RU2662960C1 - Штамм вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда Lymantria dispar L., используемый для получения инсектицидного препарата - Google Patents
Штамм вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда Lymantria dispar L., используемый для получения инсектицидного препарата Download PDFInfo
- Publication number
- RU2662960C1 RU2662960C1 RU2017143083A RU2017143083A RU2662960C1 RU 2662960 C1 RU2662960 C1 RU 2662960C1 RU 2017143083 A RU2017143083 A RU 2017143083A RU 2017143083 A RU2017143083 A RU 2017143083A RU 2662960 C1 RU2662960 C1 RU 2662960C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- lymantria dispar
- nuclear polyhedrosis
- drug
- caterpillars
- Prior art date
Links
- 241000721703 Lymantria dispar Species 0.000 title claims abstract description 26
- 241000701366 unidentified nuclear polyhedrosis viruses Species 0.000 title claims description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 title abstract description 23
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title abstract description 23
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 8
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 title description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 21
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 claims abstract description 4
- 208000034712 Rickettsia Infections Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 claims abstract description 3
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 claims description 29
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 15
- 230000001018 virulence Effects 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 206010061495 Rickettsiosis Diseases 0.000 abstract 1
- 240000001307 Myosotis scorpioides Species 0.000 description 29
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 13
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 11
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 5
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 5
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000035613 defoliation Effects 0.000 description 4
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701409 Lymantria dispar multiple nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- FWWGXZYUURXJLK-UHFFFAOYSA-N glycyrin Chemical compound C=1C=2C(OC)=C(CC=C(C)C)C(OC)=CC=2OC(=O)C=1C1=CC=C(O)C=C1O FWWGXZYUURXJLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 2
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000011076 safety test Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 2
- 241000701412 Baculoviridae Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- QDHHCQZDFGDHMP-UHFFFAOYSA-N Chloramine Chemical compound ClN QDHHCQZDFGDHMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010010741 Conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- 241000905789 Lactobacillus larvae Species 0.000 description 1
- 241000218652 Larix Species 0.000 description 1
- 235000005590 Larix decidua Nutrition 0.000 description 1
- 208000032420 Latent Infection Diseases 0.000 description 1
- 241000124033 Salix Species 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000256247 Spodoptera exigua Species 0.000 description 1
- 231100000605 Toxicity Class Toxicity 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 229910021536 Zeolite Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- HNPSIPDUKPIQMN-UHFFFAOYSA-N dioxosilane;oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O HNPSIPDUKPIQMN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037771 disease arising from reactivation of latent virus Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000967 entomopathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 230000000622 irritating effect Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002161 passivation Methods 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000027272 reproductive process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- RMAQACBXLXPBSY-UHFFFAOYSA-N silicic acid Chemical compound O[Si](O)(O)O RMAQACBXLXPBSY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000004861 thermometry Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 description 1
- 239000010457 zeolite Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N25/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой штамм вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда Lymantria dispar L. НШ-07, используемый для получения инсектицидного препарата и депонированного в государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под номером V-799. Изобретение позволяет произвести инсектицидный препарат с большей вирулентностью по отношению к непарному шелкопряду. 1 табл., 4 пр.
Description
Изобретение относится к микробиологической промышленности и биотехнологии, а именно к производству биологических инсектицидов для лесного и сельского хозяйства на основе нового штамма вируса ядерного полиэдроза (ВЯП), патогенного для личинок непарного шелкопряда (НШ), являющихся опасным вредителем лиственичных лесов.
Вирус ядерного полиэдроза непарного шелкопряда (Lymantria dispar nuclear polyhedrosis virus) относится к семейству бакуловирусов (Baculoviridae).
ВЯП НШ может быть использован как активная основа энтомопатогенного препарата для подавления вспышек массового размножения непарного шелкопряда Lymantria dispar L. (синоним Porthetria dispar, http://www.sevin.ru/invasive/invasion/insects/settled/lymantria_dispar.html). Применение подобного препарата является экономически и экологически оправдано, поскольку, во-первых, стоимость препарата, созданного на основе ВЯП НШ, в пересчете на обрабатываемую площадь оказывается ниже, чем стоимость используемых в настоящее время химических пестицидов; во-вторых, вызывая заболевание и гибель только личинок непарного шелкопряда, он не оказывает вредного воздействия на другие виды животных (насекомых и позвоночных).
