JPH11500309A

JPH11500309A - 心臓血管病の治療および診断のための組成物並びに方法

Info

Publication number: JPH11500309A
Application number: JP8524480A
Authority: JP
Inventors: ファルブ，ディーン，エー．
Original assignee: ミレニウムファーマセティカルズ，インコーポレーテッド
Priority date: 1995-02-10
Filing date: 1996-02-09
Publication date: 1999-01-12
Also published as: EP1403372A2; US6018025A; EP1403372A3; US5882925A; US6225084B1; CA2212731A1; WO1996024604A1; US20030188327A1; US6020463A; US5834248A; US5968770A; US6054558A; AU714778B2; EP0808324A4; US5849578A; US6124433A; EP0808324A1; US20020137700A1; US20020178458A1; AU4921496A

Abstract

(57)【要約】本発明は、アテローム性動脈硬化症、虚血／再灌流、高血圧症、再狭窄、動脈の炎症を含むがこれらに限らない、心臓血管病の治療および診断のための方法並びに組成物に関する。詳細には、本発明は、正常な状態または非心臓血管病の状態での遺伝子発現に対して、および／または心臓血管病に関係した操作に応答して、心臓血管病の状態において示差的に発現(differentially expressed)される遺伝子を同定し、記載する。さらに、本発明は、その遺伝子産物が心臓血管病に関係のある他の遺伝子産物と相互作用する能力によっても遺伝子を同定し、記載する。さらにまた、本発明は、心臓血管病治療用の化合物の同定および治療的使用を提供する。さらに、本発明は、心臓血管病の治療の臨床評価を受ける患者の診断的モニター法、および臨床試験における化合物の効力のモニター法を提供する。さらに、本発明は、種々の心臓血管病の診断評価および予後判定の方法、並びに心臓血管病の素因をもつ患者の同定法を記載する。

Description

【発明の詳細な説明】心臓血管病の治療および診断のための組成物並びに方法本出願は、1995年２月10日付けの同時係属中の特許出願第08/386,844号の一部継続出願である、1995年６月７日付けの同時係属中の特許出願第08/485,573号の一部継続出願であり、各出願の全体をそのまま参考としてここに組み入れるものとする。１．序論本発明は、アテローム性動脈硬化症、虚血／再灌流、高血圧症、再狭窄、動脈の炎症を含むがこれらに限らない、心臓血管病の治療および診断のための方法並びに組成物に関する。正常な状態または非心臓血管病の状態での遺伝子発現に対して、心臓血管病の状態では示差的に発現される遺伝子が同定される。また、その遺伝子産物が心臓血管病に関係のある他の遺伝子産物と相互作用する能力によっても遺伝子が同定される。同定された遺伝子は診断的に使用されるか、または治療的介入のターゲットとして使用される。これに関して、本発明は、心臓血管病の治療および診断用の化合物の同定法並びに治療的使用を提供する。さらに、心臓血管病の治療の臨床的評価を受ける患者の診断的モニター法、臨床試験における化合物の効力のモニター法、および心臓血管病の素因をもつ患者の同定法も提供する。２．発明の背景心臓血管病は産業の発達した世界の至る所で主要な健康上の問題となっている。アテローム性動脈硬化症は、心臓血管病のうちで最も一般的なもので、心臓発作、卒中、四肢の壊疽の主な原因となり、それゆえ米国では第一位の死亡原因でもある。アテローム性動脈硬化症は多くの細胞型と分子因子を巻き込んだ複雑な疾患である（詳細については、Ross，1993，Nature 362: 801-809を参照のこと）。その過程は、正常な状況では動脈壁の内皮および平滑筋細胞（ＳＭＣ）の傷害に対する防御反応であり、炎症が先行し、炎症を伴った繊維脂肪質または繊維質の病変部または斑の形成から成り立っている。アテローム性動脈硬化の進行した病変部は関係した動脈を閉塞させることがあり、多数の異なる形の傷害に対する過度の炎症−繊維性増殖応答が原因である。例えば、分岐点や不規則な構造のような、乱れた血流が起こる循環系の領域にアテローム性動脈硬化斑がよく生じるのは、ずれ応力(shear stress)が関与していると考えられている。アテローム性動脈硬化斑の形成において最初に観察される現象は、血液由来の単球が血管内皮層に付着して内皮下腔に移行するときに起こる。同時に隣接内皮細胞が酸化された低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を産生する。その後これらの酸化型ＬＤＬは、単球の表面に発現されたスカベンジャー受容体を介して単球によって大量に取り込まれる。調節された経路（これにより天然ＬＤＬ（ｎＬＤＬ）がｎＬＤＬ特異的受容体により取り込まれる）とは対照的に、取込みのスカベンジャー経路は単球によって調節されない。こうした脂質に富む単球は泡沫細胞(foam cell)と呼ばれ、脂肪線条(fatty st reak)の主成分である。泡沫細胞とそれらを取り囲む内皮およびＳＭＣとの相互作用は慢性の限局的炎症状態をもたらし、最終的には平滑筋細胞の増殖および移動、そして繊維質の斑(plaque)の形成を引き起こす。この種の斑は血管を閉塞させ、血液の流れを制限し、結果的に虚血を生じさせる。虚血は不十分な灌流による器官組織への酸素供給の欠乏により特徴づけられる症状である。このような不十分な灌流は多くの症状の自然因となり得、二三の名を挙げると、アテローム性動脈硬化または再狭窄、貧血、卒中などである。多くの医学的介入（例えばバイパス手術中の血流の遮断）も虚血をまねく。疾病状態の心臓血管組織により時々引き起こされることに加えて、虚血は虚血性心疾患におけるように心臓血管組織に影響を及ぼすことがある。しかしながら、虚血は酸素供給の欠乏という問題を抱えているどの器官でも起こり得る。心臓における虚血の最も一般的な原因は、噴門上部の冠状動脈のアテローム性動脈硬化である。これらの血管の内腔を狭めることにより、アテローム性動脈硬化は基底状態の心筋灌流の絶対的低下を引き起こすか、または血流に対する要求が増大するときには適切な灌流増加を制限することになる。冠状動脈の血流は、動脈の血栓、痙攣、稀には冠状動脈の塞栓により、さらに梅毒性大動脈炎による口狭窄によっても制限される。肺動脈からの左前下行冠状動脈の異常な起点のような先天異常は、幼児では心筋虚血や梗塞を引き起こすことがあるが、この原因は成人では非常に稀である。また、高血圧や大動脈弁狭窄による重症の心室肥厚におけるように、心筋の酸素要求が異常に増大したときにも心筋虚血が起こりうる。大動脈弁狭窄は冠状動脈のアテローム性動脈硬化によって引き起こされるものと区別のつかない狭心症とともに存在する。極端に重度の貧血や一酸化炭素ヘモグロビンの存在におけるような、血液の酸素運搬能の低下は心筋虚血の原因としては稀である。それほど多くはないが、虚血の２以上の原因も同時に存在することができ、例えば、左心室肥厚による酸素要求の増加と、冠状動脈のアテローム性動脈硬化にとって二次的な酸素供給の低下が共存できるだろう。虚血性アテローム性動脈硬化の治療に対する主要な外科的アプローチは、バイパス移植術、動脈内膜切除術および経皮経管冠状動脈形成術（ＰＣＴＡ）である。これら外科的アプローチ後の再狭窄（閉塞が再び発生して、しばしば一層ひどくなる）による失敗率は驚くほど高い（30〜50％）。再狭窄の多くはさらなる炎症、平滑筋の蓄積および血栓によるものと思われる。ごく最近、ブタの動脈再狭窄を遺伝子治療により治療するために、改良されたバルーン血管形成術が採用された（Ohnoら，1994，Science 265: 781-784）。特殊なカテーテルを使って、動脈閉塞部位の細胞にチミジンキナーゼ（ｔｋ）をコードする遺伝子を担持する組換えアデノウイルスが導入された。続いて、ブタをガンシクロビルで治療した。ガンシクロビルはＤＮＡに組み込まれたとき細胞を殺す毒性形態にｔｋにより変換されるヌクレオシド類似体である。治療した動物は動脈壁の厚さが50〜90％縮小し、いかなる局所または全身毒性も観察されなかった。アテローム性動脈硬化および虚血における過度の炎症−繊維性増殖応答の推定される役割のために、多くの研究者らは、動脈損傷の概念において、炎症、細胞漸増(cell recruitment)および増殖に関与するいくつかの因子の発現を研究してきた。こうした因子としては、増殖因子、サイトカインおよび他の化学物質（細胞漸増および移動、細胞増殖、脂質およびタンパク質の合成の制御に関与する脂質類を含む）が挙げられる。例えば、ＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）またはその受容体の発現が、動脈損傷の修復中のラットで(Majesky ら，1990，J．Cell Biol．111: 2149); 酸化型ＬＤＬで処置したヒト単球由来マクロファージの接着性培養物で(Maldenら，199 1，J．Biol．Chem．266: 13901); および流体ずれ応力を受けたウシ大動脈内皮細胞で（Resnick ら，1993，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90: 4591-4595）研究された。ＩＧＦ−Ｉ（インスリン様増殖因子−Ｉ）の発現はラット大動脈のバルーン脱内皮化（deendothelialization）後に研究された（Cercekら，1990，Circ ulation Research 66: 1755-1760）。その他の研究は、単球の接着を媒介する活性化内皮細胞の表面上の接着分子の発現に集中していた。これらの接着分子としては、細胞内接着分子−１、ＩＣＡＭ−１（Simmons ら，1988，Nature，331: 624-627）、ＥＬＡＭ（Bevilacquaら，1989，Science 243: 1160-1165; Bevilacquaら，1991，Cell 67: 233）、および血管細胞接着分子、ＶＣＡＭ−１（Osbornら，1989，Cell 59: 1203-1211）があり、これらの表面分子はすべてＩＬ−１の存在下で転写的に誘導される。組織学的研究は、ＩＣＡＭ−１、ＥＬＡＭおよびＶＣＡＭ−１がin vivo で病変部位の内皮細胞上に発現されることを明らかにした(Cybulskyら，1991，Science 251 : 788-791; 1991，Arterioscler．Thromb．11: 1397a; Poston ら，1992，Am．J ．Pathol．140: 665-673)。ＶＣＡＭ−１とＩＣＡＭ−１は、培養下のウサギ動脈内皮ばかりでなく培養下のヒト回腸動脈内皮細胞において、リゾホスファチジルコリン（アテローム発生リポタンパク質の主要なリン脂質成分）により誘導されることが示された（Kumeら，1992，J．Clin．Invest．90: 1138-1144）。ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１およびクラスII主要組織適合性抗原は、ウサギ大動脈の損傷に応答して誘導されることが報告された(Tanakaら，1993，Circulation 88: 1788-1803)。近年、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）は一般にアテローム性動脈硬化と同様に再狭窄にも関与していることが示された（Speir ら，1994，Science 265: 391 -394）。ＣＭＶタンパク質ＩＥ８４は、ｐ５３（その活性形で腫瘍を抑制することが知られている）と結合してそれを不活性化することにより、平滑筋細胞を再狭窄部位で明らかに増殖しやすくすることが観察された。前述の研究は、アテローム性動脈硬化斑を形成させる過度の炎症−繊維性増殖応答に関与すると予想された特定の遺伝子産物の役割を規定することにねらいを定めていた。しかしながら、このようなアプローチでは病気の過程で関係のある一そろいの遺伝子産物を同定することはできず、ましてや、さまざまな心臓血管病の診断および治療のターゲットとして機能しうるものを同定することなど及びもつかない。３．発明の概要本発明は、アテローム性動脈硬化症、虚血／再灌流、高血圧症、再狭窄、動脈の炎症を含むがこれらに限らない、心臓血管病の治療および診断のための方法並びに組成物に関する。詳細には、正常な状態または非心臓血管病の状態での遺伝子発現に対して、心臓血管病の状態では示差的に発現される遺伝子が同定され、記載される。本明細書中で用いる「示差発現」(differential expression)とは、遺伝子の時間的および／または組織発現パターンの定量的および定性的差異を意味する。示差発現される遺伝子は「フィンガープリント遺伝子」および／または「ターゲット遺伝子」でありうる。本明細書中で用いる「フィンガープリント遺伝子」とは、その発現パターンが心臓血管病の予後または診断評価の一部として利用され得るか、または心臓血管病治療用化合物の同定方法に使用し得る示差発現遺伝子のことである。本明細書中で用いる「ターゲット遺伝子」とは、ターゲット遺伝子の発現レベルの調節またはターゲット遺伝子産物の活性の調節が心臓血管病の症状を改善するように働くような、心臓血管病に関与する示差発現遺伝子のことである。ターゲット遺伝子の発現またはターゲット遺伝子産物の活性を調節する化合物は、心臓血管病の治療に使用することができる。さらに、「パスウェイ遺伝子」(pathway gene)は、その遺伝子の産物が心臓血管病に係わりのある他の遺伝子の産物と相互作用する能力により定義される。パスウェイ遺伝子はまた、ターゲット遺伝子および／またはフィンガープリント遺伝子の特徴を示すこともできる。本明細書中に記載する遺伝子は心臓血管病に関して示差的に発現され、そして／また、それらの産物が心臓血管病にとって重要な遺伝子産物と相互作用しうるが、別の心臓血管プロセスにとって重要なメカニズムにそれらの遺伝子が関与していてもよい。本発明は、このようなフィンガープリント、ターゲットおよびパスウェイ遺伝子の産物、並びにこのような遺伝子産物に対する抗体を包含する。さらに、このような遺伝子産物が寄与しうる心臓血管病の細胞および動物を土台としたモデルの遺伝子工学的作製および使用も記載される。本発明は、心臓血管病の症状の予後判定および診断評価法、このような疾病に対する素因をもつ被験者の同定法を包含する。さらに、本発明は、心臓血管病の治療の臨床試験に関係する薬物の効力を評価し、かつ患者の疾病の経過をモニターする方法を提供する。本発明はまた、心臓血管病に関係のある遺伝子の発現または遺伝子産物の活性を調節する化合物の同定法、並びに心臓血管病の症状または傾向を示す個体にこの種の化合物を投与することを含んでなる心臓血管病の治療法を提供する。本発明は、一部には、感度のよい高処理量の遺伝子発現アッセイと結びついた in vivo およびin vitro心臓血管病パラダイムを巻き込んだ体系的な検索戦略に基づいている。疾病の過程で何らかの役割を果たすと推定された所与の遺伝子産物の発現を単に評価するだけのアプローチとは対照的に、ここで用いる検索戦略およびアッセイは、既知であろうと新規であろうと、疾病状態で発現または抑制されるあらゆる遺伝子の同定を可能にし、同時に疾病の進行中のそれらの時間的調節および機能の評価を可能にする。この包括的なアプローチおよび評価は、新規な遺伝子と遺伝子産物の発見のみならず、その疾病の病理学において主要な役割を果たす新規な経路（パスウェイ）において関与する（新規であろうと既知であろうと）一そろいの遺伝子および遺伝子産物の同定を可能にする。かくして、本発明は診断、モニター、合理的薬物スクリーニングおよびデザイン、および／または他の治療的介入に有用なターゲットを規定することを可能にする。ここに記載する実施例では８つの新規なヒト遺伝子が同定され、これらの遺伝子は異なる心臓血管病の状態で示差発現されることが実証される。さらに、以前に同定された４つのヒト遺伝子の示差発現が記載される。これらの遺伝子の同定並びに特定の疾病状態でのそれらの発現の特性づけは、新規遺伝子と既知遺伝子の両方の心臓血管病における新たな役割を認識させる。Ｂｃｌ−２およびグルタチオンペルオキシダーゼは既知遺伝子の産物であるが、これらの産物は本明細書ではアテローム発生の高脂肪／高コレステロール食にさらされた患者の単球においてダウンレギュレート（下方調節）されることが示される。さらに、ここに記載するように、アテローム発生条件下でのＢｃｌ−２のダウンレギュレーションを中和するとアテローム性動脈硬化症が改善されうる。したがって、Ｂｃｌ−２およびグルタチオンペルオキシダーゼの発現パターンに関するここに記載の知見に基づいて、心臓血管病を診断し、臨床試験においてモニターし、治療する方法が提供される。これらの２つの遺伝子はアポトーシスの阻止に関与することが知られていたので、アテローム発生条件下でのそれらのダウンレギュレーションの発見は、アポトーシスとアテローム発生との新規な正の相関関係を提供する。したがって、ここに提供される心臓血管病を診断し、モニターし、治療する方法はまた、アポトーシス経路に関与する多くの遺伝子にも基づいており、かかる遺伝子としては、ＩＣＥ（ＩＬ−１変換酵素）、Ｂａｄ、ＢＡＧ−１（Ｂｃｌ−２関連 athanogene 1，Takayama ら，1995，Cell 80: 279 -284）、ＢＡＸ（Ｂｃｌ−２関連Ｘタンパク質，Oltvaiら，1993，Cell 74: 609 -619）、ＢｃｌＸ_L（Boise ら，1993，Cell 74: 597-608）、ＢＡＫ(Ｂｃｌ−２アンタゴニストキラー，Farrowら，1995，Nature 374: 631-733)、およびＢｃｌ −Ｘ_S（Tsujimoto ら，1984，Science 226: 1097-1099）が挙げられるが、これらに限らない。このように診断され、臨床試験でモニターされ、治療される心臓血管病には、制限するものではないが、アテローム性動脈硬化症、虚血／再灌流および再狭窄がある。 rchd005 、rchd024 、rchd032 および rchd036は新たに同定された遺伝子で、それぞれがＩＬ−１で処理された内皮細胞においてアップレギュレート（上方調節）される。したがって、rchd005 、rchd024 、rchd032 および rchd036の発現パターンに関するここに記載の知見に基づいて心臓血管病を診断し、臨床試験においてモニターし、治療する方法が提供される。シクロオキシゲナーゼII（COX II、エンドペルオキシドシンターゼとしても知られている）およびマンガンスーパーオキシドジスムターゼ(MnSOD)は既知の遺伝子であり、そしてrchd502 、rchd523 、rchd528 および rchd534は新たに同定された遺伝子で、それぞれがずれ応力を受けた内皮細胞においてアップレギュレートされる。したがって、COX II、MnSOD 、rchd502 、rchd523 、rchd528 および rchd534の発現パターンに関するここに記載の知見に基づいて、心臓血管病を診断し、臨床試験においてモニターし、心臓血管病に治療上有効な化合物をスクリーニングし、そして治療する方法が提供される。より詳細には、これらの遺伝子はそれぞれがＩＬ−１（rchd005 、rchd024 、 rchd032 および rchd036）またはずれ応力（COX II、MnSOD 、rchd502 、rchd52 3 、rchd528 および rchd534）のいずれかによりアップレギュレートされる。疾病状態に対して原因的に作用する遺伝子の場合は、治療法はそれらの発現を、特に内皮細胞における発現を、低下または排除するようにデザインされる。あるいは、治療法はこれらの遺伝子のタンパク質産物の活性を抑制することを含む。疾病状態に対して防御的に作用する遺伝子の場合は、治療法はかかる遺伝子の産物の活性を高めるようにデザインされる。いずれの場合にも、これらの遺伝子の正常な発現を越える発現を検出することが心臓血管病の診断を与える。さらに、臨床試験で化合物の効力を調べるとき、これらの遺伝子の発現レベルの低下は疾病状態から正常状態に戻ることに相当し、それゆえ用いた化合物の陽性効果を示す。このように診断され、臨床試験でモニターされ、治療される心臓血管病には、制限するものではないが、アテローム性動脈硬化症、虚血／再灌流、高血圧、再狭窄および動脈の炎症がある。細胞外ドメインを含む、膜に結合したターゲット遺伝子産物は、治療法、診断法および臨床モニター法にとって特に有用なターゲットでありうる。例えば、rc hd523 遺伝子は膜貫通タンパク質をコードし、この膜貫通タンパク質は７つの膜貫通ドメインを含むため、細胞表面で他の化合物と容易に接触することができる。したがって、rchd523 遺伝子産物と結合する天然リガンド、天然リガンドの誘導体および抗体は、その活性を抑制するために、あるいは疾病状態にある細胞を特異的に破壊するために使用することができる。さらに、rchd523 遺伝子産物の細胞外ドメインは、rchd523 遺伝子産物と結合する化合物を同定するための特別に効率のよいスクリーニング系を提供する。rchd523 遺伝子産物の受容体ドメインと結合する化合物は、例えば、以下の第5.5.1 節に記載するように、Ｃａ²⁺ を動員して蛍光シグナルを発生させる能力により同定され得る。また、このようなアッセイ系は、rchd523 遺伝子産物とrchd523 遺伝子産物に結合するリガンドとの相互作用のアンタゴニストをスクリーニングして同定するにも使用され得る。例えば、これらの化合物はrchd523 遺伝子産物の内因性（すなわち、天然の）リガンドと競合することができる。こうして、リガンドと結合したrchd523 遺伝子膜貫通タンパク質の量の低下は、疾病状態にある内皮細胞のような細胞の活性を調節するだろう。rchd523 遺伝子産物の可溶性タンパク質またはペプチド（例えば、１以上の細胞外ドメインを含むペプチド）、またはrchd 523 遺伝子産物の一部および／またはその類似体（例えば、Ｉｇ−テイルド融合タンパク質のような可溶性融合タンパク質を含む）は、この目的のために特に有用でありうる。同様に、rchd523 産物の１以上の細胞外ドメインに特異的な抗体は、診断試験または臨床試験モニターにおけるこのターゲット遺伝子産物の簡便な検出を可能にする。したがって、内皮細胞をこのような標識抗体でin vivo またはin vitro のいずれかで処理することで、内皮細胞の疾病状態を判定することができる。rc hd523 遺伝子産物はずれ応力のもとでは内皮細胞においてアップレギュレートされるので、その検出は心臓血管病と正の相関関係にある。上記のrchd523 遺伝子産物を用いる治療法、診断法および臨床試験モニター法はまた、 rchd502（12の膜貫通ドメインを含む）や rchd528（その細胞外ドメインのほかに１つの膜貫通ドメインを含む）を含むがこれらに限らない膜貫通遺伝子産物をコードする他のターゲット遺伝子にも応用できる。以下の第6.9 節に示した実施例では、心臓血管病のターゲット遺伝子を同定するための本発明の心臓血管病パラダイムの使用を示す。以下の第10節に示した実施例では、診断法におけるフィンガープリント遺伝子の使用、並びに基礎研究および臨床試験で候補薬剤の効力を試験するための代理マーカーとしてのフィンガープリント遺伝子の使用を示す。以下の第11節に示した実施例では、疾病状態の心臓血管組織のイメージングにおけるフィンガープリント遺伝子、特にrchd523 、の使用を示す。以下の第12節に示した実施例では、ターゲット遺伝子産物の受容体ドメインのリガンドおよびリガンド−受容体相互作用のアンタゴニストのスクリーニングにおけるターゲット遺伝子、特にrchd523 、の使用を示す。４．図面の説明図１．in vivo コレステロール示差的ディスプレイ。異なる食事の患者の血液から単離されたヒト単球から調製されたｍＲＮＡ。高脂肪食／高血清コレステロール（レーン１、２）及び低脂肪食／低血清コレステロール（レーン３、４）の一人の患者から調製されたｃＤＮＡを、フォワードプライマーT₁₁XG 及びリバースプライマーOPO14(agcatggctc)を使用してディスプレイした。マークされたバンド(#14)に相当するＤＮＡを配列分析のために切り出し、増幅した。図２．バンド#14 ノーザンブロット分析。ランダムプライマー標識バンド#14 プローブを、示差的ディスプレイに使用したのと同じ患者の単球から調製されたノーザンブロットとハイブリダイズさせた。８kbバンドが低脂肪／低コレステロール条件で見られ、高脂肪／高コレステロール条件では見られなかった。図３．apoE欠損マウス中のマウスbcl-2 ｍＲＮＡレベルの定量的RT-PCR分析。 apoE欠損マウスおよび対照マウスからの単球ＲＮＡを、上部パネルに示されたマウスbcl-2のためのプライマー(for-cacccctggcatcttctccttcc/rev-atcctcccccag ttcaccccatcc)、また下部パネルに示されたマウスγアクチンのためのプライマー(for-cctgatagatgggcactgtgt/rev-gaacacggcattgtcactaact)を使用して比較した。それぞれのインプットｃＤＮＡの1:3 希釈系列を、野生型ｃＤＮＡに由来するそれぞれの対中の左バンドおよびapoE欠損ｃＤＮＡからの右バンドとの対で行った。図４．高脂肪食（血清コレステロールレベル=200; 上部パネル）および低脂肪食（血清コレステロールレベル=170; 下部パネル）を摂取した同一患者の血液単球に由来するＲＮＡから調製されたヒト臨床サンプルｃＤＮＡからのヒトグルタチオンペルオキシダーゼ(HUMGPXP1)ｃＤＮＡのRT-PCR定量化。HUMGPXP1配列1121 -1142（for- aagtcgcgcccgcccctgaaat）および1260-1237(rev-gatccctggccaccgt ccgtctga)から誘導されたGPX1.3プライマーを使用する増幅産物の希釈系列をそれぞれのパネルの左部分に示す。ヒトアクチンプライマー(for-accctgaagtaccca t/rev-tagaagcatttgcggtg)を使用する増幅産物の希釈系列をそれぞれのパネルの右部分に示す。HUMGPXP1バンドは高脂肪食のもとで強さが低下し（上部左を下部左と比較のこと）、一方、アクチン対照バンドはそれぞれの食事のもとで同等の強さであった（上部右を下部右と比較のこと）。図５．IL-1活性化HUVEC 示差的ディスプレイ。対照HUVEC(レーン９、10）、１時間の10単位/ml IL-1処理（レーン７、８）、または６時間の処理（レーン11、 12）からのｍＲＮＡを、フォワードプライマーOPE7（agatgcagcc）およびリバースプライマーT₁₁XA(これはＸがＧ、Ｃ、またはＡであるオリゴヌクレオチドの等モル混合物である）との示差的ディスプレイ反応に使用した。マークされたバンド、rchd005 に相当するＤＮＡをノーザン分析およびサブクローニングのために切り出し、増幅した。図６．内皮IL-1誘導rchd005 のノーザンブロット分析。対照サンプル、１時間サンプルおよび６時間サンプルからの全ＲＮＡ２μgをアガロースゲルで溶離し、ブロットし、そして増幅rchd005 配列から調製された³²P 標識プローブとともにインキュベートした。示されたバンドは約7.5kb に相当するマーカーとともに移動した。図７．ずれ応力を受けたＲＮＡから調製され、同一のrchd005 プローブとハイブリダイズさせたノーザンブロットは、１時間で最も強くアップレギュレーションされた7.5kb バンドを検出する。図８．バンドrchd005 ＤＮＡ配列。この配列は、TAクローニングベクターへの増幅rchd005 配列の連結により得られる、pRCHD005の挿入物を配列決定することにより決定した。図９．IL-1活性化HUVEC 示差的ディスプレイ。対照HUVEC（レーン３、４）、１時間の10単位/ml IL-1処理（レーン１、２）、または６時間の処理（レーン５、６）から調製されたｍＲＮＡを、フォワードプライマーOpG20(tctccctcag)およびリバースプライマーT₁₁XA(これはＸがＧ、Ｃ、またはＡであるオリゴヌクレオチドの等モル混合物である)との示差的ディスプレイ反応に使用した。マークされたバンド、rchd024 に相当するＤＮＡをノーザン分析およびサブクローニングのために切り出し、増幅した。図10．内皮IL-1誘導バンドrchd024 のノーザンブロット分析。対照サンプル、１時間サンプルおよび６時間サンプルからの全ＲＮＡ２μgをアガロースゲルで溶離し、ブロットし、そして増幅バンドrchd024 配列から調製された³²P 標識プローブとともにインキュベートした。示されたバンドは約10kbに相当するマーカーとともに移動した。図11．内皮IL-1誘導バンドrchd024 のずれ応力ノーザンブロット分析。ずれ応力を受けたＲＮＡから調製され、同一のrchd024 プローブとハイブリダイズさせたノーザンブロットは、６時間で最も強くアップレギュレーションされた10kbバンドを検出した。図12．バンドrchd024 ＤＮＡ配列。この配列は、TAクローニングベクターへの増幅rchd024 配列の連結により得られる、pRCHD024の挿入物を配列決定することにより決定した。図13．rchd032 に関するIL-1活性化HUVEC 示差的ディスプレイ。対照HUVEC(レーン３、４)、１時間の10単位/ml IL-1処理（レーン１、２）、または６時間の処理（レーン５、６）から調製されたｍＲＮＡを、フォワードプライマーOPI9（ tggagagcag）およびリバースプライマーT₁₁XA(これはＸがＧ、Ｃ、またはＡであるオリゴヌクレオチドの等モル混合物である)との示差的ディスプレイ反応に使用した。マークされたバンド、rchd032 に相当するＤＮＡをノーザン分析およびサブクローニングのために切り出し、増幅した。図14．対照、１時間、および６時間のIL-1活性化HUVEC から誘導されたＲＮＡから調製されたIL-1活性化HUVEC のｃＤＮＡからのrchd032 ｃＤＮＡのRT-PCR定量化。上部パネルではrchd032 プライマー(for-atttataaaggggtaattcatta/rev-t taaagccaatttcaaaataat)で増幅された、また下部パネルではヒトアクチンプライマー(for-accctgaagtaccccat/rev-tagaagcatttgcggtg)で増幅されたインプットｃＤＮＡの５倍希釈系列がレーン１、２、および３に示される。レーン３中の1: 125 希釈のバンドが６時間サンプルに見られるが、対照には見られない。図15．バンドrchd032 ＤＮＡ配列。この配列は、TAクローニングベクターへの増幅rchd032 配列の連結により得られる、pRCHD032の挿入物を配列決定することにより決定した。図16．rchd036 に関するIL-1活性化HUVEC 示差的ディスプレイ。対照HUVEC(レーン３、４)、１時間の10単位/ml IL-1処理（レーン１、２）、または６時間の処理（レーン５、６）から調製されたｍＲＮＡを、フォワードプライマーOPI17 (ggtggtgatg)およびリバースプライマーT₁₁XC(これはＸがＧ、Ｃ、またはＡであるオリゴヌクレオチドの等モル混合物である)との示差的ディスプレイ反応に使用した。マークされたバンド、rchd036 に相当するＤＮＡをノーザン分析およびサブクローニングのために切り出し、増幅した。図17．内皮IL-1誘導バンドrchd036 のノーザンブロット分析。対照サンプル（レーン１）、１時間サンプル（レーン２）、および６時間サンプル（レーン３）からの全ＲＮＡ２μg をアガロースゲルで溶離し、ブロットし、そして増幅バンドrchd036 配列から調製された³²P 標識プローブとともにインキュベートした。示されたバンドは約８kbに相当するマーカーとともに移動した。図18．バンドrchd036 ＤＮＡ配列。この配列は、TAクローニングベクターへの増幅rchd036 配列の連結により得られる、pRCHD036の挿入物を配列決定することにより決定した。図19．層状ずれ応力HUVEC 示差的ディスプレイ。対照HUVEC(レーン３、４)、１時間の10dyn/cm²層状ずれ応力処理（レーン１、２）、または６時間の処理（レーン５、６）から調製されたｍＲＮＡをフォワードプライマーOPE7（agatgcag cc）およびリバースプライマーT₁₁XA(これはＸがＧ、Ｃ、またはＡであるオリゴヌクレオチドの等モル混合物である)との示差的ディスプレイ反応に使用した。マークされたバンド、rchd502 に相当するＤＮＡをノーザン分析およびサブクローニングのために切り出し、増幅した。図20．ずれ応力誘導バンドrchd502 のノーザンブロット分析。対照サンプル、１時間のずれ応力を受けたサンプル、および６時間のずれ応力を受けたサンプルからの全ＲＮＡ２μg をアガロースゲルで溶離し、ブロットし、そして増幅バンドrchd502 配列から調製された³²P 標識プローブとともにインキュベートした。示されたバンドは約4.5kb に相当するマーカーとともに移動した。図21．IL-1ブロット上でのずれ応力誘導バンドrchd502 のノーザンブロット分析。対照（レーン１）、１時間（レーン２）、および６時間（レーン３）IL-1誘導HUVEC サンプルからの全ＲＮＡ２μg をアガロースゲルで溶離し、ブロットし、そして増幅バンドrchd502 配列から調製された³²P 標識プローブとともにインキュベートした。IL-1によりアップレギュレーションされなかった4.5kb バンドが見られる。図22．rchd502 遺伝子のＤＮＡ配列およびコードされたアミノ酸配列。図23．rchd505に関する層状ずれ応力HUVEC 示差的ディスプレイ。対照HUVEC( レーン３、４)、１時間の10 dyn/cm²層状ずれ応力処理（レーン１、２）、または６時間の10 dyn/cm²層状ずれ応力処理（レーン５、６）から調製されたｍＲＮＡをフォワードプライマーOPE2(ggtgcgggaa)およびリバースプライマーT₁₁XA(これはＸがＧ、Ｃ、またはＡであるオリゴヌクレオチドの等モル混合物である)との示差的ディスプレイ反応に使用した。マークされたバンド、rchd505 に相当するＤＮＡをノーザン分析およびサブクローニングのために切り出し、増幅した。図24．ずれ応力誘導バンドrchd505 のノーザンブロット分析。対照サンプル、１時間のずれ応力を受けたサンプル、および６時間のずれ応力を受けたサンプルからの全ＲＮＡ２μg をアガロースゲルで溶離し、ブロットし、そして増幅バンドrchd505 配列から調製された³²P 標識プローブとともにインキュベートした。示されたバンドは約5.0kb に相当するマーカーとともに移動した。図25．IL-1ブロット上でのずれ応力誘導バンドrchd505 のノーザンブロット分析。対照（レーン１）、１時間（レーン２）、および６時間（レーン３）のIL-1 誘導HUVEC サンプルからの全ＲＮＡ２μg をアガロースゲルで溶離し、ブロットし、そして増幅バンドrchd505 配列から調製された³²P 標識プローブとともにインキュベートした。5.0kb 誘導バンドが見られる。図26．rchd523に関する層状ずれ応力HUVEC 示差的ディスプレイ。対照HUVEC( レーン３、４)、１時間の10 dyn/cm²層状ずれ応力処理（レーン１、２）または６時間の10 dyn/cm²層状ずれ応力処理（レーン５、６）から調製されたｍＲＮＡをフォワードプライマーOPI11(acatgccgtg)およびリバースプライマーT₁₁XC(これはＸがＧ、Ｃ、またはＡであるオリゴヌクレオチドの等モル混合物である)との示差的ディスプレイ反応に使用した。マークされたバンド、rchd523 に相当するＤＮＡをノーザン分析およびサブクローニングのために切り出し、増幅した。図27．対照、１時間ずれ応力を受けたHUVEC 、および６時間ずれ応力を受けた HUVEC から誘導されたＲＮＡから調製されたずれ応力を受けた内皮細胞ｃＤＮＡからのrchd523 ｃＤＮＡのRT-PCR定量化。上部パネルにはrchd523 プライマー(f or-atgccgtgtgggttagtc/rev-attttatgggaaggtttttaca)で増幅されたインプットｃＤＮＡの５倍希釈系列がレーン１、２、３に示され、またレーン４および５には、ヒトアクチンプライマー(for-accctgaagtaccccat/rev-tagaagcatttgcggtg) を使用する５倍希釈系列が示される。レーン２の1:5 希釈のバンドが６時間サンプルに見られるが、対照には見られない。図28．rchd523 遺伝子のＤＮＡ配列およびコードされたアミノ酸配列。図29．rchd528 に関する層状ずれ応力HUVEC 示差的ディスプレイ。対照HUVEC （レーン３、４）、１時間の10 dyn/cm²層状ずれ応力処理（レーン１、２）または６時間の10 dyn/cm²層状ずれ応力処理（レーン５、６）から調製されたｍＲＮＡをフォワードプライマーOPI19(aatgcgggag)およびリバースプライマーT₁₁XG（これはＸがＧ、Ｃ、またはＡであるオリゴヌクレオチドの等モル混合物である）との示差的ディスプレイ反応に使用した。マークされたバンド、rchd528 に相当するＤＮＡをノーザン分析およびサブクローニングのために切り出し、増幅した。図30．ずれ応力誘導バンドrchd528 のノーザンブロット分析。対照（レーン１）、１時間（レーン２）、および６時間（レーン３）ずれ応力を受けたサンプルからの全ＲＮＡ２μg をアガロースゲルで溶離し、ブロットし、そして増幅バンド rchd528 配列から調製された³²P 標識プローブとともにインキュベートした。示されたバンドは約5.0kb に相当するマーカーとともに移動した。図31．rchd528 遺伝子のＤＮＡ配列およびコードされたアミノ酸配列。図32．プラスミドpScR-bc12 の制限地図。図33．ずれ応力下のrchd036 ｍＲＮＡの発現のノーザンブロット分析。ＲＮＡを未処理であるHEVEC(対照)並びに１時間および６時間にわたってずれ応力で処理されたHEVEC から調製した。ブロットを標識rchd036 ＤＮＡで釣り上げた。図34．ずれ応力下のrchd534 ｍＲＮＡの発現のノーザンブロット分析。ＲＮＡを未処理であるHEVEC(対照)並びに１時間および６時間にわたってずれ応力で処理されたHEVEC から調製した。ブロットを標識rchd534 ＤＮＡで釣り上げた。図35．rchd534遺伝子のＤＮＡ配列およびコードされたアミノ酸配列。５．発明の詳細な説明アテローム性動脈硬化症、虚血／再灌流(reperfusion)、高血圧、再狭窄、および動脈炎症を含むが、これらに限定されない、心臓血管病の診断および治療のための方法および組成物が記載される。本発明は、症状に生理的に関連するパラダイムにおいて示差的に発現される全ての遺伝子の発現および役割の評価に一部基いている。