ましくはウサギを、免疫アジュバントを伴ったかまたは伴わない適当な濃度のアポパインで免疫することにより産生させる。アポパインと反応するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、近交系マウスをアポパインで免疫するなどの通常方法で調製し得る。約０．１〜約１０ｍｇ、好ましくは約１ｍｇのアポパインを等量の許容可能なアジュバントと混合した約０．５ｍｌの緩衝液または食塩液に加えたものでマウスを免疫する。アジュバントはフロイントの完全アジュバントが好ましい。第０日にマウスに初回免疫を施し、このマウスを約３〜約３０週間放置する。免疫済みのマウスにリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）などの緩衝液中の約０．１〜約１０ｍｇのアポパインでの追加免疫を１回以上、静脈内（ＩＶ）経路を介して施す。免疫したマウスから脾臓を、当業者に知られた標準的な操作で取り出すことによって抗体陽性マウス由来のリンパ球を得る。脾臓リンパ球を、安定なハイブリドーマの形成を可能にする条件下に適当な融合相手と混合し、それによってハイブリドーマ細胞を作製する。融合ハイブリドーマ細胞は当業者に知られた操作による、ヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンを補充したダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中での増殖によって選択する。第１４、１８及び２１日ごろに増殖陽性ウェルから上清を回収し、この上清を抗体産生に関して、抗原としてアポパインを用いる固相ラジオイムノアッセイ（ＳＰＩＲＡ）などのイムノアッセイによってスクリーニングする。培養液もオクタロニー沈降アッセイで試験し、ｍＡｂのイソタイプを決定する。抗体陽性ウェルから得たハイブリドーマ細胞を、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，“ＳｏｆｔＡｇａｒＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，” ＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｋｒｕｓｅ及びＰａｔｅｒｓｏｎ編，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，１９７３に記載された軟寒天技術などの技術によってクローン化する。抗アポパイン抗体のｉｎｖｉｔｒｏ産生は、約２％のウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ中でハイブリドーマを増殖させ、それによって十分な量の特異的ｍＡｂを得ることにより行なう。ｍＡｂは当業者に知られた技術で精製する腹水またはハイブリドーマ培養液の抗体力価を、沈降、受動凝集、酵素結合イムノソルベント抗体（ＥＬＩＳＡ）技術及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）技術を非限定的に含む様々な血清学的または免疫学的アッセイによって測定する。体液または組織及び細胞抽出物においてアポパインの存在を検出するのにも同様のアッセイを用いる。上述のような方法は、アポパインポリペプチドフラグメントまたは完全長新生アポパインポリペプチドに特異的な抗体の産生に用い得る単一特異性抗体の産生に用い得る。抗体がアガロースゲルビーズ支持体と共有結合するようにＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで予め活性化したゲル支持体であるＡｆｆｉｇｅｌ−１０（Ｂｉｏｒａｄ）などのゲル支持体に抗体を添加することにより、アポパイン抗体アフィニティーカラムを作製する。次に、スペーサーアームが介在するアミド結合によって抗体とゲルとを結合させる。その後、残存する活性化エステルを１ＭエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８）で反応停止させる。カラムを水、次いで０．２３ＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で洗浄して、結合しなかった抗体や生体外タンパク質を除去する。次に、カラムをリン酸緩衝食塩液（ｐＨ７．３）中で平衡させ、このカラムにアポパインまたはアポパインフラグメントを含有する細胞培養上清または細胞抽出物をゆっくり通す。その後、カラムを洗浄し、タンパク質を溶離する。このように精製したアポパインタンパク質をリン酸緩衝食塩液に対して透析する。アポパインｃＤＮＡ、アポパインに対する抗体、またはアポパインタンパク質を含むキットを作製し得る。このようなキットは、アポパインＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡの検出、または試料におけるアポパインタンパク質またはペプチドフラグメントの存在の検出に用いられる。このようなキットを用いての特性解明は、法医学的分析及び疫学研究を非限定的に含む様々な目的のために有用である。本発明のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、組み換えタンパク質及び抗体は、アポパインＤＮＡ、アポパインＲＮＡまたはアポパインタンパク質のレベルに関するスクリーニング及び測定に用い得る。本発明の組み換えタンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子及び抗体は、アポパインの検出及び型分類に適したキットの作製に役立つ。前記キットは、少なくとも１個の容器を厳重に固定して保持するのに適した仕切り付きの支持器（ｃａｒｒｉｅｒ）を含む。この支持器はアポパインの検出に適した組み換えアポパインタンパク質または抗アポパイン抗体などの試薬も保持する。支持器は、標識した抗原または酵素基質等といったものを検出する手段も具備し得る。アポパインコーディングｃＤＮＡ配列と相補的であるヌクレオチド配列をアンチセンス療法用に合成し得る。得られるアンチセンス分子はＤＮＡ、ホスホロチオエートやメチルホスホネートといった安定なＤＮＡ誘導体、ＲＮＡ、２′−Ｏ −アルキルＲＮＡなどの安定なＲＮＡ誘導体、または他のアポパインアンチセンスオリゴヌクレオチド模擬体（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）である。アポパインアンチセンス分子は、マイクロインジェクション、リポソーム封入、またはアンチセンス配列を含む発現ベクターからの発現によって細胞内に導入し得る。アポパインアンチセンス療法は、アポパイン活性の低下が有益である疾患の治療に特に有用であり得る。アポパインを標的臓器の細胞内に導入するのに、アポパイン遺伝子療法を用い得る。アポパイン遺伝子はウイルスベクター中に連結することができ、前記ベクターは受容宿主細胞に感染することによってアポパインＤＮＡの移入を媒介する。適当なウイルスベクターに、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス等が含まれる。あるいは他の場合には、リガンド −ＤＮＡ結合体またはアデノウイルス−リガンド−ＤＮＡ結合体を用いる受容体媒介型標的指向性ＤＮＡ移入、リポフェクション、膜融合または直接マイクロインジェクションを含めた、ウイルスベクターを用いない（ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ）技術によってアポパインＤＮＡを遺伝子療法のために細胞内に移入し得る。これらの操作とその改良型とは、ｅｘｖｉｖｏ並びにｉｎｖｉｖｏアポパイン遺伝子療法に適している。アポパイン遺伝子療法は、アポパイン活性を高めることが有益である疾患の治療に特に有用であり得る。アポパインＤＮＡまたはアポパインタンパク質を含有する、医薬に有用な組成物を本出願に開示するようにして、または医薬に許容可能なキャリヤの混合によるような公知方法に従って調製し得る。前記キャリヤや調製方法の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ中に見出され得る。有効な投与に適した、医薬に許容可能な組成物を調製するべく、組成物には有効量の上記タンパク質またはＤＮＡを含有させる。本発明の治療または診断用組成物は、アポパイン関連疾患の治療または診断に十分な量で個体に投与する。有効量は、個体の状態、体重、性別及び年齢などの様々な要因に従って変化し得る。上記以外の要因に、投与モードが含まれる。医薬組成物は個体に、皮下、局所的、経口及び筋肉内などの様々な経路で個体に投与し得る。特定のアミノ酸をコードする様々なコドンに相当量の重複が存在することが知られている。従って本発明は、同じアミノ酸の究極的な翻訳をコードする代替コドンを含むＤＮＡ配列にも係わる。本明細書の趣旨に副って、１個以上の置換コドンを含む配列を縮重変異体（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｖａｒｉａｔｉｏｎ）と定義する。ＤＮＡ配列または翻訳されたタンパク質において生起する、発現されたタンパク質の最終的な物理特性を実質的に変更しない突然変異も本発明の範囲内に含まれる。例えば、ロイシンがバリンに、リシンがアルギニンに、またはグルタミンがアスパラギンに置換されてもポリペプチドの機能に変化は生じない。或るペプチドをコードするＤＮＡ配列が天然ペプチドのものとは異なる特性を有するペプチドをコードするように改変され得ることが知られている。ＤＮＡ配列を改変する方法には、位置特異的突然変異誘発が非限定的に含まれる。変更される特性の例には、酵素の基質に対する親和性の変化が非限定的に含まれる。本明細書中、アポパインの「機能性誘導体」とは、アポパインの生物活性と実質的に同様の（機能上または構造上の）生物活性を有する化合物のことである。「機能性誘導体」という語は、アポパインの「フラグメント」、「変異体」、「縮重変異体」、「類似体」及び「相同体」、または「化学誘導体」を包含するものとする。「フラグメント」という語は、アポパインの任意のポリペプチドサブセットを意味する。「変異体」という語は、完全なアポパイン分子またはそのフラグメントと実質的に同様の構造及び機能を有する分子を意味する。アポパイン分子と実質的に同様の構造を有するか、または同様の生物活性を有する分子をアポパインと「実質的に同様」とする。従って、実質的に同様の活性を有する二つの分子は、一方の分子の構造が他方において見出されなくても、あるいはまた両者のアミノ酸配列が同等でなくても変異体であると看做される。「類似体」という語は、完全なアポパイン分子またはそのフラグメントと実質的に同様の機能を有する分子を意味する。「化学誘導体」という語は、通常は基本分子の一部でない付加的な化学的部分を有する分子を意味する。前記部分によって、基本分子の溶解度、半減期、吸収性等を改善し得る。あるいは他の場合には、上記部分によって基本分子の望ましくない副作用を抑制したり、基本分子の毒性を低下させたりする。このような部分の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓなどの様々な文献に記載されている。本発明は、アポパインをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現及びアポパインタンパク質の機能をｉｎｖｉｖｏで調節する化合物をスクリーニングする方法にも係わる。上記のような活性を調節する化合物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、または非タンパク性有機分子であり得る。これらの化合物は、アポパインをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現、またはアポパインタンパク質の機能を促進または抑制して調節し得る。アポパインをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現、またはアポパインタンパク質の機能を調節する化合物は様々なアッセイによって検出できる。前記アッセイは、発現または機能に変化が有るかどうかを確認する単純な「はい／いいえ」アッセイであり得る。試験試料の発現または機能を標準試料の発現または機能レベルと比較することによってアッセイを定量的に行なうことも可能である。第二の態様において本発明は、式Ｉ〔式中Ｙは −ＣＨ（ＣＨ₂ＣＯ₂Ｈ）（ＣＯ）_mＲ² であり、ここでｍは０、１または２であり、Ｒ¹は（ａ）水素、Ｃ₁ _〜6アルコキシ、ＮＲ¹⁰Ｒ¹¹、ベンジルオキシ、または置換基がメチル、ハロゲン、メトキシもしくはシアノである一置換もしくは二置換ベンジルオキシであり、ここで、Ｒ¹⁰Ｒ¹¹は独立にＣ₁ _〜4アルキル、Ｃ₁ _〜4ペルフルオロアルキル、ベンジル、または置換基がハロゲン、メトキシもしくはシアノである一もしくは二置換ベンジルであり、またはＲ¹⁰とＲ¹¹は一緒になってピロリジン、ピペリジン、モルホリン、チアモルホリン、もしくはＮ−Ｒ¹²置換ピペラジンを形成し得、前記Ｒ¹²はＨまたはＣ₁ _〜3アルキルであり、（ｂ）Ｃ₁ _〜6アルキルであるか、または置換基が（１）ヒドロキシ、（２）ハロ、（３）Ｃ₁ _〜3アルキルオキシ、（４）Ｃ₁ _〜3アルキルチオ、（５）フェニルＣ₁ _〜3アルキルオキシ、（６）フェニルＣ₁ _〜3アルキルチオ、（７）フェニルカルボキシ、及び（８）カルボキシの中から選択された置換Ｃ₁ _〜6アルキルであり、（ｃ）アリールＣ₁ _〜6アルキルであり、ここで、アリール基は（１）フェニル、（２）ナフチル、（３）ピリジル、（４）フリル、（５）チエニル、（６）チアゾリル、（７）イソチアゾリル、（８）イミダゾリル、（９）ベンゾイミダゾリル、（１０）ピラジニル、（１１）ピリミジル、（１２）キノリル、（１３）イソキノリル、（１４）ベンゾフリル、（１５）ベンゾチエニル、（１６）ピラゾリル、（１７）インドリル、（１８）プリニル、（１９）イソオキサゾリル、及び（２０）オキサゾリル、並びに置換基が独立にＣ₁ _〜6アルキル、ハロ、ヒドロキシ、Ｃ₁ _〜6アルキルアミノ、Ｃ₁ _〜6アルコキシ、Ｃ₁ _〜6アルキルチオ、Ｃ₁ _〜6アルキルカルボニル、カルボキシ、Ｃ₁ _〜6アルキルオキシカルボニルである一及び二置換の上記（１）〜（２０）のアリールの中から選択され、Ｒ²は（ａ）水素、Ｃ₁ _〜6アルキル、ＯＨ、Ｃ₁ _〜6アルコキシ、Ｃ₁ _〜6アルキルチオ、Ｃ₁ _〜6ペルフルオロアルキルまたはＮＲ¹³Ｒ¹⁴であり、ここで、Ｒ¹³Ｒ¹⁴は独立にＣ₁ _〜4アルキル、Ｃ₁ _〜4ペルフルオロアルキル、ベンジル、または置換基がハロゲン、メトキシもしくはシアノである一もしくは二置換ベンジルであり、またはＲ¹³とＲ¹⁴は一緒になってピロリジン、ピペリジン、モルホリン、チアモルホリン、もしくはＮ−Ｒ¹⁵置換ピペラジンを形成し得、前記Ｒ¹⁵はＨまたはＣ₁ _〜3アルキルであり、（ｂ）置換基が（１）Ｃ₁ _〜3アルキルチオ、（２）Ｃ₁ _〜3アルコキシ、（３）ハロ、（４）ヒドロキシ、（５）シアノ、（６）カルボキシ、（７）Ｃ₁ _〜3アルキル、（８）トリフルオロメチル、（９）トリメチルアミノ、及び（１０）ベンジルオキシの中から個別に選択された四または五置換フェニルであり、（ｃ）フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、９−アントラシル及び２−、３ −または４−ピリジル並びにこれらのアリールの、置換基が（１）フェニル、（２）ハロ、（３）Ｃ₁ _〜3アルキル、（４）ペルフルオロＣ₁ _〜3アルキル、（５）ニトロ、（６）シアノ、（７）Ｃ₁ _〜3アルキルカルボニル、（８）フェニルカルボニル、（９）カルボキシ、（１０）アミノカルボニル、（１１）モノ及びジＣ₁ _〜3アルキルアミノカルボニル、（１２）ホルミル、（１３）ＳＯ₃Ｈ、（１４）Ｃ₁ _〜3アルキルスルホニル、（１５）フェニルスルホニル、（１６）ホルムアミド、（１７）Ｃ₁ _〜3アルキルカルボニルアミノ、（１８）フェニルカルボニルアミノ、（１９）Ｃ₁ _〜3アルコキシカルボニル、（２０）Ｃ₁ _〜3アルキルスルホンアミドカルボニル、（２１）フェニルスルホンアミドカルボニル、（２２）Ｃ₁ _〜3アルキルカルボニルアミノスルホニル、（２３）フェニルカルボニルアミノスルホニル、（２４）Ｃ₁ _〜3アルキルアミノ、（２５）モノ及びジＣ₁ _〜3アルキルアミノ、（２６）アミノ、（２７）ヒドロキシ、（２８）Ｃ₁ _〜3アルキルオキシ、及び（２９）Ｃ₁ _〜3アルキルチオの中から個別に選択された一、二または三置換誘導体の中から選択されたアリールであり、ＡＡ¹は（ａ）単結合、及び（ｂ）式ＡＩのアミノ酸の中から独立に選択され、ＡＡ²は式ＡII のアミノ酸であり、ＡＡ³は式ＡIII のアミノ酸であり、上記式中Ｒ⁷、Ｒ⁸及びＲ⁹は（ａ）水素、（ｂ）Ｃ₁ _〜6アルキル、または置換基が（１）ヒドロキシ、（２）ハロ、（３） −Ｓ−Ｃ₁ _〜4アルキル、（４） −ＳＨ、（５）Ｃ₁ _〜6アルキルカルボニル、（６）ＣＯ₂Ｈ、（７）ＣＯＮＨ₂、（８）アミノカルボニルアミノ、（９）アルキル部分がヒドロキシで任意に置換され、かつアミノが水素またはＣＢＺで置換されたＣ₁ _〜4アルキルアミノ、（１０）グアニジノ、（１１）Ｃ₁ _〜4アルキルオキシ、（１２）フェニルＣ₁ _〜4アルキルオキシ、（１３）フェニルＣ₁ _〜4アルキルチオ、及び（１４）Ｃ₁ _〜6アルキルオキシカルボニルの中から選択された置換Ｃ₁ _〜6アルキル、及び（ｃ）アリールがフェニル、１−もしくは２−ナフチル、９−アントラシルまたは２−、３−もしくは４−ピリジルであり、当該アリールは置換基が互いに独立にＣ₁ _〜6アルキル、ハロ、ヒドロキシ、Ｃ₁ _〜6アルキルアミノ、Ｃ₁ _〜6アルコキシ、Ｃ₁ _〜6アルキルチオまたはＣ₁ _〜6アルキルカルボニルである一または二置換アリールであり得るアリールＣ₁ _〜6アルキルの中から互いに独立に選択される〕の化合物またはその医薬に許容可能な塩を包含する。式Ｉの化合物に分類される或る化合物群では、Ｒ¹は（ａ）水素、Ｃ₁ _〜6アルコキシ、または置換基がメチル、ハロゲン、メトキシもしくはシアノである一もしくは二置換ベンジルオキシであり、（ｂ）Ｃ₁ _〜6アルキルであるか、または置換基が（１）ヒドロキシ、（２）クロロ、フルオロ、（３）Ｃ₁ _〜3アルキルオキシ、（４）フェニルＣ₁ _〜3アルキルオキシ、（５）フェニルカルボキシ、及び（６）カルボキシの中から選択された置換Ｃ₁ _〜6アルキルであり、（ｃ）アリールＣ₁ _〜6アルキルであり、ここで、アリール基は（１）フェニル、（２）ナフチル、（３）ピリジル、（４）フリル、（５）チエニル、（６）チアゾリル、（７）イソチアゾリル、（８）ベンゾフリル、（９）ベンゾチエニル、（１０）インドリル、（１１）イソオキサゾリル、及び（１２）オキサゾリル、並びに置換基が独立にＣ₁ _〜4アルキル、ヒドロキシ、カルボキシ、Ｃ₁ _〜6 アルキルオキシカルボニル、ハロである一及び二置換の上記（１）〜（１２）のアリールの中から選択され、Ｒ²は水素、ＯＨ、Ｃ₁ _〜6アルキルオキシまたはＣ₁ _〜6ペルフルオロアルキルであり、Ｒ⁷、Ｒ⁸及びＲ⁹は（ａ）水素、（ｂ）置換基が（１）水素、（２）ヒドロキシ、（３）ハロ、（４） −Ｓ−Ｃ₁ _〜4アルキル、（５） −ＳＨ、（６）Ｃ₁ _〜6アルキルカルボニル、（７）ＣＯ₂Ｈ、（８） −ＣＯＮＨ₂、（９）アルキル部分がヒドロキシで任意に置換されたＣ₁ _〜4アルキルアミノ、及び（１０）グアニジノの中から選択された置換Ｃ₁ _〜6アルキル、及び（ｃ）アリールが先に挙げたアリールであり、当該アリールは置換基が互いに独立にＣ₁ _〜6アルキル、ハロ、ヒドロキシ、Ｃ₁ _〜6アルキルアミノ、Ｃ₁ _〜6アルコキシ、Ｃ₁ _〜6アルキルチオまたはＣ₁ _〜6アルキルカルボニルである一または二置換アリールであり得るアリールＣ₁ _〜6アルキルの中から互いに独立に選択される。上述の化合物群には、ＡＡ¹、ＡＡ²及びＡＡ³がＬ形及びＤ形のグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リシン、ヒドロキシリシン、ヒスチジン、アルギニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、メチオニン、オルニチン、β−アラニン、ホモセリン、ホモチロシン、ホモフェニルアラニン及びシトルリンを含めたアミノ酸の中から互いに独立に選択される化合物が含まれる。あるいは他の場合には、上述の化合物群中に、Ｒ¹がＣ₁ _〜3アルキル、Ｃ₁ _〜4アルコキシであり、Ｒ⁸及びＲ⁹は互いに独立に（ａ）水素、（ｂ）Ｃ₁ _〜6アルキル、または置換基が（１）ヒドロキシ、（２）ＳＨ、（３）ＣＯ₂Ｈ、（４）ＣＯＮＨ₂、及び（５）グアニジノの中から選択された置換Ｃ₁ _〜6アルキルである化合物から成る亜群が構成される。本発明の化合物の例に次のようなものが有る。（ａ）Ｎ−（Ｎ−アセチル−アスパルチル−グルタミル−バリニル）−３−アミノ−３−ホルミルプロピオン酸（ｂ）Ｎ−（Ｎ−（１，１−ジメチルエトキシカルボニル）−アスパルチル−グルタミル−バリニル）−３−アミノ−ホルミルプロピオン酸（ｃ）Ｎ−（Ｎ−（１，１−ジメチルエトキシカルボニル）−アスパルチル− グルタミル−バリニル）−３−アミノ−３−（トリフルオロメチルカルボニル）プロピオン酸（ｄ）Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（１，１−ジメチルエトキシカルボニル）アントラニリル）−アスパルチル−グルタミル−バリニル）−３−アミノ−３−ホルミルプロピオン酸（ｅ）Ｎ−（Ｎ−（３−（２−オキソ−ヘキサヒドロ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾル−４−イル）ペンタノイル）−アスパルチル−グルタミル−バリニル）−３−アミノ−３−ホルミルプロピオン酸（ｆ）Ｎ−（Ｎ−（Ｎ−（５−（３ａ−（Ｓ）−６ａ−（Ｒ）−２−オキソ− ヘキサヒドロ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾル−４−イル）ペンタノイル）− ６−アミノヘキサノイル）−アスパルチル−グルタミル−バリニル）−３−アミノ−３−ホルミルプロピオン酸本明細書の趣旨に副って、次の略号は表記の意味を有する。ＢＯＣｔ−ブチルオキシカルボニルＣＢＺカルボベンゾキシＤＣＣ１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドＤＩＢＡＬ水素化ジイソブチルアルミニウムＤＭＡＰ４−（ジメチルアミノ）ピリジンＤＭＦＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドＤＭＳＯジメチルスルホキシドＥＤＣＩ１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルホジイミド塩酸塩Ｅｔ₃ＮトリエチルアミンＥｔＯＡｃ酢酸エチルＥｔ₂ＯエチルエーテルＦＡＢ高速原子衝撃ＨＭＰＡヘキサメチルホスホルアミドＨＯＢｔ１−ヒドロキシベンゾトリアゾールＨＲＭＳ高分解質量分析法ＫＨＭＤＳカリウムヘキサメチルジシラザンＬＤＡリチウムジイソプロピルアミドＭＣＰＢＡメタクロロ過安息香酸Ｍｓメタンスルホニル＝メシルＭｓＯメタンスルホネート＝メシレートＮＢＳＮ−ブロモスクシンイミドＰＣＣクロロクロム酸ピリジニウムＰＤＣ二クロム酸ピリジニウムＰｈフェニルＰＰＴＳｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウムｐＴＳＡｐ−トルエンスルホン酸Ｐｙｅピリジンジイルｒ．ｔ．室温ｒａｃ．ラセミ体Ｔｆトリフルオロメタンスルホニル＝トリフリルＴｆＯトリフルオロメタンスルホネート＝トリフレートＴＨＦテトラヒドロフランＴＨＰテトラヒドロピラン−２−イルＴＬＣ薄層クロマトグラフィーＴｓｐ−トルエンスルホニル＝トシルＴｓＯｐ−トルエンスルホネート＝トシレートＴｚ１Ｈ（または２Ｈ）−テトラゾル−５−イルアルキル基略号ＭｅメチルＥｔエチルｎ−Ｐｒノルマルプロピルｉ−Ｐｒイソプロピルｎ−Ｂｕノルマルブチルｉ−Ｂｕイソブチルｓ−Ｂｕ第二級ブチルｔ−Ｂｕ第三級ブチル「アルキル」という語は、前に付した記号によって示した数の炭素原子を有する直鎖状、分枝鎖状及び環状構造並びにこれらの組み合わせを意味する。「アルコキシ」という語は、直鎖状、分枝鎖状または環状に配置された、示した数の炭素原子を有するアルコキシ基を意味する。アルコキシ基の例には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、シクロプロピルオキシ、シクロヘキシルオキシ等が含まれる。「アルキルチオ」という語は、直鎖状、分枝鎖状または環状に配置された、示した数の炭素原子を有するアルキルチオ基を意味する。アルキルチオ基の例には、メチルチオ、プロピルチオ、イソプロピルチオ、シクロヘプチルチオ等が含まれる。一例として、プロピルチオ基を記号で表わすと−ＳＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₃となる。ハロにはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩが含まれる。光学異性体−ジアステレオマー−幾何異性体本明細書に開示した化合物のうちの幾つかは一つ以上の不斉中心を有し、即ちジアステレオマー及び光学異性体を生成させ得る。本発明は、生成し得るジアステレオマーとそのラセミ体、及び分割によって得られる、エナンチオマーとして純粋な形態、並びにこれらの医薬に許容可能な塩を包含するものとする。本明細書に開示した化合物のうちの幾つかはオレフィン性二重結合を有し、このような化合物は特に断わらないかぎりＥ型とＺ型との両方の幾何異性体を包含するものとする。塩本発明の医薬組成物は活性成分として式Ｉの化合物またはその医薬に許容可能な塩を含有し、また医薬に許容可能なキャリヤ、及び場合によっては他の治療薬成分も含有し得る。「医薬に許容可能な塩」という語は、無機塩基及び有機塩基を含めた医薬に許容可能な無毒塩基から形成された塩を意味する。無機塩基から得られる塩には、アルミニウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、銅塩、第二鉄塩、第一鉄塩、リチウム塩、マグネシウム塩、第二マンガン塩、第一マンガン塩、アンモニウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、亜鉛塩等が含まれる。特に好ましいのはカルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩及びナトリウム塩である。医薬に許容可能な有機無毒塩基から得られる塩には、第一級、第二級及び第三級アミン、天然置換アミンを含めた置換アミン、環状（ｃｙｃｌｉｃ）アミン、並びにアルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ´−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リシン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミン等といった塩基性イオン交換樹脂の塩が含まれる。本発明の化合物が塩基性である場合、塩は無機及び有機酸を含めた医薬に許容可能な無毒酸から形成され得る。前記のような酸には、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、樟脳スルホン酸、クエン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、硝酸、パモ酸、パントテン酸、リン酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸等が含まれる。特に好ましいのはクエン酸、臭化水素酸、塩酸、マレイン酸、リン酸、硫酸及び酒石酸である。後段での治療方法の検討において、式Ｉの化合物に言及する時はその医薬に許容可能な塩も含めてのことと理解されたい。式Ｉの化合物は、アポパインの作用を阻害する能力を有することから、アポトーシスの分野において研究手段として有用である。この化合物はまた、哺乳動物、特にヒトにおいて１．免疫不全症候群（ＡＩＤＳを含む）、２．Ｉ型糖尿病、３．病原体感染、４．心血管及び神経損傷、５．脱毛症、６．老化、７．パーキンソン病、８．アルツハイマー病を非限定的に含めた疾患の治療、予防及び改善にも有用である。用量範囲式Ｉの化合物の治療用量の多寡は当然ながら、治療するべき状態の性質及び重篤度、並びに用いる特定の式Ｉの化合物とその投与経路に応じて様々となり、臨床医の判断によっても変化する。上記用量はまた個々の患者の年齢、体重及び応答次第でも変化する。即ち、活性成分の有効用量は臨床医が、あらゆる規準を考慮した後患者にとって最良の判断を下して決定し得る。眼球への投与には、許容可能な眼科用薬剤（ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）中の式Ｉの化合物の０．００１〜１重量％溶液または懸濁液を含む眼用製剤を用い得る。医薬組成物哺乳動物、特にヒトに有効量の本発明の化合物を与えることは、いずれか適当な投与経路を用いて可能である。例えば、経口、非経口及び局所的経路を用い得る。投与形態には錠剤、トローチ剤、分散液剤、懸濁液剤、溶液剤、カプセル剤、クリーム剤、軟膏剤、エアゾル剤等が含まれる。本発明の医薬組成物は活性成分として式Ｉの化合物またはその医薬に許容可能な塩を含有し、また医薬に許容可能なキャリヤ、及び場合によっては他の治療薬成分も含有し得る。「医薬に許容可能な塩」という語は、無機塩基または酸及び有機塩基または酸を含めた医薬に許容可能な無毒塩基または酸から形成された塩を意味する。本発明の組成物は、経口投与、非経口投与及び眼球（眼内）投与に適した組成物を包含する。本発明の組成物は便利な単位投与形態で提供でき、かつ調剤の分野で良く知られた任意の方法で調製できる。実用に際して、式Ｉの化合物は通常の医薬配合技術に従い、医薬用キャリヤと十分混和した活性成分として配合し得る。