EA025657B1 - ШТАММ ВИРУСА ЯДЕРНОГО ПОЛИЭДРОЗА ХЛОПКОВОЙ СОВКИ HELICOVERPA ARMIGERA Hbn И ИНСЕКТИЦИДНЫЙ ПРЕПАРАТ НА ЕГО ОСНОВЕ - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к микробиологической промышленности и биотехнологии, а именно к производству биологических инсектицидов для сельского хозяйства на основе нового штамма вируса ядерного полиэдроза (ВЯП), патогенного для личинок хлопковой совки (ХС), являющихся опасным вредителем хлопчатника и многих других культурных растений. Техническим результатом является получение нового штамма вируса ядерного полиэдроза с более высокой противовирусной активностью по отношению к хлопковой совке. Указанный технический результат достигается созданием штамма ХС-18 вируса ядерного полиэдроза хлопковой совки Helicoverpa armigera Hbn, депонированного в Государственной коллекции Роспотребнадзора возбудителей вирусных инфекций, риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор", имеющего регистрационный номер V-607 и используемого для получения инсектицидного препарата. Штамм ХС-18 содержит уникальные маркерные признаки для идентификации, полученные в результате анализа нуклеотидной последовательности генома указанного штамма HS-18 и касающиеся следующих нуклеотидов по району Orf119-like protein: 9/С; 50/G; 58/A; 64/A; 104/G; 117/C; 133/A; 138/G; 176/T; 210/G; 282/Т; 289/С; 384/С; 444/Т; 462/С, где в числителе указан номер нуклеотида, а в знаменателе - наименование нуклеотида. Инсектицидный препарат для борьбы с хлопковой совкой, включающий действующее вещество на основе штамма вируса ядерного полиэдроза, целевые добавки и воду. В качестве действующего вещества он содержит сухой концентрат штамма вируса ядерного полиэдроза хлопковой совки Helicoverpa armigera Hbn номер V-607 по п.1 формулы, а в качестве целевых добавок содержит глицерин и цеолит.

Description

(57) Изобретение относится к микробиологической промышленности и биотехнологии, а именно к производству биологических инсектицидов для сельского хозяйства на основе нового штамма вируса ядерного полиэдроза (ВЯЛ), патогенного для личинок хлопковой совки (ХС), являющихся опасным вредителем хлопчатника и многих других культурных растений. Техническим результатом является получение нового штамма вируса ядерного полиэдроза с более высокой противовирусной активностью по отношению к хлопковой совке. Указанный технический результат достигается созданием штамма ХС-18 вируса ядерного полиэдроза хлопковой совки НсПсоусгра агнндсга НЬп, депонированного в Государственной коллекции Роспотребнадзора возбудителей вирусных инфекций, риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ Вектор, имеющего регистрационный номер У-607 и используемого для получения инсектицидного препарата. Штамм ХС-18 содержит уникальные маркерные признаки для идентификации, полученные в результате анализа нуклеотидной последовательности генома указанного штамма Н§-18 и касающиеся следующих нуклеотидов по району ОгГ119-Ьке ρτοΐείη: 9/С; 50/0; 58/А; 64/А; 104/0; 117/С; 133/А; 138/0; 176/Т; 210/0; 282/Т; 289/С; 384/С; 444/Т; 462/С, где в числителе указан номер нуклеотида, а в знаменателе - наименование нуклеотида. Инсектицидный препарат для борьбы с хлопковой совкой, включающий действующее вещество на основе штамма вируса ядерного полиэдроза, целевые добавки и воду. В качестве действующего вещества он содержит сухой концентрат штамма вируса ядерного полиэдроза хлопковой совки НсПсоусгра а гниде га НЬп номер Υ-607 по π. 1 формулы, а в качестве целевых добавок содержит глицерин и цеолит.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и биотехнологии, а именно к производству биологических инсектицидов для сельского хозяйства на основе нового штамма вируса ядерного полиэдроза (ВЯП), патогенного для личинок хлопковой совки (ХС), являющихся опасным вредителем хлопчатника и многих других культурных растений.