これは疾病経路の特定並びに診断上および治療上の両方に有益である該経路におけるターゲットの同定を可能にする。正常な状態または非心臓血管病の状態におけるそれらの発現に対して、心臓血管病の状態で示差的に発現される“ターゲット遺伝子”および／または“フィンガープリント遺伝子”と称される遺伝子は、5.4 節に記載される。更に、遺伝子産物が心臓血管病に関係する遺伝子産物と相互作用する能力を示す“パスウェイ遺伝子”と称される遺伝子がまた5.4 節に記載される。パスウェイ遺伝子は更にフィンガープリントおよび／またはターゲット遺伝子特性を更に有していてもよい。このようなフィンガープリント遺伝子、ターゲット遺伝子、およびパスウェイ遺伝子の同定方法が5.1 節、5.2 節、および5.3 節に記載される。更に、このようなフィンガープリント遺伝子、ターゲット遺伝子、およびパスウェイ遺伝子の遺伝子産物が5.4.2 節に記載され、このような遺伝子産物の抗体が5.4.3 節に記載され、同様に、このような遺伝子産物が寄与し得る心臓血管病の細胞をベースとするモデルおよび動物をベースとするモデルが5.4.4 節に記載される。心臓血管病に関係する遺伝子の発現または遺伝子産物の活性を調節する化合物の同定方法が5.5 節に記載される。臨床試験中の化合物の効力のモニタリング方法が5.5.4 節に記載される。更に、心臓血管病の治療方法が5.6 節に記載される。また、この疾病の疾病素質を示す被験者の同定を含む、心臓血管病の予後判定方法および診断評価方法、および心臓血管病の状態のイメージングが5.8 節に説明される。 5.1.示差的に発現される遺伝子の同定この節は、アテローム性動脈硬化症、虚血／再灌流、高血圧、再狭窄、および動脈炎症を含むが、これらに限定されない、心臓血管病に関係する遺伝子の同定方法を記載する。このような遺伝子は、正常な状態、または非心臓血管病状態におけるそれらの発現に対し心臓血管病状態で示差的に発現される遺伝子に相当し得る。このような示差的に発現される遺伝子は「ターゲット」遺伝子および／または“フィンガープリント”遺伝子に相当し得る。このような示差的に発現される遺伝子の同定方法がこの節で以下に記載される。このような示差的に発現される遺伝子の更なる特性決定方法、およびターゲット遺伝子および／またはフィンガープリント遺伝子としてのそれらの同定方法が5.3 節に示される。本明細書に使用される“示差的発現”は、遺伝子の時間的および／または組織発現パターンの定量的差異並びに定性的差異の両方を表す。こうして、示差的に発現される遺伝子は正常な状態vs心臓血管病状態（例えば、酸化LDL で処理vs未処理）で、または対照状態vs実験状態下で活性化または完全に不活化されたその発現を有し得る。このような定性的に調節された遺伝子は対照または心臓血管病被験者のいずれかで検出し得るが、両方では検出し得ない所定の組織内または細胞型内の発現パターンを示すであろう。また、このような定性的に調節された遺伝子は、対照または実験被験者のいずれかで検出し得るが、両方では検出し得ない所定の組織内または細胞型内の発現パターンを示すであろう。本明細書に使用される“検出し得る”は、示差的ディスプレイ、逆転写酵素-(RT-)PCR および／またはノーザン分析（これらは当業者に周知である）の通常の技術により検出し得るＲＮＡ発現パターンを表す。また、示差的に発現される遺伝子は、正常な状態vs心臓血管病状態で、または対照状態vs実験状態下で、調節された、すなわち、定量的に増加または減少されたその発現を有し得る。発現が正常な状態vs心臓血管病状態または対照状態vs実験状態で異なる程度は、通常の特性決定技術、例えば、以下に記載される示差的ディスプレイ技術により視覚化されるのに充分に大きいことのみを必要とする。発現の差異が視覚化し得るその他のこのような通常の特性決定技術として、定量的RT-PCRおよびノーザン分析が挙げられるが、これらに限定されない。示差的に発現される遺伝子はターゲット遺伝子および／またはフィンガープリント遺伝子として更に記載し得る。本明細書に使用される“フィンガープリント遺伝子”は、その発現パターンが予後判定または診断の心臓血管病評価の一部として利用されてもよく、または心臓血管病の治療に有益な化合物の同定方法に使用されてもよい示差的に発現される遺伝子を表す。また、フィンガープリント遺伝子はターゲット遺伝子の特徴を有していてもよい。本明細書に使用される“ターゲット遺伝子”は、ターゲット遺伝子発現のレベルまたはターゲット遺伝子産物活性のレベルの調節が心臓血管病の症状を改善するように作用し得る様式で心臓血管病に関与する示差的に発現される遺伝子を表す。また、ターゲット遺伝子はフィンガープリント遺伝子の特徴を有していてもよい。種々の方法が心臓血管病に関係する遺伝子の同定に利用し得る。これらの方法として、5.1.1 節に記載される実験パラダイムが挙げられるが、これに限定されない。パラダイムからの物質が5.1.2 節に記載される示差的に発現される遺伝子配列の存在について特性決定され得る。 5.1.1.示差的に発現される遺伝子の同定に関するパラダイム心臓血管病に関係する遺伝子を同定するための一つの戦略は、疾病状態vs非疾病状態に関連する状態のもとに示差的に発現される遺伝子を検出することである。下記の分節は、このような示差的に発現される遺伝子を検出するのに使用し得る、パラダイムと称される、幾つかの実験系を記載する。一般に、パラダイムは、このような疾病に関連する治療を欠いている少なくとも一つの実験対照状態に加えて、被験者またはサンプルが心臓血管病と関連する方法で治療される、少なくとも一つの実験状態を含む。示差的に発現される遺伝子は、実験状態と対照状態の間で遺伝子発現のパターンを比較することにより、本明細書に以下に記載されるように、検出される。特定の遺伝子が一つのこのようなパラダイムの使用により一旦同定されると、その発現パターンが異なるパラダイムでその発現を研究することにより更に特性決定され得る。遺伝子は、例えば、所定のパラダイムで一つの方法（例えば、アップレギュレーション）で調節されてもよいが、或る別のパラダイムで異なって（例えば、ダウンレギュレーション）調節されてもよい。更に、異なる遺伝子が一つのパラダイムで同様の発現パターンを有していてもよいが、それらのそれぞれの発現パターンが異なるパラダイムのもとで互いに異なっていてもよい。複数のパラダイムのこのような使用は心臓血管病における特定の遺伝子の役割および相対的重要性を区別するのに有益であるかもしれない。 5.1.1.1.泡沫細胞パラダイム−１例えば、アテローム性動脈硬化症に関係する示差的に発現される遺伝子の同定に利用し得るパラダイムの中に、泡沫細胞形成に関係し得る遺伝子を分析するように設計されたパラダイムがある。このようなパラダイムはこの細胞型の分化、または酸化LDL のそれらの摂取に関係する遺伝子を同定するのに利用し得る。このようなパラダイムの一実施態様が、以下パラダイムＡと称される。最初に、ヒト血液を採取し、末梢単球を当分野でルーチンに実施される方法により単離する。次にこれらのヒト単球は直ちに使用してもよく、または５〜９日にわたって、当分野でルーチンに実施される方法を使用して、in vitroで培養してもよく、この場合、それらはスカベンジャー受容体のアップレギュレーションの如きマクロファージ様特性を発現する。次にこれらの細胞を泡沫細胞形成に関係すると考えられる薬剤で種々の時間の長さにわたって処理する。これらの薬剤として、酸化LDL 、アセチル化LDL 、リゾホスファチジルコリン、およびホモシステインが挙げられるが、これらに限定されない。処理されないか、または天然LDL で処理された対照単球を平行して増殖させる。試験薬剤の添加後の或る時点で、細胞を回収し、以下の5.1.2.節に詳しく記載されるようにして示差的発現について分析する。以下の６節に示される実施例は、処理された細胞vs対照細胞中で示差的に発現される遺伝子を同定するためのこのような泡沫細胞パラダイムの使用を詳しく実証する。 5.1.1.2.泡沫細胞パラダイム−２アテローム性動脈硬化症と関連する示差的に発現される遺伝子を検出するための単球を必要とする別のパラダイムは移行(transmigration)現象の刺激を伴う。単球が動脈損傷に遭遇する時、それらは血管内皮層に付着し、この層を横切って移行し、内皮と動脈を取り囲む平滑筋細胞の層の間に位置を定める。この現象は、例えば、ヒト臍帯から単離された内皮細胞の層を培養することによりin vitroで模擬し得る。内皮単層が一旦形成すると、末梢血から採取された単球をLDL の存在下および不在下で内皮の上で培養する。数時間後に、単球は内皮を通って移行し、LDL に露出された３〜５日後に泡沫細胞に発達する。この系では、in vivo のように、内皮細胞がLDL の酸化を行い、次にこれが単球により吸収される。以下の5.1.2.節に記載されるように、次に遺伝子発現のパターンがこれらの泡沫細胞と未処理単球の間で比較される。 5.1.1.3.泡沫細胞パラダイム−３更に別の系は第三の細胞型、すなわち、アテローム発生に重要な役割を果たす平滑筋細胞を含む(Navab ら，1988，J.Clin.Invest.，82:1853)。この系では、ヒト大動脈平滑筋細胞の多層を天然コラーゲンのゲル層で覆われたミクロポアーフィルター上で増殖させ、ヒト大動脈内皮細胞の単層をコラーゲン層の上で増殖させる。走化性因子rFMLP の存在下でのヒト単球へのこの共培養物の露出は、内皮細胞への単球付着、続いて内皮単層を横切って内皮下腔のコラーゲン層への移行をもたらした。また、この型の培養物はLDL で処理すると泡沫細胞を生じることができる。次に泡沫細胞を回収して、遺伝子発現のそれらのパターンを5.1.2. 節に以下に説明されるように未処理細胞のパターンと比較する。 5.1.1.4.in vivo 単球パラダイム以下パラダイムＢと称される、単球の研究のためのこのようなパラダイムの別の実施態様は、脂質消費の食事管理によるヒト被験者の示差的治療を伴う。このようなヒト被験者を３週間にわたって低脂肪／低コレステロール食に保ち、その時点で血液を採取し、単球を当分野でルーチンに実施される方法に従って単離し、ＲＮＡを以下の5.1.2.節に記載されるようにして精製する。これらの同一患者を続いて高脂肪／高コレステロール食に切り換え、単球ＲＮＡを再度精製する。また、患者に高脂肪／低コレステロールを含む第三の組み合わせ食を支給してもよく、単球ＲＮＡをもう一度精製してもよい。患者が食事を受ける順序を変えてもよい。次いで２種の食事、または３種全ての食事で管理された患者に由来するＲＮＡを比較し、5.1.2.節に以下に説明するように示差的遺伝子発現について分析することができる。下記の７節に示される実施例は、対照食のもとでの発現に対してアテローム発生食事で管理された患者の単球中で示差的に発現される遺伝子を同定するためのこのようなin vivo 単球パラダイムの使用を実証する。また、このようなパラダイムは以下の７節に記載されるようにin vitro予備検出系と連係して使用されてもよい。 5.1.1.5.内皮細胞−IL-1パラダイム単球中の示差的遺伝子発現の検出に加えて、内皮細胞に焦点を合わせたパラダイムが心臓血管病に関係する遺伝子を検出するのに使用し得る。以下パラダイムＣと称される、一つのこのようなパラダイムでは、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC )をin vitro で増殖させる。アテローム性動脈硬化症状に関係する生理条件を模擬するために、炎症反応に関係することが知られている因子であるヒトIL-1β で実験培養物を処理する。また、実験HUVEC 培養物はアテローム発生性リポタンパク質の主要リン脂質成分であるリゾホスファチジルコリンまたは酸化ヒトLDL で処理してもよい。対照培養物はこれらの化合物の不在下で増殖させる。露出処理の或る期間後に、実験細胞および対照細胞を回収し、以下の5.1.2.節に記載されるように示差的遺伝子発現について分析する。以下の８節に示される実施例は、処理細胞vs対照細胞中で示差的に発現される配列を同定するためのこのようなIL-1誘導内皮細胞パラダイムの使用を実証する。 5.1.1.6.内皮細胞−ずれ応力パラダイム以下パラダイムＤと称される、内皮細胞を必要とする別のパラダイムでは、培養物を流体ずれ応力に露出するが、流体ずれ応力は異常な循環流の領域におけるアテローム性動脈硬化病変の広がりの原因であると考えられる。また、異常な血流は虚血／再灌流の有害な作用においてある役割を果たし、虚血はその障害が克服される時に、不十分な血液供給を受けている器管が過剰に多量の血液で急激に再灌流される。培養HUVEC 単層は、液体培地を含む特殊装置(Nagelら，1994，J.Clin.Invest. 94: 885-891)中で培養物を回転させることにより層状ずれ応力に露出される。同一培地中で増殖させた静的培養物が対照として利用できる。ずれ応力への露出の或る期間後に、実験細胞および対照細胞を回収し、以下の5.1.2 節に記載されるように示差的遺伝子発現について分析する。以下の９節に示された実施例は、露出細胞vs対照細胞中で示差的に発現される配列を同定するためのこのようなずれ応力を受けた内皮細胞パラダイムの使用を実証する。 5.1.1.1 節〜5.1.1.6 節に上記されたパラダイムを含むが、これらに限定されない、心臓血管病に関係する遺伝子を同定するために設計された全てのこのようなパラダイムでは、その疾病症状に対する改善作用を有することが知られている薬剤の如き化合物が実験系に含まれてもよい。このような化合物は既知治療薬、並びに有害な副作用のために治療薬として有用ではない化合物を含んでもよい。 5.1.1.1 節〜5.1.1.6 節に記載されたパラダイムに説明されるように培養される試験細胞は、例えば、これらの化合物の一つに露出され、以下の5.1.2 節に記載される方法に従って未処理細胞に対する示差的遺伝子発現について分析されてもよい。原理的に、特定のパラダイムに従って、その疾病に関係するあらゆる細胞型をこれらの化合物により疾病プロセスのあらゆる段階で治療することができる。また、試験細胞は、その疾病に関係しないかもしれない遺伝子発現に関する全般的作用をスクリーニングするために、その化合物でまた治療される無関係の細胞（例えば、繊維芽細胞）と比較されてもよい。このような全般的作用は、その化合物による治療後に試験細胞および無関係の細胞に共通である遺伝子発現の変化により顕在化し得る。これらの方法により、これらの化合物が作用する遺伝子および遺伝子産物が同定され、心臓血管病治療用の新規な治療化合物を同定するために以下に記載されるアッセイで使用される。 5.1.2.パラダイム物質の分析示差的に発現される遺伝子を同定するために、この節に先に記載されたようなパラダイムに利用された被験者の一つ以上の組織から全ＲＮＡまたはｍＲＮＡを単離する。ＲＮＡサンプルは実験被験者の組織および対照被験者の相当する組織から得られる。ｍＲＮＡの単離に対して選択しないＲＮＡ単離技術はどれもこのようなＲＮＡサンプルの精製に利用し得る。例えば、Sambrookら，1989，Mol-ec ular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，N.Y．、およびAusubel，F.M．ら編集，1987-1993，Current Protocols in Molecular Bio-lo gy，John Wiley＆Sons，Inc．New York(これらの両方が参考として本明細書にそのまま含まれる)を参照のこと。更に、多数の組織サンプルが、当業者に公知の技術、例えば、Chomczynski，P．(1989,米国特許第4,843,155号)(これが参考として本明細書にそのまま含まれる)の単一工程ＲＮＡ単離方法を使用して容易に処理し得る。示差的に発現される遺伝子により産生されたＲＮＡに相当する回収されたＲＮＡサンプル中の転写産物は、当業者に公知である種々の方法を利用することにより同定し得る。例えば、示差的スクリーニング(Tedder，T.F．ら，1988，Proc.N atl.Acad.Sci．USA 85:208-212)、サブトラクティブハイブリダイゼーション(He drick，S.M.ら，1984，Nature 308:149-153; Lee,S.W.ら，1984，Proc.Natl.Aca d.Sci．USA 88:2825)、および、好ましくは、示差的ディスプレイ(Liang,P．、およびPardee,A.B.，1993,米国特許第5,262,311 号(これが参考として本明細書にそのまま含まれる))が、示差的に発現される遺伝子に由来する核酸配列を同定するのに利用し得る。示差的スクリーニングは、ライブラリーの一つのコピーが一つの細胞型のｍＲＮＡ集団に対応する全細胞ｃＤＮＡプローブでスクリーニングされ、一方、ｃＤＮＡライブラリーの重複コピーが第二細胞型のｍＲＮＡ集団に対応する全ｃＤＮＡプローブでスクリーニングされる、ｃＤＮＡライブラリーの重複スクリーニングを伴う。例えば、一つのｃＤＮＡプローブが対照被験者に由来する細胞型の全細胞ｃＤＮＡプローブに対応してもよく、一方、第二ｃＤＮＡプローブが実験被験者に由来する同一細胞型の全細胞ｃＤＮＡプローブに対応してもよい。一つのプローブにハイブリダイズするが、他のプローブにハイブリダイズしないクローンは、対照被験者vs実験被験者の関心のある細胞型中で示差的に発現される遺伝子に由来するクローンである可能性がある。サブトラクティブハイブリダイゼーション技術は２種の異なる起源、例えば、対照組織および実験組織から採取されたｍＲＮＡの単離、ｍＲＮＡまたは単離されたｍＲＮＡから逆転写された一本鎖ｃＤＮＡのハイブリダイゼーション、および全てのハイブリダイズされ、それ故、二本鎖となった配列の除去を一般に伴う。残りのハイブリダイズされなかった、一本鎖のｃＤＮＡは、２種のｍＲＮＡ起源中で示差的に発現される遺伝子に由来するクローンである可能性がある。次にこのような一本鎖ｃＤＮＡが示差的に発現される遺伝子から誘導されるクローンを含むライブラリーの構築のために出発物質として使用される。示差的ディスプレイ技術は、示差的に発現される遺伝子に由来する配列の同定を可能にする公知のポリメラーゼ連鎖反応（PCR; Mullis，K.B.，1987,米国特許第4,683,202 号に示された実験実施態様）を利用する方法を記載している。最初に、単離されたＲＮＡが、当業者に公知である通常の技術を利用して、一本鎖ｃＤＮＡに逆転写される。逆転写酵素反応のプライマーとして、好ましくは以下に記載されるオリゴヌクレオチドのリバースプライマー型の、オリゴdTを含むプライマーが挙げられるが、これに限定されない。次に、この技術は、所定の細胞内に存在するＲＮＡ転写産物のランダムサブセットを提示するクローンの増幅を可能にする、下記のPCR プライマーの対を使用する。異なる対のプライマーの利用は、細胞中に存在するｍＲＮＡ転写産物のそれぞれが増幅されることを可能にする。このような増幅された転写産物の中で、示差的に発現される遺伝子から生じた転写産物が同定され得る。プライマー対のリバースオリゴヌクレオチドプライマーは、その5'末端に、好ましくは11ヌクレオチドの長さの、ヌクレオチドのオリゴdTストレッチを含むことができ、これがｍＲＮＡのpoly(A)テイルまたはｍＲＮＡpoly(A)テイルから逆転写されたｃＤＮＡの相補体にハイブリダイズする。第二に、リバースプライマーの特異性を増大するために、プライマーはその3'末端に一つ以上、好ましくは二つの付加的なヌクレオチドを含むことができる。統計上、対象のサンプル中に存在するｍＲＮＡ由来配列の一つのサブセットのみがこのようなプライマーにハイブリダイズするので、付加的なヌクレオチドはプライマーに該サンプル中に存在するｍＲＮＡ由来配列の一つのサブセットのみを増幅させる。これは、それが増幅された配列に相当するバンドのそれぞれのより一層状正確かつ完全な視覚化および特性決定を可能にする点で好ましい。フォワードプライマーは、対象の組織に由来するｃＤＮＡ配列にハイブリダイズする能力を有することが統計上期待されたヌクレオチド配列を含むことができる。そのヌクレオチド配列は任意の配列であってもよく、フォワードオリゴヌクレオチドプライマーの長さは約９〜約13のヌクレオチドの範囲であってもよく、約10のヌクレオチドが好ましい。任意のプライマー配列は、生成される増幅された部分ｃＤＮＡの長さを可変にし、こうして通常の変性配列決定用ゲル電気泳動を使用することにより異なるクローンを分離させる。増幅産物の収率および特異性を最適化し、更に、通常のゲル電気泳動技術を利用して分割され得る長さの増幅産物を生じるようなPCR 反応条件が選ばれるべきである。このような反応条件は当業者に公知であり、重要な反応パラメーターとして、例えば、先に説明されたオリゴヌクレオチドプライマーの長さおよびヌクレオチド配列、並びにアニーリングおよび伸長工程の温度および反応時間が挙げられる。２種の異なる細胞型のｍＲＮＡの逆転写および増幅から得られるクローンのパターンが配列決定用ゲル電気泳動により表示され、比較される。２種のバンド形成パターンの差異が示差的に発現される遺伝子を潜在的に示す。示差的に発現される可能性がある遺伝子配列がバルク技術、例えば、上記の技術により一旦同定されたら、このような推定上の示差的に発現される遺伝子の示差的発現が確証されるべきである。確証は、例えば、ノーザン分析および／またはRT- PCR の如き公知技術により行い得る。確証後に、示差的に発現される遺伝子が更に特性決定されてもよく、以下の5. 3 節に説明されるようにターゲット遺伝子および／またはフィンガープリント遺伝子として同定され得る。また、例えば、示差的ディスプレイにより得られた示差的に発現される遺伝子の増幅配列が、対応する遺伝子の完全長クローンを単離するのに使用されてもよい。遺伝子の完全長コード部分は、当分野で公知の分子生物学的技術により、過度の実験をしないで、容易に単離し得る。例えば、単離された示差的に発現された増幅断片が標識され、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに使用されてもよい。また、標識断片がゲノムライブラリーをスクリーニングするのに使用されてもよい。また、PCR 技術が完全長ｃＤＮＡ配列を単離するのに利用されてもよい。この節に上記されたように、示差的ディスプレイにより得られた単離された、増幅された遺伝子断片は遺伝子内の或るランダムな位置に5'末端を有し、また好ましくは遺伝子の転写部分の3'末端に相当する位置に3'末端を有する。増幅断片からのヌクレオチド配列情報が一旦得られると、遺伝子の残部（すなわち、示差的ディスプレイを利用する場合には、遺伝子の5'末端）が、例えば、RT-PCRを使用して得ることができる。完全長遺伝子配列の同定およびクローニングのためのこのような操作の一実施態様では、ＲＮＡが適当な組織または細胞起源から通常の操作に従って単離し得る。次に逆転写反応が、第一鎖合成のプライミングのために、増幅断片に対応するｍＲＮＡに相補性のオリゴヌクレオチドプライマーを使用してＲＮＡについて行われてもよい。プライマーはｍＲＮＡに逆行性であるので、伸長はｍＲＮＡの 5'末端に向かって進行するであろう。次に得られるＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドが、通常の末端トランスフェラーゼ反応を使用してグアニンで“テイルド(taile d)”されてもよく、そのハイブリッドがRNAase Hで消化されてもよく、次に第二鎖合成がpoly-Cプライマーで開始されてもよい。２種のプライマーを使用して、遺伝子の5'部分が、PCR を使用して増幅される。次に得られた配列が単離され、先に単離された配列で組換えられて、本発明の示差的に発現される遺伝子の完全長ｃＤＮＡを生成し得る。クローニング戦略および組換えＤＮＡ技術の総説について、例えば、Sambrookら，1989，上記文献、およびAusubel ら，1989，上記文献を参照のこと。 5.2.パスウェイ遺伝子の同定この節は、心臓血管病に関係する、“パスウェイ遺伝子”と称される、遺伝子の同定方法を記載する。本明細書に使用される“パスウェイ遺伝子”は、その遺伝子産物が心臓血管病に関係する遺伝子産物と相互作用する能力を示す遺伝子を表す。パスウェイ遺伝子は示差的に発現され、それ故、ターゲット遺伝子および／またはフィンガープリント遺伝子の特性を更に有し得る。タンパク質−タンパク質相互作用を検出するのに適した方法が、心臓血管病に関係することが知られている遺伝子産物と遺伝子産物との相互作用を同定することによりパスウェイ遺伝子産物を同定するのに使用し得る。このような既知の遺伝子産物は細胞タンパク質または細胞外タンパク質であってもよい。このような既知の遺伝子産物と相互作用する遺伝子産物はパスウェイ遺伝子産物に相当し、またそれらをコードする遺伝子がパスウェイ遺伝子に相当する。使用し得る従来の方法の中に、同時免疫沈殿、架橋および勾配カラムまたはクロマトグラフィーカラムによる同時精製がある。これらのような操作の利用はパスウェイ遺伝子産物の同定を可能にする。一旦同定されると、パスウェイ遺伝子産物は、通常の技術と連係して、その対応するパスウェイ遺伝子を同定するのに使用し得る。例えば、パスウェイ遺伝子産物のアミノ酸配列の少なくとも一部が、エドマン分解技術（例えば、Creighton，1983，Proteins: Structures and Mo lecular Principles，W.H.Fre-eman＆Co.，N.Y.，34-49頁を参照のこと）によるような当業者に公知の技術を使用して確かめられてもよい。得られたアミノ酸配列は、パスウェイ遺伝子配列のスクリーニングに使用し得るオリゴヌクレオチド混合物の生成のためのガイドとして使用し得る。行われるスクリーニングは、例えば、通常のハイブリダイゼーション技術またはPCR 技術により達成し得る。オリゴヌクレオチド混合物の生成およびスクリーニングに関する技術は公知である（例えば、Ausubel ら，上記文献、およびPCR Protocols: A Guide to Methods and Applications，1990，Innis，M．ら編集，Academic Press，Inc.，New York を参照のこと）。更に、心臓血管病に関係するタンパク質と相互作用するタンパク質をコードするパスウェイ遺伝子の同時同定をもたらす方法が使用し得る。これらの方法は、例えば、λgt11ライブラリーの抗体検索の公知技術と同様の方法でこのタンパク質を使用して、発現ライブラリーを心臓血管病に関係することが知られ、または示唆される標識タンパク質で検索することを含む。 in vivo でタンパク質相互作用を検出する一つのこのような方法、２ハイブリッド系が、限定のためではなく、例示のみのために詳しく記載される。この系の一つの別型が記載されており(Chien ら，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88: 9 578-9582)、Clontech(Palo Alto，CA)から市販されている。簡単に言えば、このような系を利用して、二つのハイブリッドタンパク質をコードするプラスミドが構築される。一つは既知タンパク質に融合された転写アクチベータータンパク質のＤＮＡ結合ドメインからなり、他方がｃＤＮＡライブラリーの一部としてこのプラスミドに組換えられたｃＤＮＡによりコードされる未知タンパク質に融合されたアクチベータータンパク質の活性化ドメインからなる。プラスミドは、調節領域がアクチベーターの結合部位を含むリポーター遺伝子（例えば、lacZ）を含む酵母サッカロミセス・セレビシアエ(Saccharomyces cer evisiae)の株に形質転換される。いずれのハイブリッドタンパク質も単独ではリポーター遺伝子、ＤＮＡ結合ドメインハイブリッド（それは活性化機能を提供しないから）および活性化ドメインハイブリッド（それはアクチベーターの結合部位に局在化することができないから）の転写を活性化することができない。２種のタンパク質の相互作用は機能性アクチベータータンパク質を再構成し、リポーター遺伝子の発現をもたらし、これがリポーター遺伝子産物に関するアッセイにより検出される。２ハイブリッド系または関連方法が、既知“餌(bait)”遺伝子タンパク質と相互作用するタンパク質について活性化ドメインライブラリーをスクリーニングするのに使用し得る。全ゲノム配列またはｃＤＮＡ配列は、活性化ドメインをコードするＤＮＡに融合されてもよい。このようなライブラリーおよびＤＮＡ結合ドメインに融合された餌遺伝子タンパク質のハイブリッドをコードするプラスミドが酵母リポーター株に同時形質転換され、得られる形質転換体がリポーター遺伝子を発現する形質転換体についてスクリーニングし得る。これらのコロニーが精製され、リポーター遺伝子発現を担うライブラリープラスミドが単離し得る。次にＤＮＡ配列決定が、ライブラリープラスミドによりコードされたタンパク質を同定するのに使用し得る。例えば、限定のためではなく、餌遺伝子は、それがGAL4タンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡに翻訳融合されるようにベクターにクローン化し得る。また、例えば、心臓血管病に関係する遺伝子の単離について、心臓血管病にある種の役割を果たすことが知られ、または示唆されている既に単離された遺伝子が餌遺伝子として使用し得る。これらとして、二三名を挙げると、bFGF、IG F-I 、VEGF、IL-1、M-CSF 、TGF β、TGF α、TNF α、HB-EGF、PDGF、IFN-γ、およびGM-CSFがあるが、これらに限定されない。餌遺伝子と相互作用するタンパク質が検出される細胞系のｃＤＮＡライブラリーが、当分野でルーチンに実施される方法を使用してつくられる。本明細書に記載された特別な系によれば、例えば、ｃＤＮＡ断片が、それらがGAL4の活性化ドメインに翻訳融合されるようにベクターに挿入し得る。このライブラリーが餌遺伝子-GAL4 融合プラスミドとともに、GAL4活性化配列を含むプロモーターにより誘導されたlacZ遺伝子を含む酵母株に同時形質転換し得る。餌遺伝子と相互作用する、GAL4活性化ドメインに融合された、ｃＤＮＡコードされたタンパク質が活性GAL4タンパク質を再構成し、それによりlacZ遺伝子の発現を誘導するであろう。lacZを発現するコロニーがX-gal の存在下でそれらの青色により検出し得る。次にｃＤＮＡがこれらの株から精製され、当分野でルーチンに実施される技術を使用して餌遺伝子相互作用タンパク質を生成し、単離するのに使用し得る。パスウェイ遺伝子が同定され、一旦単離されると、それは、例えば、以下の5. 3 節に説明されるように更に特性決定し得る。 5.3.示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子の特性決定示差的に発現される遺伝子、例えば、上記の5.1.1 節に説明された方法により同定された遺伝子、パスウェイ遺伝子、例えば、上記の5.2 節に説明された方法により同定された遺伝子、並びに別の手段により同定された遺伝子は、例えば、本明細書に説明されたような方法を利用することにより更に特性決定し得る。このような遺伝子が本明細書中“同定された遺伝子”と称される。本明細書に記載された分析の如き分析が同定された遺伝子の生物学的機能に関する情報をもたらすであろう。加えて、示差的に発現される遺伝子の生物学的機能の評価が、ターゲット遺伝子および／またはフィンガープリント遺伝子としてのそれらの指定を可能にするであろう。詳しくは、更なる特性決定が、遺伝子の発現の調節または遺伝子産物の活性の調節が心臓血管病を回復し得ることを示す、示差的に発現される遺伝子のいずれかが、上記5.1 節に特定されたような“ターゲット遺伝子”と指定されるであろう。このようなターゲット遺伝子およびターゲット遺伝子産物が、以下に説明されるものとともに、下記の5.5 節に説明される化合物発見戦略の焦点を構成するであろう。更なる特性決定が、このような調節が心臓血管病に積極的に影響しないかもしれないことを示すが、その発現パターンが、例えば、心臓血管病状態の相関関係のある遺伝子発現“フィンガープリントパターン”に寄与する、示差的に発現される遺伝子のいずれかが、“フィンガープリント遺伝子”と指定されるであろう。“フィンガープリントパターン”が下記の5.8 節に更に充分に説明される。ターゲット遺伝子のそれぞれがまたパスウェイ遺伝子の全部またはサブセットと同様にフィンガープリント遺伝子として機能し得ることが注目されるべきである。パスウェイ遺伝子はまた本明細書に記載された技術の如き技術に従って特性決定し得ることが更に注目されるべきである。パスウェイ遺伝子が示差的に発現されること、および遺伝子の発現の調節または遺伝子産物の活性の調節が心臓血管病を改善し得ることを指示する情報をもたらすこれらのパスウェイ遺伝子がまた“ ターゲット遺伝子”と称される。このようなターゲット遺伝子およびターゲット遺伝子産物は、先に説明されたものとともに、下記の5.5 節に説明される化合物発見戦略の焦点を構成するであろう。パスウェイ遺伝子の一つ以上の特性決定が示差的発現の欠如を明らかにし得るが、遺伝子の活性または発現の調節が、それにもかかわらず、心臓血管病症候を改善し得ることが更に注目されるべきである。このような場合、これらの遺伝子および遺伝子産物がまた下記の5.5 節の化合物発見戦略の焦点と考えられるであろう。パスウェイ遺伝子の特性決定が、遺伝子発現または遺伝子産物活性の調節が心臓血管病に積極的に影響しないかもしれないが、その発現が示差的に発現され、これが例えば心臓血管病状態の相関関係のある遺伝子発現フィンガープリントパターンに寄与する場合、このようなパスウェイ遺伝子は更にフィンガープリント遺伝子と称し得る。同定された遺伝子が更に特性決定し得る技術の中で、同定された遺伝子のヌクレオチド配列（これは当業者に公知の通常の技術を利用することにより得られてもよい）がこのような遺伝子を更に特性決定するのに使用し得る。例えば、同定された遺伝子の配列が、同定された遺伝子産物の生物学的機能に関する情報を生じ得る一つ以上の既知の配列モチーフに対する相同性を明らかにし得る。第二に、同定された遺伝子により生成されたｍＲＮＡの組織分布の分析が、当業者に公知の通常の技術を利用して、行い得る。このような技術として、例えば、ノーザン分析およびRT-PCRが挙げられる。このような分析は、同定された遺伝子が心臓血管病に寄与すると予想される組織中で発現されるか否かについて情報を与える。また、このような分析は定常状態ｍＲＮＡ調節に関する定量的情報を与え、どの同定された遺伝子が、好ましくは、心臓血管病に寄与すると予想し得る組織中の高レベルの調節を示すのかに関するデータを生じ得る。また、このような分析は所定の組織に由来する特別な細胞型の単離された細胞集団について行われてもよい。更に、通常のin situ ハイブリダイゼーション技術が、所定の組織内のどの細胞が同定された遺伝子を発現するのかに関する情報を与えるのに利用し得る。このような分析は、組織内の細胞のサブセットのみが心臓血管病に関係すると考えられる場合に心臓血管病に対する同定された遺伝子の生物学的機能に関する情報を与え得る。このようなin situ ハイブリダイゼーション分析が下記の14節の実施例に記載される。詳しくは、心臓血管病におけるrchd502 遺伝子およびrchd528 遺伝子の役割が、平滑筋細胞およびマクロファージを含む、組織中に存在するその他の細胞型中ではなく、ヒト心臓血管病患者から摘出された疾病組織の内皮細胞内の高レベルのそれらの発現を特異的に検出することにより更に実証された。これらの結果は、本明細書に記載されたパラダイム中の示差的に発現される遺伝子の検出が心臓血管病の治療および診断に生物学的に妥当な新規な特定の標的にどのようにして導くのかを明らかに実証する。第三に、同定された遺伝子の配列が、通常の技術を使用して、遺伝子を遺伝子地図、例えば、マウス遺伝子地図(Copeland ＆Jenkins，1991，Trends in Gene- tics 7:113-118)およびヒト遺伝子地図(Cohenら，1993，Nature 366: 698-701) に入れるのに使用し得る。このようなマッピング情報が、例えば、既知の遺伝子心臓血管病傾向がマッピングする近遺伝子領域をマッピングする遺伝子を同定することによりヒト疾病に対する遺伝子の重要性に関する情報を生じ得る。第四に、同定された遺伝子の生物学的機能が、妥当なin vivo 系およびin vi- tro 系を利用することにより更に直接に評価し得る。in vivo 系として、心臓血管病疾病素質を自然に示す動物系、またはapoE欠乏アテローム動脈硬化症マウスモデル(Plumpら，1992，Cell 71: 343-353)を含むが、これに限定されない、このような症候を示すように操作された動物系が挙げられるが、これらに限定されない。このような系が下記の5.4.4.1 節に説明される。このようなin vivo 系の使用が下記の７節に示される実施例に詳しく記載され、ターゲット遺伝子bcl-2 の役割を確かめる（下記の5.4.1 節中の表１を参照のこと）。簡単に言えば、最初にbcl-2 発現がapoE欠損アテローム性動脈硬化症マウスモデルでダウンレギュレーションされることが示された。次に、アテローム発生条件下で単球泡沫細胞中で誘導されるプロモーターの制御下のヒトbcl-2 遺伝子を有するトランスジェニックマウスが操作された。このような条件下のbcl- 2 の誘導の効果を試験するために、トランスジェニックマウスがapoE欠損マウスと交配された。次に高度に発現性のbcl-2 遺伝子を有するapoE欠損子孫がプラーク形成および発育について試験される。これらの子孫におけるプラーク形成および発育の低下がこのターゲット遺伝子による心臓血管病の介入の有効性を確かめる。 in vitro系として、心臓血管病の関係について知られており、またはその疑いのある細胞型を含む細胞をベースとする系が挙げられるが、これらに限定されない。このような系が下記の5.4.4.2 節に詳しく説明される。同定された遺伝子の生物学的機能を更に特性決定する際に、これらの遺伝子の発現がin vivo 系および／またはin vitro系中で調節され、すなわち、過剰発現または過小発現され、次にその系に関するその後の効果が分析し得る。また、同定された遺伝子の産物の活性が、関係するin vivo 系および／またはin vitro系における活性のレベルを増加または減少することにより調節され、次にその後の効果が分析し得る。このような特性決定により得られた情報は、関係する遺伝子を伴う心臓血管病の治療に適した方法を示唆し得る。例えば、治療は遺伝子発現および／または遺伝子産物活性の調節を含んでもよい。本明細書に記載された特性決定操作の如き特性決定操作は、このような調節が関係する遺伝子または遺伝子産物の発現または活性の増加または減少を伴うべき場所を示し得る。例えば、症状のもとにアップレギュレーションされる遺伝子は症状を発生または悪化するのに関係し得る。このような有害に発現された遺伝子の活性をダウンレギュレーションするのに指示された治療は症状を回復するであろう。一方、症状下の遺伝子のアップレギュレーションは冒された細胞による保護応答の一部であり得る。