Известен штамм S-13-p ВЯП Lymantria dispar L. (он же Porthetria dispar), используемый для производства вирусного инсектицидного препарата против непарного шелкопряда Вирин-ЭНШ и полученный путем адаптации ВЯП ивовой волянки к НШ (Итоги и перспективы производства и применения вирусных препаратов в сельском и лесном хозяйстве. Сб., М., 1984, с. 3-14). Биологическая активность препарата, полученного на основе штамма S-13-p, для гусениц Porthetria dispar имеет ЛК50 4×105 полиэдров на гусеницу.
Недостатком штамма S-13-p ВЯП является низкая вирулентность по отношению к гусеницам непарного шелкопряда Lymantria dispar L. (он же Porthetria dispar).
Известен штамм ВЯП Lymantria dispar L. (он же Porthetria dispar (Pd-1-5) ВКПМ virus-1, используемый для производства инсектицидного препарата против непарного шелкопряда (Авторское свидетельство СССР №1638161, МПК С12N 7/00, опубл. 30.03.91). Биологическая активность препарата, полученного на основе штамма Pd-1-5, для гусениц Lymantria dispar L. имеет ЛК50 0,2⋅105 полиэдров на гусеницу.
Недостатком штамма Pd-1-5 является низкая вирулентность по отношению к гусеницам непарного шелкопряда Lymantria dispar L.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является штамм ВЯП НШ-2-85 (авторское название) Lymantria dispar L. для производства инсектицидного препарата, который обладает большей вирулентностью по отношению к непарному шелкопряду по сравнению с вышеприведенными аналогами (патент РФ №2117701, МПК C12N 7/00, опубл. 20.08.1998 г.). Штамм ВЯП НШ-2-85 депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского под номером ГКВ №2156. Родословная штамма: штамм НШ-2-85 (ГКВ N 2156) получен путем перемежающих пассажей на гусеницах непарного шелкопряда различных популяций (оренбургской, московской, тюменской) вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда, выделенного из павших в инсектарии ГНЦ ВБ "Вектор" гусениц непарного шелкопряда вследствие спонтанного полиэдроза в 1985 году.
Однако и такой штамм ВЯП НШ-2-85 обладает недостаточной вирулентностью по отношению к гусеницам непарного шелкопряда Lymantria dispar L.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание такого нового штамма ВЯП Lymantria dispar L. для производства инсектицидного препарата, который обладал бы большей вирулентностью по отношению к непарному шелкопряду по сравнению с известными аналогами и прототипом.
Указанный технический результат достигается созданием штамма вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда Lymantria dispar L. НШ-07, используемого для получения инсектицидного препарата и депонированного в государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под номером V-799.
Штамм ВЯП НШ-07 выделен в августе 2015 г. из личинки непарного шелкопряда (гомогената гусеницы) лабораторной популяции, погибшей от активации латентной инфекции (Новосибирская область, Новосибирский район, р.п. Кольцово) с использованием метода слепого пятикратного пассирования образца на личинках (Lymantria dispar L.) путем заражения per os и приготовления гомогената из погибших личинок после каждого пассажа.
Идентификация штамма ВЯП НШ-07 проведена во ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Полногеномное секвенирование проведено с помощью технологии MiSEQ (Illumina). Среднее покрытие составило 49.7. Сборка генома проводилась картированием на референс-последовательность с помощью алгоритма BWA (v. 0.7.15). Работа выполнена Шваловым А.Н. в лаборатории вирусологии флавивирусов отдела молекулярной вирусологии флавивирусов и вирусных гепатитов.
Пассирование заявляемого штамма вируса ядерного полиэдроза НШ-07 с использованием метода массового отбора.
На первом этапе в течение 5 пассажей при индивидуальном заражении личинок 4-го возраста дозой 1×105 пэ/гус. отбирали гусениц, погибших в течение 9 суток от момента заражения, и выделяли из них вирус, который использовали для следующего пассажа.