Применение биологических средств защиты растений является экологически оправданным. В отличие от химических средств защиты, этот вирус вызывает заболевание и гибель только личинок хлопковой совки, не оказывая вредного воздействия на другие виды животных (насекомых и позвоночных). Кроме того, стоимость получения вируса в пересчете на обрабатываемую площадь оказывается сравнимой со стоимостью используемых в настоящее время химических пестицидов.

Известен ряд химических препаратов, применяемых для борьбы с хлопковой совкой. Например, известен препарат Регент, однако он является химическим препаратом и оказывает негативное влияние не только на вредителей, но и на человека и теплокровных животных.

Известен штамм ВЯП МатеЧга Ьга881сае (Ρά-1-5) ВКПМ νίπΐ5-1. используемый для производства инсектицидного препарата против капустной совки (АС СССР №1638161, МПК ί'Ί2Ν 7/00, опубл. 30.03.91). Биологическая активность препарата, полученного на основе штамма Ρά-1-5 для гусениц МатеЧга Ьгаккюае, составляет ЬИ50 0,2х10⁵ полиэдров на гусеницу.

Недостатком штамма Ρά-1-5 является низкая вирулентность по отношению к капустной совке МатеЧга Ьгаккюае и отсутствие значимой вирулентности по отношению к хлопковой совке НеПсоуегра агт1§ега НЬп.

Известен штамм ВЯП МатеЧга Ьгаккюае (КС-3-86) ГКВ №2155, используемый для производства инсектицидного препарата против капустной совки (патент РФ №2153258, МПК АО ΙΝ 63/00, опубл. 27.07.2000). Биологическая активность препарата, полученного на основе штамма КС-3-86 для гусениц МатеЧга Ьгаккюае, составляет (2,3-7,0)х 10² полиэдров на гусеницу.

Однако штамм КС-3-86 имеет недостаточную вирулентность по отношению к капустной совке МатеЧга Ьгаккюае и отсутствие значимой вирулентности по отношению к хлопковой совке НеПсоуегра агтщега НЬп.

Известен штамм ВЯП ХС-2, на основе которого получают препарат Вирин ХС-2 (ТУ 10.01.41-91). Он вызывает специфически направленную гибель хлопковой совки, безвреден для других животных, нетоксичен.

Однако указанный штамм имеет недостаточную противовирусную активность, требует двухкратных обработок посевов. Эффективность достигает 77%.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является штамм вируса ядерного полиэдроза ХС-17 (авторское название), который задепонирован в Коллекции культур микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ Вектор под регистрационным номером ΥΒ-06 (патент РФ № 2359031, МПК Θ12Ν7/00, опубл. 20.06.2009 г.). Предлагаемый штамм ХС-17 получен в результате селекции вируса, выделенного из гусениц, собранных на полях хлопчатника Таджикистана и погибших от спонтанного полиэдроза в лаборатории.

Однако штамм ВЯП ХС-17 также обладает недостаточной противовирусной активностью по отношению к хлопковой совке. Известен инсектицидный препарат на основе штамма ВЯП НШ-2-85, ГКВ N 2156, патогенного для личинок непарного шелкопряда (патент РФ №2117701, кл. Ο12Ν 7/00, опубл. 20.08.1998). Для получения препарата партию гусениц непарного шелкопряда по достижении ими четвертой возрастной стадии инфицируют ВЯП (штамм НШ-2-85) и скармливают зараженный корм гусеницам ШП. Затем личинки собирают, лиофилизируют и переносят в аппарат для удаления волосков, являющихся сильным аллергеном. Лишенные волосков лиофилизированные гусеницы размалывают для получения сухого вирусного порошка. В качестве наполнителя используют цеолит или кремниевую кислоту. Препарат в сухой форме представляет собой порошок белого цвета с титром не менее (2-5)х10⁹ полиэдров/г. Титр жидкой формы препарата составляет не менее 1х10⁹ полиэдров/мл. Биологическая активность препарата составляет 4х10² полиэдров/мл. Препарат использовался с титром 5х10⁷ полиэдров/г в виде водного 0,1%-ного раствора с ПАВ ОП-7. Расход препарата при наземно-очаговой обработке составляет 1,1-0,3 мл/га. Срок хранения препарата составляет 12 месяцев при температуре 46°С.