特に正常なアップレギュレーションを欠いている個体中の、このようなアップレギュレーションされた遺伝子産物の活性を増大または増進するのに指示された治療は、同様に症状を回復するであろう。このような治療の方法が下記の5.6 節に説明される。 5.4.示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子同定された遺伝子（これらは上記5.1.1 節に同定されたような示差的に発現される遺伝子、および上記5.2 節に同定されたようなパスウェイ遺伝子を含むが、これらに限定されない）が本明細書に記載される。詳しくは、このような同定された遺伝子の核酸配列および遺伝子産物が本明細書に記載される。更に、同定された遺伝子の産物、および同定された遺伝子が更に特性決定され、利用される細胞をベースとするモデルおよび動物をベースとするモデルに対し誘導された抗体がまたこの節に説明される。 5.4.1.示差的に発現される遺伝子配列およびパスウェイ遺伝子配列本発明の示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子が下記の表１にリストされる。示差的に発現される遺伝子ヌクレオチド配列およびパスウェイ遺伝子ヌクレオチド配列が図８、12、15、18、22、28、31、および35に示される。表１は、例えば、上記5.1.1 節、および下記の６節〜９節に示される実施例に説明されたパラダイムにより同定された示差的に発現される遺伝子をリストする。また、表１はこのような遺伝子の更なる特性決定に関する情報を要約する。第一に、示差的に発現される遺伝子を検出するのに最初に使用されたパラダイムが“最初の検出のパラダイム”と標題された欄の下に記載される。例えば、5. 1.1 節に記載されたパラダイム条件の一つ以上のもとに示差的に発現されることが示された遺伝子の発現パターンが“パラダイム発現パターン”と標題された欄の下に要約される。試験した遺伝子のそれぞれについて、使用されたパラダイム子発現が生成されたサンプル中でアップレギュレーションされる（すなわち、検が生成されたサンプル中でダウンレギュレーションされる（すなわち、検出可能なｍＲＮＡの量の減少がある）ことを示す。本明細書に使用される“検出可能な ”は、例えば、当業者に周知である標準のノーザン技術および／またはRT-PCR技術により検出可能であるｍＲＮＡのレベルをいう。示差的発現が検出された細胞型がまた表１中で“検出された細胞型”と標題された欄の下に要約される。“染色体位置”と標題された欄は、遺伝子が位置されるヒト染色体番号を示す。更に、遺伝子が核酸データベースに見られる配列と同様または相同のヌクレオチド配列を含む場合、このような類似性に関する文献がリストされる。表１にリストされた遺伝子は、適当なｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）ライブラリー内の遺伝子を検出するのに適したプローブの使用を含むが、これらに限定されない、当業者に周知のクローニング方法を使用して得られてもよい（例えば、Sambrookら，1989，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories（これが参考として本明細書にそのまま含まれる）を参照のこと）。本明細書に報告された新規な配列のプローブは、下記の表２に示されるような、NRRLまたはATCCに寄託された単離クローンから直接に得られてもよい。また、新規な遺伝子のオリゴヌクレオチドプローブは図８、12、15、18 、22、28、31、および35に開示されたＤＮＡ配列に基いて合成されてもよい。このような合成オリゴヌクレオチドは同様に下記の文献：Clearyら，1986，Cell 4 7:19-28(bcl-2); Takahashiら，1990，J.Biochem 108: 145-148(グルタチオンペルオキシダーゼ);およびJones ら，1993，J.Biol.Chem．268: 9049-9054(プロスタグランジンエンドペルオキサイドシンターゼII)(これらのそれぞれが本明細書にそのまま含まれる）に記載された既に知られている遺伝子について示された配列に基いて作製し得る。部分コード配列または非コード配列を含むクローンから得られた配列が、RACE 方法(Chenchik ら，1995，CLONTECHniques（X）1: 5-8; Barnes，1994，Proc.Na tl.Acad.Sci．USA 91: 2216-2220; およびCheng ら，Proc.Natl.Acad.Sci．USA 91: 5695-5699)を使用することにより全コード領域を得るのに使用し得る。オリゴヌクレオチドが全コード配列をコードする逆転写されたｍＲＮＡを増幅し得る部分クローンから得られた配列に基いて設計し得る。この方法が、rchd523 遺伝子の全コード領域を得るのに、下記の９節の実施例に記載されるように、使用された。また、プローブは、遺伝子が転写される適当な細胞または細胞系から調製されたｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに使用し得る。例えば、単球中に検出された、本明細書に記載された遺伝子が、下記の7.1.1 節に記載されるように単離された単球から調製されたｃＤＮＡライブラリーからクローン化し得る。実際に、下記の９節の実施例に詳しく記載されるように、この方法がrchd534 遺伝子の全コード領域を得るために適用された。簡単に言えば、この遺伝子のアップレギュレーションが、パラダイムＤのもとに、ずれ応力を受けたHUVEC 中で検出された。次に、rchd534 遺伝子の増幅された部分配列がサブクローン化された。次に挿入物が単離され、ずれ応力処理されたHUVEC から調製されたｃＤＮＡライブラリーを探査するのに使用された。全rchd534 コード領域を含むｃＤＮＡクローンが検出され、単離され、配列決定された。内皮細胞中で検出された、本明細書に記載された遺伝子はまたProgress in H- emostasis and Thrombosis，3 巻，P.Spaet 編集者，Grune ＆Stratton Inc.，N ew York，1-28に記載されたように単離された内皮細胞から構築されたｃＤＮＡライブラリーからクローン化し得る。また、遺伝子が、例えば、Takahashi ら， 1990，上記文献に従ってヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー(Clontech Laboratories ,Palo Alto，CA)、Jones ら，1993，上記文献に記載されたHUVEC ｃＤＮＡライブラリー、またはClearyら，1986，上記文献に記載された急性リンパ芽球性白血病(SUP-B2)ｃＤＮＡライブラリーから回収し得る。ゲノムＤＮＡライブラリーはあらゆる供給源から調製し得る。下記の表２は表１にリストされた新規な遺伝子の配列を含む単離されたクローンをリストする。このようなクローンは、下記の6.1 節に記載されるようにTAクローニングベクター(Invitrogen，San Diego，CA)にサブクローン化された表示の示差的ディスプレイバンドの増幅配列から生じた。また、それぞれのこのようなクローンを含む、NRRLまたはATCCに寄託された株が表２にリストされる。このような株は、下記の6.1 節に記載されるように、E.coli株INV αF’(Invitro-ge n)を表示のプラスミドで形質転換することにより生産された。新規な遺伝子の全コード領域を含むプラスミドの名称は接頭辞pFCHD を有し、またこれらのプラスミドを有する株の名称は接頭辞FCHDを有する。本明細書において、「示差的に発現される遺伝子」（すなわち、ターゲットおよびフィンガープリント遺伝子）または「パスウェイ遺伝子（pathway gene）」とは、（ａ）本明細書に開示（図８、１２、１５、１８、２２、２８、３１、および３５に示すように）されるＤＮＡ配列の少なくとも１つを含有するか、またはＮＲＲＬもしくはＡＴＣＣに寄託された、表２に記載のクローン内に含有されている遺伝子；（ｂ）ＮＲＲＬもしくはＡＴＣＣに寄託された、表２に記載のクローン内に含有されているか、あるいは本明細書に開示（図８、１２、１５、１８、２２、２８、３１、および３５に示すように）されるか、またはＮＲＲＬもしくはＡＴＣＣに寄託された、表２に記載のクローン内に含有されている、ＤＮＡ配列が属する遺伝子のコード領域内に含有されている、本明細書に開示（図８、１２、１５、１８、２２、２８、３１、および３５に示すように）されるＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列をコードする任意のＤＮＡ配列；（ｃ）ＮＲＲＬもしくはＡＴＣＣに寄託された、表２に記載のクローン内に含有されているか、あるいは本明細書に開示（図８、１２、１５、１８、２２、２８、３１、および３５に示すように）されるか、またはＮＲＲＬもしくはＡＴＣＣに寄託された、表２に記載のクローン内に含有されている、ＤＮＡ配列が属する遺伝子のコード領域内に含有されている、本明細書に開示されているコード配列の相補体に、高ストリンジェント条件下（例えば、０．５ＭＮａＨＰＯ₄、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１mM ＥＤＴＡ中で６５℃でフィルター結合したＤＮＡにハイブリダイゼーションし、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で６８℃で洗浄する（Ausubel F.M.ら編、1989、分子生物学の最近の方法（Current Protocols in Molecular Biology）、Vol.I,グリーンパブリシングアソシエーツ社（Green Publishing Associates，Inc.）、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（John Wiley & Sons，Inc.）、ニューヨーク、第２頁１０．３）でハイブリダイズし、表２に記載のクローン内に含有される配列によりコードされる遺伝子産物と機能的に同等の遺伝子産物をコードする、任意のＤＮＡ配列、および／または（ｄ）ＮＲＲＬもしくはＡＴＣＣに寄託された、表２に記載のクローン内に含有されているか、あるいは本明細書に開示（図８、１２、１５、１８、２２、２８、３１、および３５に示すように）されるか、またはＮＲＲＬもしくはＡＴＣＣに寄託された、表２に記載のクローン内に含有されている、ＤＮＡ配列が属する遺伝子のコード領域内に含有されている、本明細書に開示（図８、１２、１５、１８、２２、２８、３１、および３５に示すように）されるコード配列の相補体に、あまりストリンジェントでない条件下（例えば０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで４２℃で洗浄するという中程度のストリンジェント条件下（Ausube l ら、1989、同上）でハイブリダイズするが、機能的に同等の遺伝子産物をコードする任意のＤＮＡ配列、を意味する。本発明はまた、前節のＤＮＡ配列（ａ）から（ｃ）にハイブリダイズする、従ってその相補体である、核酸分子好ましくはＤＮＡ分子も含有する。このようなハイブリダイゼーション条件は、前述のように高ストリンジェントであっても、またはあまり高ストリンジェントでなくてもよい。核酸分子がデオキシヌクレオチド（「オリゴ」）であるとき、高ストリンジェント条件とは、例えば６×ＳＳＣ／０．０５％ピロリン酸ナトリウム中で３７℃（１４塩基オリゴについて）、４８℃（１７塩基オリゴについて）、５５℃（２０塩基オリゴについて）、および６０℃（２３塩基オリゴについて）での洗浄を意味する。これらの核酸分子は、例えばターゲット遺伝子制御に有用なターゲット遺伝子アンチセンス分子として、および／またはターゲット遺伝子核酸配列の増幅反応のアンチセンスプライマーとして作用してもよい。さらに、このような分子は、ターゲット遺伝子制御にも有用なリボザイムおよび／または三重らせん配列の一部として使用することができる。さらに、このような分子は、診断法の成分として使用でき、ここで心臓血管病を引き起こす対立遺伝子の存在が検出される。本発明はまた、（ａ）前記コード配列の任意のものおよび／またはその相補体（すなわち、アンチセンス）を含有するＤＮＡベクター、（ｂ）コード配列の発現を指令する調節要素に機能的に結合した前記コード配列の任意のものを含有するＤＮＡ発現ベクター、および（ｃ）宿主細胞中でコード配列の発現を指令する調節要素に機能的に結合した前記コード配列の任意のものを含有する、遺伝子操作した宿主細胞、も包含する。本明細書において、調節要素は、誘導性または非誘導性プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよび発現を指令および制御することが当該分野で公知の他の要素を含むが、これらに限定されない。本発明は、本明細書に開示したＤＮＡ配列の任意のものの断片を含む。前記の遺伝子配列以外に、例えば他の種に存在するそのような配列の相同体が、当該分野で公知の分子生物学的方法により同定され、過度の実験をすることなく容易に単離される。さらにこのような遺伝子産物の１つまたはそれ以上のドメインに対して広範な相同性を有するタンパク質をコードするゲノム内の他の遺伝子座に遺伝子が存在するかも知れない。これらの遺伝子もまた同様の方法により同定される。例えば、単離された示差的に発現される遺伝子配列は標識され、目的の生物から得られたｍＲＮＡから作製されたｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに使用してもよい。ｃＤＮＡライブラリーが、標識配列が得られた生物の型とは異なる生物から得られた時、ハイブリダイゼーション条件は低ストリンジェントであろう。あるいは、標識断片は、再度、適度のストリンジェント条件を用いて、目的の生物から得られたゲノムライブラリーをスクリーニングするために使用される。このような低ストリンジェント条件は当業者に周知であり、ライブラリーおよび標識配列が得られた特定の生物に依存して変動するであろう。このような条件に関する指針は、例えば Sambrookら、1989、分子クローニング、実験室マニュアル（Molecular Cloning，A Laboratory Manual）、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Cold Spring Harbor Press）、ニューヨーク；Ausube l F.M.ら編、1989、分子生物学の最近の方法（Current Protocols in Molecular Biology）、グリーンパブリシングアソシエーツ・アンド・ワイリー・インタイーサイエンス（Green Publishing AssociatesとWiley Interscience）、ニューヨークを参照のこと。さらに、従来は未知の示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子型配列が、目的の遺伝子内のアミノ酸配列に基づいて設計された、２つの縮重オリゴヌクレオチドプライマープールを用いてＰＣＲを行うことにより単離される。反応の鋳型は、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子対立遺伝子を発現することが知られているかまたは疑われる、ヒトまたは非ヒト細胞株または組織から調製されるｍＲＮＡの逆転写により得られるｃＤＮＡでもよい。ＰＣＲ産物は、増幅された配列が、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子様の核酸配列の配列であることを確認するために、サブクローニングまたは配列決定してもよい。次にＰＣＲ断片を用いて、種々の方法で全長ｃＤＮＡクローンを単離する。例えば、増幅断片を標識し、バクテリオファージｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに用いてもよい。あるいは標識断片を用いて、ゲノムライブラリーをスクリーニングしてもよい。ＰＣＲ技術はまた、全長ｃＤＮＡ配列を単離するのに利用できる。例えば適当な細胞または組織供給源から、標準的方法を用いてＲＮＡが単離される。第１の鎖の合成のプライミングのための増幅断片の最も５’末端に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＲＮＡについて逆転写反応を行う。得られるＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを次に、標準的末端トランスフェラーゼ反応を用いてグアニンで「テイル」を作り、ＲＮＡａｓｅＨを用いてハイブリッドを消化し、次にポリーＣプライマーを用いて第２の鎖の合成をプライミングする。こうして、増幅断片の上流のｃＤＮＡ配列が容易に単離される。使用されるクローニング法の総説については、Sambrookら、1989（前述）を参照のこと。同定される示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子が正常（すなわち、野生型）な場合、この遺伝子は遺伝子の突然変異対立遺伝子を単離するのに使用される。このような単離は、遺伝的基礎を有することが知られているかまたは疑われる過程および疾患において好適である。突然変異対立遺伝子は、心臓血管病症状に寄与する遺伝子型を有することが知られているかまたは疑われる個人から単離される。突然変異対立遺伝子と突然変異対立遺伝子産物は次に、後述の治療および診断測定系に使用される。突然変異遺伝子のｃＤＮＡは、例えば当業者に周知のＰＣＲ法を用いて単離される。この場合、第１のｃＤＮＡ鎖は、突然変異対立遺伝子を有すると考えられる個人で発現されることが知られているかまたは疑われる組織から単離されるｍＲＮＡに、オリゴ−ｄＴオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、新しい鎖を逆転写酵素を用いて伸長するることにより合成できる。次にｃＤＮＡの第２の鎖は、正常な遺伝子の５’末端に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを用いて合成される。次にこれらの２つのプライマーを用いて、ＰＣＲにより生成物を増幅し、適切なベクターにクローン化させ、当業者に周知の方法によりＤＮＡ配列解析を行う。突然変異遺伝子のＤＮＡ配列を正常な遺伝子と比較して、突然変異遺伝子産物の機能の喪失または変化に関係する突然変異を確認することができる。あるいは、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーは、突然変異対立遺伝子を有することが知られているかまたは疑われる個体の目的の遺伝子を発現することが知られているかまたは疑われる組織から、それぞれＤＮＡまたはＲＮＡを用いて構築し、スクリーニングすることができる。正常な遺伝子またはその適切な断片は次に、標識して、ライブラリー中の対応する突然変異対立遺伝子を同定するためのプローブとして使用される。次にこの遺伝子を含有するクローンを、当該分野で通常使用される方法により精製して、この節で前記したように配列分析にかける。さらに発現ライブラリーは、突然変異対立遺伝子を有することが疑われるかまたは知られている個体の目的の遺伝子を発現することが知られているかまたは疑われる組織から合成されるｃＤＮＡから単離されたＤＮＡを用いて作製される。こうして、推定の突然変異組織により作成した遺伝子産物を発現させ、以下の５．４．３節で説明するように正常な遺伝子産物に対して作成した抗体とともに標準的抗体スクリーニング法を使用してスクリーニングする。（スクリーニング法については、Harlow，E.とLane編、1988、「抗体：実験室マニュアル（Antibodi es: A Labratory Manual）」、コールド・スプリング・ハーバー・プレス、コールド・スプリング・ハーバーを参照のこと）。突然変異により、機能が変化した（例えば、ミスセンス突然変異の結果として）遺伝子産物が発現される場合、ポリクローナルな抗体のセットは、突然変異遺伝子産物と交差反応する可能性がある。そのような標識抗体との反応を介して検出されるライブラリークローンを精製し、この節で前記したように配列分析にかける。５．４．２示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子の産物示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子の産物には、前記５．４．１節に記載の示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子配列によりコードされるタンパク質がある。具体的には、示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子の産物は、ＮＲＲＬもしくはＡＴＣＣに寄託された、表２に記載の前記クローン内に含有されているか、あるいは本明細書に開示（図８、１２、１５、１８、２２、２８、３１、および３５に示すように）されるか、またはＮＲＲＬもしくはＡＴＣＣに寄託された、表２に記載のクローン内に含有されている、ＤＮＡ配列が属する遺伝子のコード領域内に含有されている、示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子の配列によりコードされる示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子ポリペプチドを含む。さらに、示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子の産物は、機能的に同等の同等の遺伝子産物であるタンパク質を含んでもよい。このような同等の示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子の産物は、前記５．４．１節に記載の示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子の配列によりコードされるアミノ酸配列内のアミノ酸残基の欠失、付加または置換を有してもよいが、サイレント変化であるため、機能的に同等の示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子の産物を産生する欠失、付加または置換を含有してもよい。アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両性に基づいて行われる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンがあり、極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンがあり、陽性に荷電した（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンがあり、陰性に荷電（酸性）したアミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸がある。本明細書において「機能的に同等である」とは、前記５．４．１節に記載の示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子の配列によりコードされる内因性の示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子の産物と、インビボで実質的に同様の活性を示すことができるタンパク質を意味する。あるいは以下の５．５節に記載のような測定法の一部として使用される時、「機能的同等である」とは、内因性の示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子の産物の対応する部分が相互作用するのと実質的に同じ方法で、他の細胞性または細胞外分子と相互作用することができるペプチドを意味する。示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子の産物は、当該分野で周知の技術を使用して組換えＤＮＡ技術により産生してよい。すなわち、示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子配列をコードする核酸を発現することにより、本発明の示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子ポリペプチドおよびペプチドを調製する方法が本明細書中に記載される。示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子タンパク質コード配列および適切な転写／翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを作製するために、当業者に周知の方法が使用できる。これらの方法には例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術およびインビボ組換え／遺伝的組換えがある。例えば、Sambrookら、1989（前述）およびAusubelら、1989（前述）を参照のこと。あるいは、示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子タンパク質配列をコードすることができるＲＮＡは、例えば合成機を用いて化学的に合成できる。例えば、「オリゴヌクレオチド合成（Oligonucleotide Synthesis）」、１９８４、Gait，J.J.編、ＩＲＬプレス、オックスフォオード（これは参考のためその全体が本明細書に引用される）を参照のこと。本発明の示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子コード配列を発現するために、種々の宿主−発現ベクター系が使用できる。このような宿主−発現ベクター系は、目的のコード配列を産生し、次に精製するが、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクションした時には、本発明の示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子タンパク質をその場で示すビヒクルである。これらは、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子タンパク質コード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌（例えば、大腸菌（E．c oli）、枯草菌（Bacillus subtilis））、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子タンパク質コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母（例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）、ピヒア（Pichia））、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子タンパク質コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子タンパク質コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））で感染させたか、または組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換した植物細胞系、または哺乳動物細胞（例えば、メタロチオネインプロモーター）のゲノムまたは哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）から得られるプロモーターを含有する組換え発現構築物を有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３）を含むが、これらに限定されない。細菌系では、発現される示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子タンパク質の使用目的に依存して、多くの発現ベクターが有利に選択できる。例えば、抗体の産生のために、あるいはペプチドライブラリーをスクリーニングするために、このようなタンパク質を大量に産生する時、容易に精製できる融合タンパク質産物の高レベルの発現を指令するベクターが好ましい。このようなベクターには、大腸菌（E．coli）発現ベクターｐＵＲ２７８（Rutherら、1983、EMBO J．2:1791）（ここでは、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子タンパク質をコードする配列は、ｌａｃＺコード領域と一緒にフレーム内でベクターに個々に連結され、その結果融合タンパク質が産生される）；ｐＩＮベクター（Inouye & Inouye，1985，Nucleic Acids Res．13: 3101-3109; Van Heeke & S chuster，1989，J．Biol．Chem 264:: 5503-5509）などがあるが、これらに限定されない。ｐＧＥＸベクターも、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現するために使用することができる。一般的にこのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン− アガロースビーズに吸着させ、次に遊離グルタチオンの存在下で溶出することにより、溶解した細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、クローン化されたターゲット遺伝子タンパク質がＧＳＴ部分から放出されるように、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計される。好適な実施態様において、標準的ＰＣＲ法（Innisら、1990、前述）を用いて、アミノ末端のフレーム内（in-frame）のＢａｍＨＩ部位とカルボキシ末端のＥｃｏＲＩ部位に、全長ｃＤＮＡ配列を追加し、ｐＧＥＸ−２ＴＫベクター（ファルマシア（Pharmacia）、ウプサラ（Uppsala）、スエーデン）に連結することができる。得られるｃＤＮＡ構築物は、放射能標識のためにアミノ末端にキナーゼ認識部位を含有し、親和性精製のためにカルボキシ末端にグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ配列を有する（Nilssonら、1985、EMBO J．4: 1075；Zabeauと Stanley，1982，EMBO J．1: 1217）。昆虫の系では、オートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。このウイルスは、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera fru giperda）細胞中で増殖する。示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子コード配列は、ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個々にクローン化され、そしてＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置かれる。示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子コード配列の挿入が成功すれば、、ポリヘドリン遺伝子が不活性化され、非閉塞組換えウイルス（すなわち、、ポリヘドリン遺伝子にコードされるタンパク質性コートが欠如したウイルス）が産生される。次にこれらの組換えウイルスは、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞を感染させるのに使用され、そこで挿入遺伝子が発現される（例えば、Smithら、1983，J．V irol．46: 584; Smith、米国特許第４，２１５，０５１号）。哺乳動物宿主細胞では、多くのウイルスベースの発現系が使用される。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される時、目的の示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子コード配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体（例えば、後期プロモーターおよび三部分リーダー配列）に連結される。次にこのキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボ組換えによりアデノウイルスゲノム中に挿入される。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）への挿入により、感染宿主中で生存活性がありそこで示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子タンパク質を発現することができる組換えウイルスができる。（例えば、LoganとShenk、1984，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81: 3655-3 659）。挿入された示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子コード配列の効率的な翻訳のために具体的な開始シグナルがまた必要とされる。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列がある。示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子の全遺伝子（それ自身の開始コドンと隣接配列を含む）が適切な発現ベクターに挿入される場合、追加の翻訳制御シグナルは必要ない。しかし、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子コード配列の一部のみが挿入される場合、内因性翻訳制御シグナル（おそらく、ＡＴＧ開始コドンを含む）が提供される必要がある。さらに開始コドンは、完全な挿入体の翻訳を確認するために、開始コドンは目的のコード配列の読みとり枠と同じフェーズになければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の種々の起源のものでもよい。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなど（Bittner ら、1987，Methods in Enzymol.1 53: 516-544）を含めることにより増強されてもよい。好適な実施態様において、全長読みとり枠をコードするｃＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡ発現がＣＭＶプロモーターにより指令されるように、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を置換してｐＣＭＶβ中に連結される（Alam，1990，Anal．Biochem．188 : 245-254; MacGregorとCaskey，1989，Nucl．Acids Res．17: 2365; NortonとC orrin，1985，Mol．Cell．Biol．5: 281）。さらに、挿入された配列の発現を調節するか、または所望の具体的な方法で遺伝子産物を修飾しプロセシングする、宿主細胞株が選択される。タンパク質産物のこのような修飾（例えば、グリコシル化）やプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能にとって重要である。異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳後プロセシングや修飾の特徴的および特異的機構を有する。適切な細胞株または宿主系は、発現される外来タンパク質の正しい修飾やプロセシングを確保するように選択することができる。このために、一次転写物の正しいプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化、およびリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞が使用される。このような哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８などがあるが、これらに限定されない。組換えタンパク質の長期、高収率産生のために安定な発現が好ましい。例えば、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子タンパク質を安定に産生する細胞株が操作される。ウイルス性複製開始点を含有する発現ベクターを用いるより、宿主細胞を、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）および選択性マーカーにより制御されるＤＮＡで形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入後に、作成した細胞は、高富化培地中で１〜２日間増殖され、次に選択培地に交換される。組換えプラスミド中の選択性マーカーは、選択に耐性を与え、細胞が、その染色体中にプラスミドを安定に組み込み、増殖して増殖巣を形成させ、次にこれがクローン化され細胞株に拡大されることを可能にする。この方法は、示差的に発現されるあるいはパスウェイ遺伝子タンパク質を発現する細胞株を操作するのに有利に用いられる。このような作成した細胞株は、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子タンパク質の内因性活性に影響を与える化合物のスクリーニングや評価に特に有用である。多くの選択系が利用でき、例えば単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wi glerら、1977，Cell 11: 223）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（SzybalskaとSzybalski，1962，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 4 8: 2026）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowyら、1980, Cell 22: 817）遺伝子が、それぞれｔｋ^-、ｈｇｐｒｔ^-またはａｐｒｔ^-細胞に用いられるが、これらに限定されない。