JPH11501521A

JPH11501521A - 複合毒素による昆虫駆除

Info

Publication number: JPH11501521A
Application number: JP8534861A
Authority: JP
Inventors: ディー．ハンモック、ブルース; ハーマン、ラファエル; モスコビッツ、ハイム
Original assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Current assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Priority date: 1995-05-08
Filing date: 1996-04-30
Publication date: 1999-02-09
Also published as: KR19990008424A; US6162430A; CN1112105C; AU710774B2; BR9608474A; AU5788796A; NZ308294A; IN185147B; KR100253766B1; TR199701319T1; WO1996036221A2; EP0838999A2; WO1996036221A3; CN1185718A; US5756340A

Abstract

(57)【要約】鱗翅属などからの害虫の死滅速度を速める方法を提供する。本法は、少なくとも一つの組換え微生物から発現した少なくとも二つの異なる害虫毒素で害虫またはそれらの病巣を処理することを有する。同一の結合部位には競合せず、薬理学的性質の異なる毒素対が相乗的駆除を提供することを見出した。好ましい殺虫微生物はバクロウイルスである。

Description

【発明の詳細な説明】複合毒素による昆虫駆除発明の分野一般に、本発明は昆虫駆除(control)における昆虫毒の使用に関し、より具体的には、昆虫致死率を高めるように、昆虫に選択的な毒素を相乗的組合せの形で発現する殺虫組換え微生物に関する。本発明は、米国農務省のグラント第91−37302 −6185号に基づき政府の支援を受けてなされた。米国政府は、本発明に関して一部の権利を有する。発明の背景鱗翅類のヤガ科(Noctuidae)は、最も有害な農業害虫の幾つか、例えば、ヘリオシス(Heliothis)属、ヘリコベルパ(Helicoverpa)属、スポドプテラ（Spodopte ra ）属およびトリコプラシア（Trichoplusia）属を含む。例えば、この科に含まれるものには、オオタバコガ（ヘリオシス・ビレセンス(Heliothis virescens) ）、コットンボールワーム（ヘリコベルパ・ゼア(Helicoverpa zea)）、コットンリーフワーム（Alabama argillacea）、シロノモンヤガ（Amathes niarum）、グラッシーカットワーム（Crymodesdevastator）、ブロンズドカットワーム(Nep helodesemmedonia )、フォールアーミーワーム（Laphygmafrugiperda）、ビートヨトウ（Spodopteraexigua）およびマダラネキリムシ（Peridroma saucia）がある。ヤガ科（および他のもの）等の農業害虫の殺虫剤に対する耐性は、環境および人間の健康への危険をもたらしている。防虫剤耐性の問題は、害虫耐性を克服するためにさらに非特異的で有毒な化合物の利用を導く。これにより、破壊的な悪循環が作られる。昆虫駆除の使用に選択的な天然毒素が示唆されている。これらの毒素には、毒液を分泌する動物体の特定の腺組織で作られる物質がある。獲物または敵の体を麻痺させるか、および／または殺すために、毒液を輸送する他の手段が知られているが、その毒液をその獲物または敵の体に、例えば針で刺して孔を開ける器官により導入することができる。例えば、サソリは毒液中に多くのタンパク質または神経毒を有しており、これらは毒性があり、興奮系に作用する。昆虫駆除への使用が示唆される、昆虫に特異的な毒素の中には、Bacillus thuringiensisからの毒素、サソリのButhus eupeus およびAndroctonus australis、Leiurus quinq ustriatus hebraeu s、Leiurus quinqustriatus quinqustriatus からの毒素、およびダニのPyemotes triticiからの毒素がある。ブチナエ（Buthinae）亜科に属するサソリに由来する毒液は、軸索ナトリウム導電性を変える４つの主要なグループのポリペプチド神経毒を有する。サソリ毒素の第一グループはα−毒素であり、ナトリウムチャンネル不活化を遅延させるかまたはブロックすることにより作用ポテンシャルを極端に長期化させてホ乳動物に選択的に影響を与える（Catterall，Science，223:653-661(1984); Rochat ら、Advances in Cytopharmacology，pp．325-334(1979)）。第二グループの毒素であるβ−毒素はナトリウムチャンネル活性化に影響を与える（Couraud and Jover in Handbook of Natural Toxins（Tu，A．Ed.）Vol．2，pp．659-678（19 84）New York: Marcel Dekker）。第三グループの神経毒は、実質的にナトリウム流を抑制することにより作用ポテンシャルをブロックして昆虫に進行性の柔弱性麻痺を引き起こす抑制昆虫選択毒素である（Lesterら、Biochim．Biophys．Ac ta，701:370-381(1982); Zlotkin ら、Arch．Biochem．Biophys.，240:877-887 （1985））。第四の神経毒は、ナトリウムピーク電流の上昇および不活化の電圧依存性遅延により運動神経で繰り返される興奮を誘発して昆虫の迅速な（ノックダウン）痙攣性麻痺を引き起こす興奮性昆虫選択的毒素である（Walther ら、J. Insect Physiol.，22:1187-1194(1976); Pelhateら、J．Physiol.，30:318-319 (1981)）。サソリとダニの毒素に加えて、他の昆虫選択的毒素が、カタツムリ、クモおよび多数の他の節足動物由来の毒液中で同定された［Zlotkin による概説(Compreh ensive Insect Physiology，Biochemistry and Pharmacology，10巻、15章、499 -541 頁(1985年))を参照のこと］。コマユバチ科（broconid）スズメバチの毒液は鱗翅目の幼虫に対して高い毒性がある。コマユバチ科Bracon hebetorの毒液は、昆虫神経筋肉結合部で興奮性グルタミン作動性伝達のシナプス前部中断を誘発することにより鱗翅目幼虫の柔弱麻痺を引き起こす(Piekら、Comp．Biochem． Physiol.，72C:303-309(1982))。群居しないスズメバチの毒液は異なる目からの多数の昆虫およびクモに対して毒性がある（Rathmeyer，Z．