Недостатком известного препарата является недостаточная биологическая активность препарата, отсутствие значимой вирулентности по отношению к хлопковой совке и низкая стабильность при хранении, инсектицидный препарат против капустной совки на основе штамма ВЯП МатеЧга Ьгаккюае (КС-386) ГКВ №2155 (патент РФ №2153258, кл. Α01Ν 63/00, опубл. 27.07.2000). В качестве наполнителя используют цеолит или кремниевую кислоту. Препарат в сухой форме представляет собой порошок белого цвета с титром не менее (2-5)х 10⁹ полиэдров/г. Для получения жидкой формы препарата (в виде суспензии) перед применением сухой препарат растворяют в воде до нужной концентрации с добавлением поверхностно-активного вещества (ПАВ), например ОП-7. Титр жидкой формы препарата составляет не менее 1х 10⁹ полиэдров/мл. Биологическая активность препарата (ЛД50), полученного на основе штамма КС-3-86 для гусениц Матекйа Ьгаккюае, составляет (2,3-7,0)х 10⁴ полиэдров на гусеницу. Расход препарата при наземно-очаговой обработке составляет 1,1-0,3 мл/га. Срок хранения препарата составляет 12

- 1 025657 месяцев при температуре 4-6°С.

Недостатком препарата на основе штамма КС-3-86 является недостаточная вирулентность по отношению к капустной совке МатезНа Ьга^ысас. отсутствие значимой вирулентности по отношению к хлопковой совке и низкая стабильность при хранении.

Наиболее близким аналогом (прототипом) средства для борьбы с хлопковой совкой является препарат, включающий действующее вещество на основе штамма вируса ядерного полиэдроза, целевые добавки и вода (патент РФ №2396750, ΜΗΚΑ01Ν63/00, опубл. 20.08.2010 г.). В качестве действующего вещества он содержит сухой концентрат штамма вируса ядерного полиэдроза хлопковой совки НИИ ККМ ГНЦ ВБ Вектор УВ-06, а в качестве целевых добавок содержит альгинат натрия, бычий альбумин, аскорбиновую кислоту и хлорид кальция.

Однако данный препарат имеет недостаточную активность против хлопковой совки и требует высокотехнологичное оборудование при использовании на полях хлопчатника.

Техническим результатом является получение нового штамма вируса ядерного полиэдроза с более высокой противовирусной активностью по отношению к хлопковой совке и инсектицидный препарат на его основе.

Указанный технический результат достигается созданием штамма ХС-18 вируса ядерного полиэдроза хлопковой совки НеНсоуегра агтщега НЬп, депонированного в Государственной коллекции Роспотребнадзора возбудителей вирусных инфекций, риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ Вектор, имеющего регистрационный номер У-607 и используемого для получения инсектицидного препарата.

Указанный технический результат достигается также инсектицидным препаратом для борьбы с хлопковой совкой, включающем действующее вещество на основе штамма вируса ядерного полиэдроза и целевые добавки, согласно изобретению в качестве действующего вещества он содержит водную суспензию концентрата штамма вируса ядерного полиэдроза хлопковой совки НеНсоуегра агтщега НЬп номер У-607 по п. 1 формулы, а в качестве целевых добавок содержит глицерин и цеолит при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Глицерин

Цеолит

44.5- 45,5

9.5- 10,5 водная суспензия концентрата штамма вируса ядерного полиэдроза хлопковой совки

НеНсоуегра атицега НЬп помер У-607 с титром (3,0-5,0)х10^п полиэдров остальное до 100%

Штамм ХС-18 содержит уникальные маркерные признаки для идентификации, полученные в результате анализа нуклеотидной последовательности генома указанного штамма Ηδ-18 и касающиеся следующих нуклеотидов по району Ог£119-Нке ргсйет: 9/С; 50/0; 58/Α; 64/Α; 104/0; 117/С; 133/Α; 138/0; 176/Т; 210/0; 282/Т; 289/С; 384/С; 444/Т; 462/С, где в числителе указан номер нуклеотида, а в знаменателе - наименование нуклеотида.

