JPH11500309A - 心臓血管病の治療および診断のための組成物並びに方法 - Google Patents
心臓血管病の治療および診断のための組成物並びに方法Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、アテローム性動脈硬化症、虚血/再灌流、高血圧症、再狭窄、動脈の炎症を含むがこれらに限らない、心臓血管病の治療および診断のための方法並びに組成物に関する。詳細には、本発明は、正常な状態または非心臓血管病の状態での遺伝子発現に対して、および/または心臓血管病に関係した操作に応答して、心臓血管病の状態において示差的に発現(differentially expressed)される遺伝子を同定し、記載する。さらに、本発明は、その遺伝子産物が心臓血管病に関係のある他の遺伝子産物と相互作用する能力によっても遺伝子を同定し、記載する。さらにまた、本発明は、心臓血管病治療用の化合物の同定および治療的使用を提供する。さらに、本発明は、心臓血管病の治療の臨床評価を受ける患者の診断的モニター法、および臨床試験における化合物の効力のモニター法を提供する。さらに、本発明は、種々の心臓血管病の診断評価および予後判定の方法、並びに心臓血管病の素因をもつ患者の同定法を記載する。
Description
【発明の詳細な説明】
心臓血管病の治療および診断のための組成物並びに方法
本出願は、1995年2月10日付けの同時係属中の特許出願第08/386,844号の一部
継続出願である、1995年6月7日付けの同時係属中の特許出願第08/485,573号の
一部継続出願であり、各出願の全体をそのまま参考としてここに組み入れるもの
とする。
1.序論
本発明は、アテローム性動脈硬化症、虚血/再灌流、高血圧症、再狭窄、動脈
の炎症を含むがこれらに限らない、心臓血管病の治療および診断のための方法並
びに組成物に関する。正常な状態または非心臓血管病の状態での遺伝子発現に対
して、心臓血管病の状態では示差的に発現される遺伝子が同定される。また、そ
の遺伝子産物が心臓血管病に関係のある他の遺伝子産物と相互作用する能力によ
っても遺伝子が同定される。同定された遺伝子は診断的に使用されるか、または
治療的介入のターゲットとして使用される。これに関して、本発明は、心臓血管
病の治療および診断用の化合物の同定法並びに治療的使用を提供する。さらに、
心臓血管病の治療の臨床的評価を受ける患者の診断的モニター法、臨床試験にお
ける化合物の効力のモニター法、および心臓血管病の素因をもつ患者の同定法も
提供する。
2.発明の背景
心臓血管病は産業の発達した世界の至る所で主要な健康上の問題となっている
。アテローム性動脈硬化症は、心臓血管病のうちで最も一般的なもので、心臓発
作、卒中、四肢の壊疽の主な原因となり、それゆえ米国では第一位の死亡原因で
もある。アテローム性動脈硬化症は多くの細胞型と分子因子を巻き込んだ複雑な
疾患である(詳細については、Ross,1993,Nature 362: 801-809を参照のこと
)。その過程は、正常な状況では動脈壁の内皮および平滑筋細胞(SMC)の傷
害に対する防御反応であり、炎症が先行し、炎症を伴った繊維脂肪質または繊維
質の
病変部または斑の形成から成り立っている。アテローム性動脈硬化の進行した病
変部は関係した動脈を閉塞させることがあり、多数の異なる形の傷害に対する過
度の炎症−繊維性増殖応答が原因である。例えば、分岐点や不規則な構造のよう
な、乱れた血流が起こる循環系の領域にアテローム性動脈硬化斑がよく生じるの
は、ずれ応力(shear stress)が関与していると考えられている。
アテローム性動脈硬化斑の形成において最初に観察される現象は、血液由来の
単球が血管内皮層に付着して内皮下腔に移行するときに起こる。同時に隣接内皮
細胞が酸化された低密度リポタンパク質(LDL)を産生する。その後これらの
酸化型LDLは、単球の表面に発現されたスカベンジャー受容体を介して単球に
よって大量に取り込まれる。調節された経路(これにより天然LDL(nLDL
)がnLDL特異的受容体により取り込まれる)とは対照的に、取込みのスカベ
ンジャー経路は単球によって調節されない。
こうした脂質に富む単球は泡沫細胞(foam cell)と呼ばれ、脂肪線条(fatty st
reak)の主成分である。泡沫細胞とそれらを取り囲む内皮およびSMCとの相互
作用は慢性の限局的炎症状態をもたらし、最終的には平滑筋細胞の増殖および移
動、そして繊維質の斑(plaque)の形成を引き起こす。この種の斑は血管を閉塞さ
せ、血液の流れを制限し、結果的に虚血を生じさせる。
虚血は不十分な灌流による器官組織への酸素供給の欠乏により特徴づけられる
症状である。このような不十分な灌流は多くの症状の自然因となり得、二三の名
を挙げると、アテローム性動脈硬化または再狭窄、貧血、卒中などである。多く
の医学的介入(例えばバイパス手術中の血流の遮断)も虚血をまねく。疾病状態
の心臓血管組織により時々引き起こされることに加えて、虚血は虚血性心疾患に
おけるように心臓血管組織に影響を及ぼすことがある。しかしながら、虚血は酸
素供給の欠乏という問題を抱えているどの器官でも起こり得る。
心臓における虚血の最も一般的な原因は、噴門上部の冠状動脈のアテローム性
動脈硬化である。これらの血管の内腔を狭めることにより、アテローム性動脈硬
化は基底状態の心筋灌流の絶対的低下を引き起こすか、または血流に対する要求
が増大するときには適切な灌流増加を制限することになる。冠状動脈の血流は、
動脈の血栓、痙攣、稀には冠状動脈の塞栓により、さらに梅毒性大動脈炎による
口狭窄によっても制限される。肺動脈からの左前下行冠状動脈の異常な起点のよ
うな先天異常は、幼児では心筋虚血や梗塞を引き起こすことがあるが、この原因
は成人では非常に稀である。また、高血圧や大動脈弁狭窄による重症の心室肥厚
におけるように、心筋の酸素要求が異常に増大したときにも心筋虚血が起こりう
る。大動脈弁狭窄は冠状動脈のアテローム性動脈硬化によって引き起こされるも
のと区別のつかない狭心症とともに存在する。極端に重度の貧血や一酸化炭素ヘ
モグロビンの存在におけるような、血液の酸素運搬能の低下は心筋虚血の原因と
しては稀である。それほど多くはないが、虚血の2以上の原因も同時に存在する
ことができ、例えば、左心室肥厚による酸素要求の増加と、冠状動脈のアテロー
ム性動脈硬化にとって二次的な酸素供給の低下が共存できるだろう。
虚血性アテローム性動脈硬化の治療に対する主要な外科的アプローチは、バイ
パス移植術、動脈内膜切除術および経皮経管冠状動脈形成術(PCTA)である
。これら外科的アプローチ後の再狭窄(閉塞が再び発生して、しばしば一層ひど
くなる)による失敗率は驚くほど高い(30〜50%)。再狭窄の多くはさらなる炎
症、平滑筋の蓄積および血栓によるものと思われる。
ごく最近、ブタの動脈再狭窄を遺伝子治療により治療するために、改良された
バルーン血管形成術が採用された(Ohnoら,1994,Science 265: 781-784)。特
殊なカテーテルを使って、動脈閉塞部位の細胞にチミジンキナーゼ(tk)をコ
ードする遺伝子を担持する組換えアデノウイルスが導入された。続いて、ブタを
ガンシクロビルで治療した。ガンシクロビルはDNAに組み込まれたとき細胞を
殺す毒性形態にtkにより変換されるヌクレオシド類似体である。治療した動物
は動脈壁の厚さが50〜90%縮小し、いかなる局所または全身毒性も観察されなか
った。
アテローム性動脈硬化および虚血における過度の炎症−繊維性増殖応答の推定
される役割のために、多くの研究者らは、動脈損傷の概念において、炎症、細胞
漸増(cell recruitment)および増殖に関与するいくつかの因子の発現を研究して
きた。こうした因子としては、増殖因子、サイトカインおよび他の化学物質(細
胞漸増および移動、細胞増殖、脂質およびタンパク質の合成の制御に関与する脂
質類を含む)が挙げられる。
例えば、PDGF(血小板由来増殖因子)またはその受容体の発現が、動脈損
傷の修復中のラットで(Majesky ら,1990,J.Cell Biol.111: 2149); 酸化型
LDLで処置したヒト単球由来マクロファージの接着性培養物で(Maldenら,199
1,J.Biol.Chem.266: 13901); および流体ずれ応力を受けたウシ大動脈内皮
細胞で(Resnick ら,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 4591-4595)研究
された。IGF−I(インスリン様増殖因子−I)の発現はラット大動脈のバル
ーン脱内皮化(deendothelialization)後に研究された(Cercekら,1990,Circ
ulation Research 66: 1755-1760)。
その他の研究は、単球の接着を媒介する活性化内皮細胞の表面上の接着分子の
発現に集中していた。これらの接着分子としては、細胞内接着分子−1、ICA
M−1(Simmons ら,1988,Nature,331: 624-627)、ELAM(Bevilacquaら
,1989,Science 243: 1160-1165; Bevilacquaら,1991,Cell 67: 233)、およ
び血管細胞接着分子、VCAM−1(Osbornら,1989,Cell 59: 1203-1211)が
あり、これらの表面分子はすべてIL−1の存在下で転写的に誘導される。組織
学的研究は、ICAM−1、ELAMおよびVCAM−1がin vivo で病変部位
の内皮細胞上に発現されることを明らかにした(Cybulskyら,1991,Science 251
: 788-791; 1991,Arterioscler.Thromb.11: 1397a; Poston ら,1992,Am.J
.Pathol.140: 665-673)。VCAM−1とICAM−1は、培養下のウサギ動
脈内皮ばかりでなく培養下のヒト回腸動脈内皮細胞において、リゾホスファチジ
ルコリン(アテローム発生リポタンパク質の主要なリン脂質成分)により誘導さ
れることが示された(Kumeら,1992,J.Clin.Invest.90: 1138-1144)。VC
AM−1、ICAM−1およびクラスII主要組織適合性抗原は、ウサギ大動脈の
損傷に応答して誘導されることが報告された(Tanakaら,1993,Circulation 88:
1788-1803)。
近年、サイトメガロウイルス(CMV)は一般にアテローム性動脈硬化と同様
に再狭窄にも関与していることが示された(Speir ら,1994,Science 265: 391
-394)。CMVタンパク質IE84は、p53(その活性形で腫瘍を抑制するこ
とが知られている)と結合してそれを不活性化することにより、平滑筋細胞を再
狭窄部位で明らかに増殖しやすくすることが観察された。
前述の研究は、アテローム性動脈硬化斑を形成させる過度の炎症−繊維性増殖
応答に関与すると予想された特定の遺伝子産物の役割を規定することにねらいを
定めていた。しかしながら、このようなアプローチでは病気の過程で関係のある
一そろいの遺伝子産物を同定することはできず、ましてや、さまざまな心臓血管
病の診断および治療のターゲットとして機能しうるものを同定することなど及び
もつかない。
3.発明の概要
本発明は、アテローム性動脈硬化症、虚血/再灌流、高血圧症、再狭窄、動脈
の炎症を含むがこれらに限らない、心臓血管病の治療および診断のための方法並
びに組成物に関する。詳細には、正常な状態または非心臓血管病の状態での遺伝
子発現に対して、心臓血管病の状態では示差的に発現される遺伝子が同定され、
記載される。
本明細書中で用いる「示差発現」(differential expression)とは、遺伝子の
時間的および/または組織発現パターンの定量的および定性的差異を意味する。
示差発現される遺伝子は「フィンガープリント遺伝子」および/または「ターゲ
ット遺伝子」でありうる。本明細書中で用いる「フィンガープリント遺伝子」と
は、その発現パターンが心臓血管病の予後または診断評価の一部として利用され
得るか、または心臓血管病治療用化合物の同定方法に使用し得る示差発現遺伝子
のことである。本明細書中で用いる「ターゲット遺伝子」とは、ターゲット遺伝
子の発現レベルの調節またはターゲット遺伝子産物の活性の調節が心臓血管病の
症状を改善するように働くような、心臓血管病に関与する示差発現遺伝子のこと
である。ターゲット遺伝子の発現またはターゲット遺伝子産物の活性を調節する
化合物は、心臓血管病の治療に使用することができる。
さらに、「パスウェイ遺伝子」(pathway gene)は、その遺伝子の産物が心臓血
管病に係わりのある他の遺伝子の産物と相互作用する能力により定義される。パ
スウェイ遺伝子はまた、ターゲット遺伝子および/またはフィンガープリント遺
伝子の特徴を示すこともできる。本明細書中に記載する遺伝子は心臓血管病に関