キャリヤは、投与のために望ましい剤形に応じてきわめて様々な形態を有し得る。経口投与形態の組成物の調製ではいずれか普通の医薬用媒体を用い得、それは例えば懸濁液剤、エリキシル剤及び溶液剤などの経口液体製剤であれば例えば水、アルコール、油、香味付与剤、防腐剤、着色剤等であり、例えば散剤、カプセル剤及び錠剤などの経口固体製剤であれば澱粉、糖、微晶質セルロース、稀釈剤、顆粒化剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤等のキャリヤであり、その際固体の経口製剤の方が液体製剤よりも好ましい。投与の容易さから、錠剤及びカプセル剤が最も有利な経口投与単位形態であり、これらの形態では明らかに固体の医薬用キャリヤが用いられる。所望であれば、錠剤を標準的な水性または非水性技術によって被覆してもよい。経口投与に適する本発明の医薬組成物はカプセル剤、カシェ剤または錠剤といった、各剤粒が粉末もしくは顆粒状、または水性液体、非水性液体、水中油型乳濁液もしくは油中水型乳濁液を媒体とした溶液もしくは懸濁液状の活性成分を所定量ずつ含有する個別的単位投与形態として提供し得る。このような組成物は任意の調剤方法で調製可能であるが、それらの方法はいずれも活性成分を１種以上の必要成分から成るキャリヤと混合するステップを含む。上記組成物は通常、活性成分を液体キャリヤもしくは微粉状固体キャリヤまたはこれらの両方と均一かつ十分に混合し、その後必要であれば混合物を所望の形状に成形することによって調製する。例えば、場合によっては１種以上の付加的成分を加えての圧縮成形または擦り込み成形（ｍｏｌｄｉｎｇ）によって錠剤を製造し得る。圧縮錠剤は、場合によっては結合剤、滑沢剤、不活性稀釈剤、界面活性剤または分散剤と混合した粉末または顆粒などの自由流動形態の活性成分を適当な機械で圧縮成形することによって製造し得る。擦り込み錠剤は、不活性稀釈液で湿した粉末状化合物の混合物を適当な機械で擦り込み成形することにより製造し得る。望ましくは、錠剤は１錠当たり約１〜約５００ｍｇの活性成分を含有し、カシェ剤またはカプセル剤も１錠当たり約１〜約５００ｍｇの活性成分を含有する。合成方法本発明の化合物は、以下に概説し、かつ後出の実施例においてより詳細に説明した操作を用いると好ましく製造できる。方法ＡＢＯＣ、ＣＢＺまたは他の任意の適当な窒素保護基などの基でＮ保護したアミノ酸１を、アリルアルコール存在下に０℃においてＣＨ₂Ｃｌ₂またはＣＨＣｌ₃ といった不活性溶媒中で１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ）とのカップリング反応によりアリルエステルに変換して２を得る。このアミノ酸を、窒素をＢＯＣ基で保護した場合はＭｅＯＨ中でＨＢｒなどの酸でＮ脱保護して遊離アミンを得る。異なる基を用いた場合の脱保護については、“ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓｉｎＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，” ２ｎｄｅｄ．，ＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，１９９１に記載が有る。上記アミンを３と、先に述べたようにしてカップリングさせ、それによってジペプチド４を得る。先の条件に従ってのアミン脱保護後、アミンを５とカップリングさせてトリペプチド６を得る。５上のＢＯＣ基は、２−ｔ−ブチルオキシカルボニルアミノベンゾエートなどの螢光原基質（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃｓｕｂｓｔａｔｅ）によって置き換えることも可能である。アリル基のパラジウム（０）及びピロリジンでの脱保護（ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．２８，ｐ．４３７１，１９８７）によって酸を得、この酸をＢｉｏ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２，ｐ．６１３，１９９２に従ってｎ−アリルオキシカルボニル−４−アミノ−５−ベンジルオキシ−２−オキソテトラヒドロフラン７とカップリングさせることにより、還元条件下でのベンジル脱保護後に８を得る。７のＲ²はＨ、ＣＨ₃、ＣＦ₃、ＯＭｅ及びＳＭｅであり得る。生物活性測定アッセイポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼのタンパク質分解性切断の測定（ａ）［³⁵Ｓ］放射性標識ＰＡＲＰの調製ヒトポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼをコードするｃＤＮＡ（クローンｐＣＤ−１２；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号第Ｍ３２７２１号；ＮＣＢＩｇｉ１９０２６６）をそのクローニングベクターからＸｈｏＩ制限消化によって切り出し、その後ＸｈｏＩ切断したＣＩＰ処理済みのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に連結した。コンピテント大腸菌細胞を形質転換し、コロニーを精製し、得られた形質転換細胞を培養液中で増殖させた後プラスミドＤＮＡを精製し、ＰＡＲＰｃＤＮＡの向きを制限酵素分析によって確認した。Ｔ７方向及びＴ３方向への向きを有するクローンが得られ、これらのプラスミドＤＮＡを用いて、［³⁵Ｓ］メチオニン（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ）の存在下にＴｎＴ網状赤血球溶解物（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いる共役ｉｎｖｉｔｒｏ転写／翻訳により［³⁵Ｓ］ＰＡＲＰの合成を行なった。得られた［³⁵Ｓ］ＰＡＲＰポリペプチドを、１０ｍＭＨｅｐｅｓ／ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、２ｍＭＥＤＴＡ、０．１％ＣＨＡＰＳ、５ｍＭジチオトレイトール中で平衡させたＳｕｐｅｒｄｅｘ− ７５ＨＲ１０／３０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上でのゲル濾過クロマトグラフィーによって網状赤血球溶解物混合物の諸成分から精製単離した。（ｂ）ＰＡＲＰ切断の測定１０ｍＭＨｅｐｅｓ／ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、２ｍＭＥＤＴＡ、０．１％ＣＨＡＰＳ、５ｍＭジチオトレイトールから成る緩衝液に５μｌの精製［³⁵Ｓ］ＰＡＲＰ及び０〜１０μｌのＰＡＲＰ切断活性（例えばアポトーシスを起こした骨肉腫細胞、ＴＨＰ−１細胞または他の細胞から得た画分や、精製アポパインまたは組み換えアポパイン）プラス薬剤（指示した場合）または賦形剤を加えてインキュベーション混合物（最終体積２５μｌ）を製造した。混合物を３７℃で６０分間インキュベートしてから６．５μｌの５倍濃縮ＳＤＳ含有ＰＡＧＥ試料緩衝液を添加し、その後９５℃で５分間変性を生起させた。試料を１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、エレクトロブロッティングによってポリ（二フッ化ビニリデン）膜に移し取り、その後［³⁵Ｓ］ＰＡＲＰ切断生成物をオートラジオグラフィーによって可視化した。ＰＡＲＰ切断を、１１３．１ｋＤａのＰＡＲＰポリペプチドの２４．１ｋＤａ及び８９．１ｋＤａフラグメントへの分裂として測定した。得られたオートラジオグラムのレーザー濃度測定により測定した２４．１ｋＤａフラグメントの体積−密度によってＰＡＲＰ切断活性を定量した。（ｃ）螢光原基質の切断によるＰＡＲＰ切断の測定アポパインによって認識される、ＰＡＲＰ切断部位のＰ₁ _〜Ｐ₄アミノ酸に対応するテトラペプチドの螢光原誘導体であるＡｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ（ＡＭＣはアミノ−４−メチルクマリン）を、ｉ）Ｎ−Ａｃ−Ａｓｐ（ＯＢｎ）−Ｇｌｕ（ＯＢｎ）−Ｖａｌ−ＣＯ₂Ｈの合成、ｉｉ）Ａｓｐ（ＯＢｎ）−７−アミノ−４− メチルクマリンとのカップリング、ｉｉｉ）ベンジル基の除去によって製造した。１００ｍＭＨｅｐｅｓ／ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１０％（ｗ／ｖ）スクロース、０．１％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ、１０ｍＭジチオトレイトールにＡｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ及び精製したかまたは粗なままのＰＡＲＰ切断アポパイン／ＣＰＰ３２酵素を加えて標準反応混合物（最終体積３００μｌ）を製造し、これを２５℃でインキュベートした。反応を、励起波長３８０ｎｍ、発光波長４６０ｎｍの分光螢光光度計で連続的に監視した。本発明を以下の実施例によって詳述するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。図面の詳細な説明図１は、自然にアポトーシスを起こした骨肉腫細胞におけるＰＡＲＰ切断活性を示している。（ａ）ＰＡＲＰの構造及びタンパク質分解酵素による切断によって生じた断片。ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼは、３つの機能性ドメイン：一本鎖又は二本鎖ＤＮＡの切断を選択的に認識する２つの亜鉛フィンガーモチーフを含むアミノ末端ＤＮＡ結合ドメインと、カルボキシ末端触媒ドメインと、自己修飾を起こしてＤＮＡの結合親和性を変化させる中央領域とからなる１１３ｋＤａの核タンパク質である³⁷。アポトーシス発生時に生起するタンパク質分解酵素による切断部位は矢印で示されている。（ｂ）細胞抽出物によるＰＡＲＰのｉｎｖｉｔｒｏ切断。ｉｎｖｉｔｒｏ転写／翻訳により［³⁵Ｓ］ＰＡＲＰを生成させ、次いで、集密前のアポトーシスを起こしていない骨肉腫細胞のシトソール抽出物（レーン２）、集密後のアポトーシスを起こした骨肉腫細胞のシトソール抽出物（レーン３）、新たに分離したＴＨＰ−１細胞のシトソール抽出物（レーン４）、３７℃で６０分間予備インキュベートして活性化したＴＨＰ−１細胞抽出物（レーン５）又はアポトーシスを起こしたニワトリＳ／Ｍ抽出物（レーン６）と合わせた。（ｃ）アポトーシスが進行している骨肉腫細胞におけるヌクレオソーム内のＤＮＡの切断。骨肉腫細胞を指示された日数培養してから回収した。ＤＮＡを抽出し、アガロースゲル上で分離した。アスタリスクは集密に達した時点（６日目）を示す。（ｄ）アポトーシスが進行している骨肉腫細胞におけるＰＡＲＰ切断活性の評価。パネル（ｃ）に記載のアポトーシスが進行している骨肉腫細胞からシトソール画分を分離し、次いで、ＰＡＲＰ切断活性（白丸）及びｐｒｏＩＬ−１β切断活性（白四角）についてアッセイした。方法（ｂ）シトソール抽出物は、培養したヒト骨肉腫細胞（１４３．９８．２：ＡＴＣＣＣＲＬ１１２２６）及びＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣＴＩＢ２０２）から、ＰＢＳで洗浄した細胞ペレットを、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ／ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％（ｗ／ｖ）のＣＨＡＰＳ、５ｍＭのジチオトレイトール、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド、１０μ ｇ／ｍｌのペプスタチンＡ、２０μｇ／ｍｌのロイペプチン、１０μｇ／ｍｌのアプロチニン（１×１０⁸細胞／ｍｌ）中でホモジナイズし、１，０００×ｇ、１０，０００×ｇ、次いで１００，０００×ｇで連続遠心した後上清を回収して調製した。ニワトリＳ／Ｍ抽出物は、先に記載のように³⁵、Ｓ期アフィジコリン停止次いでＭ期ノコダゾール蓄積によりアポトーシスを起こさせたＤＵ２４９ヘパトーマ細胞³⁸から調製した。ＰＡＲＰの全長ｃＤＮＡクローン（ｐｃＤ−１２）³⁹を切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−II ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＸｈｏＩ部位に連結し、次いで、転写（Ｔ７ポリメラーゼ）／翻訳（ウサギ網状赤血球溶解物）（Ｐｒｏｍｅｇａ）による［³⁵Ｓ］メチオニン標識ＰＡＲＰの合成の推進に用いた。［³⁵Ｓ］ＰＡＲＰは、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ／ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％（ｗ／ｖ）のＣＨＡＰＳ、５ｍＭのジチオトレイトール中のＳｕｐｅｒｄｅｘ−７５ＦＰＬＣカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ；１×３０ｃｍ）上のゲル濾過クロマトグラフィーにより、転写／翻訳混合物の構成成分から分離した。［³⁵Ｓ］ＰＡＲＰ〔５０ｍＭのＰｉｐｅｓ／ＫＯＨ（ｐＨ６．５）、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％（ｗ／ｖ）のＣＨＡＰＳ、５ｍＭのジチオトレイトール中２５μｌの最終容量〕を含む反応混合物を、アポトーシスを起こしていない骨肉腫細胞（３日目の集密前培養物）のシトソール画分由来のタンパク質４．５ μｇ（レーン２）、アポトーシスを起こした骨肉腫細胞（７日目の集密後培養物）のシトソール画分由来のタンパク質４．５μｇ（レーン３）、ＴＨＰ−１細胞のシトソール画分由来のタンパク質３０μｇ（レーン４）、３７℃で６０分間予備インキュベートして活性化したＴＨＰ−１細胞のシトソール画分由来のタンパク質３０μｇ（レーン５）又はニワトリＳ／Ｍ抽出物由来のタンパク質０．６μ ｇ（レーン６）を含むシトソール抽出物の不在下（レーン１）又は存在下（レーン２〜６）に、３７℃で１時間インキュベートした。試料を１０％ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル上で分離し、［³⁵Ｓ］ＰＡＲＰ切断産物をフルオログラフィーにより視覚化した。（ｃ）骨肉腫細胞を４，０００細胞／ｃｍ²の密度で培地に接種し、指示された期間培養した。各時点でフェノール／クロロホルム抽出により、１×１０⁶個の細胞からＤＮＡを分離し、ＤＮアーゼを含まないＲＮアーゼで消化し、アルコール沈降させ、次いで、１．２％アガロース／ＴＡＥゲル上で分離した後、臭化エチジウムで染色した。（ｄ）上記（ｃ）に記載の細胞からシトソール画分を分離し、次いで（ｂ）に記載の方法で、［³⁵Ｓ］ＰＡＲＰ（白丸）を用いてＰＡＲＰ切断活性についてアッセイした。