Происхождение заявляемого штамма ХС-18.

Вирус ядерного полиэдроза хлопковой совки штамм ХС-18 получен в инсектарии отдела биофизики и экологических исследований ФБУН ГНЦ ВБ Вектор, Новосибирская область, Новосибирский район, р.п. Кольцово при активации латентной инфекции личинки 3 возраста лабораторной популяции хлопковой совки. Из погибшей от полиэдроза гусеницы был приготовлен гомогенат, из которого путем грубой очистки был выделен вирус ядерного полиэдроза. Собственно штамм был выделен путём слепого пятикратного пассирования образца на личинках НеНсоуегра агтщега путем заражения рег 08 и приготовления гомогената из погибших личинок. Из каждого пассажа для прохождения дальнейшего пассирования отбирался вирус, выделенный только из одной гусеницы погибшей от полиэдроза на 7-е сутки после инфицирования. К моменту патентования штамм ВЯП ХС 18 прошел 4 пассажа на гусеницах хлопковой совки лабораторной популяции при пероральном заражении.

Идентификация вируса проведена с помощью частичного секвенирования в лаборатории молекулярной эпидемиологии ФБУН ГНЦ ВБ Вектор. Штамм ХС-18 вируса ядерного полиэдроза хлопковой совки НеНсоуегра апшдега НЬп депонирован Государственной коллекции Роспотребнадзора возбудителей вирусных инфекций, риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ Вектор, имеющий регистрационный номер V607 (справка о депонировании прилагается).

Морфологическое описание.

Размеры полиэдров составляют: 0 1-3 мкм; размеры вирионов: 400x80 нм; размеры нуклеокапсидов 310x50 нм. ДНК кольцевая ковалентно замкнутая, мол.вес 121,7 МД.

Штамм обладает высокой репродуктивной активностью. Выход вируса составляет (1-6)х10⁹ полиэдров на гусеницу при его культивировании на личинках (НеНсоуегра апшдега НЬп.) 4-го возраста.

Высоко патогенен исключительно для вида НеНсоуегра агтщега (хлопковая совка) и абсолютно безопасен для других видов животных, включая класс Насекомые. Биологическая активность: 1дЛД50 = 1.23 ± 0.29 (на гусеницах 3-го возраста хлопковой совки лабораторной популяции), ЛВ50 = 4.3 суток при

- 2 025657 заражении дозой ЛД90.

Культивирование вируса.

Штамм бакуловируса ХС-18 размножают путем инфицирования личинок хлопковой совки и дальнейшего содержания их при температуре 28°С и влажности 60% на искусственной питательной среде (ИПС) в течение 14 дней. Состав ИПС: люцерновая мука - 88 г, кукурузная мука - 35 г, дрожжи кормовые - 44 г, аскорбиновая кислота - 4,4 г, бензойная кислота - 2,0 г, формалин (100 р-р) - 8 мл, агар -15 мл, вода дистиллированная - 788 мл.

Штамм хорошо хранится при плюс 4°С как в лиофильно высушенном виде, так и в 50%-ном водном растворе глицерина.

Определение полной нуклеотидной последовательности генома НеНсоуегра агш1§ега пис1еаг ро1уНеάτοδίδ уииз, штамм Н8-18.

Для установления генотипа штамма Н8-18 Не1|сотегра агш1§ега пис1еоро1уНейгоуииз образцы вирусного материала были четырежды пассированы на НеНсоуегра агш1§ега НЬп. и были исследованы методом неспецифического секвенирования на метагеномном секвенаторе 1оп ТоггепР При проведении анализа нуклеотидной последовательности генома штамм Н8-18 в работе был использован метод секвенирования ДНК на основе обнаружения ионов водорода. Данная технология реализована фирмой ЫРе ТесНпо1о§1ез в приборе 1оп Тоггеп! (РОМ). Эта технология отличается от других секвенирующих технологий тем, что в ней нет модифицированных нуклеотидов и не используются сложные оптические системы. В приборе используется полупроводниковая технология для определения ионного потока во время полимеразной цепной реакции. Данные по ионному потоку переводятся в нуклеотидные последовательности длиной до 200 п.н., а полученные нуклеотидные последовательности обрабатываются сервером и выстраиваются в элаймент. Полученные консенсусные последовательности сравниваются с прототипными последовательностями из международной базы данных ОепВапк. Геномная последовательность района Ог£119-Нке рго1еш НеНсоуегра агш1§ега пис1еоро1уНейгоуииз штамма Н8-18 представлена на чертеже. На чертеже приведено филогенетическое дерево, построенное для различных штаммов НеНсоуегра агш1§ега пис1еоро1уНейгоу1гиз. Штамм Н8-18 обозначен в рамке.