На втором этапе снижали дозу заражения личинок непарного шелкопряда 4-го возраста до 1×104 и на протяжении 4 пассажей отбирали гусениц по тому же принципу.
На третьем этапе инфицировали личинок 5 возраста дозой 1×104 и для каждого следующего инфицирования отбирались гусеницы, погибшие от полиэдроза на 7-10 сутки после заражения при предыдущем инфицировании.
В результате использования метода массового отбора активность заявляемого штамма стала на 60% выше, чем у наиболее активного аналога (штамма НШ-2-85).
Число пассажей к моменту паспортизации и депонирования: штамм прошел 11 пассажей на гусеницах непарного шелкопряда при заражении перорально.
Характеристика штамма.
Культурально-морфологические особенности штамма. Размеры полиэдров (мкм): ∅ 5-10, размеры вирионов (нм): 400×80, нуклеокапсидов 310×50 нм. Штамм обладает высокой репродуктивной активностью, хорошо хранится при плюс 4°С. Оптимальные культуры насекомых для культивирования Lymantria dispar L.
Способ, условия и состав сред для размножения. Штамм бакуловируса НШ-07 размножают путем инфицирования личинок непарного шелкопряда и дальнейшего содержания их при температуре 25°С и влажности 60% на искусственной питательной среде (ИПС) в течение 18 суток. Состав ИПС: соевая мука - 15 г, кукурузная мука - 75 г, дрожжи кормовые - 30 г, аскорбиновая кислота - 4,5 г, бензойная кислота - 5,0 мл, агар - 6 г, вода дистиллированная - 351 мл.
Активность (продуктивность) штамма. Выход вируса составляет 5×108 полиэдров на гусеницу при его культивировании на личинках Lymantria dispar L. 4-го возраста.
Биохимическая активность. Чувствителен к эфиру, формалину, хлорамину, хлороформу; не чувствителен к ацетону.
Серологические свойства. Белковый состав вируса: состоит из 34 полипептидов. Молекулярный вес основных полипептидов: от 18 до 75 МД.
Генетические характеристики штамма. ДНК кольцевая ковалентно-замкнутая. Длина генома 158,9 т.п.н. Доля GC - 57.46%. Установлены сайты рестрикции (количество) для HindIII - 20, EcoRI - 20, PstI - 75, BamH1 - 14. Ближайшая опубликованная полная последовательность - КМ386655.1 (Lymantria dispar multiple nucleopolyhedrovirus strain 3029, complete genome) - 1574 замены.
Вирулентность (патогенность). Для человека не патогенен.
Патогенность для животных. Высоко патогенен исключительно для личинок непарного шелкопряда Lymantria dispar L. и абсолютно безопасен для других видов животных, включая класс Насекомые.
Для растений не патогенен.
Антигенные свойства штамма: преципитирующая активность антисыворотки с гомологичным вирусом методом двойной иммунодиффузии составляет 1/32.
Способ хранения. Штамм хранится при -30°С в виде очищенных и лиофильно высушенных при -20°С полиэдров.
Штамм вируса также хранят в погибших гусеницах, помещенных в 50% водный раствор глицирина при Т=4°С.
Проверка жизнеспособности культуры. Биологическая активность штамма ВЯП НШ-07 составляет lgЛД50=2.40±0.22 (на гусеницах 3-го возраста непарного шелкопряда лабораторной популяции), ЛВ50=7.5 суток при заражении дозой ЛД90. Выход вируса при заражении гусениц 4-го возраста 2-6×108 полиэдров на гусеницу.
Пересев вируса осуществляют путем инфицирования личинок непарного шелкопряда и дальнейшего содержания их при температуре 25°С и влажности 60% на искусственной питательной среде (ИПС). Состав ИПС: соевая мука - 15 г, кукурузная мука - 75 г, дрожжи кормовые - 30 г, аскорбиновая кислота - 4,5 г, бензойная кислота - 5,0 мл, агар - 6 г, вода дистиллированная - 351 мл.
Пример 1. Технология получения вирусного инсектицидного препарата. Технология производства вирусных препаратов осуществляется по следующей схеме: выращивание насекомых, культивирование в них вирусов, сбор погибших гусениц, выделение вирусной биомассы и получение готового продукта.