Vergl．Physiol., 4 5:453-462(1962)）。これらの毒液の一例として、実質的に神経筋肉伝達のシナプス前ブロックにより昆虫に柔弱麻痺を誘発するPhilanthus triangulum の毒液である。この毒液は興奮性伝達と抑制伝達の両方に影響を与える（May ら、Inse ct Physiol.，25:285-691(1979)）。クロゴケグモ(Latrodectus mactans)の毒液は昆虫に対して神経毒性があるが、ホ乳類に対しては神経毒性のない成分、およびその反対の選択性を有する成分を含有する（Fritz ら、Nature，238:486-487( 1980); Ornberg ら、Toxicon，14:329-333(1976)）。更に最近では、一次構造と電気生理学的な効果においてα毒素と著しく類似するLqh αITと命名された毒素が毒素L.quinquestriatus hebraeusから単離されて主に昆虫に影響を与えることがわかった（Eitan ら、Biochemistry，29(1990)， pp．5941-5947）。毒液を持つ動物の毒液は獲物の興奮系で異なる標的部位に影響を与える多様な毒素からなる。鱗翅目幼虫に対する毒素の活性とそれらの各粗製毒液を比較するデータに基づけば、粗製毒液の有効性は、一つの毒素の活性のみでは明らかに説明できない。同じイオンチャンネル上で異なる標的部位に影響を与える毒液における異なる毒素間で（表３、Trainer ら、JBC，268，17114-17119(1993)）、同じ興奮性細胞上の異なるイオンチャンネル間で（Olivera ら、Science，249，25 7-263(1990)）、および／または隣接する興奮性細胞（神経および／または筋肉）上の異なる部位間で（Olivera ら、Science，249，257-263(1990)）、粗製毒液の高い有効性を協同作用に関連付けることができた。抑制および興奮性の昆虫選択的毒素は、その結合部位に対してα昆虫毒素と競合することはない（Gordon and Zlotkin，FEBS Lett.，315(1993)，pp．125-128 ）。イナゴまたはゴキブリの神経細胞膜とは対照的に、興奮性毒素は、鱗翅目幼虫の神経細胞膜で抑制毒素に置き換わってそれらの結合部位から移動させることはない（Gordonら、Biochemistry，31(1992)，pp．76-22-7628; Moskowitzら、I nsect Biochem．Molec．Biol.，24(1994)，pp．13-19）。最近、バクロウイルス科(Baculoviridae)からの核多角体病ウイルスであるオートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）(AcNPV)は、遺伝子修飾されて、昆虫選択的毒素を発現することにより死滅速度を増加させた。昆虫選択的毒素を昆虫病原ウイルスに導入することにより、共通（一部）譲渡を含む米国特許出願第07／629,603 号（1990年12月19日出願）の一部継続出願である米国特許出願第08／229,417 号（1994年４月15日出願）に記載されているように、昆虫宿主の死滅時間が減少することとなった。 Tomalskiら、米国特許第 5,266,317号（1993年11月30日発行）は、昆虫に特異的な麻痺神経毒を発現する組換えバクロウイルスの使用について論じている。Ba rtonら、米国特許第 5,177,308号（1993年１月５日発行）は、サソリ由来の昆虫特異的毒素および／または土壌生息微生物毒素を発現するトランスジェニック植物を作る際に異なるアプローチを採用している。本出願とともに共有譲渡され、同時係属している出願において、Hammock とMcCutchen、米国特許出願第08／279 ,956 号（1994年７月５日出願）は、組換えウイルスと有機殺虫剤との相乗的な組合せによる昆虫駆除を論じている。害虫の集団を駆除するのに組換え技法を用いるこれらの新しく現れた手段は、プレトロイド等の有機殺虫剤に対して広範囲な害虫耐性が存在することにより、実質的な作物の損失をもたらし始めたため、特に有望視されている。綿だけで、 pyr-R Heliothis （プレトロイド耐性ヘリオシス）種の存在により毎年数百万ドルの損失をもたらし始めている。実際、いくつかの場合で、プレトロイド殺虫剤は綿においてヘリオシスの幼虫の侵入駆除に失敗し、作物は完全に破壊される結果となった。発明の要約本発明の一つの面として、遺伝子工学により作られた殺虫微生物を使用することにより、さまざまな害虫を駆除する方法を提供する。本発明により駆除される害虫は、例えば昆虫群、ダニおよび線虫からのものである。よって、本発明は鱗翅目ならびに他の目に、またヤガ科ならびに他の科に適用できる。そのような害虫（またはそれら害虫の病巣）は、１種類以上の組換え微生物により発現される毒素の相乗的な組合せにより処理される。例えば、本法は、第一の神経毒を発現する第一の組換え病原体及び第二の神経毒を発現する第二の組換え病原体の組合せを用いてもよく、または複数の（例えば第一および第二の）神経毒素を発現する単一の組換えウイルスを用いてもよい。本発明の方法はウイルスによる害虫の死滅率を速める。図面の簡単な説明図面において、図１は、本発明の実施に好適な毒素の一つである、配列番号１で示される合成遺伝子LqhIV の塩基配列を示す。好適な実施態様の詳細な説明本発明は、遺伝子工学により作られた殺虫微生物を用いた、昆虫等の害虫を駆除するものである。組換えバクロウイルスを、好ましい微生物の具体例として本明細書全体にわたり使用するが、本発明はさまざまな微生物を組換えデリバリーシステムとして用いることにより実施することができる。よって、本発明に有用な微生物としてはDNA ウイルス及びRNA ウイルス、例えばバクロウイルス、菌類および細菌が挙げられる。およそ40種類におよぶ核多角体病ウイルスが昆虫種から単離された（Atlas of Invertebrate Viruses（Adams およびBonami編集、CRC 出版社、1991年）を参照のこと）。コットンボールワーム（ヘリコベルパ・ゼア）、オオタバコガ（ヘリオシス・ビレセンス）、ダグラスフィアトソックモス(Orgia pseudotsugata) 、ジプシーモス（Lymantria dispar）、アルファルファルーパー（オートグラファ・カリフォルニカ）、ヨーロピアンパインフライ（Neodiiprion sertifer）、およびコドリングモス（Laspeyresia pomonella）等に感染するさまざまなバクロウイルスが殺虫剤として登録され、昆虫種からのすべてのそのようなバクロウイルスが本発明を実施するのに適切である。多様な菌類が昆虫に感染することができる。そのような菌類のゲノムへ昆虫選択的毒素を導入することにより殺菌剤としての効力が高めることができる。