Н8-18 типирован как НеНсоуегра агш1§ега пис1еоро1уНейгоупиз. При сравнении с прототипным штаммом з!гат На8№У-О4 (Китай, 2010 г., §Ь Ν0_002654) процент гомологии составил 99%. Штамм Н8-18 по сравнению с наиболее близкими прототипами - штамм На8NРV-О4 и штамм NN§1 имеет нуклеотидные отличия по району Ог£119-Нке рго!ет (табл. 1). Указанные различия являются уникальными для Н8-18 и могут быть использованы для идентификации данного вируса.

Т аблица 1. Нуклеотидные отличия между различными штаммами НеНсоуегра агш1§ега пис1еоро1уНейгоупиз по району Ог£119-Нке рго1еш

50 58 64 104 117 133 138 176 210 282 289 384 444 462

Н5-18 ^с ё X λ ί с X ί ϊ β ϊ с с τ ё~

1X131375^с α * * ё с X Ψ ί ё ϊ ё ϊ ΐ ~

АР271059С ё X л ё Ε X ё ί X Е Е с т Е~

АР303045^с ё X X ё ё а е τ X ё ё~~ ё т ё~

1Ν584482 с ё X X ё τ X ё ΐ X ё т ё т ё~

АР010907^с ё X X ё ё X ё т ё т Е ё ё ё~ ”АР334030 ^т ё ~а X ё с X е с ё т ё ё т т^-

АР275264 тсссА~ссбсетсстт

Для сравнения были использованы следующие штаммы:

1X131375 НеНсоуегра аптйдега пис1еаг ро1уЬе<1го515 νίηΐδ, з(гат Вап§а1оге АР271059 НеНсоуегра агпидега пис1еаг роЬЬсйгоыз νίηΐϊ, з1гат 04 АР303045 НеНсоуегра атндега пис1еаг роЬЬеНгомк νϊπΐδ, з1гат С1 1Ν584482 НеНсоуегра аишдега ΝΡν з!гат Аиз1гаНа

АР010907 НеНсоуегра агппдега ΝΡν з1гат NN§1 АР334030 НеНсоуегра геа асгопут ΗζδΝΡν АР275264 НеНсоуегра геа зГгат δΝΡν

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Технология получения жидкой суспензии штамма ХС-18.

Технология вирусов ядерного полиэлроза т У1уо осуществляется по следующей схеме: выращивание насекомых, культивирование в них вирусов, сбор погибших гусениц, выделение вирусной биомассы и очистка полиэдров.

Отродившихся из яиц личинок хлопковой совки (НеНсоуегра агшгдега НЬп.) доращивают до четвер- 3 025657 того возраста и инфицируют вирусом ядерного полиэдроза (штамм ХС-18). Для этого искусственную питательную среду (ИПС) в чашках Петри диаметром 90 мм (по 25 мл в 1 чашке) опрыскивают вирусной суспензией штамма ХС-18 из расчета 1 мл с титром 2х10⁵ полиэдров/мл на 60 кв.см поверхности и скармливают зараженную ИПС гусеницам хлопковой совки (ХС) примерно по 0,2 г на 1 гусеницу. Инфицированных таким образом гусениц ХС содержат при 27±1,5°С и влажности 65%. Время инкубирования инфицированных гусениц 8-10 дней. При этом гибель насекомых составляет не менее 75%. Затем личинки собирают с помощью вакуумного насоса с давлением (8,7±0,1)х10⁴ Па в посуду из толстостенного стекла, добавляют раствор диэтилтиокарбоната натрия до конечной концентрации 0,1% и хранят при температуре от плюс 5 до плюс 10°С не более года. Для очистки вируса к биомассе из погибших гусениц добавляют дистиллированную воду и размельчают с помощью гомогенизатора. Полученный гомогенат фильтруют через 2 слоя капроновой ткани с ячейками 0,1 мм. Затем из фильтрата осаждают крупные остатки тканей центрифугированием в течение 0,5 мин при 500 об/мин. Из супернатанта осаждают очищенный вирус двойным центрифугированием 10 мин при 5000 об/мин.