して示差的に発現され、そして/また、それらの産物が心臓血管病にとって重要
な遺伝子産物と相互作用しうるが、別の心臓血管プロセスにとって重要なメカニ
ズムにそれらの遺伝子が関与していてもよい。
本発明は、このようなフィンガープリント、ターゲットおよびパスウェイ遺伝
子の産物、並びにこのような遺伝子産物に対する抗体を包含する。さらに、この
ような遺伝子産物が寄与しうる心臓血管病の細胞および動物を土台としたモデル
の遺伝子工学的作製および使用も記載される。
本発明は、心臓血管病の症状の予後判定および診断評価法、このような疾病に
対する素因をもつ被験者の同定法を包含する。さらに、本発明は、心臓血管病の
治療の臨床試験に関係する薬物の効力を評価し、かつ患者の疾病の経過をモニタ
ーする方法を提供する。
本発明はまた、心臓血管病に関係のある遺伝子の発現または遺伝子産物の活性
を調節する化合物の同定法、並びに心臓血管病の症状または傾向を示す個体にこ
の種の化合物を投与することを含んでなる心臓血管病の治療法を提供する。
本発明は、一部には、感度のよい高処理量の遺伝子発現アッセイと結びついた
in vivo およびin vitro心臓血管病パラダイムを巻き込んだ体系的な検索戦略に
基づいている。疾病の過程で何らかの役割を果たすと推定された所与の遺伝子産
物の発現を単に評価するだけのアプローチとは対照的に、ここで用いる検索戦略
およびアッセイは、既知であろうと新規であろうと、疾病状態で発現または抑制
されるあらゆる遺伝子の同定を可能にし、同時に疾病の進行中のそれらの時間的
調節および機能の評価を可能にする。この包括的なアプローチおよび評価は、新
規な遺伝子と遺伝子産物の発見のみならず、その疾病の病理学において主要な役
割を果たす新規な経路(パスウェイ)において関与する(新規であろうと既知で
あろうと)一そろいの遺伝子および遺伝子産物の同定を可能にする。かくして、
本発明は診断、モニター、合理的薬物スクリーニングおよびデザイン、および/
または他の治療的介入に有用なターゲットを規定することを可能にする。
ここに記載する実施例では8つの新規なヒト遺伝子が同定され、これらの遺伝
子は異なる心臓血管病の状態で示差発現されることが実証される。さらに、以前
に同定された4つのヒト遺伝子の示差発現が記載される。これらの遺伝子の同定
並びに特定の疾病状態でのそれらの発現の特性づけは、新規遺伝子と既知遺伝子
の両方の心臓血管病における新たな役割を認識させる。
Bcl−2およびグルタチオンペルオキシダーゼは既知遺伝子の産物であるが
、これらの産物は本明細書ではアテローム発生の高脂肪/高コレステロール食に
さらされた患者の単球においてダウンレギュレート(下方調節)されることが示
される。さらに、ここに記載するように、アテローム発生条件下でのBcl−2
のダウンレギュレーションを中和するとアテローム性動脈硬化症が改善されうる
。したがって、Bcl−2およびグルタチオンペルオキシダーゼの発現パターン
に関するここに記載の知見に基づいて、心臓血管病を診断し、臨床試験において
モニターし、治療する方法が提供される。これらの2つの遺伝子はアポトーシス
の阻止に関与することが知られていたので、アテローム発生条件下でのそれらの
ダウンレギュレーションの発見は、アポトーシスとアテローム発生との新規な正
の相関関係を提供する。したがって、ここに提供される心臓血管病を診断し、モ
ニターし、治療する方法はまた、アポトーシス経路に関与する多くの遺伝子にも
基づいており、かかる遺伝子としては、ICE(IL−1変換酵素)、Bad、
BAG−1(Bcl−2関連 athanogene 1,Takayama ら,1995,Cell 80: 279
-284)、BAX(Bcl−2関連Xタンパク質,Oltvaiら,1993,Cell 74: 609
-619)、BclXL(Boise ら,1993,Cell 74: 597-608)、BAK(Bcl−2
アンタゴニストキラー,Farrowら,1995,Nature 374: 631-733)、およびBcl
−XS(Tsujimoto ら,1984,Science 226: 1097-1099)が挙げられるが、これ
らに限らない。このように診断され、臨床試験でモニターされ、治療される心臓
血管病には、制限するものではないが、アテローム性動脈硬化症、虚血/再灌流
および再狭窄がある。
rchd005 、rchd024 、rchd032 および rchd036は新たに同定された遺伝子で、
それぞれがIL−1で処理された内皮細胞においてアップレギュレート(上方調
節)される。したがって、rchd005 、rchd024 、rchd032 および rchd036の発現
パターンに関するここに記載の知見に基づいて心臓血管病を診断し、臨床試験に
おいてモニターし、治療する方法が提供される。
シクロオキシゲナーゼII(COX II、エンドペルオキシドシンターゼとしても知
られている)およびマンガンスーパーオキシドジスムターゼ(MnSOD)は既知の遺
伝子であり、そしてrchd502 、rchd523 、rchd528 および rchd534は新たに同定
された遺伝子で、それぞれがずれ応力を受けた内皮細胞においてアップレギュレ
ートされる。したがって、COX II、MnSOD 、rchd502 、rchd523 、rchd528 およ
び rchd534の発現パターンに関するここに記載の知見に基づいて、心臓血管病を
診断し、臨床試験においてモニターし、心臓血管病に治療上有効な化合物をスク
リーニングし、そして治療する方法が提供される。
より詳細には、これらの遺伝子はそれぞれがIL−1(rchd005 、rchd024 、
rchd032 および rchd036)またはずれ応力(COX II、MnSOD 、rchd502 、rchd52
3 、rchd528 および rchd534)のいずれかによりアップレギュレートされる。疾
病状態に対して原因的に作用する遺伝子の場合は、治療法はそれらの発現を、特
に内皮細胞における発現を、低下または排除するようにデザインされる。あるい
は、治療法はこれらの遺伝子のタンパク質産物の活性を抑制することを含む。疾
病状態に対して防御的に作用する遺伝子の場合は、治療法はかかる遺伝子の産物
の活性を高めるようにデザインされる。
いずれの場合にも、これらの遺伝子の正常な発現を越える発現を検出すること
が心臓血管病の診断を与える。さらに、臨床試験で化合物の効力を調べるとき、
これらの遺伝子の発現レベルの低下は疾病状態から正常状態に戻ることに相当し
、それゆえ用いた化合物の陽性効果を示す。このように診断され、臨床試験でモ
ニターされ、治療される心臓血管病には、制限するものではないが、アテローム
性動脈硬化症、虚血/再灌流、高血圧、再狭窄および動脈の炎症がある。
細胞外ドメインを含む、膜に結合したターゲット遺伝子産物は、治療法、診断
法および臨床モニター法にとって特に有用なターゲットでありうる。例えば、rc
hd523 遺伝子は膜貫通タンパク質をコードし、この膜貫通タンパク質は7つの膜
貫通ドメインを含むため、細胞表面で他の化合物と容易に接触することができる
。したがって、rchd523 遺伝子産物と結合する天然リガンド、天然リガンドの誘
導体および抗体は、その活性を抑制するために、あるいは疾病状態にある細胞を
特異的に破壊するために使用することができる。さらに、rchd523 遺伝子産物の
細胞外ドメインは、rchd523 遺伝子産物と結合する化合物を同定するための特別
に効率のよいスクリーニング系を提供する。rchd523 遺伝子産物の受容体ドメ
インと結合する化合物は、例えば、以下の第5.5.1 節に記載するように、Ca2+
を動員して蛍光シグナルを発生させる能力により同定され得る。
また、このようなアッセイ系は、rchd523 遺伝子産物とrchd523 遺伝子産物に
結合するリガンドとの相互作用のアンタゴニストをスクリーニングして同定する
にも使用され得る。例えば、これらの化合物はrchd523 遺伝子産物の内因性(す
なわち、天然の)リガンドと競合することができる。こうして、リガンドと結合
したrchd523 遺伝子膜貫通タンパク質の量の低下は、疾病状態にある内皮細胞の
ような細胞の活性を調節するだろう。rchd523 遺伝子産物の可溶性タンパク質ま
たはペプチド(例えば、1以上の細胞外ドメインを含むペプチド)、またはrchd
523 遺伝子産物の一部および/またはその類似体(例えば、Ig−テイルド融合
タンパク質のような可溶性融合タンパク質を含む)は、この目的のために特に有
用でありうる。
同様に、rchd523 産物の1以上の細胞外ドメインに特異的な抗体は、診断試験
または臨床試験モニターにおけるこのターゲット遺伝子産物の簡便な検出を可能
にする。したがって、内皮細胞をこのような標識抗体でin vivo またはin vitro
のいずれかで処理することで、内皮細胞の疾病状態を判定することができる。rc
hd523 遺伝子産物はずれ応力のもとでは内皮細胞においてアップレギュレートさ
れるので、その検出は心臓血管病と正の相関関係にある。
上記のrchd523 遺伝子産物を用いる治療法、診断法および臨床試験モニター法
はまた、 rchd502(12の膜貫通ドメインを含む)や rchd528(その細胞外ドメイ
ンのほかに1つの膜貫通ドメインを含む)を含むがこれらに限らない膜貫通遺伝
子産物をコードする他のターゲット遺伝子にも応用できる。
以下の第6.9 節に示した実施例では、心臓血管病のターゲット遺伝子を同定す
るための本発明の心臓血管病パラダイムの使用を示す。
以下の第10節に示した実施例では、診断法におけるフィンガープリント遺伝子
の使用、並びに基礎研究および臨床試験で候補薬剤の効力を試験するための代理
マーカーとしてのフィンガープリント遺伝子の使用を示す。
以下の第11節に示した実施例では、疾病状態の心臓血管組織のイメージングに
おけるフィンガープリント遺伝子、特にrchd523 、の使用を示す。
以下の第12節に示した実施例では、ターゲット遺伝子産物の受容体ドメインの
リガンドおよびリガンド−受容体相互作用のアンタゴニストのスクリーニングに
おけるターゲット遺伝子、特にrchd523 、の使用を示す。
4.図面の説明
図1.in vivo コレステロール示差的ディスプレイ。異なる食事の患者の血液
から単離されたヒト単球から調製されたmRNA。高脂肪食/高血清コレステロ
ール(レーン1、2)及び低脂肪食/低血清コレステロール(レーン3、4)の
一人の患者から調製されたcDNAを、フォワードプライマーT11XG 及びリバー
スプライマーOPO14(agcatggctc)を使用してディスプレイした。マークされたバ
ンド(#14)に相当するDNAを配列分析のために切り出し、増幅した。
図2.バンド#14 ノーザンブロット分析。ランダムプライマー標識バンド#14
プローブを、示差的ディスプレイに使用したのと同じ患者の単球から調製された
ノーザンブロットとハイブリダイズさせた。8kbバンドが低脂肪/低コレステロ
ール条件で見られ、高脂肪/高コレステロール条件では見られなかった。
図3.apoE欠損マウス中のマウスbcl-2 mRNAレベルの定量的RT-PCR分析。
apoE欠損マウスおよび対照マウスからの単球RNAを、上部パネルに示されたマ
ウスbcl-2のためのプライマー(for-cacccctggcatcttctccttcc/rev-atcctcccccag
ttcaccccatcc)、また下部パネルに示されたマウスγアクチンのためのプライマ
ー(for-cctgatagatgggcactgtgt/rev-gaacacggcattgtcactaact)を使用して比較し
た。それぞれのインプットcDNAの1:3 希釈系列を、野生型cDNAに由来す
るそれぞれの対中の左バンドおよびapoE欠損cDNAからの右バンドとの対で行
った。
図4.高脂肪食(血清コレステロールレベル=200; 上部パネル)および低脂肪
食(血清コレステロールレベル=170; 下部パネル)を摂取した同一患者の血液単
球に由来するRNAから調製されたヒト臨床サンプルcDNAからのヒトグルタ
チオンペルオキシダーゼ(HUMGPXP1)cDNAのRT-PCR定量化。HUMGPXP1配列1121
-1142(for- aagtcgcgcccgcccctgaaat)および1260-1237(rev-gatccctggccaccgt
ccgtctga)から誘導されたGPX1.3プライマーを使用する増幅産物の希釈系列をそ
れぞれのパネルの左部分に示す。ヒトアクチンプライマー(for-accctgaagtaccca
t/rev-tagaagcatttgcggtg)を使用する増幅産物の希釈系列をそれぞれのパネルの
右部分に示す。HUMGPXP1バンドは高脂肪食のもとで強さが低下し(上部左を下部
左と比較のこと)、一方、アクチン対照バンドはそれぞれの食事のもとで同等の
強さであった(上部右を下部右と比較のこと)。