また、抗代謝物耐性が、ｄｈｆｒ（これはメトトレキセートに対する耐性を与える（Wiglerら、1980，Proc．Natl. Acad．Sci．USA 77: 3567; O'Hareら、1981，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78:1 527）；ｇｐｔ（これは、ミコフェノール酸に対する耐性を与える）（Mulligan とBerg，1981，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78: 2072）；ｎｅｏ（これは、アミノグリコシドＧ４１８に対する耐性を与える）（Colberre-Garapinら、1981， J．Mol．Biol．150: 1）；およびｈｙｇｒｏ（これは、ヒグロマイシンに対する耐性を与える）（Santerreら、1984，Gene 30: 147）遺伝子の選択の基礎として使用することができる。別の融合タンパク質系は、ヒト細胞株で発現される非変性融合タンパク質の容易な精製を可能にする（Janknechtら、1991，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88: 8972-8976）。この系では、目的の遺伝子は、遺伝子の読みとり枠が一過性に、６つのヒスチジン残基からなるアミノ末端タグに融合されるように、ワクシニア組換えプラスミド中にサブクローニングされる。組換えワクシニアウイルスで感染させた細胞の抽出物を、Ｎｉ²⁺ニトリロ酢酸−アガロースカラムにのせ、ヒスチジンが付加されたタンパク質をイミダゾール含有緩衝液で選択的に溶出する。５．５節で後述するような測定系の成分として使用される時、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子タンパク質は、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子タンパク質と試験物質の間で形成される複合体の検出を促進するために、直接または間接に標識される。種々の適切な標識系の任意のものが使用でき、例えば、¹²⁵Ｉ；基質に接触させた時、検出可能な発色シグナルまたは光を産生する酵素標識系；および蛍光標識物があるが、これらに限定されない。このような測定系のために示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子タンパク質を産生するために組換えＤＮＡ技術が使用される時、標識化、固定化および／または検出を促進できる融合タンパク質を作成することが有利である。間接標識化では、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子産物に特異的に結合する、標識抗体のようなタンパク質を使用する。そのような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、１本鎖抗体、Ｆａｂ断片およびＦａｂ発現ライブラリーにより産生される断片があるが、これらに限定されない。５．４．３示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子産物抗体本明細書に、１つまたはそれ以上の示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子エピトープを特異的に認識することができる抗体の産生方法が記載される。そのような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化またはキメラ抗体、１本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ(ab')₂断片、Ｆａｂ発現ライブラリーから産生される断片、抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、および前記いずれかのエピトープ結合断片があるが、これらに限定されない。このような抗体は、例えば生物試料中のフィンガープリント、ターゲット、またはパスウェイ遺伝子の検出に用いられるか、あるいは異常ターゲット遺伝子活性の阻害方法として使用される。すなわち、このような抗体は、心臓血管病治療法の一部として、および／または診断法（こうして、患者は、フィンガープリント、ターゲット、またはパスウェイ遺伝子タンパク質の異常レベル、あるいはこのようなタンパク質の異常な型の存在の試験のために用いられる）の一部として使用される。示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子に対する抗体の産生のために、種々の宿主動物を、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子タンパク質またはその部分を注射して免疫する。このような宿主動物には、ウサギ、マウス、およびラットなどがあるが、これらに限定されない。宿主の種に依存して、免疫応答を上昇させるために種々のアジュバントが使用できる。例えば、フロイント（完全および不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムのような鉱物ゲル、表面活性物質（例えば、リソレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびＢＣＧ（bacille Calmette-Guerin）やコリネバクテリウム・パルブム（Corynebacterium parvum）のような有用である可能性のあるヒトアジュバントがあるが、これらに限定されない。好適な実施態様において、ターゲット遺伝子産物のアミノ酸配列に対応するペプチド配列が選択され、合成と抗体産生のためにリサーチジェネティクス（Rese arch Genetics）（ハンツビル（Huntsville）、アラバマ州）に提出された。ペプチドは、記載されている（Tam，J.P.，1988，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85 : 5409-5413; Tam，J.P.,とZavala，F.，1989，J．Immunol．Methods 124: 53-6 1; Tam，J.P.,とLu，Y.A.，1989，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86: 9084-9088 ）ように修飾され、等量のフロイントアジュバントに乳化させ、ウサギの背中側の皮下に１回の免疫当たり総量１．０ml（ペプチド０．５mg）を注射した。２週間および６週間後ウサギに追加免疫し、４、８、および１０週間目に採血した。血液を凝固させ、遠心分離して血清を採取した。ポリクローナル抗体は、ターゲット遺伝子産物のような抗原またはその抗原機能のある誘導体で免疫した動物の血清から得られる抗体分子の不均一な集団である。ポリクローナル抗体の産生のために、前述のような宿主動物を、これも前述のアジュバントを補足した示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子産物を注射して免疫する。特定の抗原に対する抗体の均一な集団であるモノクローナル抗体は、細胞株の連続培養により抗体分子の産生を提供する任意の方法により得られる。これらには、KohlerとMilstein のハイブリドーマ法（1975，Nature 256: 495-497；および米国特許第４，３７６，１１０号）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Kosborら、1983，Immunolgy Today 4: 72; Coleら、1983，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 80: 2026-2030）、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Coleら、1985，モノクローナル抗体と癌治療（Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy）、アランアールリス社（Alan R．Liss，Inc.）、pp．77-96）があるが、これらに限定されない。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびこれらの任意のサブクラスを含む任意の免疫グロブリンクラスである。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボで培養できる。インビボでの高力価のｍＡｂの産生は、本発明の好適な産生方法である。さらに、適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子からの遺伝子を、適切な生物活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子とともにスプライスすることによる、「キメラ抗体」の産生のために開発されている方法（Morrisonら、1984，Proc.N atl．Acad．Sci.，81: 6851-6855; Neubergerら、1984，Nature，317: 604-608; Takedaら、1985，Nature，314: 452-454）が使用できる。キメラ抗体は、マウスｍＡｂ由来の可変領域とヒトの免疫グロブリン定常領域を有するような、異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。あるいは、１本鎖抗体の産生について記載されている方法（米国特許第４，９４６，７７８号；Bird，1988，Science 242: 423-426; Hustonら、1988，Proc.N atl．Acad．Sci．USA85: 5879-5883；およびWardら、1989，Nature 334: 544-54 6）を、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子１本鎖抗体を産生するように応用することができる。１本鎖抗体は、アミノ酸の橋を介してＦｖ領域の重鎖と軽鎖フラグメントを連結し、１本鎖ポリペプチドを得ることにより形成される。特異的エピトープを認識する抗体断片は、既知の方法により産生される。このような断片には例えば、抗体分子のペプシン消化により産生されるＦ(ab')₂断片、およびＦ(ab')₂断片のジスルフィド架橋を還元することにより形成されるＦａｂ断片があるが、これらに限定されない。あるいは、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速で容易な同定を可能にするように、Ｆａｂ発現ライブラリーが構築される（Huseら、1989，Science，246: 1275-1281）。５．４．４細胞ベースおよび動物ベースのモデル系本明細書において、心臓血管病のモデルとして作用する細胞ベースおよび動物ベースの系が記載される。これらの系は、種々の応用に使用される。例えば、細胞ベースおよび動物ベースの系は、前記５．３節に記載したように示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子をさらに性状解析するために使用される。このようなさらなる性状解析は、例えば示差的に発現される遺伝子はターゲット遺伝子であることを示す。第２に、そのような測定法は、以下の５．５．４節で説明されるように、心臓血管病症状を緩和することができる化合物を同定するように設計されるスクリーニング方策の一部として使用することができる。すなわち、動物ベースおよび細胞ベースのモデルは、心臓血管病の治療に有効な薬物、医薬、治療法および介入方法を同定するのに、使用される。さらに以下の５．７．１節で詳述されるように、そのような動物モデルは、動物被験体中のＬＤ₅₀およびＥＤ₅₀を求めるために使用され、そしてそのようなデータは、心臓血管病治療法の可能性のある方法のインビボの有効性を求めるために使用することができる。５．４．４．１動物ベースの系心臓血管病の動物ベースのモデル系には、非組換え動物および作成したトランスジェニック動物が含まれるが、これらに限定されない。心臓血管病の非組換え動物モデルには、例えば遺伝的モデルがある。そのような遺伝的心臓血管病モデルには、例えばａｐｏＢまたはａｐｏＲ欠損ブタ（Rapa czら、1986，Science 234: 1573-1577）およびワタナベ（Watanebe）遺伝性高脂血症（WHHL）ウサギ（Kitaら、1987，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84: 5928-59 31）がある。動脈硬化の非組換え、非遺伝的動物モデルには、例えばＬＤＬを食餌に補足することによる化学的傷害、または例えばバルーンカテーテル血管形成術による機械的傷害を受けたブタ、ウサギ、またはラットモデルがある。さらに、心臓血管病症状を示す動物モデルは、前記５．４．１節に記載のようなターゲット遺伝子配列を、当業者に周知のトランスジェニック動物を産生する技術とともに用いて、作成できる。例えば、ターゲット遺伝子配列は、目的の動物のゲノム内に導入、およびゲノム内で過剰発現するか、あるいは内因性ターゲット遺伝子配列が存在するなら、過剰発現されるかまたは、例えばマウスのａｐｏＥの破壊について記載（Plumpら、1992，Cell 71: 343-353）されているように、ターゲット遺伝子を低発現するかもしくは発現を不活性化するために破壊される。ターゲット遺伝子配列を過剰発現させるために、ターゲット遺伝子配列のコード部分を、目的の型の動物または細胞中の遺伝子発現を指令することができる制御配列に連結してもよい。そのような制御領域は、当業者に周知であり、過度の実験をすることなく利用できる。そのような遺伝子操作により作成した動物ベース系の使用は、ターゲット遺伝子ｂｃｌ−２について以下の７節の実施例で詳細に説明される（前記表１、５．４．１節を参照）。簡単に説明すると、まずｂｃｌ−２発現が、ａｐｏＥ欠損動脈硬化マウスモデルでダウンレギュレーションされることが証明された。次に、動脈硬化性条件下で誘導されるプロモーターの制御下にヒトｂｃｌ−２遺伝子を有するトランスジェニックマウスを作成した。そのような条件下でｂｃｌ−２の誘導の効果を試験するために、トランスジェニックマウスをａｐｏＥ欠損マウスと交配させる。次に、高度に発現可能なｂｃｌ−２遺伝子を有するａｐｏＥ欠損子孫を、プラーク形成と成長について評価した。これらの子孫のプラーク形成と成長の低下は、このターゲット遺伝子を介して心臓血管病に介入することの有効性を確認している。内因性ターゲット遺伝子配列の低発現のために、そのような配列を単離し、目的の動物のゲノムに再導入された時、内因性ターゲット遺伝子対立遺伝子が不活性化されるように作成される。好ましくは、作成されるターゲット遺伝子配列は、作成されたターゲット遺伝子配列が動物のゲノム内に組み込まれると内因性標的配列が破壊されるように、遺伝子ターゲティングにより導入される。遺伝子ターゲティングは、本節で後述される。マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、マイクロブタ、ヤギ、および非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、サル、およびチンパンジー）など（ただしこれらに限定されない）の任意の種の動物を用いて、心臓血管病動物モデルを作成できる。トランスジェニック動物の創始系統を産生するために動物内にターゲット遺伝子トランスジーンを導入するのに、当該分野で公知の任意の方法が利用できる。そのような方法には、前核微量注入法（Hoppe，P.C.とWagner，T.E.，1989，米国特許第４，８７３，１９１号）；生殖系列へのレトロウイルス介在遺伝子導入（Van der Puttenら、1985，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82: 6148-6152）；胚幹細胞中の遺伝子ターゲティング（Thompsonら、1989，Cell 56: 313-321）；胚の電気穿孔法（Lo，1983，Mol Cell．Biol．3: 1803-1814）；および精子介在遺伝子導入（Lavitranoら、1989，Cell 57: 717-723）などがあるが、これらに限定されない。そのような方法の総説については、Gordon，1989，トランスジェニック動物（Transgenic Animals）、Intl．Rev．Cytol．115: 171-229（これは参考のためその全体が本明細書に引用される）を参照のこと。本発明は、そのすべての細胞中にトランスジーンを有する動物並べにすべてではないが一部の細胞にトランスジーンを有する動物（すなわち、モザイク動物）を提供する。トランスジーンは、単一のトランスジーンとしてまたはコンカタマー（例えば、頭対頭縦列（head-to head tandem）もしくは頭対尾縦列（head-to -tail tandem）として組み込まれる。トランスジーンはまた、例えばLaskoら（L asko，M.ら、1992，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89: 6232-6236）の教示に従って、特定の細胞型中に導入され活性化される。そのような細胞型に特異的な活性化に必要な制御配列は、目的の特定の細胞型に依存し、当業者には公知である。ターゲット遺伝子トランスジーンを、内因性ターゲット遺伝子の染色体部位内に組み込みたい場合は、遺伝子ターゲティングが好ましい。簡単に説明すると、そのような方法が使用される時、目的の内因性ターゲット遺伝子に相同的ないくつかのヌクレオチド配列を含有するベクターが、染色体配列との相同的組換えを介して、内因性ターゲット遺伝子のヌクレオチド配列の中に組み込まれ、その機能を破壊することを目的として設計される。トランスジーンはまた、特定の細胞型に選択的に導入され、こうして、例えばGuら（Guら、1994，Science 265: 103-1 06）の教示に従って、その細胞型のみの目的の内因性遺伝子を不活性化する。そのような細胞型特異的不活性化に必要な制御配列は、目的の特定の細胞型に依存し、当業者に公知である。ターゲット遺伝子を発現するための組換え法は、前記５．４．２節に記載されている。トランスジェニック動物がいったん作成されると、標準的方法を用いて組換えターゲット遺伝子およびタンパク質の発現が測定される。最初のスクリーニングは、サザンブロット解析またはＰＣＲ法により行って、動物組織を解析し、トランスジーンの組み込みが起きた否かを測定することができる。トランスジェニック動物の組織中のトランスジーンのｍＲＮＡ発現レベルはまた、動物から得られる組織試料のノーザンブロット解析、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析、およびＲＴ−ＰＣＲなどの方法（しかし、これらに限定されない）でも測定できる。ターゲット遺伝子発現組織の試料はまた、目的のターゲット遺伝子トランスジーン産物に特異的な抗体を用いて免疫組織化学的に評価される。容易に検出可能なレベルでターゲット遺伝子ｍＲＮＡまたはターゲット遺伝子トランスジーンペプチド（ターゲット遺伝子産物のエピトープに対して作成された抗体を用いて免疫組織化学的に検出される）を発現するターゲット遺伝子トランスジェニック動物は、次にさらに評価して特徴的な心臓血管病症状を示す動物を同定する。そのような症状には、例えば脂肪の縞および／または心臓血管病班の数やサイズの増加がある。さらにトランスジェニック動物内の特異的細胞型を解析し、心臓血管病に特徴的な細胞表現型について測定する。単核細胞の場合は、そのような表現型には、ＬＤＬ摂取率、内皮細胞への接着、遊出、泡沫細胞形成、脂肪縞形成、泡沫細胞特異的産物の産生の増加があるが、これらに限定されない。細胞表現型測定法は、以下の５．４．４．２節で詳述される。さらに、そのような細胞表現型は、心臓血管病症状を示す動物での特定の細胞型の既知のフィンガープリント発現プロフィールに比較して、特定の細胞型のフィンガープリントパターンの発現を含んでもよい。フィンガープリントプロフィールは、以下の５．８．１節で詳述される。そのようなトランスジェニック動物は、心臓血管病の適切なモデル系になる。ターゲット遺伝子トランスジェニック創始動物がいったん産生されると、これらは育種、同系交配、異系交配、または交雑して特定の動物のコロニーが産生される。このような育種の例には、創始動物を２つ以上の組み込み部位で異系交配して別の系統を樹立すること、別の系統を同系交配して、各ターゲット遺伝子トランスジーンの付加的発現の作用のために、より高レベルで目的のターゲット遺伝子トランスジーンを発現する複合ターゲット遺伝子トランスジェニック体を産生すること、異型接合トランスジェニック動物を交配させて、特定の組み込み部位で同型接合である動物を産生させて、発現を増強することおよびＤＮＡ解析で動物をスクリーニングする必要性をなくすこと、別の同系接合系統を交配させて、複合異型接合または同型接合系統を産生させること、動物を異なる近交系遺伝的バックグランドに品種改良してターゲット遺伝子トランスジーンの発現および心臓血管病症状の進展に及ぼす対立遺伝子修飾の影響を調べることがあるが、これらに限定されない。そのような方法の１つは、ターゲット遺伝子トランスジェニック創始動物を野生株と交配させて、心臓血管病症状を示すＦ１世代を産生することである。次に同型接合ターゲット遺伝子トランスジェニック動物が生存活性を有することがわかれば、Ｆ１世代を同系交配して同型接合系統を出現させる。５．４．４．２細胞ベースの測定法ターゲット遺伝子タンパク質をコードし、さらに心臓血管病に関連した細胞表現型を示すターゲット遺伝子配列を含有し発現する細胞は、抗心臓血管病活性を示す化合物を同定するのに利用される。そのような細胞は、非組換え単核細胞株、例えばＵ９３７（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ −１５９３）、ＴＨＰ−１（ＡＴＣＣ＃ＴＩＢ−２０２）、およびＰ３８８Ｄ１（ＡＴＣＣ＃ＴＩＢ−６３）；内皮細胞、例えばＨＵＶＥＣおよびウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）；並びに一般的哺乳動物細胞株、例えばＨｅＬａ細胞およびＣＯＳ細胞、例えばＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ＃−１６５１）がある。さらにそのような細胞には、組換えトランスジェニック細胞株がある。例えば、前記５．４．４．１節で考察した本発明の心臓血管病動物モデルは、心臓血管病の細胞培養モデルとして使用できる、心臓血管病に関与する１つまたはそれ以上の細胞型を含有する、細胞株を産生するために使用される。本発明の心臓血管病トランスジェニック動物から得られる初代培養物が利用できるが、連続細胞株の産生が好ましい。トランスジェニック動物から連続細胞株を得るために使用される方法の例については、Smallら、1985，Mol．Cell Biol．5: 642-648を参照。あるいは、心臓血管病に関与することが知られている細胞型の細胞を、細胞内のターゲット遺伝子発現の量を増加または低下させることができる配列でトランスフェクションしてもよい。例えば、ターゲット遺伝子配列は、目的の細胞のゲノム内に導入され過剰発現されるか、またはもし内因性ターゲット遺伝子配列が存在するなら、これらは過剰発現されるかまたは破壊されてターゲット遺伝子を低発現または発現を不活性化する。ターゲット遺伝子配列を過剰発現するために、ターゲット遺伝子配列のコード部分を、目的の細胞型中で遺伝子発現を指令することができる制御配列に連結する。そのような制御配列は当業者に周知であり、過度の実験をすることなく利用できる。ターゲット遺伝子を発現するための組換え法は、前記５．４．２節に記載されている。内因性ターゲット遺伝子配列の低発現のために、そのような配列は単離され、目的の細胞型のゲノムに再導入される時、内因性ターゲット遺伝子対立遺伝子が不活性化されるように作成される。好ましくは作成されるターゲット遺伝子配列は、作成されたターゲット遺伝子配列が細胞のゲノムに組み込まれた時、内因性標的配列が破壊されるように、遺伝子ターゲティングにより導入される。ターゲット遺伝子を用いる宿主細胞のトランスフェクション法は、前記５．４．４．１節に記載される。化合物で処理される細胞またはターゲット遺伝子でトランスフェクションされる細胞を、心臓血管病に関連した表現型について調べることができる。単核細胞の場合は、そのような表現型は、ＬＤＬ摂取率、内皮細胞への接着、遊出、泡沫細胞形成、脂肪縞形成、泡沫細胞によるｂＦＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＶＥＧＦ、ＩＬ −Ｉ、Ｍ−ＣＳＦ、ＴＧＦβ、ＴＧＦα、ＴＮＦα、ＨＢ−ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＦＮ−γ、およびＧＭ−ＣＳＦのような成長因子の産生の増加があるが、これらに限定されない。例えば、遊出速度は、前記５．１．１．３節に記載のNavab らのインビトロの系を用いて、内皮単層を通過して移動し内皮下スペースのコラーゲン層に入る単核細胞の数を定量することにより、測定される。同様に、ＨＵＶＥＣは、試験化合物で処理できるか、または前記５．４．２節に記載の遺伝子操作したターゲット遺伝子によりトランスフェクションできる。次にＨＵＶＥＣは、心臓血管病に関連する表現型、例えば細胞形態、細胞増殖、細胞遊走、および単核細胞接着など（ただし、これらに限定されない）、または心臓血管病に関与する他のタンパク質（例えば、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭ、ＰＤＧＦ −β、およびＥ−セレクチン）の産生に及ぼす作用について、試験される。ターゲット遺伝子配列核酸のトランスフェクションは、標準的方法を使用して行われる。例えば、Ausubelら、1989（前述）を参照のこと。トランスフェクションされた細胞は、組換えターゲット遺伝子配列の有無、ターゲット遺伝子ｍＲＮＡの発現と蓄積、および組換えターゲット遺伝子タンパク質産生があることについて評価される。ターゲット遺伝子発現の減少が好ましい場合、標準的方法を使用して内因性ターゲット遺伝子発現および／またはターゲット遺伝子産物の産生の減少が達成されるかどうかを証明する。５．５ターゲット遺伝子産物と相互作用する化合物のスクリーニング測定法ターゲット遺伝子産物に結合する化合物、ターゲット遺伝子産物と相互作用する他の細胞性または細胞外タンパク質に結合する化合物、およびターゲット遺伝子産物と他の細胞性または細胞外タンパク質との相互作用を妨害する化合物を同定するために以下の測定法が設計される。例えば、膜貫通受容体型タンパク質であるｒｃｈｄ５２３遺伝子産物の場合は、そのような方法によりそのような受容体のリガンドが同定できる。ｒｃｈｄ５２３アップレギュレーションが内皮細胞に特異的であれば、ｒｃｈｄ５２３遺伝子産物リガンドは、例えば動脈硬化、虚血／再潅流、高血圧、再狭窄、および動脈炎症のような心臓血管病の緩和の基礎として作用する。そのような化合物には、ペプチド、抗体または小さい有機もしくは無機化合物があるが、これらに限定されない。このような化合物の同定方法は、以下の５．５．１節で説明される。このような化合物には、他の細胞性タンパク質もある。このような細胞性タンパク質の同定方法は、以下の５．５．２節で説明される。本明細書に記載のような測定法により同定される化合物は、例えばターゲット遺伝子産物の生物学的機能を調べたり、心臓血管病の緩和に有用である。心臓血管病の状態がターゲット遺伝子発現の総合的な低レベルおよび／または細胞または組織でのターゲット遺伝子産物の総合的な低レベルに起因する場合は、ターゲット遺伝子産物と相互作用する化合物は、結合したターゲット遺伝子タンパク質の活性を強調もしくは増幅する化合物を含んでよい。このような化合物は、ターゲット遺伝子産物活性のレベルを有効に上昇させ、こうして症状を緩和する。ある場合には、病気の状態によりアップレギュレーションされていることが観察されるターゲット遺伝子は、保護作用を示しているかも知れない。このようなアップレギュレーション遺伝子の発現、またはその遺伝子産物の活性を増強する化合物はまた、特にターゲット遺伝子が正常な場合にはアップレギュレーションされない個体で、症状を緩和するであろう。他の場合には、ターゲット遺伝子内の突然変異は、ターゲット遺伝子タンパク質の異常な型もしくは過剰量の産生を引き起こし、これは有害作用を引き起こし心臓血管病をもたらす。同様に生理学的条件が、ターゲット遺伝子発現の過剰な上昇を引き起こし、心臓血管病をもたらすことがある。このような場合は、結合したターゲット遺伝子タンパク質の活性を阻害する、ターゲット遺伝子タンパク質に結合する化合物が同定される。例えばこの節で説明したような方法により同定される化合物の有効性を試験するための測定法は、５．５．４節で考察される。５．５．１．ターゲット遺伝子産物に結合する化合物のインビトロスクリーニング測定法本発明のターゲット遺伝子に結合することができる化合物を同定するために、インビトロの系を設計することができる。このような化合物は、Ｄ−および／またはＬ−立体配置のアミノ酸から作られるペプチド（例えば、ランダムペプチドライブラリーの形で；例えば、Lam，K.S.ら，1991，Nature 354: 82-84を参照のこと）、ホスホペプチド（例えば、ランダムまたは部分縮重指向性ホスホペプチドライブラリー(partially degenerate，directed phosphopeptide libraries) の形で；例えば、Songyang，Z.ら，1993，Cell 72: 767-778を参照のこと）、抗体、および有機または無機低分子を含むが、これらに限定されない。同定される化合物は、例えば、ターゲット遺伝子タンパク質、好ましくは突然変異ターゲット遺伝子タンパク質の活性を調節するのに有用であるか、ターゲット遺伝子タンパク質の生物学的機能を調べるのに有用であるか、正常なターゲット遺伝子相互作用を破壊する化合物を同定するためのスクリーニングにおいて利用することができるか、またはこれら自体がこのような相互作用を妨害しうる。ターゲット遺伝子タンパク質に結合する化合物を同定するために使用される測定法の原理は、ターゲット遺伝子タンパク質と試験化合物の２つの成分が相互作用し結合することが可能な条件下で、かつそのための十分な時間、この２つの成分の反応混合物を調製して、そして反応混合物中で除去および／または検出することができる複合体を形成することを含む。これらの測定法は、種々の方法で行うことができる。例えば、このような測定を行うための１つの方法では、固相にターゲット遺伝子または試験物質を固定し、固相に固定されたターゲット遺伝子／試験物質複合体を反応の最後に検出する。このような方法の１つの実施態様において、ターゲット遺伝子タンパク質は固相表面に固定され、固定されない試験化合物が、直接または間接に標識される。実際、マイクロタイタープレートの利用が便利である。固定される成分は、非共有または共有結合により固定化される。非共有結合は、単に、タンパク質の溶液で固相表面をコーティングして乾燥することにより行うことができる。あるいは、タンパク質に特異的な固定化抗体、好ましくはモノクローナル抗体を使用して、タンパク質を固相表面に固定する。表面は、前もって調製して保存することができる。測定を行うために、固定された成分を含有するコーティングされた表面に非固定化成分を添加する。反応終了後、形成した複合体が固相表面に固定化されて残る条件下で、未反応成分を除去（例えば、洗浄により）する。固相表面に固定された複合体の検出は、多くの方法で行うことができる。非固定化成分を前もって標識してある場合、表面上に固定化された標識の検出は、複合体が形成されたことを示している。非固定化成分を前もって標識しない場合、表面に固定された複合体を検出するために、間接的標識を使用することができる。例えば、非固定化成分に特異的な標識抗体を使用する（抗体は、次に標識抗Ｉｇ抗体で直接標識または間接標識されてよい）。あるいは、反応を液相で行い、反応生成物を未反応成分から分離し、そして複合体を検出することができる（例えば、溶液中で形成された複合体を固定するためのターゲット遺伝子産物または試験化合物に特異的な固定化抗体、および固定された複合体を検出するための可能な複合体の他の成分に特異的な標識抗体を使用する）。前記方法の１つにより特定のターゲット遺伝子産物に結合することが示される化合物は、さらに、ターゲット遺伝子タンパク質からの生物化学的応答を誘発するその能力について試験することができる。ｒｃｈｄ５２３遺伝子産物を含む（しかし、これに限定されない）シグナル伝達に関与する受容体タンパク質についてのある実施態様を、本明細書に記載する。ターゲット遺伝子産物受容体ドメインと相互作用する化合物は、リガンドとして機能する（すなわち、シグナル伝達経路を開始させるように、受容体タンパク質に結合する）その能力についてスクリーニングすることができる。本発明の有用な受容体断片または類似体は、リガンドと相互作用するものである。受容体成分は、機能的に（すなわち、リガンドに結合し、Ｃａ⁺⁺を移動するその能力に関して）測定することができる（下記を参照のこと）。これらの測定は、成分として、結合の検出を可能にする配置の、リガンドと組換えターゲット遺伝子産物（または適切な断片若しくは類似体）を含む。例えば、組換え受容体は、カルシウムのリガンド依存性の移動を媒介するその能力により、リガンドのスクリーニングのために使用することができるが、これに限定されない。ターゲット遺伝子発現ベクター（前記５．４．２節に記載された方法により構築される）でトランスフェクションされた細胞、好ましくはミエローマ細胞若しくはアフリカツメガエル卵母細胞は、標準法によりＦＵＲＡ−２またはＩＮＤＯ−１を付加する。リガンドにより誘導されるＣａ²⁺の移動は、すでに報告（Grynkiewiczら，1985，J．Biol．Chem．260: 3440）されたように蛍光分光法により測定される。したがってターゲット遺伝子産物の受容体ドメインと反応するリガンドは、蛍光シグナルを生成する能力により同定することができる。これらの受容体結合活性は、バックグラウンド以上の生成する蛍光のレベルを測定することにより定量し比較することができる。ｒｃｈｄ５２３遺伝子産物は、複数の膜貫通ドメインを有するＧタンパク結合受容体よりなる。したがってＣａ²⁺移動測定は、ｒｃｈｄ５２３受容体のリガンドである化合物をスクリーニングするために使用することができる。このスクリーニング法は、ｒｃｈｄ５２３に関して下記１２節の実施例に詳細に記載される。ｒｃｈｄ５２３リガンドの同定、およびリガンド−受容体複合体の活性の測定により、下記５．５．３節に記載されるように、この相互作用のアンタゴニストを同定することができる。このようなアンタゴニストは、心臓血管病の治療に有用である。５．５．２．ターゲット遺伝子産物と相互作用する細胞性または細胞外タンパク質の測定タンパク質−タンパク質相互作用を検出するのに適切な任意の方法を使用して、新規な標的タンパク質−細胞性または細胞外タンパク質相互作用を同定することができる。これらの方法は、パスウェイ遺伝子の同定に関して上記５．２．節に略述されており、そして同定された標的タンパク質と相互作用するタンパク質の同定に関して本明細書において利用することができる。このような場合に、ターゲット遺伝子は、既知の「餌（bait）」遺伝子として働く。５．５．３．ターゲット遺伝子産物と他の化合物との間の相互作用を妨害する化合物の測定本発明のターゲット遺伝子タンパク質は、インビボで、１つまたはそれ以上の細胞性または細胞外タンパク質と相互作用しうる。このようなタンパク質は、上記５．５．２．節に記載されたような方法により同定されるタンパク質を含むが、これらに限定されない。この考察のために、ターゲット遺伝子産物とこのような細胞性および細胞外タンパク質は、本明細書では「結合パートナー」と呼ぶ。そのような相互作用を破壊する化合物は、ターゲット遺伝子タンパク質、特に突然変異ターゲット遺伝子タンパク質の活性を調節するのに有用である。このような化合物は、前記５．５．１．節に記載される、抗体、ペプチドなどのような分子を含むが、これらに限定されない。ターゲット遺伝子タンパク質と、その細胞性または細胞外タンパク質結合パートナーとの間の相互作用を妨害する化合物を同定するために使用される測定系の基本的原理は、ターゲット遺伝子タンパク質と結合パートナーが相互作用し結合することが可能な条件下で、かつそのための十分な時間で、この２つのタンパク質を含有する反応混合物を調製して、複合体を形成する。阻害活性について化合物を試験するために、反応混合物は、試験化合物の存在下および非存在下で調製する。試験化合物は、最初に反応混合物に含ませるか、またはターゲット遺伝子およびその細胞性または細胞外結合パートナーの添加後に添加してもよい。対照の反応混合物は、試験化合物なしで、またはプラセボと共にインキュベートする。次に、ターゲット遺伝子タンパク質と、細胞性または細胞外結合パートナーとの間の複合体の形成が検出される。対照反応において複合体の形成があるが、試験化合物を含有する反応混合物ではそれがないということは、その化合物が、ターゲット遺伝子タンパク質とその相互作用性結合パートナータンパク質との相互作用を妨害していることを示している。さらに、試験化合物と正常なターゲット遺伝子タンパク質を含有する反応混合物内での複合体形成はまた、試験化合物と突然変異ターゲット遺伝子タンパク質を含有する反応混合物内での複合体形成と比較することができる。この比較は、突然変異ターゲット遺伝子タンパク質の相互作用は妨害するが、正常なターゲット遺伝子タンパク質のそれは妨害しない化合物を同定することを目的とする場合には重要であろう。結合パートナーの相互作用を妨害する化合物の測定は、不均一系または均一系で行うことができる。不均一系測定は、結合パートナーの１つを固相に固定し、反応の最後に固相に固定されている複合体を検出することを含む。均一系測定では、全反応は液相で行われる。いずれのアプローチにおいても、反応物の添加の順番は、試験化合物に関する異なる情報を得るために変化させてよい。例えば、結合パートナーの間の相互作用を、例えば競合により妨害する試験化合物は、試験物質の存在下で反応を行うことにより（すなわち、試験物質を、ターゲット遺伝子タンパク質と相互作用性細胞性または細胞外タンパク質の前またはこれらと同時に反応混合物に添加することにより）同定することができる。あるいは、前もって形成された複合体を破壊する試験化合物（例えば、複合体から結合パートナーの１つを置き換える高い結合定数を有する化合物）は、複合体形成後に反応混合物に試験化合物を添加することにより試験することができる。種々の測定法を以下に簡単に記載する。