例えば、Beauvaria bassaniaおよびBeauvaria brongniartiiは広いホスト範囲を有し、微生物殺虫剤候補として示唆されている（Millerら、Science，219:715-721， (1983)による概説を参照のこと）。昆虫駆除剤とみなされてきた細菌（Bacillus thuringiensis以外のもの）には、Bacillus popilliae 、B.lentimorbus 、およびB.sphaericusがある。殺虫剤としてのそれらの潜在能力は、昆虫選択的毒素をそれらのゲノムに導入することにより効力が向上して高めることができる。本発明の実施には、昆虫の駆除にあたり相乗的に働く２種類の毒素を併用することが含まれる。これらの２つの毒素は、両方の毒素遺伝子が導入された単一の組換え微生物によって発現してもよいし、または各々が各昆虫毒素をコードする遺伝子をゲノムにクローニングすることにより作られた二つの組換え微生物を調製することにより実施してもよい。選択される毒素対の組合せは幾つかの方法により決定される。後に説明されるように（実施例６のスクリーニング法により記載されるように）、同じ細胞チャンネル（典型的にはナトリウムチャンネル）ではあるが、非重複部位に作用する毒素を選択するのが望ましい。これを、さらに以下で説明する。既に指摘したように、本発明を実施するために好ましい殺虫微生物はバクロウイルスである。「バクロウイルス」とは、核多角体病ウイルス（NPV）等のバクロウイルス科(Baculoviridae)のバクロウイルスを意味する。バクロウイルスは節足動物のみに感染する進化的に関連する大きなグループである。実際、いくつかのバクロウイルスは産業的に重要な農産物または林業作物の害虫である昆虫にのみ感染する一方、他の昆虫害虫に特異的に感染する他のバクロウイルスが知られている。バクロウイルスは節足動物のみに感染するために、それらはヒト、植物または環境に対して危険性がほとんどないか、まったくない。バクロウイルス科以外の適当なDNA ウイルスには、メロロンタ・メロノータ（Melolontha melonotha ） EPV、アムサクタ・ムーレイ（Amsacta moorei）EPV、ロクスタ・ミグラトリア（Locusta migratoria）EPV、メラノプルス・サンギニペス（Melanoplus sanguinipes）EPV、スキストセルカ・グレガリア（Schistoce rca gregaria ）EPV、アエデス・アオジプチ(Aedes aogypti)EPV およびキロノムス・ルリドウス（Chironomus luridus）EPV などの昆虫ボックスウイルス（EPV ）がある。他の適当なDNA ウイルスはグラニュローシスウイスル（GV）である。適当なRNA ウイルスには、トガウイルス、フラビウイルス、ピコルナウイルス、細胞質多角体ウイルス（CPV）等が含まれる。二本鎖DNA ウイルスであるユーバクロビリナーエ科(Eubaculovirinae)の亜科はNPV とGVの２つの属があり、これらはそのライフサイクルにおいて閉鎖体を作るために特に生物学的駆除に有用である。GVの具体例としては、シデイア・ポモネラ(Cydia pomonella)GV（コドリングモスGV）、ピエリス・ブラシカエ（Pieris brassicae ）GV、トリコプルシア・ニ(Trichoplusia ni)GV、アルトゲイア・ラパエ(Artogeia rapae)GV、およびプロデイア・インタプンクテラ(Plodia interpunctella)GV（インデイアンミールモス）が挙げられる。本発明を実施するために適当なバクロウイルスは、閉鎖性でも非閉鎖性でもよい。核多角体病ウイルス（「NPV」）は、「閉鎖」（"occluded"）されているバクロウイルスの一亜群である。すなわち、NPV グループの特徴は、多くのビリオンが「閉鎖体」（"occlusion body"）と呼ばれる結晶性タンパク質マトリックス中に包埋されているということである。NPV の具体例として、リマントリア・デイスパー（Lymantria dispar）NPV（マイマイガNPV）、オートグラファ・カリフォルニカMNPV、アナグラファ・ファルシフェラ(Anagrapha falcifera)NPV（セロリルーパーNPV）、スポドプテラ・リトウラリス（Spodoptera litturalis ）NPV 、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)NPV、ヘリオシス・アルミゲラ（Heliothis armigera）NPV、マメストラ・ブラシカエ（Mamestra brassi cae ）NPV、コリストネウラ・フミフェラーナ（Choristoneura fumiferana）NPV 、トリコプルシア・ニ(Trichoplusia ni)NPV、ヘリコベルパ・ゼアNPV およびラキプルシア・オウ（Rachiplusia ou）NPV が挙げられる。野外での利用には、その高い安定性のために閉鎖性ウイルスが好ましい。なぜならばウイルスのポリヘドリン多皮は封入された感染性ヌクレオカプシドを保護するからである。本発明を実施するために例示される有用なバクロウイルスにはアナグラファ・ファルシフェラ、アンチカルシア・ゲマタリス(Anticarsia gemmatalis)、ブズラ・スプレッスリア(Buzura suppressuria)、シデイア・ポモネラ、ヘリコベルパ・ゼア、ヘリオシス・アルミゲラ、マネスチア・ブラッシカエ（Manestia bra ssicae ）、プルテラ・キシロステラ(Plutella xylostella)、スポドプテラ・エクシグア(Spodoptera exigua)、スポドプテラ・リトラリスおよびスポドプテラ・リツラ(Spodoptera litura)がある。本発明を実施するために特に有用な「NPV 」バクロウイルスはAcNPV であり、これはオートグラファ・カリフォルニカからの核多角体病ウイルスである。オートグラファ・カリフォルニカは、スポドプテラ属、トリコプルシア属およびヘリオシス属に入る多様な主要な害虫種がこのウイルスに感受性があるために特に興味深い。発現された殺虫毒素は、特に、例えばサソリ毒素、スズメバチ毒素、カタツムリ毒素、ダニ毒素またはクモ毒素等の節足動物または他の非脊椎動物毒素に由来するか、またはこれらに類似する神経毒素である。有用なサソリ毒素は、例えば Androctonus australis から得られるAaITである(Zlotkin ら、Biochimie，53, 1073-1078(1971))。有用なカタツムリ毒液は、カタツムリのコノトキシン由来のもの（錐体貝カタツムリ毒）で、この毒はカタツムリの口から放出される。さらに、個々の毒素のいくつかは昆虫を含む節足動物に対して選択性を有するようである。例えばOlivera らの報告（"Diversity of Conus Neuropeptides," Scienc e，249:257-263（1990））を参照のこと。昆虫の発達過程で通常現れるペプチドさえも殺虫毒素として作用でき、本発明にしたがって用いることができる。