Осадок суспендируют в малом объеме 50% раствора глицирина. Титр живых вирусов в полученной вирусной суспензии составляет не менее 5х10⁹ полиэдров/мл.

Пример 2. Сравнительные данные биологической активности заявляемого штамма ВЯП ХС-18 и штаммов-аналогов.

Для получения сравнительных данных параллельно из разных партий гусениц, инфицированных разными штаммами вирусов, получают вирусный материал известных штаммов ХС-17, КС-3-86 и заявляемого штамма ХС-18.

Биологическую активность известных и заявляемого штаммов оценивали путем определения величины ЛД50 - дозы вируса (полиэдров на гусеницу), вызывающей гибель 50% инфицированных насекомых, и ЛВ50 время (в сутках), за которое погибает 50% гусениц, инфицированных дозой 10⁵ полиэдров/гусеницу (пэ/гус). Расчет проводили по методу Кербера, гибель насекомых определяли с поправкой по формуле Аббота (Ашмарин И.П., Воробьев А.А.// Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Медгиз, 1962, с. 82-93). Данные приведены в табл. 1.

Анализ табл. 2 показывает, что заявляемый штамм ХС-18 патогенен для гусениц ХС, причем его активность превышает активность известных штаммов КС-3-86 и ВЯП ХС (штамм ХС-17).

Таблица 2. Сравнительные данные по биологической активности штаммов

Пример 3. Исследование токсичности и патогенности вирусного штамма ХС-18.

Проведена медико-токсикологическая оценка вируса ядерного полиэдроза штамм ХС-18. Испытания безопасности для теплокровных выполнены в соответствии с Методическими указаниями по оценке новых пестицидов. МЗ СССР, 1988 г. и рекомендациями ВОЗ/ФАО, Женева, 1975 г. по испытанию безопасности бакуловирусов.

Проведены эксперименты по выявлению токсичности-патогенности ВЯП штамм ХС-18 на мышах. 5 группам мышей (массой 18-20 г) по 10 в каждой. Вводили суспензию вируса с титром 2х10⁹ пэ/мл в желудок и в брюшину из расчета по 1 мкл вирусной суспензии на 1 г веса. Контрольной группе вводили раствор 0,9% ЫаС1 по 0,2 мл.

Установлено, что введение дозы 1 мкл на 1 г или 1000 мг на 1 кг веса не приводит к гибели животных ни при введении в желудок, ни при внутрибрюшинном введении. Термометрия, взвешивание, гематологические исследования живых мышей не выявили существенных отклонений от физиологической нормы. Серологические исследования, проведенные иммуноферментным и иммунофлуоресцентным методом, не выявили специфического бакуловирусного антигена ВЯП ХС в крови и органах животных на 28-й день обследования.

Кожно-резорбтивное действие изучалось на гвинейских свинках при разовом и многократном нанесении суспензии штамма ХС-18 на неповрежденную и скарифицированную кожу. Контрольным группам наносили 0,9% ЫаС1.

Было установлено, что во всех случаях однократное нанесение не вызывало заметных местных или общих реакций у животных при воздействии всеми испытуемыми материалами. Также не выявлено от- 4 025657 клонений от показателей в опытных группах при термометрии или взвешивании животных в течение 14 дней. Многократное нанесение на скарифицированную кожу сопровождалось местной реакцией раздражения, которое проходило через 2-3 дня после окончания воздействия.

Изучение раздражающего действия вируса на слизистую глаз кроликов показало, что однократное воздействие не вызывает раздражение слизистых, а многократное приводило к развитию конъюнктивитов. Выздоровление наступало через 3-4 дня после последнего воздействия. Повреждений роговицы и повышения температуры не отмечено.