図5.IL-1活性化HUVEC 示差的ディスプレイ。対照HUVEC(レーン9、10)、1
時間の10単位/ml IL-1処理(レーン7、8)、または6時間の処理(レーン11、
12)からのmRNAを、フォワードプライマーOPE7(agatgcagcc)およびリバー
スプライマーT11XA(これはXがG、C、またはAであるオリゴヌクレオチドの等
モル混合物である)との示差的ディスプレイ反応に使用した。マークされたバン
ド、rchd005 に相当するDNAをノーザン分析およびサブクローニングのために
切り出し、増幅した。
図6.内皮IL-1誘導rchd005 のノーザンブロット分析。対照サンプル、1時間
サンプルおよび6時間サンプルからの全RNA2μgをアガロースゲルで溶離し
、ブロットし、そして増幅rchd005 配列から調製された32P 標識プローブととも
にインキュベートした。示されたバンドは約7.5kb に相当するマーカーとともに
移動した。
図7.ずれ応力を受けたRNAから調製され、同一のrchd005 プローブとハイ
ブリダイズさせたノーザンブロットは、1時間で最も強くアップレギュレーショ
ンされた7.5kb バンドを検出する。
図8.バンドrchd005 DNA配列。この配列は、TAクローニングベクターへの
増幅rchd005 配列の連結により得られる、pRCHD005の挿入物を配列決定すること
により決定した。
図9.IL-1活性化HUVEC 示差的ディスプレイ。対照HUVEC(レーン3、4)、
1時間の10単位/ml IL-1処理(レーン1、2)、または6時間の処理(レーン5
、6)から調製されたmRNAを、フォワードプライマーOpG20(tctccctcag)お
よびリバースプライマーT11XA(これはXがG、C、またはAであるオリゴヌクレ
オチドの等モル混合物である)との示差的ディスプレイ反応に使用した。マーク
されたバンド、rchd024 に相当するDNAをノーザン分析およびサブクローニン
グのために切り出し、増幅した。
図10.内皮IL-1誘導バンドrchd024 のノーザンブロット分析。対照サンプル、
1時間サンプルおよび6時間サンプルからの全RNA2μgをアガロースゲルで
溶離し、ブロットし、そして増幅バンドrchd024 配列から調製された32P 標識プ
ローブとともにインキュベートした。示されたバンドは約10kbに相当するマーカ
ーとともに移動した。
図11.内皮IL-1誘導バンドrchd024 のずれ応力ノーザンブロット分析。ずれ応
力を受けたRNAから調製され、同一のrchd024 プローブとハイブリダイズさせ
たノーザンブロットは、6時間で最も強くアップレギュレーションされた10kbバ
ンドを検出した。
図12.バンドrchd024 DNA配列。この配列は、TAクローニングベクターへの
増幅rchd024 配列の連結により得られる、pRCHD024の挿入物を配列決定すること
により決定した。
図13.rchd032 に関するIL-1活性化HUVEC 示差的ディスプレイ。対照HUVEC(レ
ーン3、4)、1時間の10単位/ml IL-1処理(レーン1、2)、または6時間の
処理(レーン5、6)から調製されたmRNAを、フォワードプライマーOPI9(
tggagagcag)およびリバースプライマーT11XA(これはXがG、C、またはAであ
るオリゴヌクレオチドの等モル混合物である)との示差的ディスプレイ反応に使
用した。マークされたバンド、rchd032 に相当するDNAをノーザン分析および
サブクローニングのために切り出し、増幅した。
図14.対照、1時間、および6時間のIL-1活性化HUVEC から誘導されたRNA
から調製されたIL-1活性化HUVEC のcDNAからのrchd032 cDNAのRT-PCR定
量化。上部パネルではrchd032 プライマー(for-atttataaaggggtaattcatta/rev-t
taaagccaatttcaaaataat)で増幅された、また下部パネルではヒトアクチンプライ
マー(for-accctgaagtaccccat/rev-tagaagcatttgcggtg)で増幅されたインプット
cDNAの5倍希釈系列がレーン1、2、および3に示される。レーン3中の1:
125 希釈のバンドが6時間サンプルに見られるが、対照には見られない。
図15.バンドrchd032 DNA配列。この配列は、TAクローニングベクターへの
増幅rchd032 配列の連結により得られる、pRCHD032の挿入物を配列決定すること
により決定した。
図16.rchd036 に関するIL-1活性化HUVEC 示差的ディスプレイ。対照HUVEC(レ
ーン3、4)、1時間の10単位/ml IL-1処理(レーン1、2)、または6時間の
処理(レーン5、6)から調製されたmRNAを、フォワードプライマーOPI17
(ggtggtgatg)およびリバースプライマーT11XC(これはXがG、C、またはAであ
るオリゴヌクレオチドの等モル混合物である)との示差的ディスプレイ反応に使
用した。マークされたバンド、rchd036 に相当するDNAをノーザン分析および
サブクローニングのために切り出し、増幅した。
図17.内皮IL-1誘導バンドrchd036 のノーザンブロット分析。対照サンプル(
レーン1)、1時間サンプル(レーン2)、および6時間サンプル(レーン3)
からの全RNA2μg をアガロースゲルで溶離し、ブロットし、そして増幅バン
ドrchd036 配列から調製された32P 標識プローブとともにインキュベートした。
示されたバンドは約8kbに相当するマーカーとともに移動した。
図18.バンドrchd036 DNA配列。この配列は、TAクローニングベクターへの
増幅rchd036 配列の連結により得られる、pRCHD036の挿入物を配列決定すること
により決定した。
図19.層状ずれ応力HUVEC 示差的ディスプレイ。対照HUVEC(レーン3、4)、
1時間の10dyn/cm2層状ずれ応力処理(レーン1、2)、または6時間の処理(
レーン5、6)から調製されたmRNAをフォワードプライマーOPE7(agatgcag
cc)およびリバースプライマーT11XA(これはXがG、C、またはAであるオリゴ
ヌクレオチドの等モル混合物である)との示差的ディスプレイ反応に使用した。
マークされたバンド、rchd502 に相当するDNAをノーザン分析およびサブクロ
ーニングのために切り出し、増幅した。
図20.ずれ応力誘導バンドrchd502 のノーザンブロット分析。対照サンプル、
1時間のずれ応力を受けたサンプル、および6時間のずれ応力を受けたサンプル
からの全RNA2μg をアガロースゲルで溶離し、ブロットし、そして増幅バン
ドrchd502 配列から調製された32P 標識プローブとともにインキュベートした。
示されたバンドは約4.5kb に相当するマーカーとともに移動した。
図21.IL-1ブロット上でのずれ応力誘導バンドrchd502 のノーザンブロット分
析。対照(レーン1)、1時間(レーン2)、および6時間(レーン3)IL-1誘
導HUVEC サンプルからの全RNA2μg をアガロースゲルで溶離し、ブロットし
、そして増幅バンドrchd502 配列から調製された32P 標識プローブとともにイン
キ
ュベートした。IL-1によりアップレギュレーションされなかった4.5kb バンドが
見られる。
図22.rchd502 遺伝子のDNA配列およびコードされたアミノ酸配列。
図23.rchd505に関する層状ずれ応力HUVEC 示差的ディスプレイ。対照HUVEC(
レーン3、4)、1時間の10 dyn/cm2層状ずれ応力処理(レーン1、2)、また
は6時間の10 dyn/cm2層状ずれ応力処理(レーン5、6)から調製されたmRN
AをフォワードプライマーOPE2(ggtgcgggaa)およびリバースプライマーT11XA(こ
れはXがG、C、またはAであるオリゴヌクレオチドの等モル混合物である)と
の示差的ディスプレイ反応に使用した。マークされたバンド、rchd505 に相当す
るDNAをノーザン分析およびサブクローニングのために切り出し、増幅した。
図24.ずれ応力誘導バンドrchd505 のノーザンブロット分析。対照サンプル、
1時間のずれ応力を受けたサンプル、および6時間のずれ応力を受けたサンプル
からの全RNA2μg をアガロースゲルで溶離し、ブロットし、そして増幅バン
ドrchd505 配列から調製された32P 標識プローブとともにインキュベートした。
示されたバンドは約5.0kb に相当するマーカーとともに移動した。
図25.IL-1ブロット上でのずれ応力誘導バンドrchd505 のノーザンブロット分
析。対照(レーン1)、1時間(レーン2)、および6時間(レーン3)のIL-1
誘導HUVEC サンプルからの全RNA2μg をアガロースゲルで溶離し、ブロット
し、そして増幅バンドrchd505 配列から調製された32P 標識プローブとともにイ
ンキュベートした。5.0kb 誘導バンドが見られる。
図26.rchd523に関する層状ずれ応力HUVEC 示差的ディスプレイ。対照HUVEC(
レーン3、4)、1時間の10 dyn/cm2層状ずれ応力処理(レーン1、2)または
6時間の10 dyn/cm2層状ずれ応力処理(レーン5、6)から調製されたmRNA
をフォワードプライマーOPI11(acatgccgtg)およびリバースプライマーT11XC(こ
れはXがG、C、またはAであるオリゴヌクレオチドの等モル混合物である)と
の示差的ディスプレイ反応に使用した。マークされたバンド、rchd523 に相当す
るDNAをノーザン分析およびサブクローニングのために切り出し、増幅した。
図27.対照、1時間ずれ応力を受けたHUVEC 、および6時間ずれ応力を受けた
HUVEC から誘導されたRNAから調製されたずれ応力を受けた内皮細胞cDNA
からのrchd523 cDNAのRT-PCR定量化。上部パネルにはrchd523 プライマー(f
or-atgccgtgtgggttagtc/rev-attttatgggaaggtttttaca)で増幅されたインプット
cDNAの5倍希釈系列がレーン1、2、3に示され、またレーン4および5に
は、ヒトアクチンプライマー(for-accctgaagtaccccat/rev-tagaagcatttgcggtg)
を使用する5倍希釈系列が示される。レーン2の1:5 希釈のバンドが6時間サン
プルに見られるが、対照には見られない。
図28.rchd523 遺伝子のDNA配列およびコードされたアミノ酸配列。
図29.rchd528 に関する層状ずれ応力HUVEC 示差的ディスプレイ。対照HUVEC
(レーン3、4)、1時間の10 dyn/cm2層状ずれ応力処理(レーン1、2)また
は6時間の10 dyn/cm2層状ずれ応力処理(レーン5、6)から調製されたmRN
AをフォワードプライマーOPI19(aatgcgggag)およびリバースプライマーT11XG(
これはXがG、C、またはAであるオリゴヌクレオチドの等モル混合物である)
との示差的ディスプレイ反応に使用した。マークされたバンド、rchd528 に相当
するDNAをノーザン分析およびサブクローニングのために切り出し、増幅した
。
図30.ずれ応力誘導バンドrchd528 のノーザンブロット分析。対照(レーン1
)、1時間(レーン2)、および6時間(レーン3)ずれ応力を受けたサンプル
からの全RNA2μg をアガロースゲルで溶離し、ブロットし、そして増幅バン
ド rchd528 配列から調製された32P 標識プローブとともにインキュベートした
。示されたバンドは約5.0kb に相当するマーカーとともに移動した。
図31.rchd528 遺伝子のDNA配列およびコードされたアミノ酸配列。
図32.プラスミドpScR-bc12 の制限地図。
図33.ずれ応力下のrchd036 mRNAの発現のノーザンブロット分析。RNA
を未処理であるHEVEC(対照)並びに1時間および6時間にわたってずれ応力で処
理されたHEVEC から調製した。ブロットを標識rchd036 DNAで釣り上げた。
図34.ずれ応力下のrchd534 mRNAの発現のノーザンブロット分析。RNA
を未処理であるHEVEC(対照)並びに1時間および6時間にわたってずれ応力で処
理されたHEVEC から調製した。ブロットを標識rchd534 DNAで釣り上げた。
図35.rchd534遺伝子のDNA配列およびコードされたアミノ酸配列。
5.発明の詳細な説明
アテローム性動脈硬化症、虚血/再灌流(reperfusion)、高血圧、再狭窄、お
よび動脈炎症を含むが、これらに限定されない、心臓血管病の診断および治療の
ための方法および組成物が記載される。本発明は、症状に生理的に関連するパラ
ダイムにおいて示差的に発現される全ての遺伝子の発現および役割の評価に一部
基いている。これは疾病経路の特定並びに診断上および治療上の両方に有益であ
る該経路におけるターゲットの同定を可能にする。