例えば、未熟なホルモンエステラーゼ（「JH E」）の早熟な出現は、宿主昆虫でホルモン力価を減少させて、典型的には食餌段階の非可逆的終了、蛹化の未遂、および害虫昆虫の死をもたらす。JHE のアミノ酸配列は公知であり、その遺伝子はクローン化されている。本発明の好適な態様として、参考として本明細書に含まれるHammock らが発明者のWO 94／03588号（1994年２月17日公開）に記載されているように、未熟なホルモンエステラーゼ（JHE）変異体を発現する組換え微生物、並びに昆虫の駆除に用いられる、そのようなJHE 変異体または欠損、幾つかの有用なJHE の変異体、および（JHE または変異型JHE をコードする配列を有する）組換え発現ベクターの調製の具体的方法が含まれる。 Hammock ら、WO 94／03588 号に記載された２種類の変異体は、JHE の29位と5 22 位の通常のリジンが部位特異的変異によりアルギニンに変更された二重リジン変異体（K29R、K522R）である。記載された一方の変異体はセリン201 がグリシンに変更されたもので、この変異体は「S201G」と命名された。JHE の触媒不全のS201G 変異体の殺虫活性はサソリ毒素と同じような時間で試験昆虫の50％致死をもたらした（AcNPV にて作られた場合）。よって、天然のJHE 昆虫タンパク質は、通常は毒性がなく、部位特異的変異等の手段（または他の方法）により毒素剤へと改変することができる。アミノ酸残基の変更に加えて、新しく作られるタンパク質を分泌経路に入らせ、グリコシル化し、そして細胞から出させるシグナル配列であるＮ末端の19個のアミノ酸を欠損させることにより他のJHE 変異体を作ることができた。 JHE と同じように、Androctonus australis（AaIT）由来の興奮性毒素のアミノ酸配列も決定され、その配列が発表され（Darbon 1982 年）、そしてAaIT遺伝子がクローニングされ、昆虫駆除のために発現ベクターに挿入された（WO 92 ／ 11363 号、1992年７月９日公開、発明者Belagajeら）。AaIT毒素は等脚目動物およびホ乳動物に対しては毒性を持たないが、昆虫に対しては毒性を示す。本発明を実施するためのさらにもう一つの適当な毒素は、ホ乳動物のナトリウムチャンネルに対するα−毒素の効果と非常に類似する様式で昆虫のナトリウムチャンネルに影響を与える。この神経毒は黄色サソリLeuirus quinquestriatush ebraeus から得られたもので、ここではLqh αITと呼ぶ。この毒素の同定と精製は、Eitan らにより発表されたBiochemistry，29:5941-5947（1990）の"A Scorp ion Venom Neurotoxin Paralytic to Insects that Affects Sodium Current In activation: Purification，Primary Structure，and Mode of Action"に記載された。本発明を実施するための二つの毒素は、単離され、精製された形においては新規であり、以下さらに詳しく説明する。簡単には、これらの二つの毒素は「LqhI V」および「LqhVI」と称される。これらの二つの毒素は、多数の毒素を天然形の混合物として有するL.quinqestriatushebraeusの毒液に存在する。LqhIV 毒素は非常に有効性のある鱗翅類に対する毒素であり、鱗翅類の幼虫に注入されたときに他のサソリ毒素と正の協同性を示し、かつホ乳類の毒性は弱いか又は全く有していない。このLqhIV 毒素の合成遺伝子を、図１の配列番号１に示す。よって、これらの二つの好適な毒素の遺伝子は合成することができる（そのペプチドの大きさはそのDNA を合成するには十分に小さいためである）。また、それらの遺伝子はクローン化することができる。後に具体的に示すように、それをコードする配列をトランスファーベクターにクローン化してもよい。我々は、AaITおよびLqh αITの毒素の相乗的組合せを有する本発明の特徴を、ホホアカクロバエおよびヘリオシス幼虫の両方において示した。この例では、併用したとき、これらの昆虫選択的神経毒の殺虫活性は５倍〜10倍まで増加した。本発明および実験の詳細を示す他の組合せを、さらに十分に以下で示す。さまざまな他のサソリ毒素（例えばButhoid サソリ）も、Leiurus quinquestr iatus quinquestriatus 由来の抑制昆虫毒素であるLqqIT2等の相乗的組合せに用いることができる。この神経毒を得るために用いられる精製方法はZlotkin ら（ Archives of Biochem．Biophys.，240:877-887（1985））により発表された。 BjIT2 はもう一つの抑制昆虫毒素であり、Buthotus judaicus に由来する。その精製はLesterら（Biochim．Biophys．Acta，701:370-381(1982)）により発表された。BjIT2 はアミノ酸配列が15位で異なる二つのアイソフォームで存在する。フォーム１はイソロイシンをこの位置に有するが、フォーム２はバリンを有する。 LqhIT2は、逆相HPLCを用いて精製されたLeiurus quinquestriatus hebraeusに由来するさらにもう一つの抑制昆虫毒素である。チャクトイドサソリ（Scorpio mauruspalmatus）の毒液から精製した、さらに別の毒素も用いることができる。例えば、チャクトイドサソリ（Scorpio maurus palmatus ）由来のSmpIT2は抑制昆虫毒素である。その精製はLazaroviciら、J．B iol．Chem.，257:8397-8404(1982)に記載されている。チャクトイドサソリ（Scorpio mauruspalmatus）の毒液から精製した、さらに別の毒素は、SmpCT2およびSmpCT3、並びに甲殻類毒素であり、これらの精製はLa zaroviciの博士論文（1980年）（Hebrew University，Jerusalem，"Studies on the Composition and Action of the Venom of the Scorpion Scorpio maurus p almatus(Scorpionidae)"）に記載されている。表１は、本発明を実施するための好適な毒素の一部をそれらの精製と特性付けの引例とともに示す。表１に例示する毒素を精製できる由来となる微生物の多くのcDNAライブラリーを。下記のものに記載されているように利用することができる。Zilberberg ら、(1992)，Insect Biochem．Molec．Biol，22(2)，199-203(Leiurus quinquestr iatus hebraeus ); Gurevitz ら（1990）Febs Lett.，269(1)，229-332(Buthus j udaicus); Bougis ら(1989)，JBC，264(32)，19259-19256(Androctonus austral is) ; Martin-Euclaire ら（1992）Febs．