Инфекционная оценка вируса проведена на теплокровных. Исследования проводили на культуре клеток эмбриональной ткани человека (ЧЭТ). Культуры инфицировали вирионами ВЯП ХС по 0,02 мл на пробирку с титром 1/512 по ИФА. Было проведено 7 пассажей патогенов. С помощью ИФА и ИФ-метода выявляли возможную адаптацию или репродукцию вируса. Установлено, что инфицирование ЧЭТ вирионами ВЯП ХС не приводит к цитопатическим изменениям монослоя клеток. В процессе пассажей исходного материала специфический антиген в культурах не выявлялся.

В результате проведенных исследований установлено, что вирусный антиген в крови и во внутренних органах теплокровных животных не накапливается и обычно элиминируется из организма к 7-14 дню после введения. Во всех случаях визуальные наблюдения и термометрия не выявили отклонений от физиологической нормы.

Таким образом, результаты исследования токсичности-патогенности вирусного штамма ХС-18 показали, что он нетоксичен для теплокровных, не репродуцируется в теплокровном организме, не вызывает инфекционного процесса.

Пример 4. Составы препарата против хлопковой совки.

Состав 1, мас.%:

Глицерин 44,5

Цеолит 9,5 водная суспензия концентрата штамма вируса ядерного полиэдроза хлопковой совки НеПсоуегра аптпдега 11Ьп номер У-607 с ги гром 3,0х 10¹¹ полиэдров 46,0

Глицерин 45,0

Цеолит 10,0

Состав 2, мас.%:

водная суспензия концентрата штамма вируса ядерного полиэдроза хлопковой совки НеПсоуегра аптпдега НЬп номер У-607 с ги гром 4,0 х 10¹¹ полиэдров 45,0

Состав 3, мас.%:

Глицерин 45,5

Цеолит 10,5 водная суспензия концентрата штамма вируса ядерного полиэдроза хлопковой совки НеПсоуегра агшЦега НЬп помер У-607 с гигром 5,0 х10¹¹ полиэдров 44,0

Пример 5. В табл. 3 приведены технические характеристики заявляемого инсектицидного препарата с использованием штамма ХС-18.

Таблица 3. Технические характеристики заявляемого препарата

Препарат используется в виде жидкой суспензии, полученной в соответствии с составами 1-3 примера 4.

- 5 025657

Схема применения препарата приведена в табл. 4

Таблица 4. Схема применения препарата ВИРИН ХСК

1.	Спектр действия	контроль за численностью вредителя хлопка хлопковой совки.
2.	Сфера применения	Сельское хозяйство, защита растений
2.1.	Культуры	хлопок
2.2.	Вредные объекты (с латинскими названиями) или назначение	Хлопковая совка (НеНапегра агпицега НЬп.)
3.	Рекомендуемые регламенты применения
3,1.	Срок проведения обработок	Начало отрождения личинок хлопковой совки из яиц.
3.1.2.	Фаза развития защищаемой культуры	Не существенна
3.1.3.	Фазы развития (стадия) вредного организма	яйцекладки, личинки 1-3 возраста
3.2.	Кратность обработок	двукратная
3.3,	Интервал между обработками	5 суток
4.	Рекомендуемая норма расхода	3 г исходной пасты на 1 га при использовании тракторного дисперсного опрыскивателя ОВХ28.
	Способ применения	Вариант А (немасштабная обработка) 1. В емкость объёмом 1,5 л поместить 9 г исходного субстрата препарата ВИРИН ХСК, добавить 0,5 л воды, тщательно перемешать. 2. Добавить к полученному раствору 0,2 л