正常な状態または非心臓血管病の状態におけるそれらの発現に対して、心臓血
管病の状態で示差的に発現される“ターゲット遺伝子”および/または“フィン
ガープリント遺伝子”と称される遺伝子は、5.4 節に記載される。更に、遺伝子
産物が心臓血管病に関係する遺伝子産物と相互作用する能力を示す“パスウェイ
遺伝子”と称される遺伝子がまた5.4 節に記載される。パスウェイ遺伝子は更に
フィンガープリントおよび/またはターゲット遺伝子特性を更に有していてもよ
い。このようなフィンガープリント遺伝子、ターゲット遺伝子、およびパスウェ
イ遺伝子の同定方法が5.1 節、5.2 節、および5.3 節に記載される。
更に、このようなフィンガープリント遺伝子、ターゲット遺伝子、およびパス
ウェイ遺伝子の遺伝子産物が5.4.2 節に記載され、このような遺伝子産物の抗体
が5.4.3 節に記載され、同様に、このような遺伝子産物が寄与し得る心臓血管病
の細胞をベースとするモデルおよび動物をベースとするモデルが5.4.4 節に記載
される。
心臓血管病に関係する遺伝子の発現または遺伝子産物の活性を調節する化合物
の同定方法が5.5 節に記載される。臨床試験中の化合物の効力のモニタリング方
法が5.5.4 節に記載される。更に、心臓血管病の治療方法が5.6 節に記載される
。
また、この疾病の疾病素質を示す被験者の同定を含む、心臓血管病の予後判定
方法および診断評価方法、および心臓血管病の状態のイメージングが5.8 節に説
明される。
5.1.示差的に発現される遺伝子の同定
この節は、アテローム性動脈硬化症、虚血/再灌流、高血圧、再狭窄、および
動脈炎症を含むが、これらに限定されない、心臓血管病に関係する遺伝子の同定
方法を記載する。このような遺伝子は、正常な状態、または非心臓血管病状態に
おけるそれらの発現に対し心臓血管病状態で示差的に発現される遺伝子に相当し
得る。このような示差的に発現される遺伝子は「ターゲット」遺伝子および/ま
たは“フィンガープリント”遺伝子に相当し得る。このような示差的に発現され
る遺伝子の同定方法がこの節で以下に記載される。このような示差的に発現され
る遺伝子の更なる特性決定方法、およびターゲット遺伝子および/またはフィン
ガープリント遺伝子としてのそれらの同定方法が5.3 節に示される。
本明細書に使用される“示差的発現”は、遺伝子の時間的および/または組織
発現パターンの定量的差異並びに定性的差異の両方を表す。こうして、示差的に
発現される遺伝子は正常な状態vs心臓血管病状態(例えば、酸化LDL で処理vs未
処理)で、または対照状態vs実験状態下で活性化または完全に不活化されたその
発現を有し得る。このような定性的に調節された遺伝子は対照または心臓血管病
被験者のいずれかで検出し得るが、両方では検出し得ない所定の組織内または細
胞型内の発現パターンを示すであろう。また、このような定性的に調節された遺
伝子は、対照または実験被験者のいずれかで検出し得るが、両方では検出し得な
い所定の組織内または細胞型内の発現パターンを示すであろう。本明細書に使用
される“検出し得る”は、示差的ディスプレイ、逆転写酵素-(RT-)PCR および/
またはノーザン分析(これらは当業者に周知である)の通常の技術により検出し
得るRNA発現パターンを表す。
また、示差的に発現される遺伝子は、正常な状態vs心臓血管病状態で、または
対照状態vs実験状態下で、調節された、すなわち、定量的に増加または減少され
たその発現を有し得る。発現が正常な状態vs心臓血管病状態または対照状態vs実
験状態で異なる程度は、通常の特性決定技術、例えば、以下に記載される示差的
ディスプレイ技術により視覚化されるのに充分に大きいことのみを必要とする。
発現の差異が視覚化し得るその他のこのような通常の特性決定技術として、定量
的RT-PCRおよびノーザン分析が挙げられるが、これらに限定されない。
示差的に発現される遺伝子はターゲット遺伝子および/またはフィンガープリ
ント遺伝子として更に記載し得る。本明細書に使用される“フィンガープリント
遺伝子”は、その発現パターンが予後判定または診断の心臓血管病評価の一部と
して利用されてもよく、または心臓血管病の治療に有益な化合物の同定方法に使
用されてもよい示差的に発現される遺伝子を表す。また、フィンガープリント遺
伝子はターゲット遺伝子の特徴を有していてもよい。
本明細書に使用される“ターゲット遺伝子”は、ターゲット遺伝子発現のレベ
ルまたはターゲット遺伝子産物活性のレベルの調節が心臓血管病の症状を改善す
るように作用し得る様式で心臓血管病に関与する示差的に発現される遺伝子を表
す。また、ターゲット遺伝子はフィンガープリント遺伝子の特徴を有していても
よい。
種々の方法が心臓血管病に関係する遺伝子の同定に利用し得る。これらの方法
として、5.1.1 節に記載される実験パラダイムが挙げられるが、これに限定され
ない。パラダイムからの物質が5.1.2 節に記載される示差的に発現される遺伝子
配列の存在について特性決定され得る。
5.1.1.示差的に発現される遺伝子の同定に関するパラダイム
心臓血管病に関係する遺伝子を同定するための一つの戦略は、疾病状態vs非疾
病状態に関連する状態のもとに示差的に発現される遺伝子を検出することである
。下記の分節は、このような示差的に発現される遺伝子を検出するのに使用し得
る、パラダイムと称される、幾つかの実験系を記載する。一般に、パラダイムは
、このような疾病に関連する治療を欠いている少なくとも一つの実験対照状態に
加えて、被験者またはサンプルが心臓血管病と関連する方法で治療される、少な
くとも一つの実験状態を含む。示差的に発現される遺伝子は、実験状態と対照状
態の間で遺伝子発現のパターンを比較することにより、本明細書に以下に記載さ
れるように、検出される。
特定の遺伝子が一つのこのようなパラダイムの使用により一旦同定されると、
その発現パターンが異なるパラダイムでその発現を研究することにより更に特性
決定され得る。遺伝子は、例えば、所定のパラダイムで一つの方法(例えば、ア
ップレギュレーション)で調節されてもよいが、或る別のパラダイムで異なって
(例えば、ダウンレギュレーション)調節されてもよい。更に、異なる遺伝子が
一つのパラダイムで同様の発現パターンを有していてもよいが、それらのそれぞ
れの発現パターンが異なるパラダイムのもとで互いに異なっていてもよい。複数
のパラダイムのこのような使用は心臓血管病における特定の遺伝子の役割および
相対的重要性を区別するのに有益であるかもしれない。
5.1.1.1.泡沫細胞パラダイム−1
例えば、アテローム性動脈硬化症に関係する示差的に発現される遺伝子の同定
に利用し得るパラダイムの中に、泡沫細胞形成に関係し得る遺伝子を分析するよ
うに設計されたパラダイムがある。このようなパラダイムはこの細胞型の分化、
または酸化LDL のそれらの摂取に関係する遺伝子を同定するのに利用し得る。
このようなパラダイムの一実施態様が、以下パラダイムAと称される。最初に
、ヒト血液を採取し、末梢単球を当分野でルーチンに実施される方法により単離
する。次にこれらのヒト単球は直ちに使用してもよく、または5〜9日にわたっ
て、当分野でルーチンに実施される方法を使用して、in vitroで培養してもよく
、この場合、それらはスカベンジャー受容体のアップレギュレーションの如きマ
クロファージ様特性を発現する。次にこれらの細胞を泡沫細胞形成に関係すると
考えられる薬剤で種々の時間の長さにわたって処理する。これらの薬剤として、
酸化LDL 、アセチル化LDL 、リゾホスファチジルコリン、およびホモシステイン
が挙げられるが、これらに限定されない。処理されないか、または天然LDL で処
理された対照単球を平行して増殖させる。試験薬剤の添加後の或る時点で、細胞
を回収し、以下の5.1.2.節に詳しく記載されるようにして示差的発現について分
析する。以下の6節に示される実施例は、処理された細胞vs対照細胞中で示差的
に発現される遺伝子を同定するためのこのような泡沫細胞パラダイムの使用を詳
しく実証する。
5.1.1.2.泡沫細胞パラダイム−2
アテローム性動脈硬化症と関連する示差的に発現される遺伝子を検出するため
の単球を必要とする別のパラダイムは移行(transmigration)現象の刺激を伴う。
単球が動脈損傷に遭遇する時、それらは血管内皮層に付着し、この層を横切って
移行し、内皮と動脈を取り囲む平滑筋細胞の層の間に位置を定める。この現象は
、
例えば、ヒト臍帯から単離された内皮細胞の層を培養することによりin vitroで
模擬し得る。内皮単層が一旦形成すると、末梢血から採取された単球をLDL の存
在下および不在下で内皮の上で培養する。数時間後に、単球は内皮を通って移行
し、LDL に露出された3〜5日後に泡沫細胞に発達する。この系では、in vivo
のように、内皮細胞がLDL の酸化を行い、次にこれが単球により吸収される。以
下の5.1.2.節に記載されるように、次に遺伝子発現のパターンがこれらの泡沫細
胞と未処理単球の間で比較される。
5.1.1.3.泡沫細胞パラダイム−3
更に別の系は第三の細胞型、すなわち、アテローム発生に重要な役割を果たす
平滑筋細胞を含む(Navab ら,1988,J.Clin.Invest.,82:1853)。この系では、
ヒト大動脈平滑筋細胞の多層を天然コラーゲンのゲル層で覆われたミクロポアー
フィルター上で増殖させ、ヒト大動脈内皮細胞の単層をコラーゲン層の上で増殖
させる。走化性因子rFMLP の存在下でのヒト単球へのこの共培養物の露出は、内
皮細胞への単球付着、続いて内皮単層を横切って内皮下腔のコラーゲン層への移
行をもたらした。また、この型の培養物はLDL で処理すると泡沫細胞を生じるこ
とができる。次に泡沫細胞を回収して、遺伝子発現のそれらのパターンを5.1.2.
節に以下に説明されるように未処理細胞のパターンと比較する。
5.1.1.4.in vivo 単球パラダイム
以下パラダイムBと称される、単球の研究のためのこのようなパラダイムの別
の実施態様は、脂質消費の食事管理によるヒト被験者の示差的治療を伴う。この
ようなヒト被験者を3週間にわたって低脂肪/低コレステロール食に保ち、その
時点で血液を採取し、単球を当分野でルーチンに実施される方法に従って単離し
、RNAを以下の5.1.2.節に記載されるようにして精製する。これらの同一患者
を続いて高脂肪/高コレステロール食に切り換え、単球RNAを再度精製する。
また、患者に高脂肪/低コレステロールを含む第三の組み合わせ食を支給しても
よく、単球RNAをもう一度精製してもよい。患者が食事を受ける順序を変えて
もよい。次いで2種の食事、または3種全ての食事で管理された患者に由来する
R
NAを比較し、5.1.2.節に以下に説明するように示差的遺伝子発現について分析
することができる。
下記の7節に示される実施例は、対照食のもとでの発現に対してアテローム発
生食事で管理された患者の単球中で示差的に発現される遺伝子を同定するための
このようなin vivo 単球パラダイムの使用を実証する。また、このようなパラダ
イムは以下の7節に記載されるようにin vitro予備検出系と連係して使用されて
もよい。
5.1.1.5.内皮細胞−IL-1パラダイム
単球中の示差的遺伝子発現の検出に加えて、内皮細胞に焦点を合わせたパラダ
イムが心臓血管病に関係する遺伝子を検出するのに使用し得る。以下パラダイム
Cと称される、一つのこのようなパラダイムでは、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC
)をin vitro で増殖させる。アテローム性動脈硬化症状に関係する生理条件を
模擬するために、炎症反応に関係することが知られている因子であるヒトIL-1β
で実験培養物を処理する。また、実験HUVEC 培養物はアテローム発生性リポタン
パク質の主要リン脂質成分であるリゾホスファチジルコリンまたは酸化ヒトLDL
で処理してもよい。対照培養物はこれらの化合物の不在下で増殖させる。
露出処理の或る期間後に、実験細胞および対照細胞を回収し、以下の5.1.2.節
に記載されるように示差的遺伝子発現について分析する。以下の8節に示される
実施例は、処理細胞vs対照細胞中で示差的に発現される配列を同定するためのこ
のようなIL-1誘導内皮細胞パラダイムの使用を実証する。
5.1.1.6.内皮細胞−ずれ応力パラダイム
以下パラダイムDと称される、内皮細胞を必要とする別のパラダイムでは、培
養物を流体ずれ応力に露出するが、流体ずれ応力は異常な循環流の領域における
アテローム性動脈硬化病変の広がりの原因であると考えられる。また、異常な血
流は虚血/再灌流の有害な作用においてある役割を果たし、虚血はその障害が克
服される時に、不十分な血液供給を受けている器管が過剰に多量の血液で急激に
再灌流される。
培養HUVEC 単層は、液体培地を含む特殊装置(Nagelら,1994,J.Clin.Invest.