ＰＡＲＰの切断は、得られたフルオログラム上の２４ｋＤａに対応するバンドをレーザーデンシトメトリーにより定量した。データは、２回の別個の実験の平均値である。ｐＨ７．４で行うこと以外は、上記に［³⁵ Ｓ］ＰＡＲＰの切断について記載のものと実質的に同じ方法で、［³⁵Ｓ］ｐｒｏＩＬ−１βの切断によりＩＣＥ活性（白四角）を測定した。図２は、アポトーシスを起こした骨肉腫細胞抽出物におけるＰＡＲＰ切断の阻害を示している。（ａ）種々のプロテアーゼ阻害剤による阻害。指示された種々のプロテアーゼ阻害剤の存在下に、アポトーシスを起こした骨肉腫細胞のシトソール画分を（ｉｎｖｉｔｒｏ転写／翻訳により誘導された）［³⁵Ｓ］ＰＡＲＰと共にインキュベートした。得られたフルオログラムからの２４ｋＤａの切断産物を示す。（ｂ）合成テトラペプチドアルデヒドによる阻害。それぞれＰＡＲＰ切断部位及びｐｒｏＩＬ−１β切断部位のＰ₁−Ｐ₄アミノ酸をモデルとした、指示濃度のテトラペプチドアルデヒドＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ（白丸）又はＡｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯ（黒四角）の存在下に、アポトーシスを起こした骨肉腫細胞のシトソール画分を［³⁵Ｓ］ＰＡＲＰと共にインキュベートした。Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯの構造は図中のインセット（はめ込み部）に示されている。方法（ａ）図１ｂに示されているように［³⁵Ｓ］ＰＡＲＰの切断を測定したが、但し、（ｉ）転写／翻訳混合物のクロマトグラフィー、細胞溶解緩衝液及び［³⁵ Ｓ］ＰＡＲＰ切断インキュベーション緩衝液のジチオトレイトールの濃度を５ｍＭから１ｍＭに低減させ、（ii）細胞溶解緩衝液はプロテアーゼ阻害剤を含んでいなかった。アポトーシスを起こした骨肉腫細胞（７日目の集密後培養物）のシトソール画分由来のタンパク質１０μｇを含むインキュベーション混合物を、指示されたプロテアーゼ阻害剤と共に３７℃で２０分間予備インキュベートしてから［³⁵Ｓ］ＰＡＲＰを加えた。３７℃で６０分間インキュベートした後、試料を１０％ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル上で分離した。得られた乾燥ゲルのフルオログラフィーにより切断産物を視覚化し、２４ｋＤａ産物に対応する領域を示す。シトソール画分の不在下（レーン１及びレーン１６）又はシトソールの存在下且つプロテアーゼ阻害剤の不在下（レーン２及びレーン１７）に対照試料をインキュベートした。インキュベーション混合物は、１００μＭの４−アミジノ−フェニル−メタン −スルホニルフルオリド（ｐＡＰＭＳＦ；レーン３）、２μｇ／ｍｌのアプロチニン（レーン４）、１００μＭのエラスチナール（レーン５）、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ；レーン６）、１００μＭのＬ−１− クロロ−３−［４−トシルアミド］−７−アミノ−２−ヘプタノン（ＴＬＣＫ；レーン７）、１００μＭのＬ−１−クロロ−３−［４−トシルアミド］−４−フェニル−２−ブタノン（ＴＰＣＫ；レーン８）、１ｍｇ／ｍｌのダイズトリプシン阻害剤（ＳＢ−ＴＩ；レーン９）、１０μＭのアマスタチン（レーン１０）、１０μＭのベスタチン（レーン１１）、５０μＭのジプロチンＡ（レーン１２）、８．５μＭのホスホラミドン（レーン１３）、１μＭのペプスタチン（レーン１４）、５ｍＭのＥＤＴＡ（レーン１５）、１ｍｇ／ｍｌのａ₂マクログロブリン（レーン１８）、１００μＭのアンチパイン（レーン１９）、１００μＭのキモトリプシン（レーン２０）、１００μＭのロイペプチン（レーン２１）、１０μＭのＥ−６４（レーン２２）、５ｍＭのヨードアセトアミド（レーン２３）、５ｍＭのＮ−エチルマレイミド（レーン２４）、１μＭのＡｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯ（レーン２５）、１００ｎＭのＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ（レーン２６）又は１００ｎＭのＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＯＯＨ（レーン２７）を含んでいた。別の対照は、阻害剤を反応混合物（新鮮な５０×ストックとして調製した）に導入するために用いた溶媒を含んでいた。該溶媒は、水（レーン２８；試料３に使用）、メタノール（レーン２９；試料７、８、１１、１４に使用）、エタノール（レーン３０；試料６、１０に使用）及びジメチルスルホキシド（レーン３１；試料２０、２５〜２７に使用）であった。その他の試料用のストックはインキュベーション緩衝液中で調製した。（ｂ）テトラペプチドアルデヒドＡｃ− ＹＶＡＤ−ＣＨＯは先に記載のように合成し⁴⁰、それと実質的に同じ手順でＡｃ −ＤＥＶＤ−ＣＨＯ（インセット）を合成した。図１ｂに記載のように［³⁵Ｓ］ＰＡＲＰ切断活性を測定した。アポトーシスを起こした骨肉腫細胞（７日目の集密後培養物）のシトソール画分由来のタンパク質１０μｇを含むインキュベーション混合物を、指示濃度のＡｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯ（黒四角）又はＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ（白丸）と共に３７℃で２０分間予備インキュベートしてから［³⁵Ｓ］ＰＡＲＰを加えた。３７℃で６０分間インキュベートした後、１０％ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル上で試料を分離した。得られた乾燥ゲルのフルオログラフィーにより切断産物を視覚化し、２４ｋＤａの切断産物に対応するバンドをレーザーデンシトメトリーで定量した。データは、阻害剤を加えなかった対照の百分率として表し、２回の別個の実験の平均値である。図３はＴＨＰ−１細胞由来のＰＡＲＰ切断プロテアーゼの精製を示している。（ａ）ＤＥＡＥアニオン交換クロマトグラフィー。（ｂ）ビオチニル化テトラペプチド−アルデヒド親和性リガンドの構造。（ｃ）ＴＨＰ−１細胞のシトソール画分（レーン１）、アフィニティークロマトグラフィー前のＤＥＡＥピータ活性画分（画分１１４）（レーン２）及びアフィニティークロマトグラフィー後の該画分（レーン３）、ビオチン−ＤＥＶＤ−ＣＨＯアフィニティーカラムからの溶離液（レーン５）及びビオチン−［Ｘ］−ＤＥＶＤ−ＣＨＯアフィニティーカラムからの溶離液（レーン６）のＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル電気泳動。方法（ａ）先に記載のように⁴¹、培養したＴＨＰ−１細胞からシトソール画分を分離し、透析、濃縮し、次いで、２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１０％（ｗ／ｖ）のスクロース、０．１％（ｗ／ｖ）のＣＨＡＰＳ、２ｍＭのジチオトレイトール中４℃で予備平衡させておいたＤＥＡＥ−５ＰＷＨＰＬＣカラム（ＴｏｓｏＨａａｓ，５．５×２０ｃｍ；１．４×１０¹¹細胞由来のタンパク質３〜５ｇｍ）に加えた。タンパク質を、線形勾配の０．４ＭのＮａＣｌ、２４０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１０％（ｗ／ｖ）のスクロース、０．１％（ｗ／ｖ）のＣＨＡＰＳ、２ｍＭのジチオトレイトールで溶離した。ＩＣＥ活性を含む画分の直前の約９０〜１２０ｍＭのＮａＣｌに対応する画分をプールし、２５ＤＥＡＥクロマトグラフィー実施で得たプールと合わせ（３．５×１０¹²ＴＨＰ−１細胞由来のタンパク質１．６ｇ）、同一条件下に再実施した。図１ｂに示されているように各画分のＰＡＲＰ切断活性をアッセイし、図２ｂに記載のようにレーザーデンシトメトリーで定量した。あるいは、図５に詳細に記載されている合成蛍光性テトラペプチドアミノメチルクマリン（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ）を用いて活性を測定した。（ｂ）ビオチン−ＤＥＶＤ−ＣＨＯとビオチン−［Ｘ］−ＤＥＶＤ−ＣＨＯとは、０．９ｎｍのスペーサーアーム（白四角で示されている）がビオチン−［Ｘ］−ＤＥＶＤ−ＣＨＯには存在するがピオチン−ＤＥＶＤ−ＣＨＯには存在しないという点で異なっている。これらのリガンドは、（ｉ）アルデヒドでベンジル化ラクトールとして保護されたｔ−Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｎ）−Ｇｌｕ（ＯＢｎ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＣＨＯの合成、（ii）ｔ−Ｂｏｃ基の除去、（iii）ＥＤＣＩ及びＨＯＢｔを用いたビオチン（ビオチン−ＤＥＶＤ−ＣＨＯの場合）又はビオチンアミドカプロン酸（ビオチン−［Ｘ］−ＤＥＶＤ−ＣＨＯの場合）による遊離アミンのアシル化によって調製した。後続段階でストレプトアビジン−アガロース（インセットに示されている）上で固定化し得るビオチニル化親和性リガンドを用いるこの方法を選択した理由は、（ｉ）スペーサーアームの長さが容易に変えられ、（ii）アガロースビーズ上のリガンドの濃度を正確に制御することができ、且つ（iii）ビオチニル化リガンドを酵素と共に予備インキュベートして完全平衡を得た後でストレプトアビジンアガロースとの複合体を回収することができるからであり、この種のリガンドがＰＡＲＰ切断酵素を加えると時間依存性平衡に達する（ｋ_on＞１０⁵Ｍ^-1ｓ^-1）という特定の利点のためである。（ｃ）ＤＥＡＥクロマトグラフィーから得たＰＡＲＰ切断活性のピークに対応する画分（画分１１４；タンパク質３ｍｇを含む２．５ｍｌ）を、５０ｍＭのＰＩＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ６．８）、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％（ｗ／ｖ）のＣＨＡＰＳ、５ｍＭのジチオトレイトールからなる総量１０ｍｌ中２０ｎｍｏｌのビオチン−［Ｘ］−ＤＥＶＤ−ＣＨＯと共に室温で３０分間インキュベートした。次いで、混合物をストレプトアビジンアガロースカラム〔ベッド容量１ｍｌ；５０ｍＭのＰＩＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ６．８）、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％（ｗ／ｖ）のＣＨＡＰＳ、５ｍＭのジチオトレイトール中で予備平衡化；結合能＝６３ｎｍｏｌビオチン／ｍｌ〕に通し、２０カラム容量の同じ緩衝液で洗浄した。カラムを同一緩衝液中で２ｍＭのＤ−ビオチンと共に灌流させて酵素を溶離し、数時間放置してから、精製されたＰＡＲＰ切断酵素を回収した。ビオチン−ＤＥＶＤ−ＣＨＯを用いて同一アフィニティークロマトグラフィーを行い、同等の結果を得た。試料を１４％ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル上で分離し、タンパク質バンドを銀染色して視覚化した。試料は、ＴＨＰ−１細胞のシトソール画分由来のタンパク質９μｇ（レーン１）、ビオチン−［Ｘ］−ＤＥＶＤ−ＣＨＯアフィニティークロマトグラフィー前のＤＥＡＥ画分１１４（レーン２）及び該クロマトグラフィーの後の該画分（レーン３）由来のタンパク質６μｇ、並びにビオチン−ＤＥＶＤ−ＣＨＯアフィニティーカラムの溶離液（レーン５）及びビオチン−［Ｘ］−ＤＥＶＤ−ＣＨＯアフィニティーカラムの溶離液（レーン６）由来のタンパク質０．１μｇを含んでいた。図４は、ＰＡＲＰ切断プロテアーゼ；不活性プロ酵素ＣＰＰ３２からプロセシングされるアポパインの構造を示している。（ａ、ｂ）精製ＰＡＲＰ切断プロテアーゼの１７ｋＤａサブユニット（左）と１２ｋＤａのサブユニット（右）のエレクトロスプレー質量分光分析。括弧内の数字は（ｃ）に記載の配列に基づいて計算されたサブユニットの質量を示す。（ｃ）アポパイン／ＣＰＰ３２の初期構造。ＣＰＰ３２β ｃＤＮＡクローンから推定されたアミノ酸配列²⁵を示している。斜線部は精製酵素サブユニットについて決定されたアミノ末端配列を示している。矢印は、ＣＰＰ３２プロ酵素からｐ１７及びｐ１２サブユニットを生成したＡｓｐ²⁸−Ｓｅｒ²⁹及びＡｓｐ¹⁷⁵−Ｓｅｒ¹⁷⁶切断部位を示している。推定触媒システイン（星印）を含む保存されたＧｌｎ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙペンタペプチドもボックスで囲まれている。（ｄ）ＩＣＥ及びＣＰＰ３２プロ酵素構造の比較。横バーは、それぞれＩＣＥ及びＣＰＰ３２のＰ４５及びｐ３２プロ酵素を表す。推定触媒システイン残基を含む大きい方のサブユニットと、小さい方のサブユニットはそれぞれ横バーの黒く塗りつぶされた部分と斜線の部分で示されている。（ｅ）システインプロテアーゼのＩＣＥ／ＣＥＤ−３ファミリーの全ての既知メンバーの系統関係。（ｆ）全ての既知ヒトＩＣＥ／ＣＥＤ−３様プロテアーゼ（上から５つの配列）及びネマトーダＣＥＤ−３（一番下の配列）の多重配列の整列。番号はヒトＩＣＥ内の残基の位置に対応する。Ｘ線結晶構造^33,34に基づく、ヒトＩＣＥに結合する基質に包含される領域が示されている。黒丸は触媒領域、白丸はＰ₁Ａｓｐのカルボキシレート結合ポケット、白三角はＰ₂−Ｐ₄残基に対する近接度（＜０．４ｎｍ）である。矢印はＩＣＥ及びＣＰＰ３２の既知プロ酵素切断部位を示している。方法（ａ、ｂ）図３ｃに記載の精製ＰＡＲＰ切断酵素のアリコートを内径の狭いＣ４逆相ＨＰＬＣカラム上で分離し、実質的に先に記載の方法⁷で、エレクトロスプレーイオン源を備えた３重セクター四重極質量分析計に接続したキャピラリー液体クロマトグラフィーにより個々のサブユニットを分析した。トリプシンペプチドも精製アポパインサブユニットからも産生され⁴⁰、同定をさらに確実にするためにエレクトロスプレー質量分光法により分析した。ペプチドとそれらの予測及び実測質量は以下の通りであった：ＩＰＶＥＡＤＦＬＹＡＹＳＴＡＰＧＹＹＳＷＲ²⁰⁷、２４７０.８、２４７０.２；ＶＡＴＥＦＥＳＦＳＦＤＡＴＦＨＡＫ²⁵⁹、１９３５.１、１９３４.７；ＬＥＦＭＨＩＬＴＲ²³⁸、１１６０.４、１１６１.０；ＥＬＹＦＹＨ²⁷⁷、８７２.０、８７２.０。（ｃ）図３ｃに記載の精製ＰＡＲＰ切断酵素約１００ｐｍｏｌを１４％ＳＤＳ／ポリアクリルアミド上で分離し、エレクトロブロッティングによりポリビニリデンジフルオリド膜に移した。膜のｐ１７サブユニットを含む領域とｐ１２サブユニットを含む領域を切り出し、連続フローリアクター（ＳｈｅｌｄｏｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｅｎｔｒｅ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）を用い、慣用のエドマン分解により配列決定した。