- 6 025657

		5 % Иа-КМЦ, тщательно перемешать. 3. Добавить к полученному раствору 0,6 л воды, тщательно перемешать. 4. Полученный в результате раствор развести в 600 л воды в тракторных бочках - это рабочий раствор для обработки 3 га хлопкового поля. 5. Обработку полей следует проводить вечером, после захода солнца (после 19 ч.). Вариант Б (масштабная обработка) 1. В емкость смесителя объёмом 700 л поместить 3 кг исходного субстрата препарата ВИРИН ХСК, добавить 200 л воды, тщательно перемешать. 2. Добавить к полученному раствору 200 л 5 % Иа-КМЦ, тщательно перемешать. 3. Добавить к полученному раствору 100 л воды, тщательно перемешать. 4. Полученный в результате раствор расфасовать по емкостям объемом 1,5 л 5. Одну порцию (1,5 л), расфасованного таким образом раствора перед применением развести в 600 л воды в тракторных бочках - это рабочий раствор для обработки 3 га хлопкового ПОЛЯ. 6. Обработку полей следует проводить вечером, после захода солнца (после 19 ч.).
5.	Рекомендуемый срок ожидания (в днях до сбора урожая)	Работа на полях допускается уже на следующий день после обработки.
6.	Вид (механизм) действия на вредные организмы	инфицирование целевого насекомого через пищеварительный тракт (алиментарно)
6.1.	Системный	-

- 7 025657

6.2.	Контактный	-
6.3.	Иной	-
7.	Период защитного действия	в течение всего сезона после обработки
8.	Селективность	препарат патогенен только для хлопковой совки и не оказывает никакого влияния на другие виды животных
9.	Скорость воздействия	5-11 суток
10.	Совместимость с другими препаратами	Совместим с любыми препаратами, но при использовании исключительно биологических средств защиты растений проявляет большую продолжительность действия.
и.	Биологическая эффективность	90%
11.1.	Лабораторные и вегетационные опыты	ЛД 50 при индивидуальном заражении составила 0,0001 мкл исходного препарата на 1 гусеницу
11.2.	Полевые опыты	90 %, при расходе 40 мл исходного препарата на 1 га посевов хлопка
12.	Фитотоксичность, толерантность защищаемых культур	Не оказывает никакого влияния на защищаемые культуры
13.	Возможность возникновения резистентности	Развитие резистентности хлопковой совки к препарату за 30 лет наблюдений не отмечена.
14.	Возможность варьирования культур в севообороте	Применение данного препарата никаких ограничений на варьирование культур в севообороте не требует
15.	Результаты оценки биологической эффективности и безопасности в других странах	Биологическая эффективность 91,5 %
15.1.	Страна	Республика Узбекистан
15.2.	Защищаемая культура	Хлопок
15.3.	Вредный организм	Хлопковая совка (НеИсочегра агт^ега НЬп.)
16.	Результаты определения остаточных количеств в	По данным австралийских исследователей препарат сохранял в почве свою активность в
	других странах (в динамике)	течение 6 лет.
17.	Влияние препарата на полезную энтомофауну защищаемого агроценоза	Не оказывает влияния на полезную энтомофауну защищаемого агроценоза

Таким образом, из вышеизложенного следует, что в заявляемом техническом решении достигается технический результат, а именно, получен новый штамм ХС-18 вируса ядерного полиэдроза и на его основе инсектицидный препарат с более высокой противовирусной активностью по отношению к хлопковой совке.

Claims (2)

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Штамм вируса ядерного полиэдроза хлопковой совки НеБсоуетра агтщега НЬБ, депонированный в Государственной коллекции Роспотребнадзора возбудителей вирусных инфекций, риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ Вектор, имеющий регистрационный номер У-607 и используемый для получения инсектицидного препарата.

2. Инсектицидный препарат для борьбы с хлопковой совкой, включающий действующее вещество на основе штамма вируса ядерного полиэдроза и целевые добавки, отличающийся тем, что в качестве действующего вещества он содержит водную суспензию концентрата штамма вируса ядерного полиэдроза хлопковой совки НеБсоуетра агтщега НЬп номер У-607 по п. 1 формулы, а в качестве целевых добавок содержит глицерин и цеолит при следующем соотношении компонентов, мас.%: глицерин 44,5-45,5; цеолит 9,5-10,5; водная суспензия концентрата штамма вируса ядерного полиэдроза хлопковой совки НеБсоуетра агтщега НЬп номер У-607 с титром (3,0-5,0)х 10¹¹ полиэдров - остальное до 100%.