不均一測定系においては、ターゲット遺伝子タンパク質または相互作用性細胞性あるいは細胞外結合パートナータンパク質のいずれかを固相表面に固定して、そして固定していないその結合パートナーを、直接的または間接的に標識する。実際、マイクロタイタープレートの利用が便利である。固定される分子種は、非共有または共有結合により固定化することができる。非共有結合は、単に、タンパク質の溶液で固相表面をコーティングして乾燥することにより行うことができる。あるいは、タンパク質に特異的な固定化抗体を使用して、タンパク質を固相表面に固定することができる。表面は、前もって調製して保存することができる。測定を行うために、固定化された分子種の結合パートナーを、試験化合物の存在下または非存在下で、コーティングした表面に暴露する。反応終了後、未反応成分を除去（例えば、洗浄により）すると、形成した複合体は固相表面に固定化されて残る。固相表面に固定された複合体の検出は、多くの方法で行うことができる。結合パートナーが前もって標識されていた場合、表面上に固定化された標識の検出は、複合体の形成を示している。結合パートナーが前もって標識されていなかった場合、表面に固定された複合体を検出するために間接標識を使用することができる。例えば、結合パートナーに特異的な標識抗体を使用する（抗体は、次に標識抗Ｉｇ抗体で直接標識または間接標識されてよい）。反応成分の添加の順番に応じて、複合体形成を阻害するかまたは前もって形成された複合体を破壊する試験化合物を検出することができる。あるいは反応は、試験化合物、未反応物成分から分離された反応物生成物、および検出される複合体の存在下または非存在下で液相で行うことができる（例えば、溶液中で形成した複合体を固定するための１つの結合パートナーに特異的な固定化抗体、および固定された複合体を検出するための、もう１つの結合パートナーに特異的な標識抗体を使用する）。ここでも再度、液相への反応物の添加の順番に応じて、複合体を阻害するかまたは前もって形成された複合体を破壊する試験化合物を同定することができる。本発明の別の実施態様において、均一測定法を使用することができる。この方法では、ターゲット遺伝子タンパク質と、相互作用性の細胞性または細胞外タンパク質との前もって形成される複合体は、結合パートナーの１つが標識されて調製されるが、標識により生成するシグナルは、複合体形成により消失する（例えば、このアプローチを免疫測定法に利用している、Rubensteinの米国特許第４，１０９，４９６号を参照のこと）。前もって形成された複合体からの結合パートナーの１つに競合してこれを置き換える試験物質の添加により、バックグラウンド以上のシグナルの生成が起こる。このように、ターゲット遺伝子タンパク質− 細胞性または細胞外タンパク質の相互作用を破壊する試験物質を同定することができる。ある実施態様において、ターゲット遺伝子タンパク質は、前記５．４．２節に記載された組換えＤＮＡ技術を使用して固定化のために調製することができる。例えば、ターゲット遺伝子コード領域は、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１のような融合ベクターを使用して、生じた融合タンパク質中でその結合活性が維持されるように、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子に融合することができる。相互作用性細胞性または細胞外タンパク質は、当該分野で通常行われ上記５．４．３節に記載した方法を使用して、精製し、かつモノクローナル抗体を作成するために使用することができる。この抗体は、例えば、放射性同位体¹²⁵Ｉを用いて、当該分野で通常行われる方法により標識することができる。不均一アッセイでは、例えばＧＳＴ−ターゲット遺伝子融合タンパク質をグルタチオン−アガロースビーズに付着させることができる。次に、相互作用的細胞性又は細胞外結合パートナータンパク質を、相互作用と結合とが起きるような方法で、試験化合物の存在下又は不在下に加える。反応期間の終わりに、未結合物質を洗い流し、標識モノクローナル抗体を系に加えて複合体を形成した結合パートナーと結合させる。ターゲット遺伝子タンパク質と相互作用的細胞性又は細胞外結合パートナータンパク質との間の相互作用は、グルタチオン−アガロースビーズと会合したままの状態である放射能量を測定することにより検出できる。試験化合物によって相互作用がうまく阻害された場合には、測定放射能が減少する。あるいは、ＧＳＴ−ターゲット遺伝子融合タンパク質と、相互作用的細胞性又は細胞外結合パートナータンパク質とを、固体グルタチオン−アガロースビーズの不在下に、液体中で混合することができる。結合パートナー間で相互作用が起きる間又はその後に、試験化合物を加える。この混合物を次にグルタチオン−アガロースビーズに加えて、未結合物質を洗い流す。ここでも、結合パートナー相互作用の阻害の程度は、標識抗体を加えてビーズと会合した放射能を測定することにより検出できる。本発明の別の態様では、ターゲット遺伝子タンパク質及び相互作用的細胞性又は細胞外タンパク質の一方又は両方の全長タンパク質に代えて、これらのタンパク質の結合ドメインにそれぞれに対応するペプチド断片を用いて同じ方法を行うことができる。当業界で日常的に実施されているあらゆる方法を用いてタンパク質の結合部位を同定し単離することができる。これらの方法は、タンパク質をコードする遺伝子の一つを突然変異誘発し、共免疫沈降アッセイで結合の破壊をスクリーニングすることを含むが、これに限定されない。ターゲット遺伝子中の代償性突然変異を選択することができる。それぞれのタンパク質をコードする遺伝子の配列分析により、相互作用的結合に関与するタンパク質の領域に対応する突然変異が明らかになるであろう。あるいは、上記の節で記載した方法を用いて、一つのタンパク質を固体表面に付着させ、トリプシンなどのタンパク質分解酵素で処理したその標識結合パートナーと相互作用させ結合させる。洗浄後に、結合ドメインを含む短い標識ペプチドが固体物質と会合したまま残るので、これを単離しアミノ酸配列決定により同定する。また、細胞性又は細胞外タンパク質をコードする遺伝子がいったん得られると、短い遺伝子セグメントを遺伝子操作してこのタンパク質のペプチド断片を発現させることができ、次いでこの結合活性を試験し、精製又は合成することができる。これに限定するものではないが、例えば、ＧＳＴ−ターゲット遺伝子融合タンパク質を作製し、これをグルタチオンアガロースビーズに結合させることによって、この節で上述したように固体物質にターゲット遺伝子を付着させることができる。相互作用的細胞性又は細胞外結合パートナータンパク質を³⁵Ｓなどの放射性同位体で標識し、トリプシンなどのタンパク質分解酵素で切断することができる。次に切断産物を、付着させたＧＳＴ−ターゲット遺伝子融合タンパク質に加えて結合させる。未結合ペプチドを洗い流した後、細胞性又は細胞外結合パートナータンパク質結合ドメインを表す標識された結合物質を溶出、精製し、当業者に公知の方法、例えばエドマン分解法（例えば、Creighton，1983，Proteins: S tructures and Molecular Principles，W.H．Freeman & Co.，N.Y.，pp.34-49参照）によってアミノ酸配列を分析する。このようにして同定されたペプチドは、合成法（例えば、Creighton，1983,前出，pp.50-60参照）又は、もしも遺伝子が既に単離されているのであれば、５．４．２節で上述したような組換えＤＮＡ法等の当業者に公知の方法を用いて製造することができる。本発明の特定の態様は、リガンドと、ｒｃｈｄ５２３遺伝子産物の受容体ドメインを含む（ただし、これに限定されない）ターゲット遺伝子産物の受容体ドメインとの間の相互作用に拮抗する能力をもつ候補化合物をスクリーニングする方法を特徴とする。複数の膜貫通ドメインを含むＧタンパク質と結合した受容体であるｒｃｈｄ５２３遺伝子産物は、リガンド−受容体相互作用のアンタゴニストをスクリーニングするのに特に有用である。この方法は、ａ）候補アンタゴニスト化合物を、受容体ドメインを含む組換えターゲット遺伝子産物（又はリガンド結合性断片又は類似体）を含む第１化合物と一方で混合し、またリガンドを含む第２化合物と他方で混合し；ｂ）第１化合物と第２化合物が結合するかどうかを決定し；そしてｃ）第１化合物の第２化合物への結合を妨げるか、及び／又はリガンドに媒介される細胞内Ｃａ⁺⁺の放出を低下する化合物としてアンタゴニスト化合物を同定する、ことを含んでなる。 ”アンタゴニスト”の語は、特定の活性、この場合では、リガンドがターゲット遺伝子産物受容体ドメインと相互作用する能力及び／又はこのような相互作用の結果生じる生物学的事象（例えば、細胞内Ｃａ⁺⁺の放出）を引き起こす能力、を阻害するような分子を意味する。好ましい治療剤には、リガンド−受容体相互作用を妨げることによってリガンド又はターゲット遺伝子産物機能をブロックする、アンタゴニスト、例えばペプチド断片（特に、Ｎ−末端細胞外ドメインに由来する断片）、抗体（特に、Ｎ−末端細胞外ドメインを認識しこれと結合する抗体）、又は薬剤を含む。ターゲット遺伝子産物の受容体成分は組換え法で生産され、また候補アンタゴニストはin vitroでスクリーニングされるので、本発明は有用な治療剤を同定するための簡単かつ迅速な方法を提供する。興味のある特異的受容体断片には、リガンドと相互作用できるターゲット遺伝子産物のあらゆる部分、例えば、Ｎ−末端細胞外ドメインの全て又は一部を含む。このような部分には、膜貫通セグメント及び細胞外であると推論される受容体の部分を含む。このような断片は、（上述したような）アンタゴニストとして有用であり、またターゲット遺伝子産物の活性をin vivoで中和する抗体（例えば、受容体とリガンドとの間の相互作用を妨げることによって；下記参照）を産生するための免疫源としても有用である。細胞外領域は類似の構造をもつ関連タンパク質（例えば、Ｇ−タンパク質結合受容体スーパーファミリーのその他のメンバー）と比較することによって同定でき；有用な領域はファミリー中のよく性状決定されたメンバーの細胞外ドメインと相同性を示すものである。あるいは、アミノ酸の一次配列から、Chou-Fasman法（例えばChou and Fasman , Ann．Rev．Biochem．47:251，1978参照）などによる疎水性／親水性の計算を用いてタンパク質の二次構造、ならびに細胞外ドメイン領域を半経験的に推定できる。親水性ドメイン、特に疎水性領域に囲まれた親水性ドメイン（例えば膜貫通ドメイン）は細胞外ドメインの強力な候補である。最後に、細胞外ドメインは、トリプシン消化分析などの標準的酵素消化分析を用いて経験的に同定できる。候補の断片（例えば、膜貫通セグメント又はあらゆる細胞外断片の全て又は一部）を用いて、本明細書で記載するアッセイ（例えば上述のアッセイ）によってリガンドとの相互作用を試験する。このような断片を用いて、本明細書で記載するアッセイによってリガンドとその内在性受容体との間の相互作用と拮抗する能力も試験する。有用な受容体断片の類似体（上述したような）を作製してスクリーニング成分又はアンタゴニストとしての有効性を試験することもでき（本明細書に記載するアッセイを用いて）；このような類似体も本発明で有用であると思われる。特に興味のあるのは、細胞外主要末端領域を含む受容体断片（又はそのリガンド結合性断片）である。同様に興味のあるのは、ターゲット遺伝子産物の細胞外ループである。これらの細胞外ループに由来するペプチド断片もアンタゴニストとして使用でき、特にループがアミノ末端ドメインと協力してリガンド結合を可能にしている場合には使用できる。あるいは、このようなループと細胞外Ｎ−末端ドメインは（全長のターゲット遺伝子産物と同様に）、抗−ターゲット遺伝子産物抗体を産生するための免疫原を提供する。リガンドのその受容体への結合は５．５．１節で上述したいかなる方法でアッセイしてもよい。好ましくは、組換えターゲット遺伝子産物（又は適当なターゲット遺伝子産物断片又は類似体）を発現する細胞を固体基質（例えばミクロタイタープレート又はカラムの壁）に固定し、検出可能に標識されたリガンドと反応させる（上述したように）。結合は、受容体成分と会合した（従って固体基質と会合した）検出標識によってアッセイする。標識リガンドの受容体−保持細胞への結合を、アンタゴニストアッセイを測定することに対する”対照”として用いる。アンタゴニストアッセイには、ターゲット遺伝子産物−保持細胞を適当な量の候補アンタゴニストとともにインキュベートすることを含む。この混合物に、標識リガンドと等量を加える。本発明で有用なアンタゴニストは、標識リガンドの固定化された受容体−発現細胞への結合を特異的に妨げる。次にアンタゴニストのリガンド機能を妨げる能力、すなわち受容体によって通常は媒介されるシグナル形質導入をもたらすことなく標識されたリガンド結合を特異的に妨げる能力を試験する。機能アッセイを用いてこの試験を行うには、ターゲット遺伝子産物を含む安定に形質転換された細胞系を本明細書に記載するようにして調製し、そしてカルシウム結合剤であるＦＵＲＡ−２などのレポーター化合物を標準的な方法で細胞質に充填した。異種のターゲット遺伝子産物をリガンド又はその他のアゴニストで刺激すると、細胞内カルシウムの放出とこれに付随するカルシウム−ＦＵＲＡ−２複合体の蛍光をもたらす。これはアゴニスト活性を測定するための便利な手段を提供する。アンタゴニストとなりうるものとリガンドとを含めることによって、蛍光の発生を伴わずに（すなわち、細胞内Ｃａ⁺⁺ の移動を引き起こすことなく）リガンド結合を有効にブロックするような真性の受容体アンタゴニストをスクリーニングし同定することが可能になる。このようなアンタゴニストは、心臓血管障害の有用な治療剤となることが期待できる。適当な候補アンタゴニストには、ターゲット遺伝子産物断片、特に１以上の膜貫通セグメント又は受容体の細胞外ドメイン（上述したもの）に隣接するか又はこれを含むリガンド−結合性部分を含む断片、を含み；このような断片は好ましくは５個以上のアミノ酸を含む。その他の候補アンタゴニストには、リガンド類似体及びその他のペプチドならびに非ペプチド化合物及び受容体の分析からデザインされる又はこれに由来する抗−ターゲット遺伝子産物抗体を含む。このスクリーニング法は下記の１２節の実施例でｒｃｈｄ５２３遺伝子に関して詳しく記載する。ｒｃｈｄ５２３遺伝子産物はＧタンパク質結合受容体であるので、ｒｃｈｄ５２３遺伝子産物とその天然のリガンドとの間の相互作用のアンタゴニストは心臓血管病の治療に有効な化合物のための優れた候補を提供する。５．５．４．心臓血管病症状の改善のアッセイ上述したアッセイ系で同定された化合物を含む（ただしこれに限定されない）あらゆる結合性化合物を用いて、その心臓血管病症状を改善する能力を試験することができる。心臓血管病症状を改善する能力を示す化合物を同定するための細胞に基づくアッセイ及び動物モデルに基づくアッセイを以下に記載する。まず、５．４．４．２．節で上述したような細胞に基づく系を用いて心臓血管病症状を改善できる化合物を同定することができる。例えば、そのような細胞系を心臓血管病症状を改善する能力を示すと疑われる化合物に、暴露した細胞中で心臓血管病症状の改善を引き出すのに十分な濃度と時間で暴露する。暴露の後、細胞を検査して、１以上の心臓血管病の細胞表現型が、より正常な又はより野生型の非心臓血管病の表現型に似るように変化したかどうかを決定する。例えば単球の場合では、より正常な表現型には、ＬＤＬ取り込み速度の低下、内皮細胞への付着、移行（transmigration）、泡沫細胞の形成、脂肪線条の形成、及び泡沫細胞によるｂＦＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１、Ｍ−ＣＳＦ、ＴＧＦβ 、ＴＧＦα、ＴＮＦα、ＨＢ−ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＦＮ−γ、及びＧＭ−ＣＳＦなどの成長因子の産生を含むが、これに限定されない。例えば移行速度は５．１．１．３．節で上述したNavabらのin vitro系を用いて、内皮単層を横切って内皮下空間のコラーゲン層に移動する単球の数を定量することによって測定できる。さらに、５．４．４．１．節で上述したような動物モデルに基づく心臓血管病系を用いて、心臓血管病症状を改善できる化合物を同定することができる。このような動物モデルを、心臓血管病の治療に有効な薬剤、医薬、治療及び介在の同定のための試験基質として用いることができる。例えば、動物モデルを心臓血管病症状を改善する能力を示すと疑われる化合物に、暴露した動物中で心臓血管病症状の改善を引き出すのに十分な濃度と時間で、暴露する。暴露に対する動物の応答を、心臓血管病と関連する障害の逆転を評価することによって、例えばアテローム性動脈硬化症プラークの数の計数及び／又は治療の前後におけるその大きさの測定によって、モニターできる。介在に関しては、心臓血管病症状のいかなる面をも逆転するいかなる治療も、ヒト心臓血管病の治療的介在の候補として考慮すべきである。試験薬剤の投与量は下記の５．７．１．節で記載する用量−応答曲線から決定できる。さらに、遺伝子発現パターンを心臓血管病症状を改善する化合物の能力評価に用いることができる。例えば、１以上のフィンガープリント遺伝子の発現パターンで”フィンガープリントプロフィール”の一部を形成し、次いでこれを用いてこのような評価を行う。本明細書における”フィンガープリントプロフィール” という語は、一定の条件下における一定の組織又は細胞型について得られたｍＲＮＡの発現パターンをいう。このような条件には、５．１．１．節のパラダイムで上述したあらゆるコントロール又は実験条件をも含んだ、アテローム性動脈硬化症、虚血症／再灌流、高血圧症、再狭窄、及び動脈炎症を含むが、これらに限定されない。フィンガープリントプロフィールは例えば５．１．２．節で上述した示差的ディスプレイ法、ノーザン分析及び／又はＲＴ−ＰＣＲを用いて作製できる。５．４．１．節で上述したあらゆる遺伝子配列を、このようなフィンガープリントプロフィールの作製及び確証のためのプローブ及び／又はＰＣＲプライマーとして用いることができる。フィンガープリントプロフィールは、細胞及び／又は動物に基づくモデル系における心臓血管病であるか正常であるかの既知の状態に対して特徴付けることができる。次いで、これらの既知のフィンガープリントプロフィールを比較して、試験化合物がこのようなフィンガープリントプロフィールを修飾したり、またより望ましいフィンガープリントのプロフィールにより似させる効果を確かめることができる。例えば、ある化合物の投与は、心臓血管病モデル系のフィンガープリントプロフィールを対照系により似させるかも知れない。あるいは、ある化合物の投与は、対照系のフィンガープリントプロフィールが心臓血管病状態を模倣し始めるようにするかも知れない。このような化合物を用いて例えば、興味のある化合物のさらなる特徴付けを行い、あるいは別の動物モデルを作製できる。５．５．５．臨床試験中の効果のモニター化合物の心臓血管病状態に及ぼす影響のモニターは、基本薬剤スクリーニングのみでなく、臨床試験においても適用できる。このような臨床試験では、５．１．１．１節から５．１．１．６節に記載したパラダイムのいずれかに見られる遺伝子パネルの発現を、心臓血管病状態に及ぼす特定薬剤の効果の”読み取り”として用いることができる。これに限定するものではないが、例えば、パラダイムＡは、酸化ＬＤＬで処置した単球においてアップレギュレートされるフィンガープリント遺伝子の同定を提供する。従って、例えば臨床試験で抗酸化剤の効果を研究するために、このような薬剤で処置する前及び処置中の種々の段階で患者から血液を抜き取る。次いでその単球を単離してＲＮＡを調製し、６．１．１及び６．１．２節で記載する示差的ディスプレイによって分析する。これらのフィンガープリント遺伝子の発現レベルは、６．１．２節で記載するノーザンブロット分析又はＲＴ−ＰＣＲ、又は５．８．１節で記載するいずれかの方法を用いて定量するか、あるいは５．８．２節で記載するいずれかの方法を用いて産生されたタンパク質の量を測定する。このようにして、フィンガープリントプロフィールは、酸化ＬＤＬを取り込んだ単球の生理学的応答を示す代理マーカーとして作用する。従って、薬剤処置の前及び処置中の種々の時点でこの応答状態を決定する。この方法は下記の１０節の実施例でさらに詳しく説明する。この方法は本明細書に記載するその他のパラダイムにも応用できる。これに限定するものではないが、例えば、パラダイムＢのフィンガープリントプロフィールは、ｂｃｌ−２及びグルタチオンパーオキシダーゼがいずれも、例えば高血清ＬＤＬレベルを導くコレステロールや脂肪などの高脂質食に暴露された患者の単球においてダウンレギュレートされることを明らかにする。例えば、臨床試験で高コレステロール血症の効果を改善する薬剤の能力を試験できる。薬剤処置の前及び処置後の種々の段階で高ＬＤＬレベルの患者の単球を単離する。薬剤の効果を、パラダイムＡのフィンガープリントプロフィールに記載するように、ｂｃｌ −２及びグルタチオンパーオキシダーゼの発現の回復程度を決定することによって測定できる。５．６．心臓血管病の治療用化合物及び方法以下に記載するするのは、心臓血管病症状を改善する方法及び組成物についてである。ある種の心臓血管病は少なくとも部分的には、遺伝子産物の過剰レベルによって、又は異常若しくは過剰活性を示す遺伝子産物の存在によってもたらされる。従って、このような遺伝子産物のレベル及び／又は活性の低下は心臓血管病症状の改善をもたらすであろう。ターゲット遺伝子の発現レベル又はターゲット遺伝子産物の活性レベルを低下する方法は下記の５．６．１節で記載する。あるいは、ある種のその他の心臓血管病は少なくとも部分的には、遺伝子の発現レベルの欠損若しくは低下、又は遺伝子産物の活性レベルの低下によってもたらされる。従って、このような遺伝子の発現レベルの上昇及び／又はこのような遺伝子産物の活性の上昇は心臓血管病症状の改善をもたらすであろう。いつくかの場合においては、疾患状態での遺伝子のアップレギュレーションは、疾患状態への応答におけるその遺伝子産物に対する防御的役割を反映する。このようなターゲット遺伝子の発現又はターゲット遺伝子産物の活性の増強は、それが及ぼす防御的効果を補強するであろう。いつくかの心臓血管病状態は、このような防御的遺伝子の活性レベルが異常に低いことに由来する。このような場合にも、遺伝子の発現レベル及び／又はこのような遺伝子産物の活性の上昇は心臓血管病症状の改善をもたらすであろう。ターゲット遺伝子の発現レベル又はターゲット遺伝子産物の活性を上昇させる方法は下記の５．６．２節で記載する。５．６．１．突然変異体ターゲット遺伝子活性の発現、合成又は活性を阻害する化合物上述したように、心臓血管病障害に関与するターゲット遺伝子は、ターゲット遺伝子の活性レベルの上昇を介してこのような障害を引き起こすことができる。上述した表１にまとめ、また下記の８節及び９節の実施例で記載するように、疾患状態下では多数の遺伝子が内皮細胞でアップレギュレートされていることが今や知られている。特に、ｒｃｈｄ００５、ｒｃｈｄ０２４、ｒｃｈｄ０３２及びｒｃｈｄ０３６は全て、ＩＬ−１で処理した内皮細胞中で上方制御されている。さらに、ｒｃｈｄ５０２、ｒｃｈｄ５２３、ｒｃｈｄ５２８、ｒｃｈｄ５３４、ＣＯＸＩＩ及びＭｎＳＯＤは全て、ずれ応力をかけた内皮細胞中でアップレギュレートされている。いくつかの場合では、このようなアップレギュレーションは疾患状態を引き起こしたり悪化させる効果をもたらす。このようなターゲット遺伝子及び／またタンパク質の発現、合成又は活性を阻害するために種々の方法を用いることができる。例えば、５．５節で上述したアッセイで同定された阻害活性を示す化合物を、本発明において心臓血管病症状の改善に用いることができる。５．５節で上述したように、このような分子には小さい有機分子、ペプチド、抗体などを含まれるが、これらに限定されない。阻害性抗体法は下記の５．６．１．２節で記載する。例えば、ｒｃｈｄ５２３遺伝子産物に対する内在性リガンドと競合する化合物を投与できる。その結果として、リガンド結合したｒｃｈｄ５２３遺伝子膜貫通タンパク質の量が低下すると、内皮細胞の生理機能をモジュレートするであろう。この目的に特に有用な化合物は、例えばｒｃｈｄ５２３遺伝子産物の１以上の細胞外ドメインを含むペプチド又はその部分及び／又は類似体等の可溶性タンパク質又はペプチド、例えばＩｇ−テイルド融合タンパク質のような可溶性融合タンパク質を含む。（Ｉｇ−テイルド融合タンパク質の生産については例えば米国特許第5,116,964号を参照されたい）。あるいは、リガンド類似体又は抗体などのｒｃｈｄ５２３遺伝子産物受容体部位と結合するがタンパク質を活性化しないような化合物（例えば、受容体−リガンドアンタゴニスト）は、ｒｃｈｄ５２３遺伝子産物の活性を阻害するのに有効でありうる。さらに、ターゲット遺伝子の発現を阻害するアンチセンス又はリボザイム分子も本発明において異常なターゲット遺伝子活性を阻害するのに用いることができる。このような方法は下記の５．６．１．１節で記載する。さらにまた、下記の５．６．１．１で記載するように、異常なターゲット遺伝子活性の阻害に三重らせん分子を用いることもできる。５．６．１．１．阻害性アンチセンス、リボザイム及び三重らせんによるアプローチ心臓血管病症状の改善能を示す化合物には、アンチセンス、リボザイム及び三重らせん分子がある。突然変異体ターゲット遺伝子活性を低下又は阻害するためにこのような分子をデザインすることができる。このような分子の製造法及び使用法は当業者に公知である。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分子は標的ｍＲＮＡとハイブリダイズしてタンパク質の翻訳を妨げることにより、ｍＲＮＡの翻訳を直接ブロックする作用を有する。アンチセンスＤＮＡに関しては、翻訳開始部位、例えば興味のあるターゲット遺伝子のヌクレオチド配列の−１０から＋１０領域に由来するオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。リボザイムはＲＮＡの特定の開裂を触媒できる酵素ＲＮＡ分子である。リボザイムの作用メカニズムには、リボザイム分子の相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリダイゼーション及びそれに続くエンドヌクレオ分解的開裂を含む。リボザイム分子の組成物には、ターゲット遺伝子のｍＲＮＡと相補的な１以上の配列を含まねばならず、またｍＲＮＡの開裂を行う公知の触媒配列を含まねばならない。この配列については、本明細書に参照として組み込まれる米国特許第5,093, 246号を参照されたい。従って、ターゲット遺伝子タンパク質をコードするＲＮＡ配列のエンドヌクレオ分解的開裂を特異的かつ効率的に触媒する遺伝子操作されたハンマーヘッドモチーフリボザイム分子が本発明に含まれる。可能性のあるあらゆるＲＮＡ標的中の特異的リボザイム開裂部位は、まず興味のある分子をスキャニングして以下の配列：ＧＵＡ、ＧＵＵ及びＧＵＣを含むリボザイム開裂部位をさがすことにより同定する。いったんこれを同定すると、開裂部位を含むターゲット遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列を用いて、オリゴヌクレオチド配列を不適当なものにする二次構造などの予測される構造的特徴を評価することができる。候補となる配列が適当なものかどうかを、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを行うことができるかどうかを試験することによっても評価する。転写阻害のための三重らせん形成に用いる核酸分子は、一本鎖でデオキシリボヌクレオチドからなるものであるべきである。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は、フーグスティーン（Hoogsteen）型塩基対則による三重らせん形成を促進するようにデザインされねばならず、これは一般に二本鎖のうちの一方の鎖にプリン又はピリミジンのかなり大きな連なりを必要とする。ヌクレオチド配列はピリミジンをベースにするものであってよく、このときは生じる三重らせんの３つの会合した鎖を横切ってＴＡＴ又はＣＧＣトリプレットになる。ピリミジンに富む分子は、二本鎖のうちの一本鎖のプリンに富む領域と、その鎖と平行な方向において塩基相補性を与える。また、核酸分子は例えばＧ残基の連なりを含むプリンに富むものであるように選択できる。これらの分子はＧＣ対に富むＤＮＡ二本鎖と三重らせんを形成することができ、このときプリン残基のほとんどは標的二本鎖の一本鎖上に位置しており、三重らせん中の３本の鎖を横切ってＧＧＣトリプレットになる。あるいは、三重らせん形成のための標的となりうる候補配列を、いわゆる”スイッチバック”核酸分子を作ることによって増加できる。スイッチバック分子は、５’−３’と３’−５’に方向を変えるように合成され、このため二本鎖のうちの一本鎖とまず塩基対をつくり、次に他方と塩基対をつくり、従ってプリン又はピリミジンのいずれかからなるかなりの大きさの連なりが二本鎖の一方の鎖に存在するように作製する必要がない。ここに記載するアンチセンス、リボザイム及び／又は三重らせん分子は、正常体及び突然変異体の両方のターゲット遺伝子の対立遺伝子によって生産されるｍＲＮＡの転写（三重らせん）及び／又は翻訳（アンチセンス、リボザイム）を低下又は阻害することができる。実質的に正常なレベルのターゲット遺伝子活性が維持されていることを確認するために、正常な活性を示すターゲット遺伝子ポリペプチドをコードし発現する核酸分子を、下記の５．７節で記載するような遺伝子治療法によって細胞中に導入することができ、これにはアンチセンス、リボザイム又は三重らせん治療に用いられる可能性のあるいかなる配列も含まない。あるいは、細胞又は組織のターゲット遺伝子活性の必要レベルを維持するために、正常なターゲット遺伝子タンパク質を細胞又は組織に共投与することが好ましい。本発明のアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ、リボザイム、並びに三重らせん分子は、ＤＮＡ及びＲＮＡ分子合成のために当業者に公知であるいかなる方法で調製してもよい。これには、例えば固相ホスホラミダイト化学合成のような当業者に公知のオリゴデオキシリボヌクレオチド及びオリゴリボヌクレオチドを化学合成する方法を含む。あるいは、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列の in vitro又はin vivo転写によってＲＮＡ分子を作製してもよい。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７又はＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの適当なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを導入した種々のベクター中に導入することができる。あるいは、使用するプロモーターによってアンチセンスＲＮＡを構成的に又は誘導的に合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築物を細胞系に安定に導入することができる。細胞内安定性や半減期を増加する手段として種々の公知の修飾をＤＮＡ分子に導入できる。これに限定するものではないが、可能な修飾には、分子の５’及び／又は３’末端へのリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのフランキング配列の付加、あるいはオリゴデオキシリボヌクレオチド骨格中のホスホジエステラーゼ結合に変えてホスホロチオエート又は２’Ｏ−メチルの使用を含む。５．６．１．２．ターゲット遺伝子産物に対する抗体ターゲット遺伝子タンパク質に特異的でかつその活性を妨げる抗体をターゲット遺伝子機能の阻害に用いることができる。このような抗体は５．４．３節で上述した標準的方法を用いて、タンパク質自体又はタンパク質の一部に対応するペプチドに対して作製することができる。このような抗体にはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂ断片、一本鎖抗体、キメラ抗体などを含むが、これらに限定されない。ターゲット遺伝子タンパク質が細胞内性であって全抗体を用いるときには、インターナリゼーションする抗体が好ましい。しかしながら、ターゲット遺伝子のエピトープと結合する抗体又はＦａｂ領域の断片を細胞に送達するためにリポフェクチンリポソームを用いることができる。抗体断片を用いる場合には、標的タンパク質の結合ドメインに結合する最小の阻害性断片が好ましい。例えば、ターゲット遺伝子タンパク質と結合する抗体の可変領域のドメインに対応するアミノ酸配列をもつペプチドを用いることができる。このようなペプチドは当業者に公知の方法を用いて化学合成又は組換えＤＮＡ法で生産できる（例えば、Creighto n，1983,前出; 及びSambrookら，1989，前出、参照）。あるいは、細胞内ターゲット遺伝子エピトープと結合する一本鎖中和抗体も投与できる。このような一本鎖抗体は例えば、Marascoら（Marasco，W．ら，1993，Proc．Natl．Acad．Sci.U SA 90:7889-7893）の記載するような方法を用いて標的細胞集団中で一本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列を発現させることによって、投与できる。いくつかの場合には、ｒｃｈｄ５２３遺伝子産物のように、ターゲット遺伝子タンパク質は細胞外性であるか、又は膜貫通タンパク質である。例えば、ｒｃｈｄ５２３遺伝子産物の１以上の細胞外ドメインに特異的でかつその活性を妨げる抗体は、心臓血管病の治療に特に有用である。このような抗体は血流から標的ドメインに直接アクセスできるので、特に有効である。ペプチド投与に適した下記の５．７節で記載するあらゆる投与法を用いて、阻害性ターゲット遺伝子抗体をその作用部位に有効に投与することができる。５．６．２．ターゲット遺伝子活性を回復又は増強する方法心臓血管病を引き起こすターゲット遺伝子は心臓血管病の状況では低く発現されていることがある。上述の表１にまとめ、また下記の７節の実施例で記載するように、疾患状態の単球ではいくつかの遺伝子がダウンレギュレートされていることが知られている。特に、高血清ＬＤＬレベルに導くコレステロールや脂肪などの高脂質食に暴露された患者の単球では、ｂｃｌ−２及びグルタチオンパーオキシダーゼ遺伝子の発現がダウンレギュレートされている。あるいは、ターゲット遺伝子産物の活性が低下して、心臓血管病症状の進展を導くのかも知れない。このようなターゲット遺伝子発現のダウンレギュレーション又はターゲット遺伝子産物活性の低下は、疾患状態を引き起こしたり悪化させるかも知れない。いくつかの場合では、疾患状態でアップレギュレートされるターゲット遺伝子が防御効果を及ぼす。上述の表１にまとめ、また下記の８節及び９節の実施例で記載するように、多数の遺伝子が疾患状態の内皮細胞中でアップレギュレートされていることが今や知られている。特に、ｒｃｈｄ００５、ｒｃｈｄ０２４、ｒｃｈｄ０３２及びｒｃｈｄ０３６は全て、ＩＬ−１で処理した内皮細胞中でアップレギュレートされている。さらに、ｒｃｈｄ５０２、ｒｃｈｄ５２３、ｒｃｈｄ５２８、ｒｃｈｄ５３４、ＣＯＸＩＩ及びＭｎＳＯＤは全て、ずれ応力をかけた内皮細胞中でアップレギュレートされている。種々の方法を用いて、このようなターゲット遺伝子の発現、合成又は活性を上昇させ、それらの遺伝子の疾患状態に応答した防御効果を発揮させることができる。この節ではターゲット遺伝子の活性レベルを心臓血管病症状が改善されるようなレベルまで上昇させる方法を記載する。遺伝子の活性レベルは例えば、ターゲット遺伝子産物の存在レベルを上昇させるか、あるいは存在する活性ターゲット遺伝子産物のレベルを上昇させることによって上昇させることができる。例えば、心臓血管病症状の改善に十分なレベルでターゲット遺伝子産物をこのような症状を示す患者に投与する。投与には下記の５．７節で記載するあらゆる方法を用いることができる。下記の５．７．１節に記載する方法を用いて、当業者であれば正常なターゲット遺伝子タンパク質の有効で無毒性な投与濃度を容易に知ることができる。さらに、ターゲット遺伝子タンパク質をコードするＲＮＡ配列を、心臓血管病症状が改善されるようなターゲット遺伝子タンパク質のレベルを生じるのに十分な濃度で、心臓血管病症状を示す患者に直接投与できる。化合物の細胞内投与を達成する下記の５．７節で記載するあらゆる方法、例えばリポソーム投与などの方法を用いて、このようなＲＮＡ分子を投与できる。ＲＮＡ分子は例えば５．４．２節で上述した組換え法で作製できる。さらに、遺伝子置換治療によって患者を治療することができる。ターゲット遺伝子機能をもつ正常なターゲット遺伝子タンパク質の産生を指示する正常なターゲット遺伝子又は該遺伝子の一部の１コピー以上を、アデノウイルス、アデノ伴生ウイルス及びレトロウイルスを含む（ただしこれに限定されない）ベクターを用いて、リポソームなどのＤＮＡを細胞中に導入するためのその他の分子とともに、細胞中に挿入する。また、正常なターゲット遺伝子配列をヒト細胞中に導入するために上述の方法を用いることができる。次いで、遺伝子配列を発現する正常なターゲット遺伝子を含む細胞、特にオートロガス細胞を、心臓血管病症状の改善を可能にする部位において患者に導入又は再導入する。このような細胞置換法は、例えばターゲット遺伝子産物が分泌された細胞外遺伝子産物であるような場合に好ましい。５．７．医薬調製物及び投与方法ターゲット遺伝子の発現、合成及び／又は活性を阻害する同定された化合物を心臓血管病を治療又は改善をするための治療的有効投与量で患者に投与することができる。治療的有効投与量とは、心臓血管病の症状の改善をもたらすのに十分な化合物の量をいう。５．７．１．有効投与量このような化合物の毒性及び治療的有効性は、例えばＬＤ₅₀（集団の５０％を致死にする用量）やＥＤ₅₀（集団の５０％に治療的有効性をもたらす用量）を決定するための細胞培養又は実験動物における標準的薬学的方法によって決定できる。毒性効果と治療効果との間の用量比を治療インデックスといい、ＬＤ₅₀／ＥＤ₅₀で表される。大きい治療インデックスを示す化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物を用いるときには、影響されない細胞への損傷の可能性を最少にし、副作用を減少するように、病気に冒された組織部位へのこのような化合物をターゲットするデリバリーシステムをデザインするよう注意すべきである。細胞培養系及び動物研究から得られたデータを用いてヒトに使用するための用量範囲を設定する。このような化合物の用量は、ほとんど又は全く毒性を伴わないＥＤ₅₀を含む循環濃度の範囲内にあるのが好ましい。用量は使用する投与形態及び投与経路により、この範囲内で変動する。本発明の方法で使用するあらゆる化合物について、治療的有効投与量を細胞培養系からまず推定できる。動物モデルでは、細胞培養で決定したＩＣ₅₀（すなわち、症状の最大阻害の半分を設定できる。このような情報を用いてヒトでの有用投与量をより正確に決定できる。