横バーの斜線部は、得られたアミノ末端配列がＣＰＰ３２βの推定アミノ酸配列と完全に一致する部分を表す。（ｄ）及び（ｅ）ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ（ＭａｄｉｓｏｎＷＩ）ＰＩＬＥＵＰアルゴリズム⁴²（ギャップ重量＝３．０；ギャップ長重量＝０．１）を用いて指示されたｃＤＮＡの推定ポリペプチド配列（全読み取り枠）即ち遺伝子配列を整列させ、系統樹（ｅ）又はアミノ酸配列の整列（ｆ）として提示する。ｈＩＣＥ_rel−II及びｈＩＣＥ_rel−IIIはそれぞれヒトＩＣＥ関連システインプロテアーゼII及びIIIであり；ｍＩＣＥ、ｒＩＣＥ及びｈＩＣＥはそれぞれ、マウス、ラット及びヒトのＩＣＥ（インターロイキン−１β変換酵素）であり；ｍＮｅｄｄ２及びｈＩＣＨ−１はそれぞれ、Ｎｅｄｄ２／ＩＣＨ−１_Lのマウス及びヒト形態であり；ｃｂＣＥＤ−３、ｃｖＣＥＤ −３及びｃｅＣＥＤ−３はそれぞれ、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓｂｒｉｇｇｓａｅ、ｖｕｌｇａｒｉｓ及びｅｌｅｇａｎｓのＣＥＤ−３（細胞−死−異常ｃｅｄ−３遺伝子産物）であり；ｈＣＰＰ３２はヒトＣＰＰ３２βである。図５は蛍光性基質を用いたアポパイン及び有効な阻害剤の動力学的分析を示す。（ａ）Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ（インセット中の構造）のＫ_mの決定。（ｂ）ペプチドアルデヒドＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯによるＣＰＰ３２阻害の動力学。（ｃ）ＴＨＰ−１細胞、骨肉腫細胞及びニワトリＳ／Ｍ抽出物におけるＰＡＲＰ切断活性及びＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯによる阻害の比較。方法（ａ）Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ（インセット）（ＡＭＣ；アミノ−４−メチルクマリン）を以下のように調製した：（ｉ）Ｎ−Ａｃ−Ａｓｐ（ＯＢｎ）−Ｇｌｕ（ＯＢｎ）−Ｖａｌ−ＣＯ₂ Ｈの合成；（ii）Ａｓｐ（ＯＢｎ）−７−アミノ−４−メチルクマリンとの結合；（iii）ベンジル基の除去。１００ｍＭのＨｅｐｅｓ／ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１０％（ｗ／ｖ）のスクロース、０．１％（ｗ／ｖ）のＣＨＡＰＳ、１０ｍＭのジチオトレイトール中の指示濃度のＡｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ及び３５Ｕの精製ＰＡＲＰ切断アポパイン／ＣＰＰ３２酵素（１Ｕ＝２５℃、飽和基質濃度で１分間に遊離したＡＭＣ１ｐｍｏｌ）を含む標準反応混合物（最終容量：３００μｌ）を２５℃でインキュベートした。励起波長３８０ｎｍ、発光波長４６０ｎｍの分光ケイ光光度計で反応を連続的にモニターした。初速度及び基質濃度を非線形回帰によりミカエリス−メンテンの式（実線）に当てはめた。数回の実験の結果、アポパインによる該基質の切断のＫ_mは、９．７±１．０μＭであることが示された。（ｂ）図２ｂに示されているように、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯを調製した。反応体（３００μｌ）は、（ａ）に記載の緩衝液中の１×Ｋ_mのＡｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ（１０μＭ）及び精製ＰＡＲＰ切断アポパイン酵素（１２０Ｕ）を含んでいた。この反応混合物にテトラペプチドアルデヒド（５０ｎＭ）を加えると、酵素活性の時間依存性損失が生じた（黒丸）が、阻害剤を含まない反応体は完全に線形であった（白丸）。遅結合性阻害剤及び密着結合性阻害剤を分析するためにＭｏｒｉｉｓｏｎによって開発された式⁴³に従って、いくつかの結合進行（progress）曲線から結合速度定数（ｋ_on）を計算した。活性の完全阻害は５０ｎＭのＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯにより無限時間で観察されたが、これは、この阻害剤のＫ_iが１ｎＭ未満であることを示している。（ｃ）図１ｂに記載のように、ＴＨＰ−１細胞、アポトーシスを起こした骨肉腫細胞及びアポトーシスを起こしたニワトリＤＵ２４９細胞から抽出物を調製した。合成蛍光性テトラペプチドＡｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣの切断のＫ_m 並びにテトラペプチドアルデヒド阻害剤Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯのｋ_on及びＫ_i値をそれぞれ上記（ａ）及び（ｂ）に記載の方法で測定した。図６は、ｉｎｖｉｔｒｏアポトーシス及びＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ又はアポパイン仲介ＰＡＲＰ切断活性の除去による選択的阻害を示している。（ａ）アポトーシスが進行している骨肉腫細胞のシトソールはアポトーシスを起こしていない健康な細胞の核にアポトーシス性変化を起こさせる。アポトーシスによる細胞死の種々の段階の骨肉腫細胞から分離したシトソール画分をアポトーシスを起こしていない骨肉腫細胞から分離した核と共にインキュベートし、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した後、蛍光顕微鏡により形態学的な変化を評価した。（ｂ）アポパインの阻害又は除去によるｉｎｖｉｔｒｏアポトーシスの減弱化（attenuation）。縦列（column）２〜９：種々の濃度のＣＰＰ３２阻害剤Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ（縦列３〜８）又はＩＣＥ阻害剤Ａｃ−ＹＶＡＤ− ＣＨＯ（縦列９）の存在下に、アポトーシスを起こした骨肉腫細胞のシトソール画分をアポトーシスを起こしていない健康な骨肉腫細胞の核と合わせた。縦列１０〜１５：活性化されるとアポトーシスを起こす骨肉腫細胞のシトソールからＰＡＲＰ切断活性を除去し（縦列１１〜１５）、次いで、種々の量の精製アポパイン（縦列１２〜１４）又は精製ＩＣＥ（縦列１５）の存在下にアポトーシスを起こしていない健康な骨肉腫細胞の核と共にインキュベートした。方法図１に記載のように、アポトーシスの種々の段階における骨肉腫細胞及び該細胞のシトソール抽出物を調製した。実質的に先に記載のように³⁶（但し、核を分離するための緩衝液は、１０ｍＭのＰｉｐｅｓ／ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ₂ 、１ｍＭのジチオトレイトール、１０μＭのサイトカラシンＢ、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド、１０μｇ／ｍｌのペプスタチンＡ、２０μｇ／ｍｌのロイペプチン、１０μｇ／ｍｌのアプロチニンであった）、アポトーシスを起こしていない（３日目の）細胞から核を分離した。（ａ）２×１０⁶個の３日目細胞から分離した核を、指示された時間培養した細胞からのシトソール画分（２．５×１０⁶細胞当量）２５μｌと合わせ、次いで、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ／ＫＯＨ（ｐＨ７．０）、５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．１ｍＭのＣａＣｌ₂、４０ｍＭのβ−グリセロホスフェート、１ｍＭのジチオトレイトール、２ｍＭのＡＴＰ、１０ｍＭのクレアチンホスフェート及び５０μｇ／ｍｌのクレアチンキナーゼを含む混合物１００μｌ（最終容量）中でインキュベートした。３７℃で２時間後、核クロマチンを５μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色し、蛍光顕微鏡（励起波長３３０ｎｍ；発光波長４５０ｎｍ）で調べた。鮮やかな蛍光の疑縮・断片化クロマチンを有する核をアポトーシスを起こしたものと同定し、蛍光が弱く、均一にクロマチン染色された核をアポトーシスを起こしていないものと同定した。各条件に関して、５つの別個のフィールドで最低２５０個の核を同定した。データは２回の別個の実験の平均値である。（ｂ）縦列１〜９：指示濃度のＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ（３〜８）又はＡｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯ（９）の存在下に、アポトーシスを起こした７日目の骨肉腫細胞のシトソール画分（２〜９）と合わせたアポトーシスを起こしていない３日目の骨肉腫細胞の分離した核を用いて、（ａ）に記載の方法でｉｎｖｉｔｒｏアポトーシスを測定した。データは３回の別個の実験の平均値±ＳＥＭである。縦列１０〜１５：アポトーシスを起こした７日目の細胞（Ｄ７_dep）のシトソール画分１ｍｌを１００ｎＭのビオチン−［Ｘ］−ＤＥＶＤ−ＣＨＯと共に２０分間インキュベートし、次いで５０μ ｌのストレプトアビジンアガロースを用いて回収し、該画分からＰＡＲＰ切断活性を除去した（ビオチン結合能＝６３ｎｍｏｌ／ｍｌ）。次いで、同じ画分について除去手順を繰り返した。種々の濃度の精製アポパイン／ＣＰＰ３２（１２〜１５）又は精製ＩＣＥ（１５）を加えた、処理していない７日目のシトソール（１０）又は切断活性を除去した７日目のシトソール（１１〜１５）と合わせた、アポトーシスを起こしていない３日目の骨肉腫細胞（１０〜１５）の核を用い、（ａ）に記載の方法で、ｉｎｖｉｔｒｏアポトーシスを測定した。低濃度のＩＣＥも作用しなかった（図示せず）。実施例１アポトーシスが進行している骨肉腫細胞におけるＰＡＲＰ切断活性アポトーシスの発生に付随して生起する初期事象は、ＩＣＥ（ｐｒＩＣＥ）と類似の特性を有する未同定プロテアーゼによるＰＡＲＰのタンパク質分解性切断である¹⁹。（Ａｓｐ²¹⁶とＧｌｙ²¹⁷の間の）切断により、ＰＡＲＰのアミノ末端ＤＮＡニックセンサーがそのカルボキシ末端触媒ドメインから分離する（図１ａ）。このタンパク質分解活性を測定するために、全長のヒトＰＡＲＰｃＤＮＡクローンのｉｎｖｉｔｒｏ転写／翻訳により［³⁵Ｓ］ＰＡＲＰを基質として生成させ、次いで、種々の細胞抽出物と合わせた（図１ｂ）。自発性アポトーシス死傾向を有するヒト骨肉腫細胞系は、アポトーシスを起こした細胞からの抽出物ではアポトーシスを起こしていない細胞からの抽出物に比べて（レーン２対レーン３）著しく高い実質的ＰＡＲＰ切断活性を有していた。骨肉腫細胞はアポトーシス発生中に生起する事象の研究における良好なモデル系である。骨肉腫細胞は、培養中に集密に達すると、細胞の収縮、膜の気胞形成（blebbing ）、クロマチンの凝縮及び断片化（図示せず）並びにヌクレオソーム間のＤＮＡの切断を含むアポトーシス死に特徴的な形態学的・生化学的変化を起こす（図１ｃ）。集密後の骨肉腫細胞培養物に発生するアポトーシスの進行に伴って、該細胞抽出物中で測定されたＰＡＲＰ切断活性が１０倍以上も上昇した（図１ｄ）。イムノブロッティング、逆転写酵素ＰＣＲ（図示せず）やｐｒｏＩＬ−１βのプロセシングの不在から判断すると、これらの抽出物中には検出可能なＩＣＥが存在せず、それは、ＩＣＥがアポトーシス又はＰＡＲＰ切断には必要とされないことを示している。ＩＣＥがアポトーシスに関与しないということは、正常にアポトーシスを起こしたＩＣＥ欠失マウスで確認された²⁹。ＰＡＲＰ切断活性は、ＴＨＰ−１細胞の細胞質抽出物、特に３７℃で予備インキュベートした後の、初期にＩＣＥが精製されたヒト単球白血病細胞系でも測定可能であった（図１ｂ、レーン４対レーン５）。これは、この細胞系のＩＣＥに関して記載されているように³⁰、ＰＡＲＰ切断酵素は潜伏形態の活性化を必要とすることを示唆している。アポトーシスを起こした骨肉腫細胞抽出物及び活性化ＴＨＰ−１細胞抽出物におけるＰＡＲＰの切断は、このタンパク質分解活性が初期に同定されたアポトーシスを起こしたニワトリＳ／Ｍ抽出物¹⁹（レーン６）のものと同等であった。実施例２ＰＡＲＰ切断阻害剤アポトーシスを起こした骨肉腫細胞のシトソール抽出物におけるＰＡＲＰのタンパク質分解性切断は、システイン−アルキル化試薬Ｎ−エチルマレイミド及びヨードアセトアミドによって阻止されたが、Ｅ−６４（これもシステインプロテアーゼ阻害剤である）又はセリンプロテアーゼ、アスパルテートプロテアーゼ若しくはメタロプロテアーゼによっては阻止されなかった（図２ａ）。この阻害剤プロフィールは、新生のＩＣＥ様システインプロテアーゼファミリーのメンバーであるＰＡＲＰ切断酵素と一致する。より有効且つ特異的なＰＡＲＰ切断阻害剤を開発するために、切断可能な結合に隣接する配列を阻害剤設計用のテンプレートとして用いた。テトラペプチドアルデヒドＡｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯに対するＩＣＥの感受性（Ｋ_i＝０．７６ｎＭ）によって示されるように、適切なペプチドアルデヒドはシステインプロテアーゼの有効な阻害剤であり得る。従って、ＰＡＲＰ切断部位（ＤＥＶＤ²¹⁶−Ｇ²¹⁷ ）のＰ₁−Ｐ₄アミノ酸配列を含むテトラペプチドアルデヒドを合成し、該アルデヒドがＰＡＲＰ切断の有効な阻害剤（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ；図２ｂインセット）であることを見出した。Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯは、アポトーシスを起こした骨肉腫細胞抽出物のＰＡＲＰ切断活性を０．２ｎＭのＩＣ₅₀値をもって阻害した。それに対し、対応カルボン酸（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＯＯＨ）及びＩＣＥのｐｒｏＩＬ−１β認識配列を含むテトラペプチドアルデヒド（Ａｃ−ＹＶＡＤ− ＣＨＯ）のＩＣ₅₀値は１０μＭ超であった（図２ａ及び図２ｂ）。活性化ＴＨＰ −１細胞抽出物でもアポトーシスを起こしたニワトリＳ／Ｍ抽出物でもＰＡＲＰ切断活性に関して同じ阻害剤プロフィールが見出された（図示せず）。ＩＣＥの有効な阻害剤（Ｋ_i＜４ｐＭ）である牛痘ウイルスセルピンＣｒｍＡ〔サイトカイン応答モディファイアーＡ（ｃｒｍＡ）遺伝子産物〕³¹は、０．６μＭまでのレベルでテストした場合、ＰＡＲＰ切断に対する阻害作用は有していなかった（図示せず）。従って、ＰＡＲＰの切断は、低濃度のテトラペプチドアルデヒドＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯによって阻害され得るが、有効なＩＣＥ阻害剤では高レベルでも阻害し得ないＥ−６４非感受性システインプロテアーゼによって仲介される。