94: 885-891)中で培養物を回転させることにより層状ずれ応力に露出される。
同一培地中で増殖させた静的培養物が対照として利用できる。ずれ応力への露出
の或る期間後に、実験細胞および対照細胞を回収し、以下の5.1.2 節に記載され
るように示差的遺伝子発現について分析する。以下の9節に示された実施例は、
露出細胞vs対照細胞中で示差的に発現される配列を同定するためのこのようなず
れ応力を受けた内皮細胞パラダイムの使用を実証する。
5.1.1.1 節〜5.1.1.6 節に上記されたパラダイムを含むが、これらに限定され
ない、心臓血管病に関係する遺伝子を同定するために設計された全てのこのよう
なパラダイムでは、その疾病症状に対する改善作用を有することが知られている
薬剤の如き化合物が実験系に含まれてもよい。このような化合物は既知治療薬、
並びに有害な副作用のために治療薬として有用ではない化合物を含んでもよい。
5.1.1.1 節〜5.1.1.6 節に記載されたパラダイムに説明されるように培養され
る試験細胞は、例えば、これらの化合物の一つに露出され、以下の5.1.2 節に記
載される方法に従って未処理細胞に対する示差的遺伝子発現について分析されて
もよい。原理的に、特定のパラダイムに従って、その疾病に関係するあらゆる細
胞型をこれらの化合物により疾病プロセスのあらゆる段階で治療することができ
る。
また、試験細胞は、その疾病に関係しないかもしれない遺伝子発現に関する全
般的作用をスクリーニングするために、その化合物でまた治療される無関係の細
胞(例えば、繊維芽細胞)と比較されてもよい。このような全般的作用は、その
化合物による治療後に試験細胞および無関係の細胞に共通である遺伝子発現の変
化により顕在化し得る。
これらの方法により、これらの化合物が作用する遺伝子および遺伝子産物が同
定され、心臓血管病治療用の新規な治療化合物を同定するために以下に記載され
るアッセイで使用される。
5.1.2.パラダイム物質の分析
示差的に発現される遺伝子を同定するために、この節に先に記載されたような
パラダイムに利用された被験者の一つ以上の組織から全RNAまたはmRNAを
単離する。RNAサンプルは実験被験者の組織および対照被験者の相当する組織
から得られる。mRNAの単離に対して選択しないRNA単離技術はどれもこの
ようなRNAサンプルの精製に利用し得る。例えば、Sambrookら,1989,Mol-ec
ular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,N.Y.、およ
びAusubel,F.M.ら編集,1987-1993,Current Protocols in Molecular Bio-lo
gy,John Wiley&Sons,Inc.New York(これらの両方が参考として本明細書にそ
のまま含まれる)を参照のこと。更に、多数の組織サンプルが、当業者に公知の
技術、例えば、Chomczynski,P.(1989,米国特許第4,843,155号)(これが参考と
して本明細書にそのまま含まれる)の単一工程RNA単離方法を使用して容易に
処理し得る。
示差的に発現される遺伝子により産生されたRNAに相当する回収されたRN
Aサンプル中の転写産物は、当業者に公知である種々の方法を利用することによ
り同定し得る。例えば、示差的スクリーニング(Tedder,T.F.ら,1988,Proc.N
atl.Acad.Sci.USA 85:208-212)、サブトラクティブハイブリダイゼーション(He
drick,S.M.ら,1984,Nature 308:149-153; Lee,S.W.ら,1984,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 88:2825)、および、好ましくは、示差的ディスプレイ(Liang,P.、
およびPardee,A.B.,1993,米国特許第5,262,311 号(これが参考として本明細書
にそのまま含まれる))が、示差的に発現される遺伝子に由来する核酸配列を同定
するのに利用し得る。
示差的スクリーニングは、ライブラリーの一つのコピーが一つの細胞型のmR
NA集団に対応する全細胞cDNAプローブでスクリーニングされ、一方、cD
NAライブラリーの重複コピーが第二細胞型のmRNA集団に対応する全cDN
Aプローブでスクリーニングされる、cDNAライブラリーの重複スクリーニン
グを伴う。例えば、一つのcDNAプローブが対照被験者に由来する細胞型の全
細胞cDNAプローブに対応してもよく、一方、第二cDNAプローブが実験被
験者に由来する同一細胞型の全細胞cDNAプローブに対応してもよい。一つの
プローブにハイブリダイズするが、他のプローブにハイブリダイズしないクロー
ンは、対照被験者vs実験被験者の関心のある細胞型中で示差的に発現される遺伝
子に由来するクローンである可能性がある。
サブトラクティブハイブリダイゼーション技術は2種の異なる起源、例えば、
対照組織および実験組織から採取されたmRNAの単離、mRNAまたは単離さ
れたmRNAから逆転写された一本鎖cDNAのハイブリダイゼーション、およ
び全てのハイブリダイズされ、それ故、二本鎖となった配列の除去を一般に伴う
。残りのハイブリダイズされなかった、一本鎖のcDNAは、2種のmRNA起
源中で示差的に発現される遺伝子に由来するクローンである可能性がある。次に
このような一本鎖cDNAが示差的に発現される遺伝子から誘導されるクローン
を含むライブラリーの構築のために出発物質として使用される。
示差的ディスプレイ技術は、示差的に発現される遺伝子に由来する配列の同定
を可能にする公知のポリメラーゼ連鎖反応(PCR; Mullis,K.B.,1987,米国特許
第4,683,202 号に示された実験実施態様)を利用する方法を記載している。最初
に、単離されたRNAが、当業者に公知である通常の技術を利用して、一本鎖c
DNAに逆転写される。逆転写酵素反応のプライマーとして、好ましくは以下に
記載されるオリゴヌクレオチドのリバースプライマー型の、オリゴdTを含むプラ
イマーが挙げられるが、これに限定されない。次に、この技術は、所定の細胞内
に存在するRNA転写産物のランダムサブセットを提示するクローンの増幅を可
能にする、下記のPCR プライマーの対を使用する。異なる対のプライマーの利用
は、細胞中に存在するmRNA転写産物のそれぞれが増幅されることを可能にす
る。このような増幅された転写産物の中で、示差的に発現される遺伝子から生じ
た転写産物が同定され得る。
プライマー対のリバースオリゴヌクレオチドプライマーは、その5'末端に、好
ましくは11ヌクレオチドの長さの、ヌクレオチドのオリゴdTストレッチを含むこ
とができ、これがmRNAのpoly(A)テイルまたはmRNApoly(A)テイルから逆
転写されたcDNAの相補体にハイブリダイズする。第二に、リバースプライマ
ーの特異性を増大するために、プライマーはその3'末端に一つ以上、好ましくは
二つの付加的なヌクレオチドを含むことができる。統計上、対象のサンプル中に
存在するmRNA由来配列の一つのサブセットのみがこのようなプライマーにハ
イブリダイズするので、付加的なヌクレオチドはプライマーに該サンプル中に存
在するmRNA由来配列の一つのサブセットのみを増幅させる。これは、それ
が増幅された配列に相当するバンドのそれぞれのより一層状正確かつ完全な視覚
化および特性決定を可能にする点で好ましい。
フォワードプライマーは、対象の組織に由来するcDNA配列にハイブリダイ
ズする能力を有することが統計上期待されたヌクレオチド配列を含むことができ
る。そのヌクレオチド配列は任意の配列であってもよく、フォワードオリゴヌク
レオチドプライマーの長さは約9〜約13のヌクレオチドの範囲であってもよく、
約10のヌクレオチドが好ましい。任意のプライマー配列は、生成される増幅され
た部分cDNAの長さを可変にし、こうして通常の変性配列決定用ゲル電気泳動
を使用することにより異なるクローンを分離させる。
増幅産物の収率および特異性を最適化し、更に、通常のゲル電気泳動技術を利
用して分割され得る長さの増幅産物を生じるようなPCR 反応条件が選ばれるべき
である。このような反応条件は当業者に公知であり、重要な反応パラメーターと
して、例えば、先に説明されたオリゴヌクレオチドプライマーの長さおよびヌク
レオチド配列、並びにアニーリングおよび伸長工程の温度および反応時間が挙げ
られる。
2種の異なる細胞型のmRNAの逆転写および増幅から得られるクローンのパ
ターンが配列決定用ゲル電気泳動により表示され、比較される。2種のバンド形
成パターンの差異が示差的に発現される遺伝子を潜在的に示す。
示差的に発現される可能性がある遺伝子配列がバルク技術、例えば、上記の技
術により一旦同定されたら、このような推定上の示差的に発現される遺伝子の示
差的発現が確証されるべきである。確証は、例えば、ノーザン分析および/また
はRT- PCR の如き公知技術により行い得る。
確証後に、示差的に発現される遺伝子が更に特性決定されてもよく、以下の5.
3 節に説明されるようにターゲット遺伝子および/またはフィンガープリント遺
伝子として同定され得る。
また、例えば、示差的ディスプレイにより得られた示差的に発現される遺伝子
の増幅配列が、対応する遺伝子の完全長クローンを単離するのに使用されてもよ
い。遺伝子の完全長コード部分は、当分野で公知の分子生物学的技術により、過
度の実験をしないで、容易に単離し得る。例えば、単離された示差的に発現され
た増幅断片が標識され、cDNAライブラリーをスクリーニングするのに使用さ
れてもよい。また、標識断片がゲノムライブラリーをスクリーニングするのに使
用されてもよい。
また、PCR 技術が完全長cDNA配列を単離するのに利用されてもよい。この
節に上記されたように、示差的ディスプレイにより得られた単離された、増幅さ
れた遺伝子断片は遺伝子内の或るランダムな位置に5'末端を有し、また好ましく
は遺伝子の転写部分の3'末端に相当する位置に3'末端を有する。増幅断片からの
ヌクレオチド配列情報が一旦得られると、遺伝子の残部(すなわち、示差的ディ
スプレイを利用する場合には、遺伝子の5'末端)が、例えば、RT-PCRを使用して
得ることができる。
完全長遺伝子配列の同定およびクローニングのためのこのような操作の一実施
態様では、RNAが適当な組織または細胞起源から通常の操作に従って単離し得
る。次に逆転写反応が、第一鎖合成のプライミングのために、増幅断片に対応す
るmRNAに相補性のオリゴヌクレオチドプライマーを使用してRNAについて
行われてもよい。プライマーはmRNAに逆行性であるので、伸長はmRNAの
5'末端に向かって進行するであろう。次に得られるRNA/DNAハイブリッド
が、通常の末端トランスフェラーゼ反応を使用してグアニンで“テイルド(taile
d)”されてもよく、そのハイブリッドがRNAase Hで消化されてもよく、次に第二
鎖合成がpoly-Cプライマーで開始されてもよい。2種のプライマーを使用して、
遺伝子の5'部分が、PCR を使用して増幅される。次に得られた配列が単離され、
先に単離された配列で組換えられて、本発明の示差的に発現される遺伝子の完全
長cDNAを生成し得る。クローニング戦略および組換えDNA技術の総説につ
いて、例えば、Sambrookら,1989,上記文献、およびAusubel ら,1989,上記文
献を参照のこと。
5.2.パスウェイ遺伝子の同定
この節は、心臓血管病に関係する、“パスウェイ遺伝子”と称される、遺伝子
の同定方法を記載する。本明細書に使用される“パスウェイ遺伝子”は、その遺
伝子産物が心臓血管病に関係する遺伝子産物と相互作用する能力を示す遺伝子を
表す。パスウェイ遺伝子は示差的に発現され、それ故、ターゲット遺伝子および
/またはフィンガープリント遺伝子の特性を更に有し得る。
タンパク質−タンパク質相互作用を検出するのに適した方法が、心臓血管病に
関係することが知られている遺伝子産物と遺伝子産物との相互作用を同定するこ
とによりパスウェイ遺伝子産物を同定するのに使用し得る。このような既知の遺
伝子産物は細胞タンパク質または細胞外タンパク質であってもよい。このような
既知の遺伝子産物と相互作用する遺伝子産物はパスウェイ遺伝子産物に相当し、
またそれらをコードする遺伝子がパスウェイ遺伝子に相当する。
使用し得る従来の方法の中に、同時免疫沈殿、架橋および勾配カラムまたはク
ロマトグラフィーカラムによる同時精製がある。これらのような操作の利用はパ
スウェイ遺伝子産物の同定を可能にする。一旦同定されると、パスウェイ遺伝子
産物は、通常の技術と連係して、その対応するパスウェイ遺伝子を同定するのに
使用し得る。例えば、パスウェイ遺伝子産物のアミノ酸配列の少なくとも一部が
、エドマン分解技術(例えば、Creighton,1983,Proteins: Structures and Mo
lecular Principles,W.H.Fre-eman&Co.,N.Y.,34-49頁を参照のこと)による
ような当業者に公知の技術を使用して確かめられてもよい。得られたアミノ酸配
列は、パスウェイ遺伝子配列のスクリーニングに使用し得るオリゴヌクレオチド
混合物の生成のためのガイドとして使用し得る。行われるスクリーニングは、例
えば、通常のハイブリダイゼーション技術またはPCR 技術により達成し得る。オ
リゴヌクレオチド混合物の生成およびスクリーニングに関する技術は公知である
(例えば、Ausubel ら,上記文献、およびPCR Protocols: A Guide to Methods
and Applications,1990,Innis,M.ら編集,Academic Press,Inc.,New York
を参照のこと)。
更に、心臓血管病に関係するタンパク質と相互作用するタンパク質をコードす
るパスウェイ遺伝子の同時同定をもたらす方法が使用し得る。これらの方法は、
例えば、λgt11ライブラリーの抗体検索の公知技術と同様の方法でこのタンパク
質を使用して、発現ライブラリーを心臓血管病に関係することが知られ、または
示唆される標識タンパク質で検索することを含む。
in vivo でタンパク質相互作用を検出する一つのこのような方法、2ハイブリ
ッド系が、限定のためではなく、例示のみのために詳しく記載される。この系の
一つの別型が記載されており(Chien ら,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88: 9