Партию гусениц непарного шелкопряда по достижению ими четвертой возрастной стадии инфицируют вирусом ядерного полиэдроза (штамм НШ-07). Для этого искусственную питательную среду (корм) опрыскивают вирусной суспензией штамма НШ-07 (рег. №V-799) с титром 1-2×107 полиэдров/мл и скармливают зараженный корм гусеницам НШ. Гусениц НШ содержат при 28±1°С и влажности 65%. Время инкубирования инфицированных гусениц 11-12 дней. При этом гибель насекомых составляет не менее 75%. Затем личинки собирают и замораживают при минус 20°С в течение 18 часов, лиофилизируют и переносят в аппарат для удаления волосков, являющихся сильным аллергеном. Аппарат представляет собой специальный барабан для стряхивания волосков, которые затем удаляют посредством вакуумной системы. Лишенные волосков лиофилизированные гусеницы размалывают для получения сухого вирусного порошка. В качестве наполнителя используют цеолит или кремниевую кислоту. Препарат в сухой форме представляет собой порошок белого цвета с титром не менее (2-5)×109 полиэдров/г. Для получения жидкой формы препарата (в виде суспензии) перед применением сухой препарат растворяют в воде до нужной концентрации с добавлением поверхностно-активного вещества (ПАВ), например ОП-7. Титр жидкой формы препарата составляет не менее 1×109 полиэдров/мл. Расход препарата при наземно-очаговой обработке составляет 1,1±0,3 мл/га.
Пример 2. Исследование токсичности и патогенности вирусного препарата на основе штамма НШ-07 (per. V-799).
Проведена инфекционно-токсикологическая оценка препарата на основе штамма НШ-07 (рег. №V-799). Испытания безопасности для теплокровных выполнены в соответствии с «Методическими указаниями по оценке новых пестицидов. МЗ СССР, 1988 г.» и рекомендациями ВОЗ/ФАО, Женева 1975 г. по испытанию безопасности бакуловирусов.
Проведены эксперименты по выявлению токсичности-патогенности препарата на мышах. 5 группам мышей по 10 в каждой вводили суспензию препарата в желудок и в брюшину из расчета по 1 мг препарата на 1 г веса, а в контрольной группе - внутрибрюшинно (физраствор).
Введение дозы 1000 мг на 1 кг веса не приводит к гибели животных при введении в желудок. Внутрибрюшинное введение вызывало гибель отдельных животных. При вскрытии обнаружены кремнийсодержащие конгломераты в месте введения и частично в брюшной полости. Гибель животных вызвана токсичным действием наполнителей. При внутрибрюшинном введении LD50 находится за пределами 1500 мг/кг, что по гигиенической классификации токсичности пестицидов расценивается как малотоксичное вещество (4 группа).
Кожно-резорбтивное действие изучалось на морских свинках при разовом и многократном воздействии препарата на основе штамма НШ-2-85, а также его действующего начала на неповрежденную и скарифицированную кожу. Однократное или многократное нанесение препарата на поврежденную кожу каких-либо заметных реакций на месте введения или в организме животных не вызывало. На скарифицированной коже однократное нанесение реакций не вызывало, а в процессе многократного воздействия отмечалось местное раздражение, которое исчезало через 2-3 дня после окончания воздействия.
Изучение раздражающего действия препарата на слизистую глаз кроликов показало, что однократное воздействие не вызывает раздражение слизистых, а многократное приводило к развитию конъюнктивитов. Выздоровление наступало через 5-7 дней после последнего воздействия.
Инфекционная оценка препарата проведена на теплокровных. Для осуществления экспериментов предварительно изготавливают специфические ингредиенты: гипериммунные кроличьи сыворотки против ВЯП НШ, выделяют IgG на их основе, разрабатывают и получают эритроцитарные диагностикумы для использования в иммунологических реакциях РПГА и РОПГА.