Lett.，302(3)，220-222(Tityus serru latus); Woodwardら(1990)EMBO J.，9(4)，1015-1020(Conus textile); および Colledge ら（1992）Toxicon，30(9)，1111-11116（Conus geographus）。他のものに関しては、毒素をコードする合成遺伝子を実施例７に例示された方法と同じように構築してもよい。既に示したように、本発明を実施するための使用に適する２種類の毒素はそれらが単離され精製された形において新規である。このうちの一つが「LqhIV」と命名され、配列番号２に示されたアミノ酸配列：GVRDAYIADD KNCVYTCGAN SYCNTE CTKN GAESGYCQWF GKYGNACWCI KLPDKVPIRI PGKCR を有する。配列番号２の65個のアミノ酸ペプチドは実施例５でさらに説明する。「LqhVI」と命名されたもう一つの新規な毒素は配列番号３： GVRDGYIAQP ENC VYHCFPG SPGCDTLCKG DGASSGHCGF KEGHGLACWC NDLPDKVGII VEGEKCHで示されるアミノ酸配列を有する。この65個のアミノ酸配列も実施例５でさらに説明する。表１に挙げた好ましい毒素、または配列番号２および配列番号３などの毒素は、最初に異なる薬学的性質を有する毒素の実験的な組合せを作ることにより最も容易に相乗的組合せを形成するように選択してもよい。例えば、AaITは興奮性昆虫毒素であり、一方LqhIT₂は抑制毒素である。日常的に用いられる結合方法により（例えばイナゴLocusta migratoria膜小胞を用いたAaIT、BjIT₁およびBjIT₂ に関してはGordonら、Biochim．Biophys．Acta，778，349-358（1984）を参照されたい）、対象とする特定の昆虫の同じチャンネルにおいてであるが、非重複部位においての活性をスクリーニングする。これは、当分野で知られているように、いろいろな昆虫の神経細胞膜中には多様性があるためである。例えば、幾つかの最近の文献は、鱗翅類幼虫の神経細胞膜はイナゴまたはゴキブリの神経細胞膜とは異なり、抑制および興奮性の昆虫毒素に同時に結合することができることを報告している。 AaITおよびLqh αITの相乗的組合せの既に挙げられた例において、ヘリオシス幼虫に対するよりもホホアカクロバエ幼虫に対してその組合せは２倍の相乗効果があった。対照的に、AaITとLqhIT₂の組合せでは、ヘリオシス幼虫に適用されたときに相乗的組合せ（５倍の効果）があるが、ホホアカクロバエ幼虫に適用されたときは各毒素それ自体に関して増強効果はない。毒素のこれらの組合せは昆虫群内において選択性を高めるために用いることができる。昆虫を駆除する目的のために、バクロウイルス等の組換え微生物を作るのに、分泌シグナル配列を包含させるのが好ましい。分泌シグナル配列は、細菌、酵母、菌類、または動物と植物の両方を含めた高等真核動物のタンパク質から得てもよい（例えば、Watson，Nucl．Ac．Res.，12:5145-5164（1984）を参照のこと）。さらに好ましいものは、昆虫起源のタンパク質からの分泌シグナル配列であり、例えばHyalophora cecropia 由来のセクロピンＢの分泌シグナル配列（Van Ho fsten ら、PNAS，82:2240-2243(1985)）、そしてManduca sexta 由来のエクロージョンホルモンの分泌シグナル配列である(Horodyski ら、PNAS，86:8123-8127( 1989))。また、サソリ毒素に生来関連した分泌シグナル配列も好ましく、これらはmRNA、cDNA、または染色体DNA の分析により決定することができる。さらに好ましいのはAaITの天然の分泌シグナル配列である（Bougisら、J．Biol．Chem.， 264:19259-19265(1989)）。組換え微生物の毒素は毒素の機能的誘導体として発現させてもよい。毒素の「機能的誘導体」は、毒素の生物学的活性（機能的にも構造的にも）に実質的に類似する生物学的活性を有する化合物である。「機能的誘導体」との用語は、分子の「フラグメント」、「変種」、「類似体」、または「化学的誘導体」を含むことを意図している。毒素等の分子の「フラグメント」とは分子のポリペプチドの一切のサブセットを指すことを意味する。毒素等の分子の「変種」とは全分子、またはそのフラグメントと構造的および機能的に実質的に類似する分子を指すことを意図する。両分子が実質的に類似する構造を有するか、または両分子が類似する生物活性を有する場合、分子はもう一つの分子と「実質的に類似」であると言われる。よって、二つの分子が類似の活性を有する場合、たとえ分子の一方の構造が他方の分子に見られないとしても、またはアミノ酸残基の配列が同一ではないとしても、それらはその用語が本明細書で用いられるように変種とみなされる。毒素等の分子の「類似体」とは機能において完全な分子またはそのフラグメントに実質的に類似する分子を指すことが意図される。ここに用いられる分子とは、ある分子が他の分子の通常は一部ではない付加的な化学的部分を有する場合に別の分子の「化学的誘導体」であると称される。そのような部分は分子の溶解性、吸収性、生物学的半減期等を向上させることができる。そのような効果を仲介することのできる部分が、Remington's Pharma ceutical Sciences（1980年）に開示されている。そのような部分を分子に結合させる方法は当分野で周知である。一般に、単一の毒素（または複数の毒素）の発現は通常、RNA 合成を開始させるために十分なプロモーター領域を有している。あるバクロウイルスプロモーター遺伝子は公知の最も強く発現された真核遺伝子の一つであるが、他のプロモーターおよび複合プロモーター配列、例えばp10 等を用いてもよい。１種類の毒素を発現する組換えバクロウイルスを当分野で現在知られている方法により調製してもよい(例えば、昆虫寄生ダニの神経毒を例示しているTomalsk iらの米国特許第5,266,317 号；AaITを発現する組換えバクロウイルスの構築を例示する、McCutchen ら、Bio/Technology，9，848-852（1991）およびMaeda ら、"Insecticidal Effects of an Insect-Specific Neurotoxin Expressed by a Recombinant Baculovirus," Virology，184，777-780(1991))。二つの異なる毒素を発現することのできる単一のバクロウイルスの調製は、Be layev とRoy、Nucleic Acid Research，21:5，1219-1223（1993）；およびWang ら、Gene，100，131-137（1991）の類似する方法に適当な改良を加えて行ってもよい。実施例１がそのような類似する方法を具体的に示している。