578-9582)、Clontech(Palo Alto,CA)から市販されている。
簡単に言えば、このような系を利用して、二つのハイブリッドタンパク質をコ
ードするプラスミドが構築される。一つは既知タンパク質に融合された転写アク
チベータータンパク質のDNA結合ドメインからなり、他方がcDNAライブラ
リーの一部としてこのプラスミドに組換えられたcDNAによりコードされる未
知タンパク質に融合されたアクチベータータンパク質の活性化ドメインからなる
。プラスミドは、調節領域がアクチベーターの結合部位を含むリポーター遺伝子
(例えば、lacZ)を含む酵母サッカロミセス・セレビシアエ(Saccharomyces cer
evisiae)の株に形質転換される。いずれのハイブリッドタンパク質も単独ではリ
ポーター遺伝子、DNA結合ドメインハイブリッド(それは活性化機能を提供し
ないから)および活性化ドメインハイブリッド(それはアクチベーターの結合部
位に局在化することができないから)の転写を活性化することができない。2種
のタンパク質の相互作用は機能性アクチベータータンパク質を再構成し、リポー
ター遺伝子の発現をもたらし、これがリポーター遺伝子産物に関するアッセイに
より検出される。
2ハイブリッド系または関連方法が、既知“餌(bait)”遺伝子タンパク質と相
互作用するタンパク質について活性化ドメインライブラリーをスクリーニングす
るのに使用し得る。全ゲノム配列またはcDNA配列は、活性化ドメインをコー
ドするDNAに融合されてもよい。このようなライブラリーおよびDNA結合ド
メインに融合された餌遺伝子タンパク質のハイブリッドをコードするプラスミド
が酵母リポーター株に同時形質転換され、得られる形質転換体がリポーター遺伝
子を発現する形質転換体についてスクリーニングし得る。これらのコロニーが精
製され、リポーター遺伝子発現を担うライブラリープラスミドが単離し得る。次
にDNA配列決定が、ライブラリープラスミドによりコードされたタンパク質を
同定するのに使用し得る。
例えば、限定のためではなく、餌遺伝子は、それがGAL4タンパク質のDNA結
合ドメインをコードするDNAに翻訳融合されるようにベクターにクローン化し
得る。また、例えば、心臓血管病に関係する遺伝子の単離について、心臓血管病
にある種の役割を果たすことが知られ、または示唆されている既に単離された遺
伝子が餌遺伝子として使用し得る。これらとして、二三名を挙げると、bFGF、IG
F-I 、VEGF、IL-1、M-CSF 、TGF β、TGF α、TNF α、HB-EGF、PDGF、IFN-γ、
およびGM-CSFがあるが、これらに限定されない。
餌遺伝子と相互作用するタンパク質が検出される細胞系のcDNAライブラリ
ーが、当分野でルーチンに実施される方法を使用してつくられる。本明細書に記
載された特別な系によれば、例えば、cDNA断片が、それらがGAL4の活性化ド
メインに翻訳融合されるようにベクターに挿入し得る。このライブラリーが餌遺
伝子-GAL4 融合プラスミドとともに、GAL4活性化配列を含むプロモーターにより
誘導されたlacZ遺伝子を含む酵母株に同時形質転換し得る。餌遺伝子と相互作用
する、GAL4活性化ドメインに融合された、cDNAコードされたタンパク質が活
性GAL4タンパク質を再構成し、それによりlacZ遺伝子の発現を誘導するであろう
。lacZを発現するコロニーがX-gal の存在下でそれらの青色により検出し得る。
次にcDNAがこれらの株から精製され、当分野でルーチンに実施される技術を
使用して餌遺伝子相互作用タンパク質を生成し、単離するのに使用し得る。
パスウェイ遺伝子が同定され、一旦単離されると、それは、例えば、以下の5.
3 節に説明されるように更に特性決定し得る。
5.3.示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子の特性決定
示差的に発現される遺伝子、例えば、上記の5.1.1 節に説明された方法により
同定された遺伝子、パスウェイ遺伝子、例えば、上記の5.2 節に説明された方法
により同定された遺伝子、並びに別の手段により同定された遺伝子は、例えば、
本明細書に説明されたような方法を利用することにより更に特性決定し得る。こ
のような遺伝子が本明細書中“同定された遺伝子”と称される。
本明細書に記載された分析の如き分析が同定された遺伝子の生物学的機能に関
する情報をもたらすであろう。加えて、示差的に発現される遺伝子の生物学的機
能の評価が、ターゲット遺伝子および/またはフィンガープリント遺伝子として
のそれらの指定を可能にするであろう。詳しくは、更なる特性決定が、遺伝子の
発現の調節または遺伝子産物の活性の調節が心臓血管病を回復し得ることを示す
、示差的に発現される遺伝子のいずれかが、上記5.1 節に特定されたような“タ
ーゲット遺伝子”と指定されるであろう。このようなターゲット遺伝子およびタ
ーゲット遺伝子産物が、以下に説明されるものとともに、下記の5.5 節に説明さ
れる化合物発見戦略の焦点を構成するであろう。
更なる特性決定が、このような調節が心臓血管病に積極的に影響しないかもし
れないことを示すが、その発現パターンが、例えば、心臓血管病状態の相関関係
のある遺伝子発現“フィンガープリントパターン”に寄与する、示差的に発現さ
れる遺伝子のいずれかが、“フィンガープリント遺伝子”と指定されるであろう
。“フィンガープリントパターン”が下記の5.8 節に更に充分に説明される。タ
ーゲット遺伝子のそれぞれがまたパスウェイ遺伝子の全部またはサブセットと同
様にフィンガープリント遺伝子として機能し得ることが注目されるべきである。
パスウェイ遺伝子はまた本明細書に記載された技術の如き技術に従って特性決定
し得ることが更に注目されるべきである。パスウェイ遺伝子が示差的に発現され
ること、および遺伝子の発現の調節または遺伝子産物の活性の調節が心臓血管病
を改善し得ることを指示する情報をもたらすこれらのパスウェイ遺伝子がまた“
ターゲット遺伝子”と称される。このようなターゲット遺伝子およびターゲット
遺伝子産物は、先に説明されたものとともに、下記の5.5 節に説明される化合物
発見戦略の焦点を構成するであろう。
パスウェイ遺伝子の一つ以上の特性決定が示差的発現の欠如を明らかにし得る
が、遺伝子の活性または発現の調節が、それにもかかわらず、心臓血管病症候を
改善し得ることが更に注目されるべきである。このような場合、これらの遺伝子
および遺伝子産物がまた下記の5.5 節の化合物発見戦略の焦点と考えられるであ
ろう。 パスウェイ遺伝子の特性決定が、遺伝子発現または遺伝子産物活性の調
節が心臓血管病に積極的に影響しないかもしれないが、その発現が示差的に発現
され、これが例えば心臓血管病状態の相関関係のある遺伝子発現フィンガープリ
ントパターンに寄与する場合、このようなパスウェイ遺伝子は更にフィンガープ
リント遺伝子と称し得る。
同定された遺伝子が更に特性決定し得る技術の中で、同定された遺伝子のヌク
レオチド配列(これは当業者に公知の通常の技術を利用することにより得られて
もよい)がこのような遺伝子を更に特性決定するのに使用し得る。例えば、同定
された遺伝子の配列が、同定された遺伝子産物の生物学的機能に関する情報を生
じ得る一つ以上の既知の配列モチーフに対する相同性を明らかにし得る。
第二に、同定された遺伝子により生成されたmRNAの組織分布の分析が、当
業者に公知の通常の技術を利用して、行い得る。このような技術として、例えば
、ノーザン分析およびRT-PCRが挙げられる。このような分析は、同定された遺伝
子が心臓血管病に寄与すると予想される組織中で発現されるか否かについて情報
を与える。また、このような分析は定常状態mRNA調節に関する定量的情報を
与え、どの同定された遺伝子が、好ましくは、心臓血管病に寄与すると予想し得
る組織中の高レベルの調節を示すのかに関するデータを生じ得る。
また、このような分析は所定の組織に由来する特別な細胞型の単離された細胞
集団について行われてもよい。更に、通常のin situ ハイブリダイゼーション技
術が、所定の組織内のどの細胞が同定された遺伝子を発現するのかに関する情報
を与えるのに利用し得る。このような分析は、組織内の細胞のサブセットのみが
心臓血管病に関係すると考えられる場合に心臓血管病に対する同定された遺伝子
の生物学的機能に関する情報を与え得る。
このようなin situ ハイブリダイゼーション分析が下記の14節の実施例に記載
される。詳しくは、心臓血管病におけるrchd502 遺伝子およびrchd528 遺伝子の
役割が、平滑筋細胞およびマクロファージを含む、組織中に存在するその他の細
胞型中ではなく、ヒト心臓血管病患者から摘出された疾病組織の内皮細胞内の高
レベルのそれらの発現を特異的に検出することにより更に実証された。これらの
結果は、本明細書に記載されたパラダイム中の示差的に発現される遺伝子の検出
が心臓血管病の治療および診断に生物学的に妥当な新規な特定の標的にどのよう
にして導くのかを明らかに実証する。
第三に、同定された遺伝子の配列が、通常の技術を使用して、遺伝子を遺伝子
地図、例えば、マウス遺伝子地図(Copeland &Jenkins,1991,Trends in Gene-
tics 7:113-118)およびヒト遺伝子地図(Cohenら,1993,Nature 366: 698-701)
に入れるのに使用し得る。このようなマッピング情報が、例えば、既知の遺伝子
心臓血管病傾向がマッピングする近遺伝子領域をマッピングする遺伝子を同定す
ることによりヒト疾病に対する遺伝子の重要性に関する情報を生じ得る。
第四に、同定された遺伝子の生物学的機能が、妥当なin vivo 系およびin vi-
tro 系を利用することにより更に直接に評価し得る。in vivo 系として、心臓血
管病疾病素質を自然に示す動物系、またはapoE欠乏アテローム動脈硬化症マウス
モデル(Plumpら,1992,Cell 71: 343-353)を含むが、これに限定されない、こ
のような症候を示すように操作された動物系が挙げられるが、これらに限定され
ない。このような系が下記の5.4.4.1 節に説明される。
このようなin vivo 系の使用が下記の7節に示される実施例に詳しく記載され
、ターゲット遺伝子bcl-2 の役割を確かめる(下記の5.4.1 節中の表1を参照の
こと)。簡単に言えば、最初にbcl-2 発現がapoE欠損アテローム性動脈硬化症マ
ウスモデルでダウンレギュレーションされることが示された。次に、アテローム
発生条件下で単球泡沫細胞中で誘導されるプロモーターの制御下のヒトbcl-2 遺
伝子を有するトランスジェニックマウスが操作された。このような条件下のbcl-
2 の誘導の効果を試験するために、トランスジェニックマウスがapoE欠損マウス
と交配された。次に高度に発現性のbcl-2 遺伝子を有するapoE欠損子孫がプラー
ク形成および発育について試験される。これらの子孫におけるプラーク形成およ
び発育の低下がこのターゲット遺伝子による心臓血管病の介入の有効性を確かめ
る。
in vitro系として、心臓血管病の関係について知られており、またはその疑い
のある細胞型を含む細胞をベースとする系が挙げられるが、これらに限定されな
い。このような系が下記の5.4.4.2 節に詳しく説明される。
同定された遺伝子の生物学的機能を更に特性決定する際に、これらの遺伝子の
発現がin vivo 系および/またはin vitro系中で調節され、すなわち、過剰発現
または過小発現され、次にその系に関するその後の効果が分析し得る。また、同
定された遺伝子の産物の活性が、関係するin vivo 系および/またはin vitro系
における活性のレベルを増加または減少することにより調節され、次にその後の
効果が分析し得る。
このような特性決定により得られた情報は、関係する遺伝子を伴う心臓血管病
の治療に適した方法を示唆し得る。例えば、治療は遺伝子発現および/または遺
伝子産物活性の調節を含んでもよい。本明細書に記載された特性決定操作の如き
特性決定操作は、このような調節が関係する遺伝子または遺伝子産物の発現また
は活性の増加または減少を伴うべき場所を示し得る。
例えば、症状のもとにアップレギュレーションされる遺伝子は症状を発生また
は悪化するのに関係し得る。このような有害に発現された遺伝子の活性をダウン
レギュレーションするのに指示された治療は症状を回復するであろう。一方、症
状下の遺伝子のアップレギュレーションは冒された細胞による保護応答の一部で
あり得る。特に正常なアップレギュレーションを欠いている個体中の、このよう
なアップレギュレーションされた遺伝子産物の活性を増大または増進するのに指
示された治療は、同様に症状を回復するであろう。このような治療の方法が下記
の5.6 節に説明される。
5.4.示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子
同定された遺伝子(これらは上記5.1.1 節に同定されたような示差的に発現さ
れる遺伝子、および上記5.2 節に同定されたようなパスウェイ遺伝子を含むが、
これらに限定されない)が本明細書に記載される。詳しくは、このような同定さ
れた遺伝子の核酸配列および遺伝子産物が本明細書に記載される。更に、同定さ
れた遺伝子の産物、および同定された遺伝子が更に特性決定され、利用される細
胞をベースとするモデルおよび動物をベースとするモデルに対し誘導された抗体
がまたこの節に説明される。
5.4.1.示差的に発現される遺伝子配列およびパスウェイ遺伝子配列
本発明の示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子が下記の表1にリ
ストされる。示差的に発現される遺伝子ヌクレオチド配列およびパスウェイ遺伝
子ヌクレオチド配列が図8、12、15、18、22、28、31、および35に示される。
表1は、例えば、上記5.1.1 節、および下記の6節〜9節に示される実施例に
説明されたパラダイムにより同定された示差的に発現される遺伝子をリストする
。また、表1はこのような遺伝子の更なる特性決定に関する情報を要約する。
第一に、示差的に発現される遺伝子を検出するのに最初に使用されたパラダイ
ムが“最初の検出のパラダイム”と標題された欄の下に記載される。例えば、5.