実施例３ＰＡＲＰ切断プロテアーゼ、アポパインの精製アポトーシスを起こしている哺乳動物細胞におけるＰＡＲＰの不活化に関与する酵素を同定するために、該酵素を培養したヒト細胞から精製して均質とした。集密に達してからアポトーシスに進行するにつれ、骨肉腫細胞のＰＡＲＰ切断活性は高度に増大した。しかし、該プロテアーゼを精製するのに十分な量の付着細胞系が得られないために、ＴＨＰ−１細胞を用いた。２つの証拠から、ＴＨＰ− １細胞でＰＡＲＰを切断したシステインプロテアーゼはアポトーシスを起こした骨肉腫細胞のものと同一であることが示唆された。第１の最も説得力のある証拠として、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯによる触媒及び阻害の動力学的パラメーターが両細胞系からの抽出物の酵素と実質的に同一であることが知見された（以下参照）。第２の証拠として、逆転写酵素ＰＣＲ分析により、（転写体がＴＨＰ−１細胞でのみ検出可能であった）ＩＣＥを除いて、ＴＨＰ−１細胞もアポトーシスを起こした骨肉腫細胞も、ＩＣＥ／ＣＥＤ−３様酵素の同じ相補体の転写体（即ち、ＩＣＥｒｅ１−II、ＩＣＨ−１及びＣＰＰ３２、但しＩＣＥｒｅ１−IIIは除く）を含んでいることが示された（図示せず）。ＤＥＡＥアニオン交換クロマトグラフィーによりＴＨＰ−１細胞からシトソール画分を分離すると、ＰＡＲＰ切断活性は、低塩濃度（ＩＣＥ及びＰＡＲＰ切断活性に関してそれぞれ約８０ｍＭ及び１３５ｍＭ）でカラムから同時溶離されたＩＣＥ免疫反応性及びｐｒｏＩＬ−１β切断活性から分離された。数回のクロマトグラフィーにより得られたＰＡＲＰ切断活性を含む画分をプールし、同一条件下に再度クロマトグラフィーにかけた（図３ａ）。この活性を選択的に精製するために、ＰＡＲＰ切断酵素用の親和性リガンドとしてＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯテトラペプチドアルデヒド阻害剤の２種のビオチニル化誘導体を合成した（図３ｂ）。何故ビオチニル化親和性リガンドを用いたかというと、それは、該リガンドが、回収前に完全平衡させることにより、遅リガンド結合性（以下参照）を克服するために酵素と共に予備インキュベートし得るからである。どちらのビオチニル化テトラペプチドアルデヒドもＰＡＲＰ切断酵素の阻害に関して、非ビオチニル化親化合物のものと同等のＩＣ₅₀値（０．２ｎＭ；図示せず）を有していた。ＰＡＲＰ切断活性のピーク時のＤＥＡＥクロマトグラフィー画分をビオチニル化テトラペプチドアルデヒドと共にインキュベートし、次いで、ストレプトアビジンアガロース上で回収した。十分に洗浄した後、２ｍＭのビオチンを用いてカラムから精製ＰＡＲＰ切断酵素を溶離した。得られた試料をＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけると、精製ＰＡＲＰ切断酵素が約１７ｋＤａと１２ｋＤａの２種の主要ポリペプチドからなることが示された（図３ｃ）。実施例４ＰＡＲＰ切断プロテアーゼ：アポパイン／ＣＰＰ３２の構造精製ＰＡＲＰ切断酵素をエレクトロスプレー質量分光分析にかけると、大きい方のポリペプチドの質量は１６，６１７．１±３．１であり、小さい方のポリペプチドの質量は１１，８９６．２±１．２であることが示された（図４ａ）。精製アポパイン酵素のアミノ末端配列決定及びトリプシンマップにより、該酵素が、最近Ｊｕｒｋａｔ細胞²⁵からクローン化された、機能が未解明のシステインプロテアーゼのＩＣＥ／ＣＥＤ−３ファミリーのメンバーである不活性ＣＰＰ３２プロ酵素のタンパク質分解産物であると同定された。クローン化ＣＰＰ３２は、もともと、単一の保存アミノ酸置換（ＣＰＰ３２α及びＣＰＰ３２βに関してそれぞれＡｓｐ¹⁹⁰対Ｇｌｕ¹⁹⁰）が異なる２種のアイソフォーム（ＣＰＰ３２α及びＣＰＰ３２β）として同定された。精製アポパインＰＡＲＰ切断酵素の１２ｋＤａサブユニットのアミノ末端配列は、胎盤、肺及び腎臓からクローン化されたヒトＣＰＰ３２のｃＤＮＡ配列（図示せず）と同じように、ＣＰＰ３２βと一致した（図４ｂ）。上記２つのサブユニットの質量測定及びアミノ末端配列は一致しており、両ポリペプチドがＡｓｐ²⁸−Ｓｅｒ²⁹ とＡｓｐ¹⁷⁵−Ｓｅｒ¹⁷⁶の間で切断された同じ３２ｋＤａのＣＰＰ３２前駆体ポリペプチドから誘導されたことが証明された（図４ｂ）。ＣＰＰ３２プロ酵素の構造はＩＣＥのものと類似している（図４ｃ）。ＩＣＥと同様、ＣＰＰ３２プロ酵素も、アミノ末端プロドメイン、その後の推定活性部位システイン及びヒスチジン残基を含む大きいサブユニット（ｐ１７）と、その後の小さいサブユニット（ｐ１２）から構成されている。ＩＣＥプロ酵素とＣＰＰ３２プロ酵素の主要な違いは、（ａ）ＣＰＰ３２のプロドメインの方が実質的に短く、（ｂ）ＣＰＰ３２プロ酵素にはアポパインの大きい（ｐ１７）サブユニットと小さい（ｐ１２）サブユニットを分離するリンカーペプチドが存在しないことである。ＣＰＰ３２のプロドメイン／ｐ１７結合部及びｐ１７／ｐ１２結合部の両方のＰ₁位置にＡｓｐ残基が存在するということは、ＩＣＥに関して示されているように^7,32,33 、プロ酵素の活性化に自触作用が重要な役割を果たすことを示唆している。システインプロテアーゼのＩＣＥ／ＣＥＤ−３ファミリーの全ての既知メンバーの配列を整列させると、アポパイン／ＣＰＰ３２がプロアポトーシス性線虫細胞−死−異常ｃｅｄ−３遺伝子産物に最も近縁の哺乳動物酵素であることが示される（図４ｄ）。このファミリーの５つの既知ヒト酵素及びＣＥＤ−３を整列させると、基質Ｐ₁アスパラギン酸のカルボキシレート側鎖の触媒作用に関与する残基及び該側鎖の結合に関与する残基の絶対保存^33,34が存在することが示される（図４ｅ）。保存は、ＩＣＥのｐ２０サブユニット（Ａｓｐ²⁹⁶−Ｓｅｒ²⁹⁷）及びＣＰＰ３２のｐ１７サブユニット（Ａｓｐ¹⁷⁵−Ｓｅｒ¹⁷⁶）のカルボキシ末端のＡｓｐ／Ｓｅｒ切断部位近傍でも高度であり、これは、このファミリーの他のメンバーの活性形態もプロ酵素から誘導されるヘテロダイマーであることを示唆している。しかし、Ｐ₂−Ｐ₄結合ポケットを形成し得る残基は広く保存されてはおらず、これは、基質特異性が１個以上のこれらアミノ酸により決定され得ることを示している。実施例５アポパイン及びその阻害剤の動力学的特性基質Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ（ＡＭＣ；アミノ−４−メチルクマリン）を用いてアポパインの連続蛍光分析アッセイを行った。この基質の設計は、ＰＡＲＰ切断部位Ｐ₁− Ｐ₄テトラペプチドを用いること以外は、ＩＣＥと共に用いて成功を治めたテトラペプチド−ＡＭＣモチーフ⁷をベースとした（図５Ａインセット）。アポパインでこの基質を切断することにより、ミカエリス−メンテン動力学がＫ_m＝９．７±１．０μＭであることが示された（図５ａ）。このアッセイにより、テトラペプチドアルデヒドＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯによる酵素阻害機構の詳細な研究が容易になった。ペプチドアルデヒドは、触媒システインの求核付加を受けてチオヘミアセタールを形成するシステインプロテアーゼの有効な可逆性阻害剤である。アルデヒド阻害剤の効力は、本来、該阻害剤が有するアミド結合加水分解における遷移状態を真似るその能力によるものであったが³⁵、最近、テトラペプチドアルデヒドＡｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯを用いて決定されたＩＣＥの結晶構造から、非遷移状態の構造中でチオヘミアセタールのオキシアニオンと結合したこの阻害剤が活性部位ヒスチジンにより安定化されていることが明らかに示される³³。アポパイン、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯに関する適切な認識配列を含むテトラペプチドアルデヒドはこの酵素の有効な拮抗的阻害剤である。該アルデヒドは、阻害剤（５０ｎＭ）及び１×Ｋ_mの基質を含む反応混合物に酵素を加えたときに認められた時間依存性平衡度により示されるように、遅結合性である（図５ｂ）。図５ｂの実線（黒丸）は、理論的結合速度定数ｋ_on＝１．３×１０⁵ Ｍ^-1ｓ^-1である。拡散律速反応速度の理論的予測値（１０⁸−１０¹⁰Ｍ^-1ｓ^- ¹ ）を大きく下回るこの速度定数は、対応する、ＩＣＥとそのテトラペプチドアルデヒド阻害剤との結合速度定数に類似している（ｋ_on Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯ＝３．８×１０⁵Ｍ^-1ｓ^-1）。５０ｎＭのＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯを用いて無限時間で認められた該活性のほぼ完全な抑制により、アポパイン阻害のＫ_iが１ｎＭ未満であることが明らかになり、それによって、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯはシステインプロテアーゼに関して知られている最も有効なペプチドアルデヒドの１つとなっている。テトラペプチドアルデヒドＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯがアポパインの有効な阻害剤であると認められたのとは対照的に、ＩＣＥ阻害剤Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯ（Ｋ_i ＩＣＥ＝０．７６ｎＭ）は極めて効力の低いアポパイン阻害剤であり、これらの酵素が別個の拡大された基質特異性を有することがさらに証明された。効力の差は、ＩＣＥの主要決定基であるｐｒｏＩＬ−１βのＰ₄ Ｔｙｒの結合に関与する残基がアポパイン／ＣＰＰ３２には保存されていないという事実に起因すると考えられる。例えば、活性ＩＣＥの結晶構造は、ｐｒｏＩＬ−１βのＰ₄ Ｔｙｒと相互作用する２つの主要アミノ酸がアポパイン／ＣＰＰ３２及びＣＥＤ−３のいずれにおいても、それぞれＡｓｎ及びＳｅｒで置換されたＨｉｓ³⁴²及びＰｒｏ³⁴³であることを示している（図４ｅ）。アポパイン／ＣＰＰ３２のこれら後者の残基はＰＡＲＰのＰ₄ Ａｓｐのカルボキシレート側鎖との相互作用に必要な水素結合をより完全に形成し得る。該酵素が異なる巨大分子基質特異性を有していることも明らかである。精製ＩＣＥはＰＡＲＰを切断し得なかったし、精製アポパインはＦＥＡＤ²⁷−Ｇ²⁸切断部位でもＤＥＶＤ²¹⁶−Ｇ²¹⁷切断部位でもｐｒｏＩＬ−１βを切断しなかった（５，０００倍過剰の各酵素をテスト；図示せず）。該酵素は、ＩＣＥに対して１０，０００倍以上もの親和性を示す牛痘セルピン（ＣｒｍＡ）に関する挙動とも異なっている。ＴＨＰ−１細胞、アポトーシスを起こした骨肉腫細胞抽出物及びアポトーシスを起こしたニワトリＳ／Ｍ抽出物におけるＰＡＲＰ切断活性の触媒及び阻害定数は実質的に同じであり（図５ｃ）、これは、３種の細胞全てにおいて同じ酵素（アポパイン）がＰＡＲＰを切断することを示唆している。実施例６アポパイン仲介ＰＡＲＰ切断阻害剤によるアポトーシスの減弱化アポトーシス事象はｉｎｖｉｔｒｏで再構成し得る。健康な細胞から分離した核は、アポトーシスを起こした細胞から分離されたシトソール画分と共にインキュベートすると、アポトーシスに特徴的な形態学的変化（例えば、クロマチンの凝縮、断片化及び周縁化（marignation）並びにヌクレオソーム間のＤＮＡの切断）を起こす³⁶。最も有効且つ選択的なアポパイン仲介ＰＡＲＰ切断阻害剤（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ）は膜不浸透性であり、従って無傷の細胞においては不活性なので、この系をヒト細胞を用いて作製し、ｉｎｖｉｔｒｏでアポトーシスに及ぼすアポパインの阻害又は除去作用の実験に用いた。アポトーシスを起こしていない骨肉腫細胞のシトソールは核の形態には殆ど作用を及ぼさなかったが、アポトーシスが進行している細胞のシトソールは受容体核にアポトーシス様変化を誘発させた（図６ａ）。さもなければ健康な核に付与されたアポトーシス形態への変化の程度は、シトソールを抽出した細胞で起こっているアポトーシスの進行度（図１ｃ参照）及びＰＡＲＰ切断活性のレベル（図１ｄ）と一致した。ＰＡＲＰを切断するアポパインシステインプロテアーゼがアポトーシスにおいて重要な役割を果たすとすれば、その活性を阻害又は除去するとこれらの核変化は起こらない筈である。アポトーシスを起こした骨肉腫細胞のシトソール画分をアポトーシスを起こしていない健康な細胞の核と共にインキュベートしたときに生じた形態学的変化は、アポパイン仲介ＰＡＲＰ切断のテトラペプチドアルデヒド阻害剤、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ（ＩＣ₅₀＝１０〜１００ｎＭ）により減弱化させることができるが、ＩＣＥ阻害剤、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＣＨＯでは減弱化し得なかった（図６ｂ；縦列２〜９）。同様に、ビオチニル化親和性リガンドを用いて、アポトーシスを起こした骨肉腫細胞のシトソール画分からアポパイン／ＣＰＰ３２を除去すると、これらのＰＡＲＰ切断活性欠失抽出物はおおむね、健康な受容体核にアポトーシス性変化を起こさせることができなかった。活性を除去された抽出物のプロアポトーシス能は、該抽出物に精製アポパイン／ＣＰＰ３２を加えると回復したが、精製ＩＣＥを加えても回復しなかった（縦列１０〜１５）。また、これら全てを総合すると、アポパインがアポトーシスにおいて主要な事象を開始させ、その活性を阻害又は除去するとアポトーシスの発生が阻止されることが示唆される。実施例７ｉｎｖｉｔｒｏ転写／翻訳及び宿主細胞へのトランスフエクションによるアポパインポリペプチドの発現アポパインをコードするＤＮＡ配列を含むベクターを用いて、ウサギ網状赤血球溶解物、哺乳動物宿主細胞及びバキュロウイルス感染昆虫細胞でアポパインポリペプチドの翻訳を推進させた。実験手順は主として製造業者の指示に従った。（ａ）ｉｎｖｉｔｒｏ転写／翻訳ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ＋アポパインプラスミドＤＮＡ（アポパインはＴ７配向）をアポパイン挿入物の下流でＢａｍＨＩ消化により線状化する。線状化プラスミドを精製し、ｍ７Ｇ（５′）ｐｐｐ（５′）Ｇの存在下にＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いたランオフ転写用のテンプレートとして用いた。得られたキャップ付きアポパイン転写体を塩化リチウム沈殿により精製し、Ｌ−［³⁵Ｓ］メチオニンの存在下ヌクレアーゼで予備処理したウサギ網状赤血球溶解物中でのアポパインの翻訳の推進に用いる。（ｂ）哺乳動物細胞における発現アポパインタンパク質を哺乳動物宿主細胞で発現させ、次いで、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ：アポパイン（ＣＭＶプロモーターの制御下）又はｐＳＺ９０１６− １：アポパイン（ＨＩＶＬＴＲプロモーターの制御下）を用いてトランスフェクトする。