実施例１標準的な分子クローニング技術を用いて、二種類の昆虫毒素遺伝子をPacUW51P 2 等のトランスファーベクターにクローニングした。このトランスファーベクターは多角体遺伝子プロモーターの上流にタンデムに、しかし反対の向きで挿入されたAcNPV p10 プロモーターとSV40転写停止シグナルを有するオートグラファ・カリフォルニカ（AcNPV）多角体イナゴ系ベクターである。これによって、多角体プロモーターの制御下にBamHI 部位で第一外来性遺伝子のコード領域、および p10 プロモーターの制御下にBglII クローニング部位に第二外来遺伝子コード領域の確認が容易となる。よって、得られる組換えウイルスは二つの外来タンパク質を発現する。このようにして調製した組換えAcNPV は、この組換えプラスミドをカルシウム沈殿により同時核酸感染させたスポドプテラ・フルギペルダ細胞（ Sf21）を増殖させることにより単離することができる。多角体感染細胞は感染後に同定して集めることができ、組換えウイルスプラークをスクリーニングにより精製する。この組換えウイルスの精製は標準的方法によってもよく、得られた純粋な組換え体を増殖させ、例えば４℃から−80℃で保存する。標準的な方法は例えばO’Reilly，Miller およびLuckow、Baculovirus Expression Vectors，A La boratory Manual に記載されている。実施例２二種類の異なる昆虫とマウスとに対する四種類の異なる昆虫毒素の活性を測定した（ホ乳動物に対して効果がほとんどないか、まったくない昆虫毒素を用いたいため）。これらのものは各々の粗製毒液から確立された方法で精製した。マウス並びにハエ及びガのそれぞれの幼虫に対するそれらの毒性を、ReedとMuench（ 1938年）の方法にしたがって測定した。表２は、50パーセント終点（半麻痺量PU₅₀または半致死量LD₅₀）による昆虫とマウスに対する毒素の活性を示す。ホホアカクロバエ幼虫に対する毒素のPU₅₀値はすでに発表された結果に一致した（Zlotkin ら、Biochim，53 1075-1078(1971 ); およびEitan ら、Biochem.，29，5941-5947(1990)）。ヘリオシス・ビレセンスのガ幼虫に対する毒素の毒性は、スポドプテラ・リトラリスの幼虫に対するそれらの毒性に匹敵する。Lqh αITはマウス(Swiss Webster)に対して高い毒性を示すが、他の毒素はホ乳動物に対して毒性を示さなかった（ホ乳動物毒素AaH_I _I のLD₅₀（0.018 μg ／20g 体重）（DeLimaら、1986年）とは対照的に３μg ／g 体重の皮下注射は効果を持たなかった）。LqhIV は現在までサソリ毒液から単離された最も有効な鱗翅類毒素である一方で、毒素LqhVI は弱いホ乳類毒素であるために毒素LqhIV とLqhVI が非常に興味がもたれる。実施例３毒素の組合せを同時に注射し、毒性を表３にまとめたように測定した。この毒素の組合せは、各毒素の１PU₅₀単位に対応する量およびそれらの希釈物を含んでいた。同じ結合部位に対してお互い競合せず、薬理学的性質の異なる毒素の組合せが相乗的であった。表３からわかるように、協同性のレベルは毒素の組合せに依存するだけではなく試験動物にも依存する。表３に示すように、１を超える有効性を有する組合せは潜在的有効性を超える投与量応答を示すものであった。よって、これらの組合せは死滅率を相乗しているものであり、本発明の好適な態様を示している。実施例４本発明を実施する際に、駆除される害虫（および／またはそれらの病巣）を前記組合せを発現する組換えバクロウイルスで処理する。本実施例では、２種類の異なる毒素を発現する２種類のウイルスを組合せて適用することにより、各ウイルスそれ自体の適用と比較して、ホスト昆虫を殺す時間を速めることを示す。よって、表４に示すように、組換えAcAaITと組換えAcLqh αITとを組合せて適用した結果、死滅時間が実質的に速められた。致死時間（LT）は、AcAaIT（10000 PIB）、AcLqh αIT（10000 PIB）、および AcAaIT（5000 PIB）とAcLqh αIT（5000 PIB）との組合せに対する第三齢のH.ビレセンス幼虫の応答に基づいて得た。少食餌プラグをマイクロタイタープレートの個々のウエルに置き、各ウイルスのいずれかを接種した。H_・ビレセンスの第三齢幼虫を次にプレートに入れ、27℃に保った。死亡数を5 〜10間隔で記録した。 LTをプロビット（Probit）分析プログラムで分析した。よって、表４のデータは致死時間（LT）として表わされる死亡速度の研究であり、類似するアプローチを用いて致死量を決定することができ、これは大きな経済的重要性を有するであろう。例えば50％の幼虫が死んだ時間を取ると、本発明を実施する際の毒素の組合せは、個々の組換え体の適用に関して宿主幼虫を殺すのに必要とされる時間のほぼ12％〜18％の減少をもたらしたことがわかる。組換えAcAaITによる処理が、野生型AcNPV に比較して宿主幼虫を殺すために必要とされる時間の約40％の減少を示していることを考慮すると、昆虫の食い荒らしによる損害の実質的な減少、および損害が顕著に少ない植物が本発明の実施から得られることがわかる。さらに、組換え微生物に感染した幼虫は典型的には麻痺の兆候を示し始め、死ぬ前のかなりの時間の間食べることを止めており、これがさらに本発明の実用的な殺虫効果を高めている。実施例５ LqhIV およびLqhVI の精製サソリL．quinqestriatus hebraeusの毒液はSigma（米国）から得た。凍結乾燥されたL．quinqestriatus hebraeus毒液（50 mg）を10 mM 酢酸アンモニウム（pH 6.4）２mlに懸濁し、均質化した。不溶物質を27000gで20分間遠心分離して除去した。上清を集めて、残ったペレットをさらに10 mM 酢酸アンモニウム（pH 6.4）２mlに再懸濁し、均質化し、再び遠心分離した。この抽出を４回行って毒液から抽出したタンパク質の収量を最大とした。すべての遠心分離から得た上清を集め、それを陽イオン交換体カラム(CM-52 10 ml)にかけ、0.01M 〜0 .5Mまでの線形勾配の酢酸アンモニウム（pH 6.4）を用いて流速10 ml ／時で溶出させた。吸光度を280 nmでモニターしてピークを集めた。この陽イオン交換クロマトグラフィーからのフラクションCM-IIIとCM-VI を逆相HPLCでVydac C4カラムを用いてさらに精製した。LqhIV はCM-VI から以下のように精製した：緩衝液Ａは 0.1％TFA を有する５％ ACNであり、緩衝液Ｂは0.1 ％ TFAを有する95％AC N であった。このカラムを緩衝液Ａで平衡化し、０〜60％Ｂの70分間での線形勾配で溶出させた。流速は0.6 ml／分であった。吸光度を214 nmでモニターし、ピークを集めた。LqhVI はCM-IIIから以下のように精製した。緩衝液Ａは0.1 ％ H FBA を有する５％ ACNであり、緩衝液Ｂは0.1 ％ HFBA を有する95％ACN であった。