1.1 節に記載されたパラダイム条件の一つ以上のもとに示差的に発現されること
が示された遺伝子の発現パターンが“パラダイム発現パターン”と標題された欄
の下に要約される。試験した遺伝子のそれぞれについて、使用されたパラダイム
子発現が生成されたサンプル中でアップレギュレーションされる(すなわち、検
が生成されたサンプル中でダウンレギュレーションされる(すなわち、検出可能
なmRNAの量の減少がある)ことを示す。本明細書に使用される“検出可能な
”は、例えば、当業者に周知である標準のノーザン技術および/またはRT-PCR技
術により検出可能であるmRNAのレベルをいう。
示差的発現が検出された細胞型がまた表1中で“検出された細胞型”と標題さ
れた欄の下に要約される。“染色体位置”と標題された欄は、遺伝子が位置され
るヒト染色体番号を示す。更に、遺伝子が核酸データベースに見られる配列と同
様または相同のヌクレオチド配列を含む場合、このような類似性に関する文献が
リストされる。
表1にリストされた遺伝子は、適当なcDNAまたはgDNA(ゲノムDNA
)ライブラリー内の遺伝子を検出するのに適したプローブの使用を含むが、これ
らに限定されない、当業者に周知のクローニング方法を使用して得られてもよい
(例えば、Sambrookら,1989,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold
Spring Harbor Laboratories(これが参考として本明細書にそのまま含まれる)
を参照のこと)。本明細書に報告された新規な配列のプローブは、下記の表2に
示されるような、NRRLまたはATCCに寄託された単離クローンから直接に得られて
もよい。また、新規な遺伝子のオリゴヌクレオチドプローブは図8、12、15、18
、22、28、31、および35に開示されたDNA配列に基いて合成されてもよい。こ
のような合成オリゴヌクレオチドは同様に下記の文献:Clearyら,1986,Cell 4
7:19-28(bcl-2); Takahashiら,1990,J.Biochem 108: 145-148(グルタチオンペ
ルオキシダーゼ);およびJones ら,1993,J.Biol.Chem.268: 9049-9054(プロス
タグランジンエンドペルオキサイドシンターゼII)(これらのそれぞれが本
明細書にそのまま含まれる)に記載された既に知られている遺伝子について示さ
れた配列に基いて作製し得る。
部分コード配列または非コード配列を含むクローンから得られた配列が、RACE
方法(Chenchik ら,1995,CLONTECHniques(X)1: 5-8; Barnes,1994,Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA 91: 2216-2220; およびCheng ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
91: 5695-5699)を使用することにより全コード領域を得るのに使用し得る。オリ
ゴヌクレオチドが全コード配列をコードする逆転写されたmRNAを増幅し得る
部分クローンから得られた配列に基いて設計し得る。この方法が、rchd523 遺伝
子の全コード領域を得るのに、下記の9節の実施例に記載されるように、使用さ
れた。
また、プローブは、遺伝子が転写される適当な細胞または細胞系から調製され
たcDNAライブラリーをスクリーニングするのに使用し得る。例えば、単球中
に検出された、本明細書に記載された遺伝子が、下記の7.1.1 節に記載されるよ
うに単離された単球から調製されたcDNAライブラリーからクローン化し得る
。実際に、下記の9節の実施例に詳しく記載されるように、この方法がrchd534
遺伝子の全コード領域を得るために適用された。簡単に言えば、この遺伝子のア
ップレギュレーションが、パラダイムDのもとに、ずれ応力を受けたHUVEC 中で
検出された。次に、rchd534 遺伝子の増幅された部分配列がサブクローン化され
た。次に挿入物が単離され、ずれ応力処理されたHUVEC から調製されたcDNA
ライブラリーを探査するのに使用された。全rchd534 コード領域を含むcDNA
クローンが検出され、単離され、配列決定された。
内皮細胞中で検出された、本明細書に記載された遺伝子はまたProgress in H-
emostasis and Thrombosis,3 巻,P.Spaet 編集者,Grune &Stratton Inc.,N
ew York,1-28に記載されたように単離された内皮細胞から構築されたcDNA
ライブラリーからクローン化し得る。また、遺伝子が、例えば、Takahashi ら,
1990,上記文献に従ってヒト胎盤cDNAライブラリー(Clontech Laboratories
,Palo Alto,CA)、Jones ら,1993,上記文献に記載されたHUVEC cDNAライ
ブラリー、またはClearyら,1986,上記文献に記載された急性リンパ芽球性白血
病(SUP-B2)cDNAライブラリーから回収し得る。ゲノムDNAライブラリーは
あ
らゆる供給源から調製し得る。
下記の表2は表1にリストされた新規な遺伝子の配列を含む単離されたクロー
ンをリストする。このようなクローンは、下記の6.1 節に記載されるようにTAク
ローニングベクター(Invitrogen,San Diego,CA)にサブクローン化された表示
の示差的ディスプレイバンドの増幅配列から生じた。また、それぞれのこのよう
なクローンを含む、NRRLまたはATCCに寄託された株が表2にリストされる。この
ような株は、下記の6.1 節に記載されるように、E.coli株INV αF’(Invitro-ge
n)を表示のプラスミドで形質転換することにより生産された。新規な遺伝子の全
コード領域を含むプラスミドの名称は接頭辞pFCHD を有し、またこれらのプラス
ミドを有する株の名称は接頭辞FCHDを有する。
本明細書において、「示差的に発現される遺伝子」(すなわち、ターゲットお
よびフィンガープリント遺伝子)または「パスウェイ遺伝子(pathway gene)」
とは、(a)本明細書に開示(図8、12、15、18、22、28、31、お
よび35に示すように)されるDNA配列の少なくとも1つを含有するか、また
はNRRLもしくはATCCに寄託された、表2に記載のクローン内に含有され
ている遺伝子;(b)NRRLもしくはATCCに寄託された、表2に記載のク
ローン内に含有されているか、あるいは本明細書に開示(図8、12、15、1
8、22、28、31、および35に示すように)されるか、またはNRRLも
しくはATCCに寄託された、表2に記載のクローン内に含有されている、DN
A配列が属する遺伝子のコード領域内に含有されている、本明細書に開示(図8
、12、15、18、22、28、31、および35に示すように)されるDN
A配列によりコードされるアミノ酸配列をコードする任意のDNA配列;(c)
NRRLもしくはATCCに寄託された、表2に記載のクローン内に含有されて
いるか、あるいは本明細書に開示(図8、12、15、18、22、28、31
、および35に示すように)されるか、またはNRRLもしくはATCCに寄託
された、表2に記載のクローン内に含有されている、DNA配列が属する遺伝子
のコード領域内に含有されている、本明細書に開示されているコード配列の相補
体に、高ストリンジェント条件下(例えば、0.5M NaHPO4、7%ドデ
シル硫酸ナトリウム(SDS)、1mM EDTA中で65℃でフィルター結合し
たDNAにハイブリダイゼーションし、0.1×SSC/0.1%SDS中で6
8℃で洗浄する(Ausubel F.M.ら編、1989、分子生物学の最近の方法(Current
Protocols in Molecular Biology)、Vol.I,グリーンパブリシングアソシエーツ
社(Green Publishing Associates,Inc.)、ジョン・ワイリー・アンド・サン
ズ社(John Wiley & Sons,Inc.)、ニューヨーク、第2頁10.3)でハイブ
リダイズし、表2に記載のクローン内に含有される配列によりコードされる遺伝
子産物と機能的に同等の遺伝子産物をコードする、任意のDNA配列、および/
または(d)NRRLもしくはATCCに寄託された、表2に記載のクローン内
に含有されているか、あるいは本明細書に開示(図8、12、15、18、22
、28、31、および35に示すように)されるか、またはNRRLもしくはA
TCCに寄託された、表2に記載のクローン内に含有されている、DNA配列が
属する遺伝子のコード領域内に含有されている、本明細書に開示(図8、12、
15、18、22、28、31、および35に示すように)されるコード配列の
相補体に、あまりストリンジェントでない条件下(例えば0.2×SSC/0.