後者（ｐＳＺ９０１６−１：アポパイン）の場合、細胞をＴＡＴ発現プラスミドｐＳＺ９０１６１：ＴＡＴと同時にトランスフェクトする。どちらのアポパイン発現プラスミドの場合も、ＣＯＳ−７細胞を、ＤＥＡＥ−デキストランを用いてトランスフェクトするか又はリポフェクタミン（ＢＲＬ）を用いてリポフェクトする。（ｃ）昆虫細胞における発現アポパイン含有バキュロウイルストランスファーベクターｐＶＬ１３９３：Ｔ７アポパインＨＡを用いてｉｎｖｉｔｒｏ相同組換えにより組換えバキュロウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）を産生させる。次いで、エピトープ標識したアポパインを、懸濁培養中で増殖させたＳｆ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）昆虫細胞中で発現させた後、アポパイン含有組換えバキュロウイルスに感染させる。実施例８他の宿主細胞系中でアポパインポリペプチドを発現させるためのアポパインのクローニング（ａ）アポパインｃＤＮＡの細菌発現ベクターへのクローニング最適なアポパインｃＤＮＡ配列を異種タンパク質の発現を誘導するように設計した発現ベクターに挿入して、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌中で組換えアポパインを産生させる。これらのベクターは、組換えアポパインが単独で合成されるか又はその後の操作用の融合タンパク質として合成されるように構築する。組換えアポパインが可溶性タンパク質又は不溶性内包体として回収されるように発現を制御し得る。ｐＢＲ３２２、ｐＳＫＦ、ｐＵＲ、ｐＡＴＨ、ｐＧＥＸ、ｐＴ７−５、ｐＴ７−６、ｐＴ７−７、ｐＥＴ、ｐＩＢＩ（ＩＢＩ）、ｐＳＰ６／Ｔ７−１９（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII（Ｓｔａｒｔａｇｅｎｅ）、ｐＴＺ１８Ｒ、ｐＴＺ１９Ｒ（ＵＳＢ）、ｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などのようなベクターはこらの目的に適している。（ｂ）アポパインｃＤＮＡの酵母発現ベクターへのクローニング最適なアポパインｃＤＮＡシストロンを異種タンパク質の細胞内又は細胞外発現を誘発するように設計した発現ベクターに挿入して、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵母中で組換えアポパインを産生させる。細胞内で発現させる場合、ＥｍＢＬｙｅｘ４などのようなベクターをアポパインシストロンに連結する〔Ｒｉｎａｓ，Ｕ．ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：５４３−５４５（１９９０）；ＨｏｒｏｗｉｔｚＢ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：４１８９−４１９２（１９８９）〕。細胞外で発現させる場合、分泌シグナル（酵母又は哺乳動物ペプチド）とアポパインタンパク質のアミノ末端を融合させる酵母発現ベクターにアポパインシストロンを連結する〔Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｍ．Ａ．，Ｇｅｎｅ８５：５１１−５１６（１９８９）；ＲｉｅｔｔＬ．及びＢｅｌｌｏｎＮ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８：２９４１−２９４９（１９８９）〕。（ｃ）アポパインｃＤＮＡのウイルス発現ベクターへのクローニングアポパインｃＤＮＡ配列を含むワクシニアウイルスに感染させた後、ＨｅＬａＳ３細胞のような哺乳動物宿主細胞中で組換えアポパインを産生させる。アポパイン：ワクシニアウイルスを産生させるために、先ず、アポパインｃＤＮＡを、ｐＳＣ１１、ｐＴＫｇｐｔＦ１ｓ、ｐＭＪ６０１のようなトランスファーベクター又は他の適当なベクターに連結し、次いで、同種組換えによりワクシニアウイルスにトランスファーする。プラークを精製し、ウイルスを増幅させた後、アポパイン：ワクシニアウイルスを用いて、哺乳動物宿主細胞に感染させて、組換えアポパインタンパク質を産生させる。実施例９アポパインポリペプチドを産生させる方法組換えアポパインは、（ａ）アポパインタンパク質をコードするＤＮＡで宿主細胞を形質転換して組換え宿主細胞を産生させるステップ；（ｂ）アポパインを産生させる条件下に組換え宿主細胞を培養するステップ；及び（ｃ）アポパインを回収するステップに従って産生させる。組換えアポパインを精製し、標準法に従って特性決定する。実施例１０アポパイン活性を調節する化合物は、種々の方法で検出し得る。アポパインに影響を与える化合物を同定する方法は：（ａ）テスト化合物とアポパインを含む溶液とを混合して混合物を形成するステップ；（ｂ）混合物のアポパイン活性を測定するステップ；及び（ｃ）混合物のアポパイン活性を標準と比較するステップを含む。アポパイン活性を調節する化合物は医薬組成物中に配合し得る。そのような医薬組成物は、アポパイン活性が変化していることを特徴とする疾患又は症状の治療に有用であり得る。アポパイン活性が増大している疾患の例には、免疫不全症候群、病原性感染症、心血管及び神経の損傷、脱毛症、老化、パーキンソン病並びにアルツハイマー病が含まれる。これらの疾患の治療には、アポパイン活性を低下させる化合物を用いた治療が含まれる。アポパイン活性が低下している疾患の例としては、自己免疫疾患、白血病、リンパ腫及び他のガンが挙げられる。これらの疾患の治療には、アポパイン活性を高める化合物を用いた治療が含まれる。実施例１１Ｎ−アセチル−アスパルチル−グルタミル−バリニル−アスパラギン酸ステップ１Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−アスパラギン酸ジベンジルエステル０℃に冷却した、２４ｍｌのＣＨＣｌ₃及び２ｍｌのＤＭＦ中のＮ−ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−アスパラギン酸ベンジルエステル（４．００ｇ，１２．３ｍｍｏｌ）、ベンジルアルコール（１．４６ｇ，１３．５ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（２．１６ｇ，１６．０ｍｍｏｌ）の混合物に、ＥＤＣＩ（３．５４ｇ，１８．４ｍｍｏｌ）を加えた。５℃で３時間半攪拌した後、混合物をＨ₂Ｏ（２５ｍｌ）中に注ぎ、有機相を分離し、Ｈ₂Ｏ（１０ｍｌ）で１回洗浄、Ｎａ₂ＳＯ₄で脱水し、溶媒を除去した。シリカゲル（ヘキサン中１０％ＥｔＯＡｃで溶離）上のクロマトグラフィーにかけ、２．１０ｇ（４１％）の標記化合物を得た。¹ ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，４００ＭＨｚ）δ１．４１（ｓ，９Ｈ），２．９５（ＡＢ，２Ｈ），４．６２（ｍ，１Ｈ），５．０５（ｓ，２Ｈ），５．１１（ｓ，２Ｈ），５．４９（ｄ，１Ｈ），７．３２（ｍ，１０Ｈ）。ステップ２Ｌ−アスパラギン酸ジベンジルエステル２．７ｍｌのＣＨＣｌ₃及び０．３ｍｌのＭｅＯＨ中のＨＢｒ飽和溶液に−７８℃で１．５ｍｌのＣＨＣｌ₃中の実施例１１、ステップ１のＮ−ｔ−Ｂｏｃ（０．３００ｇ，０．７２ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を−２０℃にし、１５分間放置してから飽和ＮａＨＣＯ₃中に注いだ。有機相を分離した。水性相をＣＨ₂Ｃｌ₂ （１０ｍｌ）で抽出し、有機相を合わせ、Ｎａ₂ＳＯ₄で脱水した。溶媒を除去して、粗標記化合物０．２１２ｇ（９３％）を得た。¹ ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，４００ＭＨｚ）δ２．７−３．０（ｍ，４Ｈ），３．９５（ｄｄ，１Ｈ），５．０５（ｓ，２Ｈ），５．１０（ｓ，２Ｈ），７．３（ｓ，１０Ｈ）。ステップ３Ｎ−Ａｃ−Ａｓｐ−（Ｂｚ）−Ｇｌｕ（Ｂｚ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ジ−ｂｚ）０．５ｍｌのＣＨＣｌ₃中の実施例１１、ステップ２のアミン（０．０４３ｇ，０．１３ｍｍｏｌ）、実施例１２のステップ６の酸（０．０７４ｇ，０．１２ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（０．０２１ｇ，０．１５ｍｍｏｌ）の混合物にＥＤＣＩ（０．０３４ｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を加えた。実施例１１のステップ１と同様な処理をし、シリカゲル（ＣＨＣｌ₃中５％ＭｅＯＨで溶離）上のクロマトグラフィーにかけ、標記化合物０．１０５ｇ（９４％）を得た。¹ ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，４００ＭＨｚ）δ０．８５（ｄｄ，６Ｈ），１．９８（ｓ，３Ｈ），２．０−２．２（ｍ，３Ｈ），２．４−２．５（ｍ，２Ｈ），２．７−２．９（ｍ，２Ｈ），３．０−３．１（ｍ，２Ｈ），４．２３（ｄｄ，１Ｈ），４．３３（ｍ，１Ｈ），４．７５（ｍ，１Ｈ），４．８５（ｍ，１Ｈ），５．０−５．１（ｍ，８Ｈ），６．６２（ｄ，１Ｈ），６．８６（ｍ，２Ｈ），７．３０（ｍ，２０Ｈ），７．４７（ｄ，１Ｈ）。ステップ４Ｎ−Ａｃ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ１．５ｍｌのＨＯＡｃ及び０．５ｍｌのＭｅＯＨ中の実施例１１、ステップ３の保護テトラペプチド（２４ｍｇ）と２０ｍｇのＰｄ−Ｃ（５％）をＨ₂で２時間処理した。混合物を濾過し、溶媒を除去した。粗生成物をＨ₂Ｏに溶解、凍結乾燥して、標記化合物１３ｍｇ（９３％）を得た。¹ ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆−ＣＤＣｌ₃，４００ＭＨｚ）δ０．８２（ｄｄ，６Ｈ），１．７７（ｍ，１Ｈ），１．８５（ｓ，３Ｈ），２．０（ｍ，２Ｈ），２．２（ｍ，２Ｈ），２．５−２．７（ｍ，４Ｈ），４．１５（ｄｄ，１Ｈ），４．３９（ｍ，１Ｈ），４．５２（ｍ，２Ｈ），７．５７（ｄ，１Ｈ），７．８８（ｍ，２Ｈ），８．０５（ｄ，１Ｈ）。Ｃ₂₀Ｈ₃₁Ｎ₄Ｏ₁₂のＦＡＢＨＲＭＳ：計算値＝５１９．１９３８５；実測値＝５１９．１９３８３。実施例１２ステップ１Ｎ−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｌ− バリンアリルエステル１５ｍｌのＣＨＣｌ₃中のＮ−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｌ−バリン（１０．５３ｇ，４８．５ｍｍｏｌ）及びアリルアルコール（３３ｍｌ，４９ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃で、ＨＯＢｔ（８．５３ｇ，６３．１ｍｍｏｌ）次いでＥＤＣＩ（１３．８８ｇ，７２．４ｍｍｏｌ）を加えた。最終混合物を４℃で１２時間攪拌し、次いで１００ｍｌのＮＨ₄ＯＡｃ（２５％）中に注いだ。有機相を分離し、水性相を５０ｍｌのＣＨＣｌ₃で洗浄した。有機相を合わせ、Ｎａ₂ＳＯ₄で脱水、濃縮し、シリカゲル（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ９：１）上のフラッシュクロマトグラフィーにかけ、標記化合物５．１０ｇ（４１％）を得た。¹ ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，４００ＭＨｚ）δ５．８９（ｍ，１Ｈ），５．３１（ｄ，１Ｈ），５．２２（ｄ，１Ｈ），４．９９（ｄ，ＮＨ）．４．６０（ｍ，２Ｈ），４．２２（ｍ，１Ｈ），２．１３（ｍ，１Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ），０．９６（ｄ，３Ｈ），０．８７（ｄ，３Ｈ）。ステップ２Ｌ−バリンアリルエステル −２０℃でＨＢｒガスで飽和した１００ｍｌのＣＨＣｌ₃／１０％ＭｅＯＨ溶液を−７８℃に冷却した。この溶液に、１０ｍｌのＣＨＣｌ₃に溶解したＮ−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｌ−バリンアリルエステル（５．１０ｇ，１９．８ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を−２０℃に加温し、１５分間攪拌し、次いで、氷冷飽和ＮａＨＣＯ₃（３００ｍｌ）中に注いだ。有機相を分離し、水性相を５０ｍｌのＣＨＣｌ₃で洗浄した。有機相を合わせ、Ｎａ₂ＳＯ₄で脱水、濃縮して、標記化合物３．１０ｇ（９９％）を得、これをさらに精製せずに次のステップに用いた。¹ ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ５．９１−５．８７（ｍ，１Ｈ），５．３２（ｄｑ，１Ｈ），５．２２（ｄｑ，１Ｈ），４．６１−４．６８（ｍ，２Ｈ），３．３０（ｄ，１Ｈ），２．０２（ｍ，１Ｈ），０．９６（ｄ，３Ｈ），０．８８（ｄ，３Ｈ）。ステップ３Ｎ−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｌ− グルタミル−ｇ−ベンジルエステル−Ｌ−バリンアリルエステル６０ｍｌのＣＨＣｌ₃中のＮ−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｌ−グルタミル−ｇ−ベンジルエステル（８．０２ｇ，２３．８ｍｍｏｌ）及びＬ−バリンアリルエステル（３．１０ｇ，１９．７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＨＯＢｔ（４．１７ｇ，３０．９ｍｍｏｌ）次いでＥＤＣＩ（６．８５ｇ，３５．７ｍｍｏｌ）を加えた。最終混合物を４℃で１２時間攪拌し、次いで、１００ｍｌの水性ＮＨ₄ＯＡｃ（５％）中に注いだ。有機相を分離し、１００ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ₃で洗浄、Ｎａ₂ＳＯ₄で脱水、濃縮し、シリカゲル（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ４：１）上のフラッシュクロマトグラフィーにかけ、標記化合物６．３６ｇ（６８％）を得た。¹ ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，４００ＭＨｚ）δ７．３６−７．２８（ｍ，５Ｈ），６．７６（ｄ，ＮＨ），５．９２−５．８２（ｍ，１Ｈ），５．３０（ｄｑ，１Ｈ），５．２２（ｄｑ，１Ｈ），５．１１（ｓ，２Ｈ），４．６５−４．５５（ｍ，２Ｈ），４．５０（ｄｄ，１Ｈ），４．１９（ｄ，ＮＨ），２．５７−２．４６（ｍ，２Ｈ），２．２１−２．０４（ｍ，２Ｈ），１．９７−１．８８（ｍ，１Ｈ），１．４１（ｓ，９Ｈ），０．９２（ｄ，３Ｈ），０．８９（ｄ，３Ｈ）。ステップ４Ｌ−グルタミル−ｇ−ベンジルエステル−Ｌ −バリンアリルエステル −２０℃でＨＢｒガスで飽和した２００ｍｌのＣＨＣｌ₃／１０％ＭｅＯＨ溶液を−７８℃に冷却した。