カラムを緩衝液Ａで平衡化し、０〜90％Ｂの105 分間での線形勾配で溶出させた。流速は0.6 ml／分であった。吸光度を214 nmでモニターしてピークを集めた。溶出されたフラクションを集め、活性（表２）および純度を調べた。毒素の純度 LqhIV とLqhVI の均一性及び純度をFree Solution Capillary Electrophoresi s （Applied Biosystems Model 270A）を用いて調べた。キャピラリーは20 mMクエン酸ナトリウム（pH＝2.9）で平衡化し、試料（0.02 mg /mlタンパク質）を減圧下に２秒間かけた。ランニング緩衝液は20 mM クエン酸ナトリウム（pH＝2.9 ）で、電圧は20KVであった。配列の決定確立された方法を用いて、各毒素20μg を還元し、カルボキシメチル化した（ Fernandez ら、 "Techniques in Protein Chemistry," Vol．5 page 215）。Ｎ末端配列を、HP配列分析装置を用いて自動化エドマン分解により決定した。還元されカルボキシメチル化されたLqhIV を、Endoproteinase Asp-Nを用いて消化してペプチドを作った。消化されたペプチドの分解は高分子カラムを用いるmicrob ore HPLC（Ultrafast Microprotein analyzer-Michrom BioResources Inc）を用いて行った。緩衝液Ａは0.1 ％TFA を有する5 ％ ACNであり、緩衝液Ｂは0.1 ％ TFA を有する95％ACN であった。このカラムを、緩衝液Ａで平衡化し、０〜50％Ｂの50分間での線形勾配で溶出させた。流速は0.05 ml ／分であった。吸光度を 214 nmでモニターし、ピークを集めた。ペプチドP2は毒素の全アミノ酸配列を決定するために配列決定を行った。実施例６結合法昆虫神経細胞膜の調製昆虫神経組織のすべての切除と調製を以下の組成の冷緩衝液で行った。0.25M マンニトール、10 mM EDTA（pH 7.4），５mM HEPES（TrisでpH 7.4に調整）、50 μg ／ml塩化フェニルメチルスルホニル、１μM ペプスタチンＡ、１ mM ヨードアセトアミドおよび１mMの1,10−フェナントロリン。氷冷緩衝液中で、昆虫神経組織を切除し、均質化し、デブリスを1,000gで10分間の遠心分離して除去する。上清を27,000g で45分間遠心分離し、膜を集める（P₂）。P₂を緩衝液に懸濁し、 10％ Ficoll （緩衝液中）に調整し、10,000g で75分間遠心分離する。豊富なシナプトソームフラクションを現す得られた浮遊外皮を集める。低張媒体（５nM T ris-HCl(pH 7.4)、１mM EDTA、50μg/mlフッ化フェニルメチルスルホニル、１μ M ペプスタチンＡ、１mMヨードアセトアミドおよび1 mM 1,10−フェナントロリン）による処理後、膜小胞を形成する。膜小胞を27,000 gで45分間の遠心分離後、少量の切除緩衝液に集めて、使用するまで−80℃で保存する。毒素の放射性ヨウ素化キャリヤーのないNa¹²⁵Ｉ 0.5 mCi（0.3 nmolまで）（Amersham）および毒素５mg（0.7 nmolまで）を用いてヨウ素源（Pierce Chemical Co.，Rockville、メリーランド州）により毒素をヨウ素化する。このモノヨード毒素を、Beckman Ul trapore C3 RPSC カラム（4.6 ×75 mm）を用いるHPLCで精製し、フラクションは0.5 ml／分の流速で10〜80％の溶媒Ｂ（溶媒Ａ= 0.1 ％ TFA、溶媒Ｂ＝50％ A CN、50％ 2- プロパノールおよび0.1 ％TFA）の勾配で溶出させた。モノヨード毒素は、在来毒素のピーク後（約28％溶媒Ｂ）、放射活性のあるタンパク質の第一ピークとして溶出する（約30％溶媒Ｂ）。放射標識された毒素の濃度は¹²⁵Ｉの比放射能により概算し、2424 dpm／fmolモノヨード毒素に対応する。結合アッセイ一定濃度の標識毒素の存在下に未標識毒素の濃度を増加させる平衡条件下に競合結合アッセイを行う。すべての結合アッセイの分析は反復コンピュータープログラムLIGAND（P．J．Munson and D．Rodbard ； G．A.McPherson （1985）により改良されたもの）を用いて行う。昆虫の膜小胞を、0.13M 塩化コリン、１ mM EDTA（pH 7.4）、20 mM HEPES／Tris（pH 7.4）および5 mg/ml BSAを含有する結合用媒体に懸濁する。毒素と１時間インキュベーション後、反応混合物を氷冷洗浄用緩衝液２ml（150 mM塩化コリン、５mM HEPES／Tris（pH 7.4）、１mM EDTA （pH 7.4）および５mg／ml BSA）で希釈し、GF／F フィルター（Whatman、英国）上で減圧下に濾過し、濾紙をさらに２回それぞれ洗浄用緩衝液２mlで洗浄する。非特異的な毒素の結合は１μM 未標識毒素の存在下で測定する。実施例７合成遺伝子の構築（図１、配列番号１）バクロウイルスの好ましいコドン利用を用いて、毒素のタンパク質配列を塩基配列に変換した。リーダー配列（bombyxin、天然または他のリーダー）の塩基配列とともに毒素遺伝子および適当な制限酵素部位を用いて５種類のオリゴヌクレオチド相補対を設計し、合成した。これらのオリゴヌクレオチドをリン酸化し、アニールし、連結し、かつプライマーとして外側のオリゴヌクレオチドを用いる PCR により増幅した。PCR 生成物は平滑末端とし、PCRscript プラスミドに連結し、正しい配列を配列決定により確認した。バクロウイルスプロモーター（例えば、P10、ポリヒドリン、Basic、IE1）下、バクロウイルストランスファーベクターにクローン化したこのプラスミドからBamHI 制限フラグメントを得た。この遺伝子の正しい配列とリーダー配列を含有するプラスミドを配列決定により確認した。得られたトランスファーベクターおよび標準的な方法を用いて、毒素を発現する組換えウイルスを構築した。AaIT およびLqhIV を発現するウイルスの構築 bombyxinのリーダー配列および毒素LqhIV をコードする遺伝子を上記のように命名、合成した。正しい配列を確認し、該遺伝子を、AaIT遺伝子を既に含有する二重発現トランスファーベクターにクローニングした。トランスファーベクター pAcUW51P2 は、二つのクローニング部位、BglII 部位を有するポリヒドリン陽性ベクターであり、bombyxinリーダーを有するLqhIV 遺伝子をBamHI 部位にクローン化した。Sf21細胞を、得られたトランスファーベクターおよび感染性ウイルス粒子にリボフェクチン法を用いて同時核酸感染させた。組換えウイルスを標準プラークアッセイでポリヘドロン陽性表現型として選択した。Sf21細胞に組換えウイルスAcAaLqを標準法により接種した。ウイルス感染細胞からのタンパク質抽出物を15％ SDS-PAGE ゲルで分離し、次にニトロセルロースメンブレンに電気溶出した。