Эксперименты проводили на белых мышах 18-20 г, которым вводили суспензию полиэдров ВЯП НШ в желудок, внутрибрюшинно и интраназально по 0,2, 0,5 и 0,4×109 полиэдров/мл соответственно. Контрольной группе вводили по 0,5 мл физраствора в брюшину. Животных термометрировали и в динамике исследовали сыворотку крови на наличие антител и антигена во внутренних органах животных.
Во всех случаях визуальные наблюдения и термометрия не выявили отклонений от физиологической нормы. С помощью РПГА в сыворотках крови выявляли антитела в невысоких титрах на 5, 7-9 дни при всех способах введения. У животных с помощью РОПГА выявляли специфический бакуловирусный антиген в постепенно убывающих количествах до 7 суток. Такая динамика подтверждает активную элиминацию антигена из организма и отсутствие репродуктивного процесса.
Таким образом, результаты исследования токсичности-патогенности вирусного препарата на основе штамма НШ-2-85 (ГКВ N 2156) показали, что препарат можно отнести к малотоксичным веществам по гигиенической классификации (LD50 более 1000 мг/кг). Действующее начало препарата ВЯП НШ-07 не токсично для теплокровных, не репродуцируется в теплокровном организме, не вызывает инфекционного процесса.
Пример 3. Испытание опытного образца вирусного препарата на основе штамма НШ-07 (регистрационный номер V-799).
Испытания проведены на участках лесного фонда Шебалинского лесничества Республики Алтай против личинок (2-3 возрастов) непарного шелкопряда (Lymantria dispar L.). Препарат использовался с титром 1×108 полиэдров/мл в виде 3,2%-ного раствора в 32%-ном водном растворе глицерина. Всего была обработана территория площадью 20 га. Расход препарата составил 0,1 л/га. Общий расход препарата составил 2 л. Обработка проводилась при помощи аэрозольной установки ГАРД на базе автомобиля Урал-4320.
Эффективность действия препарата определяли по степени дефолиации обработанных участков в сравнении с контрольными (не обработанными) участками и по наличию непарного шелкопряда.
Результаты обследования показали, что на опытных участках непарный шелкопряд отсутствовал и признаков дефолиации обнаружено не было. На контрольных участках на деревьях присутствовали куколки и гусеницы непарного шелкопряда 5-6 возрастов, дефолиация составляла 60±10%.
Использование опытного образца вирусного препарата на основе штамма НШ-07 против гусениц непарного шелкопряда, достигших 2-3 возрастов, позволяет эффективно контролировать численность этого вредителя леса и не допускать дефолиации деревьев.
Препарат удобен для применения в полевых условиях с использованием аэрозольных опрыскивателей, является экологически чистым и обладает избирательным действием к целевому насекомому - непарному шелкопряду (Lymantria dispar L.).
Пример 4. Сравнительные данные биологической активности заявляемого штамма НШ-7-12 и штаммов-аналогов.
Для получения сравнительных данных параллельно из разных партий гусениц, инфицированных разными штаммами вирусов, получают вирусный материал на основе известных штаммов S-13-p, Pd-1-5 и НШ-2-85 и заявляемого штамма НШ-7-12.
Биологическую активность штаммов вирусов оценивают путем определения величины ЛД50 - дозы вируса (полиэдров на гусеницу), вызывающей гибель 50% инфицированных насекомых, и ЛВ50 - время (в сутках), за которое погибает 50% гусениц, инфицированных дозой 107 полиэдров/гусеницу (пэ/гус). Расчет проводят по методу Кербера, гибель насекомых определяют с поправкой по формуле Аббота (Ашмарин И.П., Воробьев А.А. // Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Медгиз, 1962, с. 350). Данные приведены в таблице (ЛВ50 по каждому штамму находится в интервале 7-8 суток).
Анализ таблицы показывает, что заявляемый штамм НШ-7-12 позволяет получить вирусный инсектицидный препарат, который патогенен для гусениц НШ Lymantria dispar L. По своей активности он в 1,6 раза превосходит инсектицид на основе известного наиболее близкого аналога штамма НШ-2-85 (прототипа) и на порядки превышает инсектициды, полученные на основе штаммов-аналогов S-13-p и Pd-1-5.