この溶液に、２０ｍｌのＣＨＣｌ₃に溶解したＮ−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｌ −グルタミル−ｇ−ベンジルエステル−Ｌ−バリンアリルエステル（６．３６ｇ，１３．３ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を−２０℃に加温し、１５分間攪拌し、次いで氷冷飽和ＮａＨＣＯ₃（５００ｍｌ）中に注いだ。有機相を分離し、水性相を１００ｍｌのＣＨＣｌ₃で洗浄した。有機相を合わせ、Ｎａ₂ＳＯ₄で脱水、濃縮して、標記化合物５．００ｇ（９９％）を得、これをさらに精製せずに次のステップに用いた。¹ ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，４００ＭＨｚ）δ７．６７（ｄ，ＮＨ），７．３６− ７．２８（ｍ，５Ｈ），５．９３−５．８４（ｍ，１Ｈ），５．３１（ｄｑ，２Ｈ），５．２２（ｄｑ，２Ｈ），５．１１（ｓ，２Ｈ），４．６８−４．５６（ｍ，２Ｈ），４．５０（ｄｄ，１Ｈ），３．５（ｄ，ＮＨ２），２．５２（ｔ，２Ｈ），２．２１−２．１０（ｍ，２Ｈ），１．９４−１．８９（ｍ，１Ｈ），０．９３（ｄ，３Ｈ），０．８８（ｄ，３Ｈ）。ステップ５Ｎ−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｌ− アスパルチル−ｂ−ベンジルエステル−Ｌ− グルタミル−ｂ−ベンジルエステル−Ｌ−バリンアリルエステル５０ｍｌのＣＨＣｌ₃中のＬ−グルタミル−ｇ−ベンジルエステル−Ｌ−バリンアリルエステル（５．００ｇ，１３．３ｍｍｏｌ）及びＮ−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｌ−アスパルチル−β−ベンジルエステル（５．２３ｇ，１６．２ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃で、ＨＯＢｔ（４．１７ｇ，３０．９ｍｍｏｌ）次いでＥＤＣＩ（６．８５ｇ，３５．７ｍｍｏｌ）を加えた。最終混合物を４℃ で５時間攪拌し、次いで、１００ｍｌの水性ＮＨ₄ＯＡｃ（５％）中に注いだ。有機相を分離し、１００ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ₃で洗浄、Ｎａ₂ＳＯ₄で脱水、濃縮し、シリカゲル（ＣＨＣｌ₃／ＭｅＯＨ２％）上のクロマトグラフィーにかけ、標記化合物８．８４ｇ（９８％）を得た。¹ ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ７．３５−７．２４（ｍ，１１Ｈ），６．８４（ｄ，ＮＨ），５．９２−５．８２（ｍ，１Ｈ），５．５４（ｄ，ＮＨ），５．３０（ｄｑ，１Ｈ），５．２２（ｄｑ，１Ｈ），５．１２（ｄｄ，２Ｈ），５．０６（ｄｄ，２Ｈ），４．６４−４．５４（ｍ，２Ｈ），４．５１− ４．４５（ｍ，２Ｈ），３．０４（ｄｄ，１Ｈ），２．７３（ｄｄ，１Ｈ），２．６０−２．４３（ｍ，２Ｈ），２．２２−２．１２（ｍ，２Ｈ），２．０１−１．９２（ｍ，１Ｈ），１．４２（ｓ，９Ｈ），０．９１（ｄ，３Ｈ），０．８８（ｄ，３Ｈ）。ステップ６Ｎ−アセチル−Ｌ−（β−ベンジルアスパルチル）−Ｌ−（ｇ−ベンジルグルタミル）− Ｌ−バリン６ｍｌのＤＭＦ中のＮ−アセチル−Ｌ−（β−ベンジルアスパルチル）−Ｌ− （ｇ−ベンジルグルタミル）−Ｌ−バリンアリルエステル（０．５３０ｇ，０．８４ｍｍｏｌ）及びテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．９２ｇ，０．０８ｍｍｏｌ）の０℃懸濁液に、ピロリジン（０．０７２ｍｌ，０．８６ｍｍｏｌ）を滴下した。２５分後、ＥｔＯＡｃ（４０ｍｌ）及びＮＨ₄ＯＡｃ２５％（２０ｍｌ）を加えた。有機相を分離し、水性相を追加のＥｔＯＡｃ（２０ｍｌ）で抽出した。有機相を合わせ、Ｎａ₂ＳＯ₄で脱水、濃縮し、シリカゲル（ＣＨＣｌ₃／ＭｅＯＨ／ＨＯＡｃ、９４／４．５／０．５）上のフラッシュクロマトグラフィーにかけ、標記化合物０．４２ｇ（８６％）を得た。¹ ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，４００ＭＨｚ）δ０．９２（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，６Ｈ），１．９９（ｓ，３Ｈ），２．０３（ｍ，１Ｈ），２．１−２．２（ｍ，２Ｈ），２．５０（ｍ，２Ｈ），２．７０−３．００（２Ｈ，ＡＢ），４．３９（ｄｄ，Ｊ＝５．３０，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），４．４８（ｍ，１Ｈ），４．８０（ｍ，１Ｈ），５．０６（ｓ，２Ｈ），５．１０（ｓ，２Ｈ），６．８４（ｍ，１Ｈ），７．０９（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），７．３０（ｍ，１０Ｈ），７．６１（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ）。ステップ７Ｎ−（Ｎ−アセチル−Ｌ−アスパルチル−β −ベンジルエステル−Ｌ−グルタミル−ｇ− ベンジルエステル−Ｌ−バリン）−４−アミノ−５−ベンジルオキシ−２−オキソテトラヒドロフラン５ｍｌのＣＨＣｌ₃及び０．７ｍｌのＤＭＦ中のＮ−アセチル−Ｌ−（β−ベンジルアスパルチル）−Ｌ−（ｇ−ベンジルグルタミル）−Ｌ−バリン（６０８ｍｇ，１．０４ｍｍｏｌ）及びＮ−アリルオキシカルボニル−４−アミノ−５− ベンジルオキシ−２−オキソテトラヒドロフラン（３３５ｍｇ，１．１５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＰｄＣｌ₂ （ＰＰｈ₃）₂（４３ｍｇ，０．０６０ｍｍｏｌ）次いでＢｕ₃ＳｎＨ（３１０ｍｌ，１．１５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１０分間攪拌すると、ＣＯ₂の発生が認められた。追加量のＢｕ₃ＳｎＨ（３１０ｍｌ，１．１５ｍｍｏｌ）を加え、次いで溶液を０℃に冷却した。ＨＯＢｔ（２８４ｍｇ，２．１０ｍｍｏｌ）次いでＥＤＣＩ（２４５ｍｇ，１．２８ｍｍｏｌ）を加えた。最終混合物を０℃で４時間攪拌し、次いで、１００ｍｌのＣＨＣｌ₃で稀釈し、２０ｍｌのＮＨ₄ＯＡｃ（２５％）中に注いだ。有機相を分離し、２０ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ₃で洗浄、Ｎａ₂ＳＯ₄で脱水、濃縮し、シリカゲル（ＣＨＣｌ₃／ＭｅＯＨ５％）上のフラッシュクロマトグラフィーにかけ、ジアステレオ異性体混合物（１：１）として標記化合物７９０ｍｇ（９８％）を得た。¹ ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃，４００ＭＨｚ）δ８．２２（ｄ，ＮＨ），７．７３（ｄ，ＮＨ），７．３７−７．２５（ｍ，１５Ｈ），６．９８−６．８２（ｍ，ＮＨ），６．５２（ｄ，ＮＨ），５．５８（ｓ），５．４８（ｄ），５．１２−５．００（ｍ），４．８５（ｄ），４．７９（ｄ），４．７４−４．５９（ｍ），４．５２（ｄｄ），４．３１−４．２４（ｍ），４．１７（ｄｄ），３．０７（ｄｄ），２．９４（ｄｄ），２．９１−２．８５（ｍ），２．７７（ｄｄ），２．７４−２．３８（ｍ），２．２８−２．２３（ｍ），２．１６−２．０１（ｍ），２．０７（ｓ，ＣＨ₃ ＣＯＮＨ），１．９９（ｓ，ＣＨ₃ＣＯＮＨ），０．８９−０．８（ｍ）。ステップ８Ｎ−（Ｎ−アセチル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ −グルタミル−Ｌ−バリニル）−３−アミノ −３−ホルミルプロピオン酸５ｍｌのＭｅＯＨ中のステップ７の生成物（５１ｍｇ，６６ｍｍｏｌ）の懸濁液に、５０ｍｇのＰｄ（ＯＨ）₂（炭上２０％）を加えた。混合物をＨ₂雰囲気下に２４時間攪拌した。触媒をセライト上で濾過し、１０ｍｌのＭｅＯＨで洗浄した。ＭｅＯＨ抽出物を濃縮し、シリカゲル（ＣＨＣｌ₃／ＭｅＯＨ５％）上のフラッシュクロマトグラフィーにかけ、５ｍｌのＨ₂Ｏ及び１０ｍｌのＡｃＯＨから残留物を凍結乾燥して、標記化合物１７ｍｇ（４７％）を得た。¹ ＨＮＭＲ（ＣＤ₃ＯＤ，４００ＭＨｚ）δ４．６７（ｔ，１Ｈ），４．５５（ｄｄ，１Ｈ），４．４０−４．３５（ｍ，１Ｈ），４．３１−４．２４（ｍ，１Ｈ），４．０９−４．１５（ｍ，１Ｈ），２．８５（ｄｄ，１Ｈ），２．７１（ｄｄ，１Ｈ），２．７０−２．６０（ｍ，１Ｈ），２．５４−２．４６（ｍ，１Ｈ），２．４３−２．３８（ｍ，２Ｈ），２．１９−２．０４（ｍ，２Ｈ），１．９９（ｓ，３Ｈ），１．９７−１．９１（ｍ，１Ｈ），０．９５（ｄ，３Ｈ），０．９３（ｄ，３Ｈ）。Ｃ₂₀Ｈ₃₀Ｎ₄Ｏ₁₁＋Ｈ⁺のＨＲＭＳＦＡＢ：計算値＝５０３．１９８８９；実測値＝５０３．１９８９３。本明細書に関する参考文献には以下のものが含まれる：

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年５月３０日【補正内容】請求の範囲１．図４ｃのアミノ酸１７６−２７７と合わせるとＡｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣを切断し得るアポパイン酵素が産生される、図４ｃに示されているアミノ酸２９− １７５のアミノ酸配列の少なくとも一部を有する単離精製されたアポパインサブユニット。２．図４ｃのアミノ酸２９−１７５と合わせるとＡｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣを切断し得るアポパイン酵素が産生される、図４ｃに示されているアミノ酸１７６− ２７７のアミノ酸配列の少なくとも一部を有する単離精製されたアポパインサブユニット。３．（ａ）請求項１に記載のサブユニット；及び（ｂ）請求項２に記載のサブユニットを含む、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣを切断し得る単離精製されたアポパイン。４．請求項１、２又は３に記載のアポパインをコードする合成ＤＮＡ分子。５．請求項１、２又は３に記載のアポパインを認識する抗体。６．アポパインを調節する化合物を同定する方法であって、（ａ）テスト化合物と請求項３に記載のアポパインを含む溶液とを混合して混合物を形成すること；（ｂ）該混合物中のアポパイン活性を測定すること；及び（ｃ）該混合物中のアポパイン活性を標準と比較することを含む方法。７．請求項６に記載の方法により同定された化合物。８．請求項７に記載の化合物を含む医薬組成物。９．請求項１、２又は３に記載のアポパイン、請求項５に記載の抗体、請求項４に記載の合成ＤＮＡ及び請求項４に記載の合成ＤＮＡから誘導されたアンチセンス分子から選択される試薬を含むキット。１０．請求項７に記載の化合物を非ヒト動物に投与することを含む、ｉｎｖｉｖｏでアポパイン活性を変化させる方法。１１．請求項４に記載のＤＮＡのｉｎｖｉｖｏ又はｅｘｖｉｖｏ遺伝子移植を含む、遺伝子治療によりアポパイン活性を変化させる方法。１２．アポパイン活性を増強又は低下させることを含む、アポパイン活性が変化していることを特徴とする症状の治療を要する非ヒト動物を治療する方法。１３．前記方法が、アルツハイマー病、パーキンソン病、癌、老化、脱毛症、心血管又は神経の損傷、感染症、自己免疫疾患及び免疫不全症候群から選択される、請求項１２に記載の方法。１４．前記症状が、アルツハイマー病、パーキンソン病、癌、老化、脱毛症、心血管又は神経の損傷、感染症、自己免疫疾患及び免疫不全症候群から選択される、請求項１４に記載の方法。１５．請求項４に記載のＤＮＡ分子から誘導されたアンチセンス分子。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 48/00 ＡＢＮＡ６１Ｋ 48/00 ＡＢＮＡＤＵＡＤＵＡＤＷＡＤＷＡＧＺＡＧＺＣ０７Ｋ 16/40 Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｎ 9/64 ＺＣ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ // Ａ６１Ｋ 31/70 Ａ６１Ｋ 31/70 Ｃ０７Ｂ 61/00 Ｃ０７Ｂ 61/00 Ｚ (72)発明者ミラー，ダグラス・ケイアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者ソーンベリイ，ナンシー・エイアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者ニコルソン，ドナルド・ダブリユカナダ国、ケベツク・アシユ・９・アシユ・３・エル・１、カークランド、トランス・カナダ・ハイウエイ・16711 (72)発明者アリ，アンバレーンカナダ国、ケベツク・アシユ・９・アシユ・３・エル・１、カークランド、トランス・カナダ・ハイウエイ・16711 (72)発明者バイランコート，ジヨン・ピイカナダ国、ケベツク・アシユ・９・アシユ・３・エル・１、カークランド、トランス・カナダ・ハイウエイ・16711

Claims

【特許請求の範囲】１．単離精製されたアポパイン又はその機能性誘導体。２．組換え宿主により認識される転写終結配列を含まない、請求項１に記載のアポパインをコードする合成ＤＮＡ分子。３．請求項１に記載の精製されたアポパインに対する抗体。４．アポパインを調節する化合物を同定する方法であって、（ａ）テスト化合物とアポパインを含む溶液とを混合して混合物を形成すること；（ｂ）混合物中のアポパイン活性を測定すること；及び（ｃ）混合物中のアポパイン活性を標準と比較することを含む方法。５．請求項４に記載の方法により同定された化合物。６．請求項５に記載の化合物を含む医薬組成物。７．請求項１に記載のアポパイン、請求項１に記載のアポパインに対する抗体、請求項１に記載のアポパインをコードする合成ＤＮＡ及び請求項１に記載のアポパインをコードする合成ＤＮＡから誘導されたアンチセンス分子から選択される試薬を含むキット。８．請求項５に記載の化合物を動物に投与することを含む、ｉｎｖｉｖｏでアポパイン活性を変化させる方法。９．請求項２に記載のＤＮＡのｉｎｖｉｖｏ又はｅｘｖｉｖｏ遺伝子移植を含む、遺伝子治療によりアポパイン活性を変化させる方法。１０．アポパイン活性を増大又は低下させることを含む、アポパイン活性が変化していることを特徴とする症状の治療を要する動物を治療する方法。１１．前記症状が、アルツハイマー病、パーキンソン病、癌、老化、脱毛症、心血管又は神経の損傷、感染症、自己免疫疾患及び免疫不全症候群から選択される、請求項１０に記載の方法。１２．アポパインをコードするＤＮＡを増大又は減少させることを含む、アポパイン活性が変化していることを特徴とする症状の治療を要する動物を治療する方法。１３．前記症状が、アルツハイマー病、パーキンソン病、癌、老化、脱毛症、心血管又は神経の損傷、感染症、自己免疫疾患及び免疫不全症候群から選択される、請求項１２に記載の方法。１４．請求項２に記載のＤＮＡ分子から誘導されたアンチセンス分子。