このメンブレンにAaIT抗体とLqhIV 抗体をプローブとして用いて結合させた抗体を、ウサギIgG HRP 複合体を用いて検出した。結論として、遺伝子工学による殺虫微生物を本発明にしたがって作り、次にこれを用いてさまざまな害虫を駆除した。これを行う際に、複数の神経毒素を発現する単一の組換えウイルスを用いてもよい。毒素の組合せは、同じ細胞チャンネル（典型的にはナトリウムチャンネル）においてであるが非重複部位において作用する毒素を選択することにより決定される。もしくは、各々が異なる毒素を発現する二種類（またはそれ以上の）組換え殺虫微生物を用いてもよい。再度、幾つかの発現毒素が既に記載されたように選択される。発現された毒素のこれらの組合せは単一のウイルスまたは複数のウイルスによる害虫の死滅速度を速めて単なる「相加」機能を超える。例えば、ホホアカクロバエ幼虫およびヘリオシス幼虫における毒素AaITとLqh αITの致死率は組み合わせて用いたときに５倍から10 倍まで増加した。さらに、毒素のこれら組合せを用いて昆虫群内における選択性を高めることができる。組換え微生物の周知の適用手段（噴霧、霧状化、散布、飛散または注液）を用いることができ、そのような利用のためには、例えばポリマー物質による被包化の他に粉末、微粉砕、顆粒として製剤化できる。殺虫毒素の相乗的組合せを発現する組換え微生物を適用するために、典型的には、組成物は不活性担体、例えば粘土、ラクトース、脱脂大豆粉末等を含ませて適用を容易にすることができる。好適な態様に組み合わせて本発明を説明したが、この説明と実施例は本発明を具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するためのものではなく、本発明の範囲は、添付の請求の範囲により定められることを理解されるであろう。

【手続補正書】【提出日】１９９８年１月２９日【補正内容】請求の範囲１．組換えバクロウイルスに感染した選択された昆虫の昆虫細胞内で、複数の毒素を発現する組換えバクロウイルスであって、各毒素が純粋なタンパク質として発現され、各毒素が他の毒素に関して非重複結合部位で同じ膜イオンチャンネルと結合し、各毒素が選択された昆虫の毘虫細胞に対して殺虫能力を有し、かつ複数の毒素が一緒になって選択された昆虫の昆虫細胞に対して各毒素単独の相加効果により達成される殺虫能力よりも大きな殺虫能力を有する、上記組換えバクロウイルス。２．バクロウイルスが核多角体病ウイルスである請求項１記載の組換えバクロウイルス。３．バクロウイルスがオートグラファ・カリフォルニカである請求項１記載の組換えバクロウイルス。４．膜イオンチャンネルがナトリウムイオンチャンネルである請求項１記載の組換えバクロウイルス。５．毒素のうちの１つがLqhIV 又はLqhVI のいずれかである請求項３又は請求項４記載の組換えバクロウイルス。６．毒素のうちの１つがAaITである請求項３又は請求項４記載の組換えバクロウイルス。７．毒素がAaIT及びLqh αIT、LqhIT₂、LqhIV、又はLqhVI のうちのいずれか１つを含む請求項３記載の組換えバクロウイルス。８．少なくとも１つの毒素がサソリ、スズメバチ、カタツムリ、ダニまたはクモの毒液の成分である請求項１又は請求項３記載の組換えバクロウイルス。９．第一の毒素を純粋なタンパク質として発現する第一の組換えバクロウイルス；及び第二の毒素を純粋なタンパク質として発現する第二の組換えバクロウイルスを含有する殺虫組成物であって、第一及び第二の毒素が非重複結合部位ではなく同じイオンチャンネルと結合し、かつ第一及び第二の毒素が一緒になって選択される昆虫種に対して各毒素単独の相加効果により達成される殺虫能力よりも大きな殺虫能力を有する、上記殺虫組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:92） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ハーマン、ラファエルイスラエル国 27000 カーヤットビアリックハジェフェンストリート 31 (72)発明者モスコビッツ、ハイムイスラエル国 96704 イェルサレムグゥアテマラストリート 15 アパートメント７

Claims

【特許請求の範囲】１．害虫またはそれらの病巣を少なくとも二つの異なる昆虫毒素で処理することを有する、昆虫群、ダニ、線虫からの害虫を駆除する方法であって、毒素の供給源が少なくとも一つの組換え微生物または複数の組換え微生物であり、毒素が昆虫細胞膜チャンネルの非重複結合部位を有する、上記方法。２．毒素の供給源が組換え昆虫ウイルスである請求項１記載の方法。３．組換え昆虫ウイルス源がバクロウイルスである請求項１記載の方法。４．バクロウイルスが核多角体病ウイルスである請求項３記載の方法。５．バクロウイルスが、オートグラファ・カリフォルニカ、アナグラファ・ファルシフェラ、アンチカルシア・ゲマタリス、ブズラ・スプレッスリア、シデイア・ポモネラ、ヘリコベルパ・ゼア、ヘリオシス・アリゲラ（Heliothis arrigera ）、マリエスチア・ブラッシカエ（Mariestia brassicaae）、プルテラ・キシロステラ、スポドプテラ・エクシグア、スポドプテラ・リトラリスまたはスポドプテラ・リツラからのものである請求項３記載の方法。６．毒素がAaIT、LqhIT₂、Lqh αITおよびLqhIT3神経毒の組合せである請求項１記載の方法。７．毒素がJHE 変異体を含む請求項１記載の方法。８．害虫がヘリオシス・ビレセンスまたはホホアカクロバエである請求項６または請求項７記載の方法。９．配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を有する、昆虫駆除に有用な、実質的に純粋な昆虫毒素。 10．組換え微生物であって、それに感染した昆虫細胞内で、昆虫細胞に対して毒性のある少なくとも２つの外来タンパク質、またはその機能的誘導体を発現する組換え微生物であって、微生物ゲノムが分泌シグナル配列を設けている、組換え微生物。 11．微生物が核多角体病ウイルスである請求項10記載の組換え微生物。 12．外来タンパク質の少なくとも一つがサソリ毒素である請求項10または請求項 11記載の組換え微生物。 13．外来タンパク質が、サソリ、スズメバチ、カタツムリ、ダニまたはクモの毒液をコードする遺伝子配列に由来する請求項10記載の組換え微生物。 14．バクロウイルスがオートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルスである請求項10、請求項12または請求項13記載の組換え微生物。 15．第一および第二のバクロウイルスを含有する昆虫駆除組成物であって、第一および第二のバクロウイルスが第一および第二の毒素をそれぞれ発現し、第一および第二の毒素が昆虫細胞膜チャンネルの非重複結合部位を有する、昆虫駆除組成物。 16．組換えバクロウイルスを含有する昆虫駆除組成物であって、組換えバクロウイルスに感染した細胞内で、複数の殺虫毒素を発現する昆虫駆除組成物。