Claims (1)
- Штамм вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда Lymantria dispar L. НШ-07, используемый для получения инсектицидного препарата и депонированный в государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под номером V-799.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017143083A RU2662960C1 (ru) | 2017-12-08 | 2017-12-08 | Штамм вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда Lymantria dispar L., используемый для получения инсектицидного препарата |
| EA201800510A EA036087B1 (ru) | 2017-12-08 | 2018-08-22 | Штамм вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда lymantria dispar l., используемый для получения инсектицидного препарата |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017143083A RU2662960C1 (ru) | 2017-12-08 | 2017-12-08 | Штамм вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда Lymantria dispar L., используемый для получения инсектицидного препарата |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2662960C1 true RU2662960C1 (ru) | 2018-07-31 |
Family
ID=63142417
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017143083A RU2662960C1 (ru) | 2017-12-08 | 2017-12-08 | Штамм вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда Lymantria dispar L., используемый для получения инсектицидного препарата |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EA (1) | EA036087B1 (ru) |
| RU (1) | RU2662960C1 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2729465C1 (ru) * | 2019-11-05 | 2020-08-06 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Комплексный биологический инсектицидный препарат против непарного шелкопряда Lymantria dispar |
| RU2798221C1 (ru) * | 2023-04-17 | 2023-06-19 | Александр Александрович Агеев | Штамм вируса цитоплазматического полиэдроза сибирского шелкопряда Dendrolimus sibiricus Tschetw и инсектицидный препарат на его основе |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1638161A1 (ru) * | 1988-12-08 | 1991-03-30 | Всесоюзный Научно-Исследовательский Институт Биотехнологии | Штамм вируса дерного полиэдроза дл производства инсектицидного препарата |
| RU2117701C1 (ru) * | 1996-07-31 | 1998-08-20 | Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" | Штамм вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда lymantria dispar l., используемый для получения инсектицидного препарата |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5420031A (en) * | 1993-02-08 | 1995-05-30 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Gypsy moth virus with enhanced polyhedra production stability |
| ID20839A (id) * | 1997-07-09 | 1999-03-11 | American Cyanamid Co | Bahan acuan pestisida berlapis lebih baik, pengolahan pada pembuatannya serta komposisi-komposisi yang terkandung di dalamnya |
| US5882913A (en) * | 1997-08-07 | 1999-03-16 | The United States Of American As Represented By The Secretary Of Agriculture | Strain of gypsy moth virus with enhanced polyhedra and budded virus production |
| EP1692280A4 (en) * | 2003-11-10 | 2007-11-28 | Univ Queensland | PROCESS FOR PRODUCING BACULOVIRUS |
-
2017
- 2017-12-08 RU RU2017143083A patent/RU2662960C1/ru active
-
2018
- 2018-08-22 EA EA201800510A patent/EA036087B1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1638161A1 (ru) * | 1988-12-08 | 1991-03-30 | Всесоюзный Научно-Исследовательский Институт Биотехнологии | Штамм вируса дерного полиэдроза дл производства инсектицидного препарата |
| RU2117701C1 (ru) * | 1996-07-31 | 1998-08-20 | Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" | Штамм вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда lymantria dispar l., используемый для получения инсектицидного препарата |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| КОЛОСОВ А.В., Разработка и испытания вирусных энтомопатогенных препаратов для защиты растений, авто диссертации, Кольцово, 2011. * |