例えば血漿中のレベルは高性能液体クロマトグラフィーによって測定できる。５．７．２．製剤及び用途本発明で使用する医薬組成物は、１以上の生理学的に許容できる担体又は賦形剤を用いて慣用法で処方できる。従って、該化合物及びその生理学的に許容できる塩及び溶媒和物は、吸入若しくは通気法（口又は鼻から）又は経口、頬、腹腔、若しくは直腸投与による投与用に処方できる。経口投与には、医薬組成物は例えば、結合剤（例えば、予めゼラチン化したトウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微晶質セルロース又はリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク又はシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモ澱粉又は澱粉グリコール酸ナトリウム）；又は湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬剤学的に許容できる賦形剤とともに慣用法で調製した錠剤又はカプセル剤の形態をとりうる。錠剤は、当業者に公知の方法によりコーティングできる。経口投与用の液体製剤は、例えば溶液、シロップ又は懸濁液の形態をとることができ、あるいは使用前に水又はその他の適当なビヒクルで構成できるように乾燥粉末としてもよい。このような液体製剤は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体又は食用硬化脂肪）；乳化剤（例えば、レシチン又はアラビアゴム）；非−水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油脂エステル、エチルアルコール又は分画植物油）；及び保存剤（例えば、メチル又はプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート又はソルビン酸）などの薬剤学的に許容できる添加物とともに慣用法で調製できる。製剤には緩衝塩、着香剤、着色剤及び甘味料も適宜含むことができる。経口投与用製剤は適当に処方することにより活性化合物を制御放出させることができる。頬投与用には、組成物は慣用法で処方した錠剤又はトローチ剤の形態をとりうる。吸入による投与用には、本発明の化合物を、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素又はその他の適当なガスなどの適当な噴射剤を用いることにより、加圧パック又はネビュライザーからのエアロゾルスプレー製剤の形態で便宜送達する。加圧エアロゾルの場合、投与単位は計量された量を送達するためのバルブを装備することによって決定できる。吸入器又は通気器で使用するゼラチンなどのカプセル及びカートリッジは、化合物とラクトース又は澱粉などの適当な粉末ベースとの粉末混合物を含むよう処方される。化合物は、例えばボーラス注射や連続注射などの注射によって非経口投与するように処方できる。注射用製剤は、添加の保存料とともにアンプル又は複数投与量容器中に入れた単位投与量形態とすることができる。組成物は油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又はエマルジョンとしての形態をとることができ、また懸濁剤、安定化剤及び／又は分散剤などの処方剤を含むことができる。あるいは、活性成分を、適当なビヒクル、例えば滅菌された発熱質を含まない水で構成するように、使用前に粉末形態とすることができる。化合物は、例えばカカオバターやその他のグリセリドなどの慣用の座薬ベースを含む座薬又は保持浣腸のような直腸組成物で処方することもできる。上述した処方に加えて、化合物はデポ製剤として処方することもできる。このような長時間作用性製剤は移植（例えば皮下又は筋肉内）又は筋肉内注射により投与できる。従って、例えば化合物は適当な重合体又は疎水性物質（例えば、許容できるオイル中のエマルジョンとして）又はイオン交換樹脂とともに、又は例えばやや溶けにくい塩などのやや溶けにくい誘導体として処方することができる。所望するならば、組成物は活性成分を含む１以上の単位投与形態を含むパック又はディスペンサー装置で提供してもよい。例えばパックは発庖剤（blister）パックのような金属又はプラスチックホイルからなる。パック又はディスペンサー装置には投与の説明書を付けてもよい。５．８．心臓血管病の異常の診断５．４．１節で記載するフィンガープリント遺伝子ヌクレオチド配列のような試薬、ならびに５．４．２節（ペプチド）及び５．４．３節（抗体）で記載する示差的に発現された経路遺伝子ペプチドに対する抗体を用いて、種々の方法を実施できる。特に、このような試薬は例えばターゲット遺伝子の突然変異の存在の検出、又はターゲット遺伝子ｍＲＮＡの過剰若しくは不足発現の検出に用いることができる。本明細書で記載する方法は、本明細書に記載する少なくとも１つの特異的フィンガープリント遺伝子核酸又は抗−フィンガープリント遺伝子抗体試薬を含んでなる予めパッケージングされた診断キットを用いて実施することができ、これは心臓血管病症状を示す患者又は心臓血管病を進行させる危険のある患者を診断するために、例えば臨床現場において便宜用い得る。フィンガープリント遺伝子が発現しているあらゆる細胞型又は組織、好ましくは単球、内皮細胞、又は平滑筋細胞を下記の診断に使用できる。５．８．１．フィンガープリント遺伝子核酸の検出分析すべき細胞型又は組織からのＤＮＡ又はＲＮＡは当業者に公知の方法を用いて容易に単離できる。診断法は、核酸の精製の必要がない、バイオプシーや切除から得られた患者組織の組織切片（固定及び／又は凍結）上で直接”in situ ”で実施することもできる。５．１節で記載するような核酸試薬をこのようなin situ法のプローブ及び／又はプライマーとして使用できる（例えば、Nuovo，G. J.，1992，PCR in situ hybridization: protocols and application，Raven P ress，NY参照）。ＲＮＡ又はＤＮＡのフィンガープリント遺伝子ヌクレオチド配列は、例えば心臓血管病関連の遺伝子構造及び発現を検出するための生物学的サンプルのハイブリダイゼーション又は増幅アッセイに使用できる。このようなアッセイには、サザン又はノーザン分析、一本鎖高次多型分析、in situハイブリダイゼーションアッセイ、及びポリメラーゼチェインリアクション分析を含むが、これに限定されない。このような分析によって、フィンガープリント遺伝子の発現パターンの定量的側面と、フィンガープリント遺伝子の発現及び／又は遺伝子組成物の定性的側面の両方が明らかになる。このような側面には例えば、点突然変異、挿入、欠失、染色体の組換え、及び／又は遺伝子発現の活性化若しくは不活化を含む。このようなin situハイブリダイゼーション分析を下記の１４節の実施例に記載する。特に、ｒｃｈｄ５０２及びｒｃｈｄ５２８遺伝子の高レベルの発現が、ヒト心臓血管病患者から除去した疾患組織の内皮細胞中で特に検出され、平滑筋細胞及びマクロファージを含む組織中のいかなる他の細胞型にも検出されなかった。これらの結果は、本明細書で記載するターゲット遺伝子がいかに新規な心臓血管病の診断を提供するかを明瞭に示すものである。さらに、これらの診断は特定のターゲット遺伝子と関連するので、心臓血管病の治療法がより特定されることになる。フィンガープリント遺伝子−特異的核酸分子を検出する好ましい診断法は、例えば分析すべき細胞型又は組織に由来する核酸を、５．１節で記載するような１以上の標識した核酸試薬と、このような試薬が興味のある核酸分子中のその相補的配列と特異的にアニーリングするのに好ましい条件下に、接触させインキュベートすることを含む。好ましくは、核酸試薬の長さは少なくとも９〜３０ヌクレオチドである。インキュベーションの後、核酸：フィンガープリント分子ハイブリッドから全てのアニーリングしない核酸を除去する。ハイブリダイズしたフィンガープリント組織からの核酸の存在を、もしもそのような分子が存在する場合には、検出する。このような検出法を用いることにより、興味のある組織又は細胞型由来の核酸を、例えば膜、又はミクロタイタープレートやポリスチレンビーズなどのプラスチック表面のような固体支持体に固定することができる。この場合には、インキュベーション後に、５．１節で記載する型のアニーリングしなかった標識フィンガープリント核酸試薬は容易に除去される。残存するアニーリングした標識核酸試薬の検出は当業者に公知の標準的方法を用いて実施できる。フィンガープリント遺伝子特異的核酸分子を検出する別の診断法は、例えばＰＣＲ（Mullis，K.B.，1987，米国特許第4,683,202号に記載の実施態様）、リガーゼ連鎖反応（Barany，F.，1991，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:189-193）、自己持続性（self sustained）配列複製（Guatelli，J.C.ら，1990，Proc．Na tl.Acad．Sci．USA 87:1874-1878）、転写増幅系（Kwoh，D.Y.ら，1989，Proc． Na tl．Acad．Sci．USA 86:1173-1177）、Ｑ−βレプリカーゼ（Lizardi，P.M．ら，1988，Bio/Technology 6:1197）、又はあらゆるその他の核酸増幅法による増幅と、それに続く当業者に公知の方法を用いる増幅分子の検出を含む。これらの検出法は、核酸分子が非常に少数で存在する場合の検出に特に有用である。このような検出法のある態様では、興味のあるＲＮＡ分子からｃＤＮＡ分子を得る（例えば、ＲＮＡ分子からｃＤＮＡへの逆転写により）。このようなＲＮＡが単離される細胞型又は組織には、単球、内皮、及び／又は平滑筋を含む（ただしこれに限定されない）野生型フィンガープリント遺伝子が発現されることが知られているあらゆる組織を含む。次にｃＤＮＡ中のフィンガープリント配列をＰＣＲ増幅反応などの核酸増幅反応のための鋳型として用いる。この方法の逆転写工程及び核酸増幅工程において合成開始試薬として使用する核酸試薬（例えばプライマー）は、５．１節で記載するフィンガープリント遺伝子核酸試薬の中から選択される。このような核酸試薬の好ましい長さは、少なくとも１５〜３０ヌクレオチドである。増幅産物を検出するには、核酸増幅を放射能又は非放射能で標識したヌクレオチドを用いて実施する。あるいは、増幅産物が標準の臭化エチジウム染色又はあらゆるその他の適当な核酸染色法で可視化できるのに十分な程度に増幅産物を生産する。主として１つの核酸配列の検出に焦点をあてる方法に加えて、５．５．４節で記載するフィンガープリントプロフィールもこのような検出法で評価できる。例えば、ノーザン分析及び／又はＲＴ−ＰＣＲなどの５．１．２節で記載する差異ディスプレイ法を用いてフィンガープリントプロフィールを作製する。このようなフィンガープリントプロフィールの作製及び確証に５．４．１節で記載するあらゆる遺伝子配列をプローブ及び／又はＰＣＲプライマーとして使用できる。５．８．２．フィンガープリント遺伝子ペプチドの検出５．４．３節で記載する野生型又は突然変異型フィンガープリント遺伝子ペプチドに対する抗体も、例えば本明細書で記載する心臓血管病の診断及び予後判定に使用できる。このような診断法は、フィンガープリント遺伝子タンパク質の発現レベルの異常、又はフィンガープリント遺伝子タンパク質の構造及び／又は組織、細胞、又は細胞下（subcellular）での位置の異常の検出に使用できる。構造的相違には、例えば正常なフィンガープリント遺伝子タンパク質と比較した突然変異型フィンガープリント遺伝子タンパク質のサイズ、電気陰性度、又は抗原性の相違を含む。分析すべき組織又は細胞型からのタンパク質は、ウエスタンブロット分析を含む（ただしこれに限定されない）当業者に公知の方法を用いて容易に検出又は単離できる。ウエスタンブロット分析を行う詳細な説明はSambrookら（1989、前出）の１８章を参照されたい。ここで使用するタンパク質の検出及び単離方法は、例えばHarlowとLaneの記載する方法（Harlow，E．andLane，D.，1988，"Antibod ies: A Laboratory Manual"，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spr ing Harbor，New York）によっても実施でき、この文献の全てを参照としてここに援用する。野生型又は突然変異型のフィンガープリント遺伝子ペプチド分子を検出するための好ましい診断法には、例えばフィンガープリント遺伝子ペプチドと抗−フィンガープリント遺伝子特異的ペプチド抗体との間の相互作用によって検出するイムノアッセイを含む。例えば、本発明で有用な５．４．３節で記載するような抗体又は抗体断片を、野生型又は突然変異型のフィンガープリント遺伝子ペプチドの存在の定量的又は定性的検出に使用できる。これは例えば、蛍光標識した抗体（下記参照）を光学顕微鏡、フローサイトメトリ、又は蛍光定量的検出とともに用いる免疫蛍光法によって実施できる。フィンガープリント遺伝子ペプチドが細胞表面で発現しているときにはこの方法は特に好ましい。本発明で有用な抗体（又はその断片）はさらに、フィンガープリント遺伝子ペプチドをin situ検出するための免疫蛍光又は免疫電子顕微鏡において組織学的に使用することもできる。in situ検出は、患者から組織学的標本を取り、これに本発明の標識抗体を適用することによって実施できる。生物学的サンプル上の標識抗体（又はその断片）に上乗せすることにより抗体（又はその断片）を適用するのが好ましい。このような方法を用いることにより、フィンガープリント遺伝子ペプチドの存在のみでなく、試験組織中におけるその分布も決定することができる。本発明の方法を用いることにより、このようなin situ検出を行うためのあらゆる広範な組織学的方法（染色法など）を修飾し得ることを当業者は容易に認識するであろう。野生型又は突然変異型のフィンガープリント遺伝子ペプチドのイムノアッセイには典型的に、生物学的流体、組織抽出物、新たに回収した細胞、又は組織培養で予めインキュベートしておいた細胞のような生物学的サンプルを、フィンガープリント遺伝子ペプチドを同定できる検出可能に標識された抗体の存在下にインキュベートし、そして当業者に公知の多くの方法のいずれかによって結合抗体を検出することを含む。生物学的サンプルを、細胞、細胞粒子又は可溶性タンパク質を固定できるニトロセルロースのような固相支持体又は担体又はその他の固体支持体と接触させこれに固定する。次いで支持体を適当な緩衝液で洗浄し、検出可能に標識されたフィンガープリント遺伝子特異的抗体で処理する。次いで固相支持体を緩衝液で２度目に洗浄して未結合抗体を除去する。固相支持体に結合した標識の量を次いで慣用法により検出する。 ”固相支持体又は担体”とは、抗原又は抗体を支持できるあらゆる支持体を意味する。よく知られた支持体又は担体には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然及び修飾セルロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩、及び磁鉄鉱を含む。担体の性質は本発明の目的にとってはいくらか可溶性か又は不溶性のものである。支持体物質は、結合分子が抗原又は抗体と結合できる限り、実質上いかなる構造的配置をもっていてもよい。従って、支持体の配置はビーズのような球状であっても、試験管の内側表面又はロッドの外側表面のような円筒状であってもよい。あるいは、表面はシート、試験ストリップなどのように平面であってもよい。好ましい支持体にはポリスチレンビーズを含む。当業者であれば抗体又は抗原を結合するための他の多くの適当な担体を知っているし、また日常的実験を用いてこれを確認できるであろう。あるロットの抗−野生型又は突然変異型フィンガープリント遺伝子ペプチド抗体の結合活性は公知の方法により決定できる。当業者は日常的実験を用いて決定したそれぞれについての作動可能で最適なアッセイ条件を決定できる。フィンガープリント遺伝子ペプチド−特異的抗体を検出可能に標識する方法の１つは、これを酵素と結合してエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）に用いる（ Voller,"The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)"，Diagnostic Horizo ns 2:1-7，1978，Microbiological Associates Quarterly Publication，Walker sville，MD; Voller ら，J．Clin．Pathol．31:507-520(1978); Butler，Meth． Enzymol．73:482-523(1981); Maggio，(ed.)Enzyme Immunoassay，CRC Press，B oca Raton，FL，1980; Ishikawa,ら，(eds.)Enzyme Immunoassay，Kagaku Shoin ，Tokyo，1981）。抗体に結合した酵素は適当な基質、好ましくは色原体基質と、例えば分光光学的、蛍光定量的又は可視手段によって検出できるような化学的部分を生じるように、反応する。抗体を検出可能に標識するために用いる酵素には、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロホスフェート、デヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼを含むが、これに限定されない。酵素のための色原体基質を用いる比色法によって検出を行うことができる。基質の酵素反応の程度を同様に調製した標準と目視で比較することによっても検出を行うことができる。その他の各種イムノアッセイのいずれを用いても検出を行うことができる。例えば、抗体又は抗体断片を放射能標識することにより、フィンガープリント遺伝子野生型又は突然変異型ペプチドをラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を用いて検出できる（例えば、Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，Sevent h Training Course on Radioligand Assay Techniques，The Endocrine Society ,March，1986,参照によりここに援用する）。放射性同位体はガンマカウンター又はシンチレーションカウンター又はオートラジオグラフィーのような手段を用いて検出できる。抗体を蛍光化合物で標識することも可能である。蛍光標識された抗体を適切な波長の光に暴露し、蛍光によってその存在を検出する。最も普通に用いられる蛍光標識化合物には、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド及びフルオレスアミンである。例えば¹²⁵Ｅｕ又はその他のランタニド系のような蛍光発生金属を用いて抗体を検出可能に標識することもできる。これらの金属はジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート基を用いて抗体に結合できる。抗体を化学発光化合物に結合することによって抗体を検出可能に標識することもできる。次いで化学発光標識された抗体の存在を、化学反応中に生じる発光の存在を検出することによって測定する。特に有用な化学発光標識化合物の例としては、ルミノール、イソルミノール、テロマティックアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びシュウ酸エステルが挙げられる。同様に、生物発光化合物を本発明の抗体の標識に用いることもできる。生物発光は生物系で見いだされた化学発光の一種であり、ここでは触媒タンパク質が化学発光反応の有効性を増加する。生物発光タンパク質の存在は発光の存在を検出することにより決定できる。標識の目的にとって重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及びエクオリンである。５．８．３．心臓血管病状態の画像処理いくつかの場合では、本明細書で同定した異なって発現した遺伝子産物は、心臓血管病状態下ではアップレギュレートされて影響を受けた組織の表面で発現する。このようなターゲット遺伝子産物は、病気の診断及び治療を指示する目的で、損傷を受けたり病気の心臓血管組織を非侵入的に画像処理することができる。例えば、このような異なって発現する遺伝子産物には、動脈硬化症発生の原因となるアテローム性動脈硬化症特異的付着分子、又は２節で上述した酸化ＬＤＬに応答してアップレギュレートされる単球スカベンジャー受容体を含むが、これに限定されない。あるいは、虚血症／再灌流に悩む組織、あるいはアテローム性動脈硬化症又は再狭窄病変をもつ他の組織においては、別のこのような表面タンパク質が特異的にアップレギュレートされているかも知れない。後記第９欄の実施例に記載するように、rchd523遺伝子は、ずれ応力を受けている内皮細胞でアップレギュレートされている遺伝子である。また、このrchd52 3遺伝子は、７つの膜貫通ドメインに加えて細胞外のアミノ末端ドメインを含有する新規なＧタンパク質結合受容体をコードしている。したがって、rchd523遺伝子産物は、心臓血管病の状態をイメージング（撮像）するための優れた手段を提供する。この技術は、rchd502やrchd528の遺伝子産物のような他の膜貫通遺伝子産物にも同様に応用することができる。本発明に従ってこの方法を使用する一例を後記第１１欄に挙げる。上記第５．６．１．２欄で記載した、rchd523遺伝子産物のような表面タンパク質と特異的に結合するモノクローナル抗体は、in vivo組織イメージング技術によって心臓血管病の診断に使用することができる。ターゲット遺伝子産物に対して特異的な抗体、好ましくはその抗原結合性断片に、検出可能な信号を生成する標識（たとえば、ガンマ線放出性の放射性同位体）を結合し、心臓血管病の疑いがある被検体（人間または動物）に投与する。その検出可能なように標識された抗体が罹病または損傷組織部位（１つまたは複数）に局在化するのに充分な時間が経過した後標識が生成する信号を光走査装置によって検出する。次いで、この検出された信号をその組織の画像に変換する。この画像により、in vivoで組織の位置を確定することが可能になる。次にこのデータを使用して適切な治療法を考案することができる。一般に組織イメージングに使用するには抗体分子全体よりも抗体断片の方が好ましい。抗体断片は全抗体分子より迅速に分配されるので迅速に組織（１つまたは複数）に蓄積される。したがって、全抗体を使用するよりも短い時間で画像を得ることができる。また、これらの断片は、より迅速に組織から除去され、その結果バックグラウンド信号が低くなる。たとえば、Haberらの米国特許第4,036,9 45号、Goldenbergらの米国特許第4,331,647号参照。二価の抗原結合性断片（Ｆａｂ′）₂および一価のＦａｂが特に好ましい。このような断片は、よく知られているいくつかのプロトコルのいずれかに従って全イムノグロブリン分子を酵素ペプシンまたはパパインで消化することによって調製することができる。罹病または損傷組織の位置確定用のモノクローナル抗体に結合するのに適したタイプの標識としては、放射性標識（すなわち、放射性同位体）、螢光性標識およびビオチン標識があるがこれらに限られることはない。抗体または抗体断片を標識するのに使用することができる放射性同位体のうち、ガンマ線エミッター、ポジトロンエミッター、Ｘ線エミッターおよび螢光エミッターが位置確定に適している。抗体標識用に適した放射性同位体としては、ヨウ素‐１３１、ヨウ素‐１２３、ヨウ素‐１２５、ヨウ素‐１２６、ヨウ素‐１３３、臭素‐７７、インジウム‐１１１、インジウム‐１１３ｍ、ガリウム‐６７、ガリウム‐６８、ルテニウム‐９５、ルテニウム‐９７、ルテニウム‐１０３、ルテニウム‐１０５、水銀‐１０７、水銀‐２０３、レニウム‐９９ｍ、レニウム‐１０５、レニウム‐１０１、テルル‐１２１ｍ、テルル‐１２２ｍ、テルル‐１２５ｍ、ツリウム‐１６５、ツリウム‐１６７、ツリウム‐１６８、テクネチウム‐９９ｍおよびフッ素‐１８がある。ハロゲンは多かれ少なかれ相互に互換的に使用することができる。というのは、ハロゲンで標識された抗体および／または通常のイムノグロブリンはほとんど同じ動力学および分布ならびに類似の代謝性をもっているからである。ガンマ線エミッターであるインジウム‐１１１とテクネチウム‐９９ｍが好ましい。すなわち、これらの放射性金属はガンマカメラで検出可能であり、in viv oでのイメージングに好適な半減期をもっているからである。抗体は、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミンペンタ酢酸）のような複合金属キレート剤によってインジウム‐１１１またはテクネチウム‐９９ｍで標識することができる。Krejcare kら、１９７７年、Biochem．Biophys．Rec．Comm．77:581、Khawら、１９８０年、Science 209:295、Gansowらの米国特許第4,472,509号、Hnatowichの米国特許第4,479,930号（これらの教示は引用したことにより本明細書に含まれているものとする）参照。モノクローナル抗体に結合するのに適した螢光性化合物としては、フルオレセインナトリウム、フルオレセインイソチオシアネートおよびテキサスレッドスルホニルクロライドがある。DeBelder & Wik、１９７５年、Carbohydrate Researc h 44:254-257参照。当業者は、モノクローナル抗体を標識するのに適した他の螢光性化合物を知っているであろうし、または通常以上の実験をすることなく確かめることができるであろう。６．実施例：例Ａに応答して選択（差次）的に発現する遺伝子の同定：in vitro 泡沫細胞の例本発明によると、示差的ディスプレイを用いて、アテローム形成の間に泡沫細胞が発生する条件をシミュレートするように処理した単球で選択的に発現する遺伝子を検出することができる。６．１．材料と方法６．１．１．細胞の単離と培養クエン酸リン酸デキストロース(Sigma)３ｍｌを入れた２０ｍｌの冷却vacutai nerチューブに血液（〜２００ｍｌ）を吸い込んだ。次に血液を５０ｍｌのチューブにプールし、Beckman GS-6R中において１２５０ＲＰＭ、４℃で１５分間遠心した。次いで透明な上層（〜２５ｍｌ）をピペットで取って捨て、代わりに同容量の４℃のＰＢＳを入れた。その後血液を混合し、再び２６８０ＲＰＭ、４℃ で１５分間遠心した。次いで上層を取って捨て、界面のバフィーコートを〜５ｍｌ取り出し、別の５０ｍｌのチューブに入れ、ピペットを２０ｍｌのＰＢＳで洗浄した。細胞をＴフラスコに入れ、４℃で１６時間保存した。次に細胞試料を少し取り出し、血球計を用いて計数した。次いでバフィーコート集団中の最終赤血球細胞濃度をＰＢＳで１．５×１０⁹／ｍｌに調節し、その細胞を室温に戻した後Leucoprepチューブ(Becton Dickinson)に入れ、２３００ＲＰＭ、２５℃で２５分間遠心した。透明な上層を取って捨て、ゲル上の濁った層を取り出して５０ｍｌのチューブにプールした。次にサンプルをＰＢＳ（２５℃）で５０ｍｌに希釈し、１０００ＲＰＭで１０分間遠心した。次いで上清を除き、ペレットを５０ｍｌのＰＢＳに再懸濁させた。この手順をさらに三回繰り返した。最後の遠心後細胞を小容量のＰＢＳに再懸濁させ、計数した。単球を拡げる前に組織培養皿をウシコラーゲンで被覆した。１／６容量の７× ＲＰＭＩ（JRH Biosciences）をVitrogen 100コラーゲン（Celtrix）に入れた後これをＲＰＭＩで１：１０に希釈して最終濃度を０．３５ｍｇ／ｍｌとした。次にコラーゲン混合物をプレートに加え（２．５ｍｌ／１００ｍｍ皿）、少なくとも１時間３７℃にしてゲルを形成させた。ゲルが生成した後ＲＰＭＩを除き、細胞をＲＰＭＩ／１０％血漿由来血清（ＰＤＳ）に加えた。ＰＤＳは、１／１０倍容量の３．８％クエン酸ナトリウムを含有する排気し冷却したチューブに血液を吸い込んで調製した。次に血液を新しいSorvallチューブに移し、１４，０００〜１６，０００ＲＰＭ、４℃で２０分間遠心した。血漿層を取り、１／５０倍容量の１ＭのＣａＣｌ₂を加えた新しいチューブにプールした。血漿を混合し、その試料を新しいSorvallチューブに入れ、３７％で２時間インキュベートしてフィブリンクロットを形成させた。次にこのクロットをピペットで掻き混ぜて収縮させ、チューブを１４，５００ＲＰＭ、２５℃で２０分間遠心した。上清を集め、プールし、５６℃で熱不活化させてから滅菌濾過し凍結した。精製したヒト単球を、５単位／ｍｌのGenzyme組換えヒトＭＣＳＦを含有する１０％ＰＤＳ／ＲＰＭＩ中で５日間培養した後、ＬＤＬ、酸化ＬＤＬ、アセチル化ＬＤＬ（ＬＤＬは全て５０μｇ／ｍｌ）、リゾホスファチジルコリン（Sigma 、３７．５μＭ）またはホモシステイン（Sigma、１ｍＭ）で処理した。これらの試薬と共に２時間から３日間までの範囲の期間インキュベーションした後、培地を除去し、細胞をＲＮＡ溶菌バッファーに溶解させ、上記第６．１欄に記載したようにしてＲＮＡを調製した。リポタンパク質。酸化のためには、最初にヒトＬＤＬ（Sigam）をＰＢＳで１ｍｇ／ｍｌに希釈した後、４℃でＰＢＳに対して一晩透析した。次に、ＬＤＬをＰＢＳで０．３ｍｇ／ｍｌに希釈した。次いで、ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏを５μＭの最終濃度まで加え、その溶液を３７℃のインキュベーターにおいてＴフラスコ中で２４時間インキュベートした。次にＬＤＬ溶液を４℃で０．１５ＭＮａＣｌ／０．３ｍＭＥＤＴＡに対して２日間数回交換しながら透析した後取り出し、 Amiconスピンカラムを用いて１時間４０００ＲＰＭ、４℃で遠心することによって遠心分離した。アセチル化のためには、１ｍｌの５ｍｇ／ｍｌＬＤＬを４℃のシェーカー上の氷上で１５ｍｌのチューブ中の１ｍｌのＮａＯＡｃ飽和溶液に加えた。８μｌの無水酢酸を一度に２μｌずつ１時間かけて加えた。次にＬＤＬを４℃で４８時間０．１５ＭＮａＣｌ／０．３ｍＭＥＤＴＡに対して数回交換しながら４８時間透析した。誘導体化したＬＤＬの最終濃度はＯＤ₂₉₀で分析した天然ＬＤＬの希釈曲線と比較することによって決定した。いずれの場合も希釈剤としては０．１５ＭＮａＣｌ／０．３ｍＭＥＤＴＡを使用した。６．１．２．実例材料の分析示差的ディスプレイ：ＤＮＡの除去：ＲＮＡペレットをＨ₂Ｏに再懸濁させ、ＯＤ₂₆₀で分光光度法によって定量した。次に、サンプルのほぼ半分をＤＮＡｓｅＩで処理して夾雑する染色体ＤＮＡを除去した。以下の手順を用いてＰＣＲによりＲＮＡを増幅した。５０μｌのＲＮＡサンプル（１０〜２０μｇ）、５．７μｌの１０×ＰＣＲバッファー（Perkin-Elmer/Cetus）、１μｌのＲＮＡｓｅ阻害剤（４０単位／μｌ）（ Boehringer Mannheim、ドイツ）を一緒に混合し、ボルテックスで掻き混ぜ、簡単に遠心した。２μｌのＤＮＡｓｅＩ（１０単位／μｌ）（Boehringer Mannhei m）を反応混合物に加え、これを３７℃で３０分間インキュベートした。ＤＥＰＣＨ₂Ｏで全容量を２００μｌにし、フェノール／クロロホルムで一回、クロロホルムで一回抽出し、そして、２０μｌの３ＭＮａＯＡｃ、ｐＨ４．８（ＤＥＰＣ処理したもの）、５００μｌの無水ＥＴＯＨを加えドライアイス上で１時間または−２０℃で一晩インキュベートすることによって沈殿させた。こうして沈殿したサンプルを１５分間遠心分離し、ペレットを７０％ＥＴＯＨで洗浄した。サンプルを再度遠心分離し、残った液体を吸引し、ペレットを１００μｌのＨ₂ Ｏに再懸濁させた。ＲＮＡの濃度はＯＤ₂₆₀で読み取ることによって測定した。第一ストランドｃＤＮＡ合成：各ＲＮＡサンプルに対して重複反応を平行して行なった。４００ｎｇのＲＮＡ＋ＤＥＰＣＨ₂Ｏ（合計容量１０μｌ）を４μ ｌのＴ₁₁ＸＸ逆プライマー（１０μＭ）（Operon）に加えた。各実験で使用した特異的プライマーは上記第４欄の図面の説明に挙げてある。混合物を７０℃で５分間インキュベートしてＲＮＡを変性させた後室温にした。以下の成分を含有する２６μｌの反応混合物を各変性ＲＮＡ／プライマーサンプルに加えた。８μｌの５×First Strand Buffer（Gibco/BRL、Gaithersburg、MD）、４μｌの０．１ＭＤＴＴ（Gibco/BRL）、２μｌのＲＮＡｓｅ阻害剤（４０単位／μｌ）（Boe hringer Mannheim）、４μｌの２００μＭｄＮＴＰ混合物、６μｌのＨ₂Ｏ、２μｌのSuperscript逆転写酵素（２００単位／μｌ）（Gibco/BRL）。反応混合物を穏やかに混合し、４２℃で３０分間インキュベートした。次に６０μｌのＨ₂ Ｏ（最終容量＝１００μｌ）を加え、サンプルを８５℃で５分間変性させ、− ２０℃で保存した。ＰＣＲ反応：１３μｌの反応混合物を氷上の９６ウェルプレートの各チューブに加えた。この反応混合物は、６．４μｌのＨ₂Ｏ、２μｌの１０×ＰＣＲバッファー（Perkin-Elmer）、２μｌの２０μＭｄＮＴＰ、０．４μｌの³⁵ＳｄＡＴＰ（１２．５μＣｉ／μｌ、合計５０μＣｉ）（Dupont/NEN）、２μｌの前方プライマー（１０μＭ）（Operon）、および０．２μｌのAmpliTaqポリメラーゼ（５単位／μｌ）（Perkin-Elmer）を含有していた。次に、２μｌの逆プライマー（Ｔ₁₁ＸＸ、１０μＭ）を各チューブの側に加えた後、５μｌのｃＤＮＡもこれらチューブの側（これらはまだ氷上にあった）に加えた。各実験で使用した特異的プライマーは上記第４欄の図面の説明に挙げてある。チューブに蓋をし、混合し、遠心管中で１０００RPMまで上げた後すぐに氷に戻した。このＰＣＲ機（Perkin-Elmer 9600）は、示差的ディスプレイ用に以下のようにプログラムを組んだ。このＰＣＲ機が９４℃に達したときプレートを氷から取り出し、Perkin-Elmer 9600ＰＣＲ機に直接入れた。ＰＣＲの後１５μｌの負荷(loading)染料（８０％ホルムアミド、１０ｍＭＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌのキシレンシアノール、１ｍｇ／ｍｌのブロモフェノールブルーを含有する）を加えた。負荷染料と反応混合物を混合し、８５℃で５分間インキュベートし、氷で冷却し、遠心分離し、氷上に載せた。各チューブから約４μｌを取ってprerun（６０Ｖ）６％アクリルアミドゲルに載せた。このゲルを約８０Ｖで、最上の染料前面が底から約１インチに達するまで走らせた。ゲルを３ＭＭ紙（Whatman Paper、英国）に移し、真空中で乾燥した。バンドはオートラジオグラフィーで可視化した。バンドの単離と増幅：選択的に発現したバンドを、乾燥したゲルからかみそりの刃で切り出し、１００μｌのＨ₂Ｏと共にマイクロ遠心管(microfuge tube)に入れ、５分間１００℃に加熱し、ボルテックスで掻き混ぜ、再び５分間１００℃ に加熱し、再度ボルテックスで掻き混ぜた。冷却後、１００μｌのＨ₂Ｏ、２０ μｌの３ＭＮａＯＡｃ、１μｌのグリコーゲン（２０ｍｇ／ｍｌ）、および５００μｌのエタノールを加え、冷却した。遠心分離後ペレットを洗浄し、１０μ ｌのＨ₂Ｏに再懸濁させた。次に、こうして単離した選択発現したバンドを、以下の反応条件を用いてＰＣＲにより増幅した。５８ μｌＨ₂Ｏ１０ μｌ１０×ＰＣＲバッファー１０ μｌ２００μｍｄＮＴＰ１０ μｌ１０μＭ逆プライマー１０ μｌ１０μＭ前方プライマー１．５μｌ増幅したバンド０．５μｌ AmpliTaqポリメラーゼ（５単位／μｌ）（Perkin-Elmer）ＰＣＲは、本欄で示差的ディスプレイに関して前記したプログラムを用いて実施した。ＰＣＲの後、グリセロール負荷染料を加え、サンプルを２％調製用TAE/ Biogel（Bio101、La Jolla、CA）アガロースゲルにかけ、溶出した。次いでバンドをかみそりの刃でゲルから切り出し、室温にて１５分間ボルテックスで掻き混ぜ、Bio101製のMermaidキットを用い、マイクロ遠心管中で３容量のMermaid高塩結合性溶液と８μｌの再懸濁したglassfogを加えることによって精製した。次に glassfogをペレット化し、エタノール洗浄溶液で３回洗浄した後、ＤＮＡを５０ ℃で１０μｌ中に二回溶出させた。サブクローニング：増幅したバンドをサブクローニングするにはＴＡクローニングキット（Invitrogen、San Diego、CA）を用いた。典型的な連結反応混合物は４μｌの無菌Ｈ₂Ｏ、１μｌの連結バッファー、２μｌのＴＡクローニングベクター、２μｌのＰＣＲ産物、および１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼから成っていた。ＰＣＲ産物の容量は変えることができるが、ＰＣＲ産物とＨ₂Ｏの合計容量は常に６μｌとした。（ベクターのみを含む）連結混合物は細菌の形質転換前に１２℃で一晩インキュベートした。ＴＡクローニングキットのコンピテント細菌（ＩＮＶαＦ′：endal，recAl，hsdR17(r-k，m+k)，supE44，λ-，thi-1，gyrA ,relA1,φ80lacZαΔM15Δ(lacZYA-argF)，deoR+，F'）を氷上で解凍し、各チューブに２μｌの０．５Ｍ β‐メルカプトエタノールを加えた。各連結混合物の２μｌを各チューブのコンピテント細胞（５０μｌ）に加え、ボルテックスで掻き混ぜることなく混合し、氷上で３０分間インキュベートした。次にチューブを４２℃の浴にちょうど３０秒入れた後、２分間氷に戻した。次いで、４５０μｌのＳＯＣ培地（Sambrookら、１９８９年、上掲）を各チューブに加えた後３７℃ で１時間振盪した。次に細菌をペレット化し、〜２００μｌのＳＯＣに再懸濁させ、Ｘ‐ｇａｌおよび６０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するLuriaブロス寒天プレートに撒き、３７℃で一晩インキュベートした。次に白色のコロニーを摘出し、ＰＣＲを用いてインサートに関してスクリーニングした。２μｌの１０×ＰＣＲバッファー、１．６μｌの２．５ｍＭｄＮＴＰ、０．１μｌの２５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．２μｌのＭ１３逆プライマー（１００ｎｇ／μｌ）、０．２μｌのＭ１３前方プライマー（１００ｎｇ／μｌ）、０．１μ ｌのAmpliTaq（Perkin-Elmer）、および１５．８μｌのＨ₂Ｏを含有するマスターミックスを作成した。４０μｌのマスターミックス試料を９６ウェルプレートのチューブに入れ、ＰＣＲの前にピペットチップで全細菌を加えた。ＰＣＲ機（ Perkin-Elmer 9600）は、インサートスクリーニング用に以下のようにプログラムを組んだ。反応生成物を２％アガロースゲル上で溶出し、ベクターコントロールと比較した。インサートを含有するベクターを有するコロニーをＬＢ／Ａｍｐプレート上に画線することによって精製した。そのような菌株からベクターを単離し、Appl ied Biosystems Automated Sequencer（Applied Biosystems，Inc．Seattle，WA ）を用いて配列を解析した。ノーザン解析：ノーザン解析を実施して、増幅したバンドに対応する遺伝子の選択発現を確認した。ｍＲＮＡを検出するのに使用したプローブは以下のようにして合成した。典型的には２μｌの増幅したバンド（〜３０ｎｇ）、７μｌのＨ₂ Ｏ、および２μｌの１０×Hexanucleotide mix(Boehringer-Mannheim)を混合し、５分間９５℃に加熱した後、氷上で冷却した。増幅したバンドの容量は変えることができるが、バンドとＨ₂Ｏの合計容量は常に９μｌとした。３μｌのｄＡＴＰ／ｄＧＴＰ／ｄＴＴＰ混合物（各々０．５ｍＭで１：１：１）、５μｌのα³² ＰｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍＭ、合計５０μＣｉ）（Amersham，Arlington ，Heights，IL）、および１μｌのKlenow（２単位）（Boehringer-Mannheim）を混合し、３７℃でインキュベートした。１時間後、３０μｌのＴＥを加え、反応混合物をBiospin-6（登録商標）カラム（Biorad，Hercules，CA）上に載せ、遠心分離した。溶出液の試料１μｌを用い、scintillantを用いたシンチレーションカウンターで取込みを測定して、１０⁶ｃｐｍ/μｌの取込みが達成されたことを確認した。サンプルを変性アガロースゲル上に載せた。３００ｍｌの１％ゲルは、３ｇのアガロース（SeaKemTM LE，FMC BioProducts，Rockland，ME）と６０ｍｌの５× ＭＯＰＳバッファーを２１０ｍｌの無菌Ｈ₂Ｏに加えることによって作成した。５×ＭＯＰＳバッファー（０．１ＭＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、４０ｍＭＮａＯＡｃ、５ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））は、２０．６ｇのＭＯＰＳを８００ｍｌの５０ｍＭＮａＯＡｃ（８００mlの無菌Ｈ₂Ｏ中の１３．３ｍｌの３ＭＮａＯＡｃｐＨ４．８）に加え、次に１０ＭのＮａＯＨでｐＨを７．０に調節し、０．５ＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を１０ｍｌ加え、最終容量１ＬになるまでＨ₂Ｏを加えることによって作成した。混合物を融解するまで加熱した後５０ ℃に冷却し、この時点で５μｌの臭化エチジウム（５ｍｇ／ｍｌ）と３０ｍｌの３７％ホルムアルデヒドのゲルを加えた。このゲルをすばやく回転させて混合した後すぐに注いだ。２μｇのＲＮＡサンプル、１×最終１．５×ＲＮＡ負荷染料（６０％ホルムアミド、９％ホルムアルデヒド、１．５×ＭＯＰＳ、０．０７５％ＸＣ／ＢＰＢ染料）およびＨ₂Ｏを混合して最終容量を４０μｌとした。チューブを５分間６５ ℃に加熱した後氷上で冷却した。１０μｇのＲＮＡＭＷ標本（New England Bi olabs，Beverly，MA）も染料で変性させ、ゲル上に載せた。ゲルをＭＯＰＳ泳動バッファー中３２Ｖで一晩泳動した。次にゲルを０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムに４５分間、５０ｍＭのＮａＯＨ／０．１ＭのＮａＣｌに３０分間、０．１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）に３０分間、そして２０×のＳＳＣに２０分間浸した。各々の浸漬ステップは室温で振盪しながら行なった。次にゲルを螢光ルーラーに沿って写真に取った後、Sambro okら、１９８９年、上掲の方法に従ってHybond-Nメンブラン(Amersham)を用いて２０×のＳＳＣに一晩ブロッティングした。ハイブリダイゼーションでは、ブロットを、１０ｍｌのプレハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミドと１×Denhardt溶液から成る）を含有するローラーボトルに入れ、３０分間６５℃のインキュベーターに入れた。次にプローブを９５℃に加熱し、氷上で冷却し、１０ｍｌのハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、１×Denhardt溶液、１０％硫酸デキストランから成る）に１０⁶ｃｐｍ／ｍｌの最終濃度まで加えた。次いでプレハイブリダイゼーション溶液をプローブ溶液と交換し、４２℃で一晩インキュベートした。次の日、ブロットを室温の２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で３０分間かけて三回洗浄した後、プラスチックラップで覆い、露出させた。ＲＴ−ＰＣＲ解析：ＲＴ−ＰＣＲを実施して、増幅したバンドに対応する遺伝子から選択発現したｍＲＮＡのレベルを検出した。第一ストランド合成は、２０ μｌのＤＮａｓｅを加えたＲＮＡ（〜２μｇ）、１μｌのオリゴｄＴ(Operon)（１μｇ）、および９．７５μｌのＨ₂Ｏを混合することによって実施した。サンプルを１０分間７０℃に加熱した後、氷上で冷却した。反応混合物に１０μｌの第一ストランドバッファー(Gibco/BRL)、５μｌの０．１ＭＤＴＴ、１．２５μｌの２０ｍＭｄＮＴＰ（最終５００μＭ）、１μｌのＲＮＡｓｉｎ（４０単位／μｌ）（Boehringer Mannheim）および２μｌのSuperscript逆転写酵素（２００単位／μｌ）(Gibco/BRL)を加え、１時間４２℃にインキュベートした後、５分間８５℃にし、−２０℃に保存した。この逆転写したサンプルでＰＣＲを実施した。各反応混合物は、２μｌの１０ ×ＰＣＲバッファー、１４．５μｌのＨ₂Ｏ、０．２μｌの２０ｍＭｄＮＴＰ（最終２００μＭ）、０．５μｌの２０μＭ前方プライマー（最終０．４μＭ）、０．５μｌの２０μＭ逆プライマー（最終０．４μＭ）、０．３μｌのAmpliT aqポリメラーゼ（Perkin-Elmer/Cetus）、２μｌのｃＤＮＡ希釈または陽性コントロール（〜４０ｐｇ）を含有していた。各実験で使用した特異的プライマーは上記第４欄の図面の説明に挙げてある。サンプルを９４℃のＰＣＲ９６００機に入れた（高温開始）。このＰＣＲ機は以下のようにプログラムを組んだ。反応はｃＤＮＡ希釈系列に対して行ない、いろいろなサイクルで７２℃のステップ中にチューブを機械から取り出した。反応生成物を１．８％アガロースゲル上で溶出させ、臭化エチジウムで可視化した。６．１．３．ターゲット遺伝子の染色体上位置確定ヌクレオチド配列が決定されれば特定の染色体上の遺伝子の存在が検出される。ターゲット遺伝子のヌクレオチド配列に基づいたオリゴヌクレオチドプライマーを、個々のヒト染色体を鋳型として用いるＰＣＲ反応に使用する。各２３のヒト染色体の個々のサンプルは市販されている(Coriel Institute for Medical Re search，Camden，NJ)。次の条件に従って染色体ＤＮＡを増幅する。１０ｎｇの染色体ＤＮＡ、２μｌの１０×ＰＣＲバッファー、１．６μｌの２．５ｍＭｄＮＴＰ、０．１μｌの２５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．２μｌの逆プライマー（１００ｎｇ／μｌ）、０．２μｌの前方プライマー（１００ｎｇ／μｌ）、０．１μｌのＴａｑポリメラーゼおよび１５．８μｌのＨ₂Ｏ。サンプルを９４℃のＰＣＲ９６００機に入れた（高温開始）。このＰＣＲは以下のようにプログラムを組んだ。７．実施例：例Ｂに応答して選択的に発現する遺伝子の同定：in vivo単球本発明の別の態様においては、単球で選択的に発現した遺伝子を生理学的に極めて適切なin vivo条件で検出した。実例Ｂでは、ヒト被検者を臨床設定条件に保ち、その食事の脂肪／コレステロール含量を調節した。処置のいろいろな段階で単球を単離し、その遺伝子発現パターンをコントロール群と比較した。例Ｂを使用することにより、ヒトbcl-2遺伝子を同定した。その発現は高脂肪／高コレステロールのアテローム形成状態に応じて低下する（図１）。アポＥ− ／−マウスは、ヒトプラーク発生に似た病理を有するアテローム性動脈硬化症の最初のマウスモデルである(Plumpら、１９９２年、Cell 71:343-353)。食事(cho w diet)中のこれらのマウスの血清コレステロールレベルはコントロールのlitte rmatesより５倍高い。マウスbcl-2遺伝子の調節もまた血清コレステロールレベルの影響を受けるかどうか確かめるために、アポＥ欠損マウスとlittermate野生型コントロールから得た単球を精製し、定量ＲＴ−ＰＣＲを用いてマウスbcl-2 ｍＲＮＡレベルを比較した。この方法によると、アポＥ欠損マウスでは、野生型コントロールと比較してマウスbcl-2ｍＲＮＡレベルが大幅に低かった（図３）。ヒトグルタチオンペルオキシダーゼ遺伝子(HUMGPXP1)の選択的発現パターンも発見された。HUMGPXP1の選択発現は最初、後記第７．１．２欄に記載する予備検出系で検出された。HUMGPXP1配列が得られた後、その遺伝子の選択的発現パターンが例Ｂの生理学的に適した条件下で確認・特徴付けされた。グルタチオンペルオキシダーゼは、通常の好気性条件下および酸化性ストレス下における生育および代謝の過程で生成する毒性の過酸化物の除去に関与することが知られている。ヒト血漿グルタチオンペルオキシダーゼ遺伝子は最初、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーから単離された(Takahashiら、１９９０年、J．Biochem．108:145-148) 。これは骨髄系統の２つのヒト細胞系で発現することが示されている(Porterら、１９９２年、Clinical Science 83:343-345)。また他の研究ではこの酵素の低下したレベルと心臓発作の危険とが関連付けられてもいる(Guidiら、１９８６年、J．Clin．Lab Invest．46:549-551; Wangら、１９８１年、Klin．Wochenschr ．59:817-818; Kokら、１９８９年、J．Am．Med．Assoc．261:1161-1164;および Gromadzinska & Sklodowska、１９９０年、J．Am．Med．Assoc．263:949-950)。グルタチオンペルオキシダーゼは、本明細書に記載するように心臓血管病の状態でヒト単球においてダウンレギュレートされるということがすでに知られている。興味深いことに、bcl-2はアポトーシス（apoptosis）を予防するのに重要な役割を果たしていると認識されており、bcl-2が存在しないときのグルタチオンペルオキシダーゼの発現はアポトーシスを予防することによってその損失を相殺することが可能である(Hockenbery ら、１９９３年、Cell 75:241-251)。本明細書中で本欄に記載したbcl-2およびHUMGPXP1に関するこれらの知見は、細胞内部での高ＬＤＬ濃度によって、または恐らくは酸化したＬＤＬにより媒介される細胞内の酸化性ストレスによって、引き起こされる細胞消滅誘発を含むプラーク形成における単球の新規な役割を示唆していた。アポトーシスとアテローム性動脈硬化症とのこの関係を確認するために、bcl- 2発現がアテローム性動脈硬化症を改善する能力を試験する。bcl-2は通常アテローム形成条件でダウンレギュレートされているので、スカベンジャー受容体プロモーター（これはアテローム形成条件下で単球泡沫細胞で誘発される）の制御下でヒトbcl-2遺伝子が発現されるようにトランスジェニックマウス株を工学処理する。次にこのトランスジェニックマウスをアポＥ欠損アテローム動脈硬化症マウスモデルと交配させる。bcl-2ターゲット遺伝子の増大した発現がアテローム性動脈硬化性を改善する能力は、トランスジェニックアポＥ欠損マウスで観察されるプラーク形成の開始と進行の低下によって立証される。したがって、これらの遺伝子の選択的発現を同定すると、心臓血管病の治療・診断のターゲットが得られる。Bcl-2とグルタチオンペルオキシダーゼを介してアポトーシス経路に干渉することにより、損傷の退行またはプラーク形成の防止または両方が可能である。また、アポトーシスとアテローム性動脈硬化症との関連の発見により、本明細書に記載した方法がアテローム性動脈硬化症過程に関与する遺伝子産物の完全な一組(panoply)を同定するのに有効であることが立証される。さらに、実例Ｂの下におけるbcl-2とHUMGPXP1のダウンレギュレーションによって、過剰のＬＤＬの単球に及ぼす影響の研究に対するフィンガープリントが得られる。７．１．材料と方法７．１．１．in vivoコレステロール研究患者を合計９週間臨床設定条件に保ち、その間脂質摂取を極めて厳密に制御した。全部で３種の食事があり、各患者は各々の食事で３週間処置した。患者は、心臓病または二重脂血症(dislipidemias)の病歴も症状ももたない健康な青年（３０代）の個人であった。この３種の食事は以下の通り。アメリカ心臓関連食II 脂肪２５％コレステロール８０ｍｇ／１０００Ｋｃａｌ多不飽和／飽和脂肪１．５平均的アメリカ食脂肪４３％コレステロール２００ｍｇ／１０００Ｋｃａｌ多不飽和／飽和脂肪０．３４組合せ食脂肪４３％コレステロール８０ｍｇ／１０００Ｋｃａｌ多不飽和／飽和脂肪０．３４これら３種の食事は等カロリーであり、食事中の脂質レベルが保たれる限り各々の食事の個々の成分は参加者の好みによって変えることができる。細胞の単離各３週間の食事処置期間の終了時、１２時間の絶食の後各患者から血液を採取し、単球を精製した。５０ｍｌの血液を取り、凝血を防ぐために各々１．４ｍｌのクエン酸リン酸デキストロースを含有する排気した５つのチューブに入れた。血液を５０ｍｌのチューブにプールし、４００ｇ（１２５０ＲＰＭ／Sorvall RC 3B）、４℃で１５分間遠心した。次に、血清上層（〜２５ｍｌ）をピペットで取り出し、４℃のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で置換した。血液を混合した後、１８５０×ｇ（２６８０ＲＰＭ）、４℃で１５分間遠心した。透明な上層のほとんどをピペットで取り出した後、界面のバフィーコートを〜５ｍｌ取り出した。このバフィーコートを別の５０ｍｌのチューブに入れ、その取り出しに用いたピペットを２０ｍｌのＰＢＳで洗浄した。次に、これらの細胞の試料を少し取ってＰＢＳで１：１０００に希釈し、細胞血球計を用いて顕微鏡下で計数した。次いで赤血球細胞濃度をＰＢＳで最終濃度１．５×１０⁹／ｍｌに調節し、その試料１０ｍｌを単球単離用にLeucoprep Becton Dickinson)に入れた。brake offを備えたSorvall RT6000中において２５℃で２５分間チューブを遠心した。透明な上層のほとんどを捨て、ゲル上の濁った層を貯蔵し５０ｍｌのチューブにプールした。次に各チューブの容量を２５℃のＰＢＳで５０ｍｌに増やし、１０００ＲＰＭ(Sorvall RC3B)、４℃で１０分間遠心した。次いで液体を捨て、ペレットを５０ｍｌのＰＢＳに再懸濁させ、再度遠心した。この工程をさらに三回繰り返した。その後最終細胞ペレットを２ｍｌのＲＮＡ溶解バッファー（Sambrookら、１９８９年、上掲）に再懸濁させ、その後のＲＮＡ単離のために上記第６．１．１欄に記載したように凍結した。示差的ディスプレイ、ノーザン解析、ＲＴ−ＰＣＲ、サブクローニングおよびＤＮＡ配列決定は、上記第６．１．２欄に記載したようにして実施した。７．１．２．予備検出系本欄に記載する予備検出系を使用して、容易に検定されるin vitro系で選択的に発現する配列を同定した。次に、心臓血管病に関与すると考えられているものとなんらかの相同性を示した配列を実例Ｂで特異的プライマーまたはプローブまたは両方として使用した。この実例Ｂでは上記第７．１．１欄に記載したように生理学的に適した条件下で選択的発現が確かめられた。細胞培養健常ヒトドナーから血液（〜１００ｍｌ）を採取してヘパリン(Bec ton Dickinson)を含有するvacutainerチューブに入れた。血液をＰＤ（ＣａまたはＭｇを含まないリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）＋０．３ｍＭのＥＤＴＡ）で１：１に希釈し、Ficoll（リンパ球分離培地−Organon Teknikon）上に、青の蓋をした５０ｍｌのFalconチューブ中で、３０ｍｌ血液／７ｍｌ ficollとして重層し、２０００ＲＰＭ、室温（ｒ．ｔ．）で２５分間遠心分離した。バフィーコートをピペットで取り出し、別の５０ｍｌのチューブに移し、ＰＤで３０ｍｌに希釈し、１２００ＲＰＭ、ｒ．ｔ．で１０分間遠心分離した。ペレットを３０ｍｌのＰＤに再懸濁させ、前記遠心分離ステップを繰り返した。このペレットを４０ｍｌのＲＰＭＩ（２ｍＭの１‐グルタミン＋ペニシリン／ストレプトマイシン）に再懸濁させ、４つのプレートに拡げ、３７℃で２時間インキュベートした。上清を除き、プレートを３７℃のＰＢＳで三回洗浄した。最後にプレートをＲＰＭＩ／２０％ヒトＡＢ血清(Sigma，St．Louis，MO)と共に各々１０ｍｌに再懸濁させた。５日目培地を変え、１００単位／ｍｌのヒトγ‐ＩＦＮ(Genzyme)を加えた。７日目培地を取り出し、代わりにＲＰＭＩ／２０％ヒトＬＤＬ欠損血清＋１００単位／ｍｌのヒトγ‐ＩＦＮを入れた。天然ＬＤＬ、酸化ＬＤＬおよびアセチル化ＬＤＬをそれぞれひとつのプレートに加え、４番目のプレートはコントロールとして使った。決まったインキュベーション時間（５時間または２４時間）後培地を取り出し、細胞を２ｍｌのグアニジンイソチオシアネートＲＮＡ溶解バッファー(Sambrookら、１９８９年、上掲)に再懸濁させた。次に、溶菌した細胞を２３Ｇ．ニードルで洗浄し、５．７ＭのＣｓＣｌ上に重層し、３５ＫＲＰＭで２０時間遠心分離した。Sambrookら、１９８９年、上掲の方法に従ってＲＮＡを単離した。リポタンパク質は上記第６．１．１欄に記載したようにして調製した。示差的ディスプレイ、ノーザン解析、ＲＴ−ＰＣＲ、サブクローニングおよびＤＮＡ配列決定は、上記第６．１．２欄に記載したようにして実施した。示差的ディスプレイに使用したプライマーはＴ₁₁ＣＣ（逆）およびＯＰＥ４（前方）であり、5' GTGACATGCC3'から成っていた。ＲＴ−ＰＣＲの場合、第一のストランドｃＤＮＡをＴ₁₁ＣＣでプライムし、ＰＣＲ反応はrfhma15プライマー（for-catgcctgtagaa aaaggtt/rev-cttcatagaatctaagccta）およびマウスγアクチンプライマー（for- cctgatagatgggcactgtgt/rev-gaacacggcattgtcactaact）を用いて実施した。７．１．３．ヒトbcl-2を発現するトランスジェニックアポＥ欠損マウスヒトbcl-2遺伝子（hbcl-2）の発現を司るマウススカベンジャー受容体調節要素（５ｋｂ）（M．Freemanら、１９９５年、未公表結果）を有する構築物（図３２）をもつトランスジェニックマウスを製造した。このスカベンジャー受容体調節要素（ＳｃＲ）はトランスジェニックマウスの腹膜マクロファージにおけるレポーター遺伝子発現を活性化することが知られている(M．Freemanら、１９９５年、未公表結果)。この５ｋｂの断片をＮｏｔＩ制限部位を介してヒトbcl-2ｃＤＮＡ(Clearyら、１９８６年、上掲)に連結する。次に、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）配列(Mayoら、１９８３年、Nature 306:86-88)を、充填したＢａｍＨＩ部位とＥｃｏＲＶ部位を介してこの構築物の３′端に連結してメッセージ安定性を与える。その後この構築物をＸｈｏＩで消化し、９ｋｂのScR-hbcl2-hGH配列をベクター配列から精製する。別のプラスミドサンプルをＫｐｎＩで消化して低めのレベルの発現を提供する１．５ｋｂのスカベンジャー受容体調節配列のみを有する断片を得る。次にこれらの断片を、標準プロトコル(Hoganら、Manipulating t he Mouse Embryo，1994，Cold ESpring EHarbor Laboratory Press)に従ってマウスのＦＶＢ株およびＣ５７ＢＬ／６株に由来するマウスの胚に別々に注入する。生誕後、注入した胚由来のマウスから尾部を切り取り、サザンブロットにおいてプローブとしてhbcl-2配列を用いてトランス遺伝子配列の存在を分析する。次いで、ScR-hbcl2-hGH構築物を有するトランスジェニックマウスをそれぞれ同じ株の野生型マウスと交配した後、その子を戻し交配してマウスのホモ接合株を製造する。次にこれらのマウスをアポＥ欠損マウスと交配する。尾セクションを調製しhbcl-2配列をプローブとするサザンブロットで、その子にScR-hbcl2-hG Hが存在するか否か分析する。その後、Plumpら、１９９２年、上掲の方法に従ってその子の損傷の形成および進行について分析する。７．２．結果食事中の脂肪／コレステロール摂取量によって血清コレステロールレベルを操作した患者の血液から得た単球ＲＮＡについて示差的ディスプレイ分析を実施した。図１は、低食事脂肪／低血清コレステロール状態で存在していたが高食事脂肪／高血清コレステロール状態ではなくなるバンド＃１４を示している。バンド＃１４から放射活性標識したプローブを調製し、同じ患者に由来するＲＮＡから調製したノーザンブロットとハイブリダイズさせたとき（図２）、低血清コレステロールで存在し高血清コレステロール状態では消失した８ｋｂのバンドがみられた。バンド＃１４配列をサブクローニングし、配列を決定し、配列データベースと比較したところ、ヒトbcl-2遺伝子(Clearyら、１９８６年、Cell 47，19-28 )と９８％（２０３／２０７ｂｐ）の配列類似性が得られたが、これはバンド＃１４がbcl-2であることを示している。単球で発現するグルタチオンペルオキシダーゼ(HUMGPXP1)を検査してbcl-2との生理学的関連性を決定した。HUMGPXP1の選択発現はin vitroで培養した単球を用いた予備検出系で最初に検出された。ヒト単球は上記第７．１．２．欄に記載したようにして調製した。５時間後細胞を溶解し、ＲＮＡを調製した。示差的ディスプレイ分析を実施し、調節されたバンドを単離して特性決定した。そのように調節されたひとつのバンド（バンド１５と称する）の増幅した配列の独立したたくさんのサブクローンからＤＮＡ配列を決定した。BLASTプログラム(Altschul ら、１９９０年、J．Mol．Biol．215:403-410)を用いて、ヒト血漿グルタチオンペルオキシダーゼエキソン１(HUMGPXP1)に対する配列とバンド１５の間で１７６／１７７（９９％）の配列類似性が見出された。この配列は報告された転写開始部位の上流にみられる。にもかかわらず、ＲＴ−ＰＣＲ分析で、実際バンド１５配列が報告された転写開始部位の下流の配列と同じ転写単位の内部にあることが確認された。この予備的結果に基づき、グルタチオンペルオキシダーゼ(HUMGPXP1)の遺伝子発現パターンを実例Ｂの生理学的に関連するサンプルにおいて確定・特性決定するためにさらに解析した。アテローム形成性の条件下（高血清コレステロール）および健常の状態（低血清コレステロール）のヒト血液から得られた単球をＲＴ −ＰＣＲで検査した。図４に示したように、高脂肪／コレステロール単球に由来するHUMGPXP1プライマーによって増幅されたｃＤＮＡは、低脂肪／コレステロール単球の場合より２〜３倍少ないようであるが、アクチンコントロールバンドは同じである。アポＥ欠損マウスとlittermate野生型コントロールに由来する単球を精製し、定量ＲＴ−ＰＣＲを用いてマウスbcl-2ｍＲＮＡレベルを比較した。この方法によると、マウスbcl-2ｍＲＮＡレベルは、野生型コントロールと比較してアポＲ欠損マウスでかなり低かった（図３）。これらの結果は、bcl-2が損傷の形成と進行に干渉するための優れたターゲット遺伝子であることを立証している。正常な条件下でbcl-2発現がアポトーシス( apoptosis)を防ぐことはすでに知られていた。したがって、アテローム形成性の条件によって引き起こされたbcl-2の観察されたダウンレギュレーションは、そのようなアテローム形成性の条件がどのようにプラーク形成に導き得るかの説明を提供する。通常の保護性bcl-2遺伝子のダウンレギュレートによって、高血清コレステロールが一連の事象を誘発し、アポトーシス経路の誘導を引き起こし、その結果細胞が死滅するようにプログラムされることになり、次いで炎症性の応答、そして引き続くプラーク形成を生じる。このモデルは、bcl-2の観察されたダウンレギュレーションを相殺することによって試験することができる。ヒトbcl-2遺伝子を、アテローム形成性条件下の単球泡沫細胞中で活性化されるプロモーターによって転写されるScR-hbcl2-hGH 構築物に入れる。次にこの構築物を、他の場合にはアテローム性動脈硬化症に対するモデルとして使用できるアポＲ欠損マウスに導入する。bcl-2発現のアテローム性動脈硬化症に対する効果は、この構築物を有するアポＥ欠損マウスにおけるプラーク開始・進行の低下によって立証される。したがって、bcl-2ターゲット遺伝子のダウンレギュレーションに対するそのような干渉によってアテローム性動脈硬化症の軽減を達成することが可能である。８．実施例：例Ｃに応答して選択的に発現する遺伝子の同定：内皮細胞のＩＬ− １誘発本発明により、示差的ディスプレイを用いて、ＩＬ−１でin vitro処理した内皮細胞中で選択的に発現する４つの新規な遺伝子を検出した。これらの遺伝子のうちの３つ、rchd024、rchd032およびrchd036はいかなる公知の遺伝子とも相同ではない。４番目の遺伝子rchd005はbumetanide感受性Ｎａ−Ｋ−Ｃｌコトランスポータータンパク質といわれるクローン化したサメ遺伝子と７０％相同である。この遺伝子のヒト同族体はすでに報告されているがその配列はまだ発表されていない（1994，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:2201-2205）。これら４つの遺伝子のアップレギュレーションの発見により、ＩＬ−１によって誘発された内皮細胞のフィンガープリントプロフィールが得られる。このフィンガープリントプロフィールは、限定されるわけではないがアテローム性動脈硬化症、虚血／再灌流、高血圧症、再狭窄および動脈炎症を始めとする心臓血管病の治療および診断に使用することができる。８．１．材料および方法すでに記載されているようにして(In Progress in Hemostasis and Thrombosi s，Vol．3，P．Spaet，editor，Grune & Stratton Inc.，New York，1-28)、正常期の臍帯からHUVECの一次培養物を確立した。細胞を２０％牛胎児血清完全培地(1989，J．Immunol．142:2257-2263)で増殖させ、活性化の前に１〜３回継代した。活性化のためには、細胞を１０単位／ｍｌのヒトＩＬ−１βと共に１時間または６時間培養してから、イソチオシアン酸グアニジニウムＲＮＡ溶解バッファー (Sambrookら、１９８９年、上掲)で溶菌した。次に、溶解した細胞を２３Ｇニードルで洗浄し、５．７ＭのＣｓＣｌ上に重層し、３５Ｋで２０時間遠心分離した。あるいは、細胞を１００μＭのリゾホスファチジルコリンまたは５０μｇ／ｍｌの酸化されたヒトＬＤＬ(Sigma)の存在下で１時間または６時間インキュベートした。上記第６．１欄に記載したようにしてＲＮＡを単離した。示差的ディスプレイ、ノーザン解析、ＲＴ−ＰＣＲ、サブクローニングおよびＤＮＡ配列決定は上記第６．１．２欄に記載したようにして行なった。ただし、ノーザンブロットハイブリダイゼーションは次のようにして行なった。プレハイブリダイゼーションのために、ブロットを１０ｍｌのrapid-hyb溶液(Amersham)を含有するローラーボトルに入れ、少なくとも１時間６５℃のインキュベーター中に入れた。次にハイブリダイゼーションのために、１×１０⁷ｃｐｍのプローブを９５℃に加熱し、氷上で冷却し、１０ｍｌのrapid-hyb溶液に加えた。次にこのプレハイブリダイゼーション溶液をプローブ溶液と交換し、６５℃で３時間インキュベートした。次の日、ブロットを室温の２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中２０分間で一回、６５℃の０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中１５分間で二回洗浄した後、プラスチックのラップで覆い、露出させた。上記第６．１．３欄に記載した方法に従って染色体上の位置を決定した。rchd 024で使用したプライマーはfor-cccatagactaggctcatagおよびrev-tttaaagagaaat tcaaatcであった。８．２．結果 HUVECを１０単位／ｍｌのＩＬ−１βで１時間または６時間活性化し、示差的ディスプレイを用いて活動していないHUVECと比較した。図５に示してあるように、rchd005と印したバンドがレーン１１と１２（ＩＬ−１、６時間）には存在するが、レーン９と１０（コントロール）またはレーン７と８（ＩＬ−１、１時間）にはない。このバンドrchd005を単離し、サブクローニングして配列決定した。このバンドから調製したプローブを使用してノーザンブロットをスクリーニングしたところ、発現は６時間でみられたが１時間またはコントロールではみられなかった（図６）。しかし、この同じプローブを、後記第９欄に記載する例Ｄに従って、ずれ応力を受けているＲＮＡから調製したノーザンブロットにハイブリダイズさせたところ、やはり異なるパターンのアップレギュレーションがみられた（図７）。発現は１時間で高く、次いで６時間までにほぼ消滅した。増幅したrchd005ＤＮＡをサブクローニングして配列を決定した。配列解析により、bum etanide感受性Ｎａ−Ｋ−Ｃｌコトランスポータータンパク質といわれるクローン化したサメ遺伝子と配列類似性が７０％である約３６０ｂｐのインサートが見出された（図８）。別のＩＬ−１で誘発可能なバンドrchd024を図９に示す。ＩＬ−１によってアップレギュレートされたＲＮＡのノーザン解析によって６時間で１０ｋｂのメッセージが存在することが示された（図１０）が、これもずれ応力下６時間でのアップレギュレーションの低いレベルを示している（図１１）。増幅したＤＮＡのサブクローンからＤＮＡ配列を得た（図１２）。データベースを調査したところ大きな配列類似性はみられなかった。ＰＣＲ増幅実験によって、このrchd024遺伝子がヒト第４染色体に位置していることが決定された。ＲＴ−ＰＣＲ解析によって確認された（図１４）ＩＬ−１による６時間の処理後選択的に増大された発現（図１３）に基づいてバンドrchd032を単離した。増幅したrchd032配列をサブクローニングして配列を決定した（図１５）。いかなる公知の遺伝子とも大きな相同性はみられなかった。またバンドrchd036もＩＬ−１処理の６時間後の選択的発現に基づいて単離した（図１６）。ノーザン解析（図１７）によって、ＩＬ−１処理の６時間後にアップレギュレートされた８ｋｂのバンドが見出された。別のノーザン解析を実施して、後記第９欄の実施例に記載する実例Ｄのずれ応力条件下のrchd036を試験した。興味あることに、処理１時間後でも６時間後でもバンドがない（図３３）ことによって示されているように、rchd036はずれ応力によって誘発されない。この結果から、ずれ応力によって調節されないＩＬ−１誘発性内皮細胞遺伝子の一例が得られ（これはこれらの誘発経路は分離することができることを示唆している）、炎症やアテローム性動脈硬化症の治療に高い特異性を示す薬剤が得られる可能性がある。増幅したＤＮＡのサブクローンからＤＮＡ配列を得（図１８）、データベースの調査により配列類似性は見出されなかった。ＰＣＲ増幅実験によって、rchd036遺伝子がヒト第１５染色体に位置していることが決定された。９．実施例：例Ｄに応答して選択的に発現する遺伝子の同定：内皮細胞ずれ応力本発明により、示差的ディスプレイを用いて、in vitroで流体ずれ応力にかけた内皮細胞中で選択的に発現する遺伝子を検出した。ずれ応力は、正常な循環流の領域におけるアテローム性動脈硬化症の損傷の原因として有力であると考えられている。実例Ｄの方法を用いて新規なＤＮＡ配列をもつ４つのバンドが同定された。 rchd502はラットmatrinＦ／ＧｍＲＮＡ配列(Hakesら、１９９１年、Proc．Nat l．Asad．Sci．U.S.A．88:6186-6190)と相同である。このラット遺伝子はプロスタグランジン輸送体として機能するタンパク質をコードしていることが示されており、ＰＧＴと指称されている(Kanaiら、１９９５年、Science 268:866-869)。実際、rchd502の配列はＰＧＴ遺伝子にみられる相同な１２個の膜貫通ドメインをコードしている。さらに、rchd502はずれ応力によってアップレギュレートされるがＩＬ−１ではされないことが立証されている。したがって、心臓血管病の診断・治療のための優れた新規な手段となる。 rchd523遺伝子の完全な配列から、これは３７５個のアミノ酸と７つの膜貫通ドメインから構成される新規なＧタンパク質結合受容体タンパク質をコードしていることが分かる。アミノ酸レベルでrchd523はアンジオテンシンII受容体と４０％同一である。このような新規なタンパク質の発見は、心臓血管病の治療ならびに診断およびモニター系を企画するのに特に有用である。シグナル伝達を行なう際、Ｇタンパク質は、細胞生理に変化を起こす経路で初期に重要な役割をする。したがって、rchd523遺伝子産物は、心臓血管病の治療における干渉用の優れたターゲットとなる。 rchd528に対するコード領域の配列を部分的に決定した。配列を並べてみたところ、この部分rchd528配列は、表皮成長因子（ＥＧＦ）リピートと特に強い相同性をもつ細胞外ドメインを含有していることが判明した。また、膜貫通タンパク質として、rchd502、rchd523およびrchd528の遺伝子産物は内皮細胞表面において他の化合物によって容易にアクセスまたは検出され得る。したがってこれらは、診断系において、また臨床試験で化合物の有効性をモニターする際に、心臓血管病の状態の検出用として優れたターゲットとなる。さらに、これら４つの遺伝子産物の細胞外ドメインにより、これらに結合する化合物を同定するための特に効率的なスクリーニング系となる。そのような化合物は膜貫通遺伝子産物の活性を調節することによって心臓血管病を治療するのに有用であり得る。 rchd534遺伝子の完全なコード領域の配列も得られた。このrchd534遺伝子はDr osophila gene Mothers against decapentaplegic（Ｍａｄ）(Sekelskyら、１９９５年、Genetics 139:1347-1358)と相同である２３５個のアミノ酸で構成される新規なタンパク質をコードしている。またこのrchd534遺伝子は、C．elegans ゲノムプロジェクト(Wilsonら、１９９４年、Nature 368:32-38)で同定されたCa enorhabditis elegans由来の未知の機能の配列と極めてよく似ている。ＭＡＤは、骨形態形成タンパク質‐４／形質転換成長因子‐β（ＴＧＦ−β）のDrosop hila同族体であるDecapentaplegic（ｄｐｐ）と同じ経路内にある。また、実例Ｄの方法を用いて、以前に同定されているシクロオキシゲナーゼII （ＣＯＸＩＩ）ともいわれるヒトプロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼII型も同定された（バンドrchd505）。この遺伝子は炎症に関与しておりＩＬ−１によってアップレギュレートされることがすでに知られていた(Jonesら、１９９３年、J．Biol．Chem．268:9049-9054)が、そのずれ応力によるアップレギュレーションは知られていなかった。この結果により、心臓血管病に関与する遺伝子の検出における、本発明で使用した技術の一般的有効性が確認された。 rchd530と指称する別のアップレギュレートされた遺伝子の配列はすでに同定されているヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子（ＭｎＳＯＤ）と同一であることが示された。ＭｎＳＯＤのずれ応力下でのアップレギュレーションは以前に知られていなかった。ずれ応力を受けた内皮細胞におけるこれら６つの遺伝子のアップレギュレーションにより、限定されるわけではないがアテローム性動脈硬化症、虚血／再灌流、高血圧症および再狭窄を始めとする心臓血管病の研究のためのフィンガープリントが得られる。これらの遺伝子のうちのひとつrchd502が実例Ｃ（ＩＬ−１誘発）でアップレギュレートされなかったという事実により、ずれ応力に特異的な生理学的現象を区別しターゲットとする極めて有用な手段が得られる。病気の状態における内皮細胞でのこれらの遺伝子の誘発の重要性をさらに解析するために、その発現に対するエストロゲンの影響を試験した。エストロゲン置換療法を受けている閉経後の婦人および動物モデルにおける研究によって、エストロゲンは、冠動脈症の発生を減らすのに粥状保護効果(atheroprotective effe ct)を有することが立証された。これらの研究によりエストロゲンが肝臓においてＬＤＬレベルを低下させてＨＤＬレベルを増大させるのに効果があることを立証しているが、これらのリポタンパク質の変化がエストロゲンの心臓保護効果(c ardioprotective)を全て受け持っていると考えられるわけではない。ある種の病気の状態で選択的に発現するターゲット遺伝子の同定により、エストロゲンの心臓血管病に対する効果をさらに解析できる。したがって、内皮細胞におけるターゲット遺伝子発現に対するエストロゲンの効果を特定の実例による発現パターンと比較した。特に、エストロゲン受容体が転写因子である(Kumaran d Chambon，Cell 55:145-156，1988)として、ずれ応力によって誘発された遺伝子の、HUVEC内におけるエストロゲンによる調節を検査した。エストロゲンの他に、同様に心臓保護効果を有することが報告されているエストロゲン受容体アゴニスト／アンタゴニストタモキシフェン(Graingerら、Nature Medicine 1:1067- 1073，1995)およびラロキシフェン(Blackら、J．Clin．Invest．93:63-69，1994 )による処理も検査した。その結果、ずれ応力によってアップレギュレートされるrchd528はエストロゲンによってもアップレギュレートされることが立証され、ずれ応力とエストロゲンは心血管症において類似の役割を果たし得ることが示唆された。９．１．材料および方法すでに記載されているようにして(In Progress in Hemostasis and Thrombosi s，Vol．3，P．Spaet，editor，Grune & Stratton Inc.