| КОЛОСОВ А.В., Разработка и испытания вирусных энтомопатогенных препаратов для защиты растений, автореферат диссертации, Кольцово, 2011. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2729465C1 (ru) * | 2019-11-05 | 2020-08-06 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Комплексный биологический инсектицидный препарат против непарного шелкопряда Lymantria dispar |
| RU2800128C1 (ru) * | 2022-09-20 | 2023-07-18 | Федеральное бюджетное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт лесоводства и механизации лесного хозяйства" (ФБУ ВНИИЛМ) | Способ снижения численности непарного шелкопряда Lymanria dispar |
| RU2798221C1 (ru) * | 2023-04-17 | 2023-06-19 | Александр Александрович Агеев | Штамм вируса цитоплазматического полиэдроза сибирского шелкопряда Dendrolimus sibiricus Tschetw и инсектицидный препарат на его основе |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EA036087B1 (ru) | 2020-09-24 |
| EA201800510A2 (ru) | 2019-06-28 |
| EA201800510A3 (ru) | 2019-07-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Roberts et al. | Entomopathogenic fungi as bioinsecticides | |
| Banerjee | Kyasanur forest disease | |
| MudronÄ ekovà et al. | Entomopathogenic fungus species Beauveria bassiana (Bals.) and Metarhizium anisopliae (Metsch.) used as mycoinsecticide effective in biological control of Ips typographus (L.) | |
| Moyo et al. | Arthropods vector grapevine trunk disease pathogens | |
| Kariithi et al. | Virology, epidemiology and pathology of Glossina hytrosavirus, and its control prospects in laboratory colonies of the tsetse fly, Glossina pallidipes (Diptera; Glossinidae) | |
| Pedroso et al. | The isolation and characterization of virulence factors of Cryptococcus spp. from saprophytic sources in the city of Ribeirão Preto, São Paulo, Brazil | |
| RU2662960C1 (ru) | Штамм вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда Lymantria dispar L., используемый для получения инсектицидного препарата | |
| RU2359031C1 (ru) | ШТАММ ВИРУСА ЯДЕРНОГО ПОЛИЭДРОЗА ХЛОПКОВОЙ СОВКИ Heliothis armigera Hbn, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСЕКТИЦИДНОГО ПРЕПАРАТА | |
| KR101510807B1 (ko) | 낭충봉아부패병 바이러스의 배양방법 및 검출방법 | |
| RU2117701C1 (ru) | Штамм вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда lymantria dispar l., используемый для получения инсектицидного препарата | |
| Dinu et al. | New Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. isolate from Ips duplicatus (Sahlberg) | |
| RU2153258C1 (ru) | Штамм вируса ядерного полиэдроза капустной совки mamestrа вrassicae l., используемый для получения инсектицидного препарата | |
| CN105274007B (zh) | 一株金龟子绿僵菌小孢变种MaTS02及其在防治烟粉虱方面的应用 | |
| RU2511042C1 (ru) | ШТАММ ХС-18 ВИРУСА ЯДЕРНОГО ПОЛИЭДРОЗА ХЛОПКОВОЙ СОВКИ Helicoverpa armigera Hbn, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСЕКТИЦИДНОГО ПРЕПАРАТА | |
| RU2744522C1 (ru) | ШТАММ ВИРУСА ГРАНУЛЁЗА ЯБЛОННОЙ ПЛОДОЖОРКИ Cydia pomonella L., ОБЛАДАЮЩИЙ ИНСЕКТИЦИДНОЙ АКТИВНОСТЬЮ | |
| Martignoni | History of TM BioControl-1: the first registered virus-based product for control of a forest insect | |
| RU2652879C1 (ru) | Штамм xcm 22-а вируса ядерного полиэдроза хлопковой совки helicoverpa armigera hbn., используемый для получения инсектицидного препарата | |
| KR20190020715A (ko) | 이사리아 파리노사 유소를 포함하는 재선충병 매개충의 살충용 조성물 | |
| RU2396750C2 (ru) | Препарат для борьбы с хлопковой совкой | |
| Kheswa et al. | Evaluation of two Beauveria brongniartii isolates for pathogenicity against different life stages of white grub species (Coleoptera: Scarabaeidae) in South African sugarcane. | |
| Purwar | Bioefficacy of entomopathogenic fungi against Fruit fly, Bactrocera dorsalis (Hendel) infesting Pear in Uttarakhand | |
| Sajap et al. | Isaria fumosorosea and Metarhizium anisopliae for controlling Atteva sciodoxa (Lepidoptera: Yponomeutidae), a pest of Eurycoma longifolia | |
| RU2729465C1 (ru) | Комплексный биологический инсектицидный препарат против непарного шелкопряда Lymantria dispar | |
| Maulina et al. | The effect of the combination of two biological control agents, Mirabilis jalapa and Bacillus thuringiensis, to Spodoptera litura's immune response and their mortality | |
| CN110438016A (zh) | 一种金龟子绿僵菌菌株及其应用 |