，New York，1-28)、正常期の臍帯からHUVECの一次培養物を確立した。細胞を２０％牛胎児血清完全培地(1989，J．Immunol．142:2257-2263)で増殖させ、ずれ応力誘発の前に１〜３回継代した。誘発のためには、第二継代HUVECを組織培養処理ポリスチレンに載せ、すでに記載されているようにして(１９９４年、J．Clin．Invest．94:885-891)１０ｄｙｎ／ｃｍ²の層流に１時間および６時間、またはすでに記載されているようにして(１９８６年、Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．83:2114-2117)３〜１０ｄｙｎ／ｃｍ²の乱流にかけた。ターゲット遺伝子発現に対するエストロゲンの影響を試験するために、HUVEC を、１μｇ／ｍｌのインシュリン、１μｇ／ｍｌのトランスフェリン、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンおよび２００μｇ／ｍｌの脂肪酸不含ＢＳＡを補充した無血清内皮細胞基礎培地で培養した。細胞を最終濃度１ｎｍのエストラジオール、タモキシフェンまたはラロキシフェンで４時間または１６時間処理した後溶解し、ＲＮＡを単離した。rchd528の場合はノーザン解析用のプローブとして、塩基１６００〜２６００を含むＤＮＡ断片を使用した。上記第６．１欄に記載したようにしてＲＮＡを単離した。示差的ディスプレイ、ノーザン解析、ＲＴ−ＰＣＲ、サブクローニングおよびＤＮＡ配列決定は上記第６．１．２欄に記載したようにして行なった。ただし、ノーザンブロットハイブリダイゼーションは上記第８．１欄に記載したようにして行なった。ＲＡＣＥにより、またはｃＤＮＡライブラリーをプローブ探査することにより、または両方により、遺伝子の大きめの部分または完全なコード領域を含有するｃＤＮＡを得た。ＲＡＣＥ法はキットを用いてその製造業者の指示に従って実施した(Clontech，Palo Alto，CA。また、Chenchikら、１９９５年、CLONTECHniqu es（X）1:5-8、Barnes，1994，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:2216-2220、およびChengら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:5695-5699参照)。プライマーは、増幅した配列か、またはｃＤＮＡライブラリー由来の単離体から得た配列に基づいて設計した。鋳型のｍＲＮＡはずれ応力を受けているHUVECから単離した。遺伝子の一部を含有する増幅した配列をサブクローニングした後、別個に使用してｃＤＮＡライブラリー内の対応する遺伝子をコードしているｃＤＮＡを回収した。プローブは、上記第６．１．２欄に記載したようにして、ベクターＤＮＡに由来するサブクローニングしたインサートＤＮＡを単離し³²Ｐで標識することによって調製した。使用したライブラリーは個々のヒト心臓、ヒト膵臓およびヒト肺ｃＤＮＡライブラリー(Clontech，Palo Alto，CA)、ならびに本欄に上記したようにずれ応力を受けているHUVECから単離したｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡライブラリーを含んでいた。HUVECｃＤＮＡライブラリーは、バクテリオファージλ‐ＺＡＰベクター(Stratagene，La Jolla，CA)を用いて周知の方法（Samb rookら、１９８９年、上掲）に従って製造した。ライブラリーを周知の方法（Sa mbrookら、１９８９年、上掲）を用いてそれぞれのプローブによってスクリーニングした。プローブによって検出されたライブラリーから得たプラークを単離し、ファージベクター内のｃＤＮＡインサートを配列決定した。上記第６．１．３欄に記載した方法に従って染色体上の位置を決定した。rchd 523で使用したプライマーはfor-atgccgtgtgggttagtcおよびrev-attttatgggaaggt ttttaca、rchd534ではfor-cttttctgcgtctcccatおよびrev-agacatcagaaactccaacc であった。各種ヒト臓器および組織から抽出したＲＮＡのノーザンブロット解析は、市販されているプレブロットフィルター(Clontech，Palo Alto，CA)を用いて行なった。９．２．結果 HUVECに層状ずれ応力を１時間または６時間加え、静的コントロール細胞と示差的ディスプレイで比較した。図１９に示したように、バンド(rchd502)が同定された。これはレーン５、６（６時間）でみられたがレーン１，２（コントロール）ではみられなかった。このバンドを切り出し、増幅し、配列を決定した。増幅したrchd502配列を用いてノーザン解析をしたところ、コントロールと比較して６時間でアップレギュレートされた４．５ｋｂのバンドが明らかになった（図２０）。rchd502プローブをＩＬ−１で誘発した内皮細胞から調製したノーザンブロットにハイブリダイズさせたところ、４．５ｋｂバンドのアップレギュレーションはみられない（図２１）。この結果により、ＩＬ−１によって調節されないがずれ応力によって誘発可能な内皮細胞遺伝子の第一の例が得られ、これはこれらの誘発経路が分離することができることを示唆している。また、炎症やアテローム性動脈硬化症の治療に大きな特異性を有する薬剤が得られ得る。rchd502 の増幅した領域の配列を使用して遺伝子全体をクローニングするためのプローブを設計した。５′および３′ＲＡＣＥ反応を実施してrchd502遺伝子の全コード配列を含有する２．２ｋｂのｃＤＮＡを得た。ＲＡＣＥから得た配列情報に基づき、ヒト膵臓ライブラリーからrchd502コード領域の最初の２００塩基対を除く全てを含有するファージクローンを単離した。このクローンをpFCHD502SFと指称する。残りの２００塩基対は、特異的なプライマーを用いたＰＣＲによってヒト肺ライブラリーから増幅させて得た。rchd502遺伝子の塩基対１〜２６５を含む断片をＴＡクローニングベクターにサブクローニングしてプラスミドpFCHD502SJを製造した。すなわち、rchd502は、塩基対１〜２６５を含むpFCHD502SJと、塩基対２０１からコード領域の３′端まで、さらに３′非翻訳配列を含むpFCHD502SFとの２つのサブクローンによって表わされる。コード領域全体を含む完全配列を図２２に示す。rchd502は、プロスタグランジン輸送体（Kanaiら、１９９５年、上掲）をコードしているラットＰＧＴ遺伝子と強い相同性（８１．４％）を示す。これは１２の膜貫通（ＴＭ）ドメインを含有している。これら１２のＴＭドメインの各々の概略の境界は次の通りである。ＴＭ１：ほぼアミノ酸３１〜ほぼアミノ酸５２ＴＭ２：ほぼアミノ酸６８〜ほぼアミノ酸８９ＴＭ３：ほぼアミノ酸１０２〜ほぼアミノ酸１２１ TM4 ：約第173アミノ酸から約第194アミノ酸。 TM5 ：約第206アミノ酸から約第227アミノ酸。 TM6 ：約第259アミノ酸から約第280アミノ酸。 TM7 ：約第315アミノ酸から約第337アミノ酸。 TM8 ：約第366アミノ酸から約第385アミノ酸。 TM9 ：約第403アミノ酸から約第423アミノ酸。 TM10：約第510アミノ酸から約第530アミノ酸。 TM11：約第555アミノ酸から約第575アミノ酸。 TM12：約第607アミノ酸から約第627アミノ酸。未処理の対照細胞に比較して、ずれ応力バンド rchd505はずれ応力の１時間および６時間後に減少した（図23）。ノーザン分析によって、rchd505 が１時間および６時間のずれ応力処理後にアップレギュレートされたことを除いて、示差的発現をすることが明らかにした（図24）。Paradigm CにしたがってIL-1で処理された細胞において、このバンドが同様にアップレギュレートされた（図25）。配列分析によって、rchd505 はすでに特性決定されており、シクロオキシゲナーゼ II（cox II）としても知られている、ヒトエンドペルオキシドシンターゼII型であることが明らかになった。 rchd523 は示差的ディスプレイにおいて１時間および６時間のずれ応力処理後にアップレギュレートされたバンドとして検出された（図26）。rchd523 の６時間後のアップレギュレーションはＲＴ−ＰＣＲによって確認された（図27）。増幅されたrchd523 配列をサブクローン化し、そして単離物を配列決定し、pRCHD5 23と命名した。rchd523 遺伝子の全コード配列を含有する2.5 kbのｃＤＮＡを得るため、RACE操作法を利用した。rchd523 の完全コード配列を含有するｃＤＮＡ単離物をpFCHD523と命名する。配列分析によって、rchd523 遺伝子産生物は375 アミノ酸からなり、７つの膜貫通ドメインからなっている、新規なＧ−タンパク質と結合した受容体であることが明らかになった。アミノ酸レベルにおいては、 rchd523 はアンギオテンシンII受容体と40％同一性である。ＰＣＲ増幅実験によって、rchd523 遺伝子はヒト第７染色体に位置していることが決定された。 rchd528 もまた１時間および６時間のずれ応力処理後にアップレギュレートされたバンドとして検出された（図29）。この結果はノーザン分析によって確認された。この分析では、rchd523 の増幅された配列のプローブが、１時間後に中程度にアップレギュレートされ、６時間後に非常に強くアップレギュレートされる約8 kbのメッセージを検出した（図30）。増幅された配列をサブクローン化し、配列決定した。rchd528 遺伝子の単離用のｃＤＮＡライブラリーを最初にプローブするために、この配列の情報を使用した。 rchd528 の部分クローンを単離するため、ずれ応力HUVEC ｃＤＮＡライブラリーを最初にプローブするために、この増幅された配列を使用した。その後、全rc hd528 コード領域を包含する重複クローンを得るため、ヒト心臓ｃＤＮＡライブラリーのプローブおよびＰＣＲ増幅と組み合わせて、RACE操作法を使用した。rc hd528 遺伝子の完全コード領域は、それぞれpBluescript 中にクローン化された rchd528 遺伝子のセグメントを含有している以下の３つのプラスミド中に含まれる：核酸1-1200を含有するpFCHD528A 、核酸237-2982を含有するpFCHD528B 、および核酸2982からコード領域の3'末端までを含有するpFCHD528C 。rchd528 遺伝子の完全コード領域を含有するＤＮＡ配列を図31に示す。多数の異なるタンパク質との相同性に基づいて、rchd528 遺伝子産生物は表皮成長因子（EDF ）の反復単位を有する細胞外ドメインを含有することが示された。EGF 反復のおよその範囲は約第1089アミノ酸から約第1122アミノ酸である。そこには約第５アミノ酸から約第28アミノ酸の範囲のシグナルペプチドがある。また、約第1348アミノ酸から約第1370アミノ酸の範囲の膜貫通ドメインがある。その上、約第1140アミノ酸から約第1151アミノ酸のアスパラギン加水分解部位共通配列がある。各種のヒト器官および組織から単離したｍＲＮＡのノーザンブロット分析によって、rchd528 が心臓において非常に高度に発現されることが明らかになった。内皮細胞におけるrchd528 の発現に対するエストロゲンの影響もまた試験した。ノーザンブロット分析によって、対照細胞に対して、エストロゲンで一晩処理した後のrchd528 の有意なアップレギュレーションが明らかになった。 rchd530 と命名したバンドは、６時間のずれ応力後にHUVEC 中で強くアップレギュレートされた配列に相当する（図36）。このアップレギュレーションは乱流ずれ応力に対するよりも層流ずれ応力に対する方が大きい。配列分析によってrc hd530 はヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ（MnSOD）と同一であることが明らかになった。ずれ応力によるMnSOD の誘導は以前には知られていなかった。MnSOD はIL-1での６時間の処理によって誘導されることもまた示された。 rchd534 もまたずれ応力に応答してアップレギュレートされるものとして検出された。ノーザン分析によって、rchd534 が６時間のずれ応力処理後に強く誘導されることが明らかになった（図34）。増幅された配列をサブクローン化し配列決定して、全長rchd534 のｃＤＮＡを回収するためのプローブとして使用するために再単離した。3.3 kbのλ-ZAPクローンを配列決定して全長rchd534 のｃＤＮＡを明らかにした（図35）。rchd534 遺伝子の全コード領域を含有するこのクローンをpFCHD534クローンと命名した。コードされたタンパク質は235 アミノ酸からなっている。ＰＣＲ増幅試験によつて、rchd534 遺伝子がヒト第15染色体に位置することが決定された。データベース中の配列との最初の比較ではrchd534 はいずれの既知のＤＮＡ配列とも相同性は示されなかった。その後実施した探索の結果、rchd534 はショウジョウバエ遺伝子 Mothers against decapentaplegic(Mad)（Sekelskyら,1995,G enetics 139:1347-1358）の相同体であること、またCaenorhabditis elegans ゲノムプロジェクト中で同定された、C.elegans からの機能が未知の１配列（Wils onら、1994,Nature 368:32-38）に有意に類似していることが明らかになった。 rchd534 はまた、上記第８節に記載したようなParadigm Cの条件下で試験した時、IL-1によって調節されないことが示された。rchd502 と全く同様に、rchd53 4 はIL-1によって調節されないずれ応力誘導性の内皮細胞遺伝子の一例であって、これらの誘導経路を分離することができることの確証となるものであり、そして炎症およびアテローム性動脈硬化の治療のためのより特異的な薬剤を提供することになるかも知れない。 10．実施例：臨床試験の代用マーカーとしてのパラダイムＡ下での遺伝子の使用本発明にしたがって、5.1.1.1 節から5.1.1.6 節に記載したいずれかのパラダイムから誘導されたフィンガープリントプロフィールを使用して、ヒト患者における薬剤の臨床試験をモニターすることができる。上記5.5.4 節で一般的に記載したフィンガープリントプロフィールは特定の病状に対応する特定的な遺伝子調節の特性的なパターンを示す。5.1.1.1 節に記載した、および例えば上記第６節の例で示したパラダイムＡは酸性ストレス下における単球のフィンガープリントプロフィールを提供する。このプロフィールは指標となる読みを与えるので、したがって、酸化IDL の取り込みに対する単球の生理的応答を与える。これによって、臨床試験を実施している患者の単球上に示差的ディスプレイが表れることによって、酸化ポテンシャルに対する抗酸化薬剤の影響を測定することができる。 10．１．患者の処置および細胞の単離抗酸化活性を有すると推測される化合物を試験患者に投与することができる。対照患者にはプラシーボを与える。12時間の絶食後に各患者から血液を取り、上記第7.1.1 節のように単球を精製する。上記第6.1.1 節にしたがってＲＮＡを単離することができる。 10．２．サンプルの分析上記第6.1.2 節にしたがって、ＲＮＡを示差的ディスプレイ分析に供することができる。上記第6.2 節にしたがって、パラダイムＡにおいて酸化IDL によってアップレギュレートされたバンドの強度の減少、およびパラダイムＡにおいて酸化IDL によってダウンレギュレートされたバンドの強度の増加によって、単球の生理的応答状態の減少が示される。 11．実施例：心臓血管病の状態のイメージング本発明にしたがって、病気のまたは損傷された組織を画像化するために、患部組織の表面に位置する示差的に発現された遺伝子産生物をマーカーとして使用することができる。示差的に発現された遺伝子産生物に特異的な複合抗体を患者または試験動物に静脈内投与することができる。この方法は、病気のまたは損傷した組織を侵害しないで可視化させるという利点を与える。説明の目的で、この方法をrchd523 遺伝子産生物について詳細に記載する。この原理および手法を、例えばrchd502 およびrchd528 遺伝子産生物を含む、いずれの同定された膜貫通ターゲット遺伝子産生物に対しても適用することができる。 11．１．モノクローナル複合抗体上記第5.4.2 節の方法を使用して、rchd523 遺伝子産生物などの示差的に発現された表面遺伝子産生物が組換え体ホスト中に発現され、精製される。好ましくは、rchd523 産生物の１以上の細胞外ドメインを含有するタンパク質断片が産生される。精製後、上記第5.4.3 節にしたがって、F(ab')₂またはFab 断片を産生させるのに使用される。その後、上記第5.8.3 節にしたがって、DTPAなどの複合金属キレート剤を使用して、これらの断片をテクネチウム-99m（^99mTc）で標識する。 11．２．画像化剤の投与および検出アテローム性動脈硬化、再狭窄、または虚血／再潅流と診断された患者に対して、標識Mab を静脈内投与することができる。検出を可能にするために標識した抗体が病気のまたは損傷した組織部位（または複数の部位）に局在して、rchd52 3 遺伝子産生物と結合するのに十分な時間を与える。標識によって発生するシグナルを光走査装置によって検出する。その後、検出されたシグナルを、rchd523 遺伝子発現がアップレギュレートされる内皮細胞などの細胞を示す組織の画像に転換する。 12．実施例：rchd523 遺伝子産生物のリガンドおよびrchd523 遺伝子産生物− リガンド相互作用のアンタゴニストのスクリーニング rchd523 遺伝子産生物は多数の膜貫通ドメインを含有する、Ｇタンパク質が連結している受容体タンパク質ファミリーの一つである。このタンパク質ファミリーの受容体結合活性を、この受容体遺伝子が発現される細胞の膜を通過するＣａ²⁺ の移動度をアッセイすることによって検出する。以下に記載するこのアッセイはrchd523 遺伝子産生物受容体に結合するリガンドを同定するために使用される。このリガンド−受容体活性を確立することによって、リガンド−受容体相互作用のアンタゴニストを同定するためのスクリーニング法が提供される。アンタゴニストはリガンド−受容体結合によって誘導されるＣａ²⁺の移動度を阻害する能力として検出される。したがって、こうしたアンタゴニストは疾病状態においてアップレギュレートされるこのターゲット遺伝子の産生活性を妨害することによって、心臓血管疾患の治療に有効な化合物を提供する。 rchd523 遺伝子産生物へのリガンドの結合は以下のようにして測定される。pF CHD523からrchd523 遺伝子の全コード領域を含有するｃＤＮＡを取り出して、哺乳類細胞中で高度に発現されるプロモーターの制御下で好適な発現ベクター中に入れる。生成した構築物を骨髄細胞中にトランスフェクトし、その後標準的手法によってFURA-2またはINDO-1を添加する。細胞培養物にリガンドを添加して、細胞膜を通過するＣａ²⁺の移動によって測定されるシグナルの導入を誘発するような方法で、リガンドのrchd523 受容体への結合能力を試験する。リガンドによって誘導されるＣａ²⁺の移動は、Grynkiewicz ら、1985,J.Biol.Chem.260:3440 の記載にしたがって、蛍光分光分析によって測定する。ターゲット遺伝子産生物の受容体ドメインと反応するリガンドはそれらの蛍光シグナルを生成する能力によって同定される。バックグラウンドに対して生成された蛍光レベルを測定することによって、それらの受容体との結合活性を定量し、比較する。その後、リガンド−受容体結合を妨害する能力について、候補となるアンタゴニストをスクリーニングする。rchd523 遺伝子産生物を発現するトランスフェクトされた骨髄をリガンドのみ、および候補アンタゴニストの存在下のリガンドで処理する。蛍光シグナルを減少させる候補アンタゴニストをリガンド−rchd523 受容体相互作用のアンタゴニストに選定する。 13．ターゲット遺伝子ペプチド配列に対するポリクローナル抗体示されたｃＤＮＡのアミノ酸配列に相当するペプチド配列を選定し、合成および抗体の製造のためにResearch Genetics(Huntsville,AL)に提出した。ペプチドを文献の記載（Tam,J.P.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5409-5413；Tam,J.P .,and Zavala,F.,1989,J.Immunol.Methods 124:53-61；Tam,J.P.,and Lu,Y.A.,1 989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9084-9088）にしたがって改変し、同容量の Fr eund アジュバンド中で乳化し、ウサギの背部の３，４箇所に１免疫当たり総量で1.0ml（ペプチド0.5 mg）となるように皮下注入した。この動物に２および６週間後に追加免疫し、４，８，および10週間目に採血した。血液を凝固させて、遠心分離によって血清を採取した。使用したペプチドを下記に要約する。 14．in situ ハイブリダイゼーションによる新規遺伝子の位置決定２つのターゲット遺伝子、rchd502 およびrchd528 の発現をin situハイブリダイゼーションによって試験した。発現を、心臓血管疾患を有する生存している患者から取り出した、ヒト頸動脈内膜切除サンプル、すなわちヒト心臓血管組織中で検出した。各遺伝子についての発現パターンは、内皮細胞中で構成的に発現することが知られている陽性対照について検出されるパターンに類似していることが観察された。これらの結果は、心臓血管疾患におけるrchd502 およびrchd52 8 の両者の役割の証拠をさらに提供するものである。病態組織の内皮細胞内におけるこれらのターゲット遺伝子の発現の特異的な高数値の検出は、アテローム性動脈硬化の病変の単なる検出が提供するよりも、より明確な診断およびより明確な治療方法を与えることになる。 14．１方法ヒト頸動脈内膜切除サンプルのパラフィン包埋切片 7μm をキシレン中で脱パラフィンし、エタノール勾配シリーズで再水和し、4％ PFA/PBSで15分、ポストフィックスした。PBS で洗浄後、切片を37°で15分、２μg/mlプロテナーゼＫで消化し、再び4％ PFA/PBSで10分インキュベートした。その後切片をPBS で洗浄し、0.2 N ＨＣｌとともに10分インキュベートし、PBS で洗浄し、0.25％無水酢酸／1 M トリエタノールアミンとともに10分インキュベートし、PBS で洗浄し、 70％エタノールおよび100％エタノールで脱水した。 50％ホルムアミド、10％硫酸デキストラン、1x Denhardt 溶液、600 mMＮａＣｌ、10 mM DTT 、0.25％ SDSおよび100μg/mlｔＲＮＡの存在下で、55°で18時間、１）ヒトフォン・ウィルブランド(von Willebrand)因子遺伝子のコード領域の 0.8 kB SmaI断片セグメント、２）新規遺伝子 rchd502の部分を含有する断片（塩基396-622 を除く塩基対配列3-1195）、および３）新規遺伝子 fchd528の断片（塩基対配列3718-6407）をコードする³⁵Ｓ放射性標識（5×10⁷cpm/ml）ｃＲＮＡプローブでハイブリダイゼーションを実施した。ハイブリダイゼーション後、スライドを5x SSCで55°で、50％ホルムアミド／2x SSCで55°で30分、10 mM Tris−ＨＣｌ(pH7.6)/500 mMＮａＣｌ/1 mM EDTA(TNE)で37°で10分洗浄し、TNE 中の10μg/mlＲＮase中で37°で30分インキュベートし、TNE で37°で10分洗浄し、2x SSC中で50°で30、１回インキュベートし、70％エタノールおよび100％エタノールで脱水した。スライドをKodak NBT-2 写真乳剤に浸漬し、4°で7日間露光し、続いてKodak Dektol現像機で現像することによって、ｍＲＮＡ転写物の位置を検出した。スライドをヘマトキシリンおよびエオシンで対比染色して、撮影した。in situ ハイブリダイゼーション試験のための対照の中に、バックグラウンド数値以上のシグナルを示さないセンスプローブの使用が含まれた。 14．２結果 rchd502 およびrchd528 遺伝子はそれぞれ、構造的に発現される内皮細胞マーカーである、フォン・ウィルブランド因子からの陽性対照シグナルに類似した発現パターンを表した。シグナルはフォン・ウィルブランド因子について観察されるものと同様に、rchd502 およびrchd528 の両者について、頸動脈の内腔表面を被覆するほとんどの内皮細胞から検出された。試験した３つの遺伝子はいずれも平滑筋細胞およびマクロファージを含む、組織中に存在するその他の細胞型において発現を示さなかった。 15．微生物の寄託以下の微生物を、1995年１月11日、Agricultural Research Service Culture Collection(NRRL),Peoria,Illinoisに寄託し、以下に示す受託番号が定められた。以下の微生物を、1995年６月６日、Agricultural Research Service Culture Collection(NRRL),Peoria,Illinoisに寄託し、以下に示す受託番号が定められた。以下の微生物を、1996年２月７日、American Type Culture Collection(ATCC) ,Rockville,Marylandに寄託し、以下に示す受託番号が定められた。以下の微生物を、1996年２月９日、American Type Culture Collection(ATCC) , Rockville,Marylandに寄託し、以下に示す受託番号が定められた。本発明はここに記載した特定の態様の範囲に限定されるべきものではなく、これらの態様は本発明の個々の様相の一説明のためのものであり、機能的に等価な方法および成分が本発明の範囲内に含まれるものである。実際に、ここまでの記載および添付した図面から、ここに示し、そして記載したものの他に、本発明の各種の改変が、当業者にとって明らかになるであろう。そうした改変が請求範囲の中に含まれることを意図するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 48/00 ＡＢＵＧ０１Ｎ 33/15 ＺＣ１２Ｑ 1/68 33/50 ＴＧ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｎ 33/50 Ｃ０７Ｋ 14/47 33/53 Ａ６１Ｋ 37/50 ＡＢＳ // Ｃ０７Ｋ 14/47 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ

Claims

【特許請求の範囲】１．次のヌクレオチド配列： rchd005 （配列番号１）、 rchd024 （配列番号２）、 rchd032 （配列番号３）、 rchd036 （配列番号４）、 rchd502 （配列番号５）、 rchd523 （配列番号６）、 rchd528 （配列番号７）、もしくは rchd534 （配列番号36）またはNRRLに寄託された次のクローン： pRCHD005（NRRL受託番号B-21376）、 pRCHD024（NRRL受託番号B-21377）、 pRCHD032（NRRL受託番号B-21378）、 pRCHD036（NRRL受託番号B-21379）、 pRCHD502（NRRL受託番号B-21380）、 pFCHD502SF（ATCC受託番号）、 pFCHD502SJ（ATCC受託番号）、 pRCHD523（NRRL受託番号B-21381）、 pFCHD523（NRRL受託番号B-21458）、 pRCHD528（NRRL受託番号B-21382）、 pFCHD528A （ATCC受託番号）、 pFCHD528B （ATCC受託番号）、 pFCHD528C （ATCC受託番号）、もしくは pFCHD534（NRRL受託番号B-21459）に含まれる遺伝子もしくは遺伝子断片のヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。２．請求項１に記載のヌクレオチド配列もしくはその相補配列に、またはNRRLに寄託された請求項１に記載のクローンに含まれる遺伝子もしくは遺伝子断片にストリンジェント条件下でハイブリダイズする、単離された核酸。３．請求項１に記載のヌクレオチド配列もしくはその相補配列、またはNRRLに寄託された請求項１に記載のクローンに含まれる遺伝子もしくは遺伝子断片によりコードされるアミノ酸配列をコードする、単離された核酸。４．請求項１、２または３に記載のヌクレオチド配列を含有するヌクレオチドベクター。５．宿主細胞内で請求項１、２または３に記載のヌクレオチド配列の発現をコントロールするヌクレオチド調節要素と機能的に結合された該ヌクレオチド配列を含有する発現ベクター。６．請求項１、２または３に記載のヌクレオチド配列を含有する遺伝子工学的に作製された宿主細胞。７．宿主細胞内で請求項１、２または３に記載のヌクレオチド配列の発現をコントロールするヌクレオチド調節要素と機能的に結合された該ヌクレオチド配列を含有する、遺伝子工学的に作製された宿主細胞。８．請求項１、２または３に記載の核酸によりコードされる、実質的に純粋な遺伝子産物。９．請求項８に記載の遺伝子産物と免疫特異的に結合する抗体。 10．請求項１、２または３に記載の核酸が動物のゲノムに含まれて発現されるトランスジーンであるトランスジェニック動物。 11．請求項８に記載の遺伝子産物をコードするゲノム配列の発現が妨害または抑制されているトランスジェニック動物。 12．心臓血管病の診断方法であって、患者サンプルにおいて、心臓血管病の状態で示差的に発現される遺伝子またはその遺伝子産物を検出することを含んでなる方法。 13．心臓血管病がアテローム性動脈硬化症である、請求項12に記載の方法。 14．心臓血管病が虚血／再灌流である、請求項12に記載の方法。 15．心臓血管病が高血圧症である、請求項12に記載の方法。 16．心臓血管病が再狭窄である、請求項12に記載の方法。 17．前記遺伝子が心臓血管病に遺伝的になりやすい個体においてアップレギュレートされる、請求項12に記載の方法。 18．前記遺伝子が Na-K-Clコトランスポータータンパク質相同体、rchd024 タンパク質、rchd032 タンパク質、rchd036 タンパク質、ラットGPT の相同体、COX IIタンパク質、rchd523 タンパク質、rchd528 タンパク質、MnSOD タンパク質またはrchd534 タンパク質をコードする、請求項17に記載の方法。 19．前記遺伝子が心臓血管病に遺伝的になりやすい個体においてダウンレギュレートされる、請求項12に記載の方法。 20．前記遺伝子がグルタチオンペルオキシダーゼタンパク質またはBcl-2 タンパク質をコードする、請求項19に記載の方法。 21．前記遺伝子がＩＬ−１処理によりアップレギュレートされる、請求項12に記載の方法。 22．前記遺伝子が Na-K-Clコトランスポータータンパク質相同体、rchd024 タンパク質、rchd032 タンパク質、rchd036 タンパク質、COX IIタンパク質またはMn SOD タンパク質をコードする、請求項21に記載の方法。 23．前記遺伝子がずれ応力で処理することによりアップレギュレートされる、請求項12に記載の方法。 24．前記遺伝子が Na-K-Clコトランスポータータンパク質相同体、rchd024 タンパク質、ラットGPT タンパク質相同体、COX IIタンパク質、rchd523 タンパク質、rchd528 タンパク質、MnSOD タンパク質またはrchd534 タンパク質をコードする、請求項23に記載の方法。 25．前記遺伝子が高脂肪／高コレステロール食で個体を処置することによりダウンレギュレートされる、請求項12に記載の方法。 26．前記遺伝子がグルタチオンペルオキシダーゼタンパク質またはBcl-2 タンパク質をコードする、請求項25に記載の方法。 27．心臓血管病の治療方法であって、かかる治療を必要としている患者に、ターゲット遺伝子の発現、またはターゲット遺伝子産物の合成もしくは活性を調節する化合物を投与することを含んでなる方法。 28．心臓血管病がアテローム性動脈硬化症である、請求項27に記載の方法。 29．心臓血管病が虚血／再灌流である、請求項27に記載の方法。 30．心臓血管病が高血圧症である、請求項27に記載の方法。 31．心臓血管病が再狭窄である、請求項27に記載の方法。 32．前記化合物がターゲット遺伝子の発現、またはターゲット遺伝子産物の合成もしくは活性を抑制する、請求項27に記載の方法。 33．前記遺伝子が Na-K-Clコトランスポータータンパク質相同体、rchd024 タンパク質、rchd032 タンパク質、rchd036 タンパク質、ラットGPT タンパク質の相同体、COX IIタンパク質、rchd523 タンパク質、rchd528 タンパク質、MnSOD タンパク質またはrchd534 タンパク質をコードする、請求項32に記載の方法。 34．前記化合物がターゲット遺伝子の翻訳をブロックするアンチセンスまたはリボザイム分子である、請求項27に記載の方法。 35．前記遺伝子が Na-K-Clコトランスポータータンパク質相同体、rchd024 タンパク質、rchd032 タンパク質、rchd036 タンパク質、ラットGPT タンパク質の相同体、COX IIタンパク質、rchd523 タンパク質、rchd528 タンパク質、MnSOD タンパク質またはrchd534 タンパク質をコードする、請求項34に記載の方法。 36．前記化合物がターゲット遺伝子の5'領域に相補的であり、三重らせん形成により転写をブロックする、請求項27に記載の方法。 37．前記遺伝子が Na-K-Clコトランスポータータンパク質相同体、rchd024 タンパク質、rchd032 タンパク質、rchd036 タンパク質、ラットGPT タンパク質の相同体、COX IIタンパク質、rchd523 タンパク質、rchd528 タンパク質、MnSOD タンパク質またはrchd534 タンパク質をコードする、請求項36に記載の方法。 38．前記化合物がターゲット遺伝子産物の活性を中和する抗体である、請求項27 に記載の方法。 39．前記遺伝子産物が Na-K-Clコトランスポータータンパク質相同体、rchd024 タンパク質、rchd032 タンパク質、rchd036 タンパク質、ラットGPT タンパク質の相同体、COX IIタンパク質、rchd523 タンパク質、rchd528 タンパク質、 MnSOD タンパク質またはrchd534 タンパク質である、請求項38に記載の方法。 40．前記化合物がターゲット遺伝子の発現、またはターゲット遺伝子産物の合成もしくは活性を増強する、請求項27に記載の方法。 41．ターゲット遺伝子がBcl-2 またはグルタチオンペルオキシダーゼをコードする、請求項40に記載の方法。 42．心臓血管病の治療方法であって、かかる治療を必要としている患者に、活性なターゲット遺伝子産物をコードする核酸を投与することを含んでなる方法。 43．前記核酸がBcl-2 またはグルタチオンペルオキシダーゼをコードする、請求項42に記載の方法。 44．心臓血管病の治療方法であって、かかる治療を必要としている患者に、有効量のターゲット遺伝子産物を投与することを含んでなる方法。 45．前記遺伝子産物がBcl-2 またはグルタチオンペルオキシダーゼである、請求項44に記載の方法。 46．心臓血管病を治療する臨床試験で化合物の効力をモニターする方法であって、患者サンプルにおいて、心臓血管病の状態で示差的に発現される遺伝子またはその遺伝子産物を検出することを含んでなる方法。 47．心臓血管病がアテローム性動脈硬化症である、請求項46に記載の方法。 48．心臓血管病が虚血／再灌流である、請求項46に記載の方法。 49．心臓血管病が高血圧症である、請求項46に記載の方法。 50．心臓血管病が再狭窄である、請求項46に記載の方法。 51．前記遺伝子が心臓血管病に遺伝的になりやすい個体においてアップレギュレートされる、請求項46に記載の方法。 52．前記遺伝子が Na-K-Clコトランスポータータンパク質相同体、rchd024 タンパク質、rchd032 タンパク質、rchd036 タンパク質、ラットGPT タンパク質の相同体、COX IIタンパク質、rchd523 タンパク質、rchd528 タンパク質、MnSOD タンパク質またはrchd534 タンパク質をコードする、請求項51に記載の方法。 53．前記遺伝子が心臓血管病に遺伝的になりやすい個体においてダウンレギュレートされる、請求項46に記載の方法。 54．前記遺伝子がグルタチオンペルオキシダーゼタンパク質またはBcl-2 タンパク質をコードする、請求項53に記載の方法。 55．前記遺伝子がＩＬ−１処理によりアップレギュレートされる、請求項46に記載の方法。 56．前記遺伝子が Na-K-Clコトランスポータータンパク質相同体、rchd024 タンパク質、rchd032 タンパク質、rchd036 タンパク質、COX IIタンパク質またはMn SOD タンパク質をコードする、請求項55に記載の方法。 57．前記遺伝子がずれ応力で処理することによりアップレギュレートされる、請求項46に記載の方法。 58．前記遺伝子が Na-K-Clコトランスポータータンパク質相同体、rchd024 タンパク質、ラットGPT タンパク質相同体、COX IIタンパク質、rchd523 タンパク質、rchd528 タンパク質、MnSOD タンパク質またはrchd534 タンパク質をコードする、請求項57に記載の方法。 59．前記遺伝子が高脂肪／高コレステロール食で個体を処置することによりダウンレギュレートされる、請求項46に記載の方法。 60．前記遺伝子がグルタチオンペルオキシダーゼタンパク質またはBcl-2 タンパク質をコードする、請求項59に記載の方法。 61．多重膜貫通ドメイン受容体ターゲット遺伝子産物の活性を調節する化合物の同定方法であって、多重膜貫通ドメイン受容体ターゲット遺伝子産物を発現する第１の細胞を、試験化合物および多重膜貫通ドメイン受容体ターゲット遺伝子産物の活性化剤と接触させ、第１の細胞の細胞内カルシウム放出レベルを測定し、そして、そのレベルを、該活性化剤と接触させたが試験化合物とは接触させていない第２の多重膜貫通ドメイン受容体ターゲット遺伝子産物を発現する細胞の細胞内カルシウム放出レベルと比較することを含んでなり、その際、第１の細胞の細胞内カルシウム放出レベルが第２の細胞の該レベルと異なるとき、多重膜貫通ドメイン受容体ターゲット遺伝子産物の活性を調節する化合物が同定されたことになる、上記方法。 62．多重膜貫通ドメイン受容体ターゲット遺伝子産物が rchd523遺伝子産物である、請求項61に記載の方法。 63．前記細胞がツメガエル(Xenopus)の卵母細胞である、請求項61に記載の方法。 64．前記細胞がミエローマ細胞である、請求項61に記載の方法。