1%SDSで42℃で洗浄するという中程度のストリンジェント条件下(Ausube
l ら、1989、同上)でハイブリダイズするが、機能的に同等の遺伝子産物をコー
ドする任意のDNA配列、を意味する。
本発明はまた、前節のDNA配列(a)から(c)にハイブリダイズする、従
ってその相補体である、核酸分子好ましくはDNA分子も含有する。このような
ハイブリダイゼーション条件は、前述のように高ストリンジェントであっても、
またはあまり高ストリンジェントでなくてもよい。核酸分子がデオキシヌクレオ
チド(「オリゴ」)であるとき、高ストリンジェント条件とは、例えば6×SS
C/0.05%ピロリン酸ナトリウム中で37℃(14塩基オリゴについて)、
48℃(17塩基オリゴについて)、55℃(20塩基オリゴについて)、およ
び60℃(23塩基オリゴについて)での洗浄を意味する。これらの核酸分子は
、例えばターゲット遺伝子制御に有用なターゲット遺伝子アンチセンス分子とし
て、および/またはターゲット遺伝子核酸配列の増幅反応のアンチセンスプライ
マーとして作用してもよい。さらに、このような分子は、ターゲット遺伝子制御
にも有用なリボザイムおよび/または三重らせん配列の一部として使用すること
ができる。さらに、このような分子は、診断法の成分として使用でき、ここで心
臓血管病を引き起こす対立遺伝子の存在が検出される。
本発明はまた、(a)前記コード配列の任意のものおよび/またはその相補体
(すなわち、アンチセンス)を含有するDNAベクター、(b)コード配列の発
現を指令する調節要素に機能的に結合した前記コード配列の任意のものを含有す
るDNA発現ベクター、および(c)宿主細胞中でコード配列の発現を指令する
調節要素に機能的に結合した前記コード配列の任意のものを含有する、遺伝子操
作した宿主細胞、も包含する。本明細書において、調節要素は、誘導性または非
誘導性プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよび発現を指令および制御
することが当該分野で公知の他の要素を含むが、これらに限定されない。本発明
は、本明細書に開示したDNA配列の任意のものの断片を含む。
前記の遺伝子配列以外に、例えば他の種に存在するそのような配列の相同体が
、当該分野で公知の分子生物学的方法により同定され、過度の実験をすることな
く容易に単離される。さらにこのような遺伝子産物の1つまたはそれ以上のドメ
インに対して広範な相同性を有するタンパク質をコードするゲノム内の他の遺伝
子座に遺伝子が存在するかも知れない。これらの遺伝子もまた同様の方法により
同定される。
例えば、単離された示差的に発現される遺伝子配列は標識され、目的の生物か
ら得られたmRNAから作製されたcDNAライブラリーをスクリーニングする
のに使用してもよい。cDNAライブラリーが、標識配列が得られた生物の型と
は異なる生物から得られた時、ハイブリダイゼーション条件は低ストリンジェン
トであろう。あるいは、標識断片は、再度、適度のストリンジェント条件を用い
て、目的の生物から得られたゲノムライブラリーをスクリーニングするために使
用される。このような低ストリンジェント条件は当業者に周知であり、ライブラ
リーおよび標識配列が得られた特定の生物に依存して変動するであろう。このよ
うな条件に関する指針は、例えば Sambrookら、1989、分子クローニング、実験
室マニュアル(Molecular Cloning,A Laboratory Manual)、コールド・スプリ
ング・ハーバー・プレス(Cold Spring Harbor Press)、ニューヨーク;Ausube
l F.M.ら編、1989、分子生物学の最近の方法(Current Protocols in Molecular
Biology)、グリーンパブリシングアソシエーツ・アンド・ワイリー・インタイ
ーサイエンス(Green Publishing AssociatesとWiley Interscience)、ニュー
ヨークを参照のこと。
さらに、従来は未知の示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子型配
列が、目的の遺伝子内のアミノ酸配列に基づいて設計された、2つの縮重オリゴ
ヌクレオチドプライマープールを用いてPCRを行うことにより単離される。反
応の鋳型は、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子対立遺伝子を発
現することが知られているかまたは疑われる、ヒトまたは非ヒト細胞株または組
織から調製されるmRNAの逆転写により得られるcDNAでもよい。
PCR産物は、増幅された配列が、示差的に発現される遺伝子またはパスウェ
イ遺伝子様の核酸配列の配列であることを確認するために、サブクローニングま
たは配列決定してもよい。次にPCR断片を用いて、種々の方法で全長cDNA
クローンを単離する。例えば、増幅断片を標識し、バクテリオファージcDNA
ライブラリーをスクリーニングするのに用いてもよい。あるいは標識断片を用い
て、ゲノムライブラリーをスクリーニングしてもよい。
PCR技術はまた、全長cDNA配列を単離するのに利用できる。例えば適当
な細胞または組織供給源から、標準的方法を用いてRNAが単離される。第1の
鎖の合成のプライミングのための増幅断片の最も5’末端に特異的なオリゴヌク
レオチドプライマーを用いて、RNAについて逆転写反応を行う。得られるRN
A/DNAハイブリッドを次に、標準的末端トランスフェラーゼ反応を用いてグ
アニンで「テイル」を作り、RNAaseHを用いてハイブリッドを消化し、次
にポリーCプライマーを用いて第2の鎖の合成をプライミングする。こうして、
増幅断片の上流のcDNA配列が容易に単離される。使用されるクローニング法
の総説については、Sambrookら、1989(前述)を参照のこと。
同定される示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子が正常(すなわ
ち、野生型)な場合、この遺伝子は遺伝子の突然変異対立遺伝子を単離するのに
使用される。このような単離は、遺伝的基礎を有することが知られているかまた
は疑われる過程および疾患において好適である。突然変異対立遺伝子は、心臓血
管病症状に寄与する遺伝子型を有することが知られているかまたは疑われる個人
から単離される。突然変異対立遺伝子と突然変異対立遺伝子産物は次に、後述の
治療および診断測定系に使用される。
突然変異遺伝子のcDNAは、例えば当業者に周知のPCR法を用いて単離さ
れる。この場合、第1のcDNA鎖は、突然変異対立遺伝子を有すると考えられ
る個人で発現されることが知られているかまたは疑われる組織から単離されるm
RNAに、オリゴ−dTオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、新しい鎖を
逆転写酵素を用いて伸長するることにより合成できる。次にcDNAの第2の鎖
は、正常な遺伝子の5’末端に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
を用いて合成される。次にこれらの2つのプライマーを用いて、PCRにより生
成物を増幅し、適切なベクターにクローン化させ、当業者に周知の方法によりD
NA配列解析を行う。突然変異遺伝子のDNA配列を正常な遺伝子と比較して、
突然変異遺伝子産物の機能の喪失または変化に関係する突然変異を確認すること
ができる。
あるいは、ゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーは、突然変異対立
遺伝子を有することが知られているかまたは疑われる個体の目的の遺伝子を発現
することが知られているかまたは疑われる組織から、それぞれDNAまたはRN
Aを用いて構築し、スクリーニングすることができる。正常な遺伝子またはその
適切な断片は次に、標識して、ライブラリー中の対応する突然変異対立遺伝子を
同定するためのプローブとして使用される。次にこの遺伝子を含有するクローン
を、当該分野で通常使用される方法により精製して、この節で前記したように配
列分析にかける。
さらに発現ライブラリーは、突然変異対立遺伝子を有することが疑われるかま
たは知られている個体の目的の遺伝子を発現することが知られているかまたは疑
われる組織から合成されるcDNAから単離されたDNAを用いて作製される。
こうして、推定の突然変異組織により作成した遺伝子産物を発現させ、以下の5
.4.3節で説明するように正常な遺伝子産物に対して作成した抗体とともに標
準的抗体スクリーニング法を使用してスクリーニングする。(スクリーニング法
については、Harlow,E.とLane編、1988、「抗体:実験室マニュアル(Antibodi
es: A Labratory Manual)」、コールド・スプリング・ハーバー・プレス、コー
ルド・スプリング・ハーバーを参照のこと)。突然変異により、機能が変化した
(例えば、ミスセンス突然変異の結果として)遺伝子産物が発現される場合、ポ
リクローナルな抗体のセットは、突然変異遺伝子産物と交差反応する可能性があ
る。そのような標識抗体との反応を介して検出されるライブラリークローンを精
製し、この節で前記したように配列分析にかける。
5.4.2 示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子の産物
示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子の産物には、前記5.4.
1節に記載の示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子配列によりコー
ドされるタンパク質がある。具体的には、示差的に発現される遺伝子およびパス
ウェイ遺伝子の産物は、NRRLもしくはATCCに寄託された、表2に記載の
前記クローン内に含有されているか、あるいは本明細書に開示(図8、12、1
5、18、22、28、31、および35に示すように)されるか、またはNR
RLもしくはATCCに寄託された、表2に記載のクローン内に含有されている
、DNA配列が属する遺伝子のコード領域内に含有されている、示差的に発現さ
れる遺伝子およびパスウェイ遺伝子の配列によりコードされる示差的に発現され
る遺伝子およびパスウェイ遺伝子ポリペプチドを含む。
さらに、示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子の産物は、機能的
に同等の同等の遺伝子産物であるタンパク質を含んでもよい。このような同等の
示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子の産物は、前記5.4.1節
に記載の示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子の配列によりコード
されるアミノ酸配列内のアミノ酸残基の欠失、付加または置換を有してもよいが
、サイレント変化であるため、機能的に同等の示差的に発現される遺伝子および
パスウェイ遺伝子の産物を産生する欠失、付加または置換を含有してもよい。ア
ミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および/
また
は両性に基づいて行われる。
例えば、非極性(疎水性)アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン
、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが
あり、極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チ
ロシン、アスパラギン、およびグルタミンがあり、陽性に荷電した(塩基性)ア
ミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンがあり、陰性に荷電(酸性
)したアミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸がある。本明細書にお
いて「機能的に同等である」とは、前記5.4.1節に記載の示差的に発現され
る遺伝子およびパスウェイ遺伝子の配列によりコードされる内因性の示差的に発
現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子の産物と、インビボで実質的に同様の活
性を示すことができるタンパク質を意味する。あるいは以下の5.5節に記載の
ような測定法の一部として使用される時、「機能的同等である」とは、内因性の
示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子の産物の対応する部分が相互
作用するのと実質的に同じ方法で、他の細胞性または細胞外分子と相互作用する
ことができるペプチドを意味する。
示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子の産物は、当該分野で周知
の技術を使用して組換えDNA技術により産生してよい。すなわち、示差的に発
現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子配列をコードする核酸を発現することに
より、本発明の示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子ポリペプチド
およびペプチドを調製する方法が本明細書中に記載される。示差的に発現される
遺伝子およびパスウェイ遺伝子タンパク質コード配列および適切な転写/翻訳制
御シグナルを含有する発現ベクターを作製するために、当業者に周知の方法が使
用できる。これらの方法には例えば、インビトロ組換えDNA技術、合成技術お
よびインビボ組換え/遺伝的組換えがある。例えば、Sambrookら、1989(前述)
およびAusubelら、1989(前述)を参照のこと。あるいは、示差的に発現される
遺伝子およびパスウェイ遺伝子タンパク質配列をコードすることができるRNA
は、例えば合成機を用いて化学的に合成できる。例えば、「オリゴヌクレオチド
合成(Oligonucleotide Synthesis)」、1984、Gait,J.J.編、IRLプレ
ス、オックスフォオード(これは参考のためその全体が本明細書に引用される)
を参照のこと。
本発明の示差的に発現される遺伝子およびパスウェイ遺伝子コード配列を発現
するために、種々の宿主−発現ベクター系が使用できる。このような宿主−発現
ベクター系は、目的のコード配列を産生し、次に精製するが、適切なヌクレオチ
ドコード配列で形質転換またはトランスフェクションした時には、本発明の示差
的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子タンパク質をその場で示すビヒク
ルである。これらは、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子タンパ
ク質コード配列を含有する組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA
またはコスミドDNA発現ベクターで形質転換した細菌(例えば、大腸菌(E.c
oli)、枯草菌(Bacillus subtilis))、示差的に発現される遺伝子またはパス
ウェイ遺伝子タンパク質コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転
換した酵母(例えば、サッカロミセス(Saccharomyces)、ピヒア(Pichia))
、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子タンパク質コード配列を含
有する組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)で感染させた
昆虫細胞系、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子タンパク質コー
ド配列を含有する組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイク
ウイルス(CaMV)、タバコモザイクウイルス(TMV))で感染させたか、
または組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)で形質転換し
た植物細胞系、または哺乳動物細胞(例えば、メタロチオネインプロモーター)
のゲノムまたは哺乳動物ウイルス(例えば、アデノウイルス後期プロモーター、
ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター)から得られるプロモーターを含有す
る組換え発現構築物を有する哺乳動物細胞系(例えば、COS、CHO、BHK
、293、3T3)を含むが、これらに限定されない。
細菌系では、発現される示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子タ
ンパク質の使用目的に依存して、多くの発現ベクターが有利に選択できる。例え
ば、抗体の産生のために、あるいはペプチドライブラリーをスクリーニングする
ために、このようなタンパク質を大量に産生する時、容易に精製できる融合タン
パク質産物の高レベルの発現を指令するベクターが好ましい。このようなベクタ
ーには、大腸菌(E.coli)発現ベクターpUR278(Rutherら、1983、EMBO
J.2:1791)(ここでは、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子タ
ンパク質をコードする配列は、lacZコード領域と一緒にフレーム内でベクタ
ーに個々に連結され、その結果融合タンパク質が産生される);pINベクター
(Inouye & Inouye,1985,Nucleic Acids Res.13: 3101-3109; Van Heeke & S
chuster,1989,J.Biol.Chem 264:: 5503-5509)などがあるが、これらに限定
されない。pGEXベクターも、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GS
T)との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現するために使用すること
ができる。一般的にこのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−
アガロースビーズに吸着させ、次に遊離グルタチオンの存在下で溶出することに
より、溶解した細胞から容易に精製することができる。pGEXベクターは、ク
ローン化されたターゲット遺伝子タンパク質がGST部分から放出されるように
、トロンビンまたは第Xa因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計される。
好適な実施態様において、標準的PCR法(Innisら、1990、前述)を用いて
、アミノ末端のフレーム内(in-frame)のBamHI部位とカルボキシ末端のE
coRI部位に、全長cDNA配列を追加し、pGEX−2TKベクター(ファ
ルマシア(Pharmacia)、ウプサラ(Uppsala)、スエーデン)に連結することが
できる。得られるcDNA構築物は、放射能標識のためにアミノ末端にキナーゼ
認識部位を含有し、親和性精製のためにカルボキシ末端にグルタチオン−S−ト
ランスフェラーゼ配列を有する(Nilssonら、1985、EMBO J.4: 1075;Zabeauと
Stanley,1982,EMBO J.1: 1217)。
昆虫の系では、オートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)
多角体病ウイルス(AcNPV)が、外来遺伝子を発現するためのベクターとし
て使用される。このウイルスは、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera fru
giperda)細胞中で増殖する。示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝
子コード配列は、ウイルスの非必須領域(例えば、ポリヘドリン遺伝子)に個々
にクローン化され、そしてAcNPVプロモーター(例えば、、ポリヘドリンプ
ロモーター)の制御下に置かれる。示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ
遺伝子コード配列の挿入が成功すれば、、ポリヘドリン遺伝子が不活性化され、
非閉塞組換えウイルス(すなわち、、ポリヘドリン遺伝子にコードされるタンパ
ク質性コートが欠如したウイルス)が産生される。次にこれらの組換えウイルス
は、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞を感染させる
のに使用され、そこで挿入遺伝子が発現される(例えば、Smithら、1983,J.V
irol.46: 584; Smith、米国特許第4,215,051号)。
哺乳動物宿主細胞では、多くのウイルスベースの発現系が使用される。アデノ
ウイルスが発現ベクターとして使用される時、目的の示差的に発現される遺伝子
またはパスウェイ遺伝子コード配列は、アデノウイルス転写/翻訳制御複合体(
例えば、後期プロモーターおよび三部分リーダー配列)に連結される。次にこの
キメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボ組換えによりアデノウイルスゲノム
中に挿入される。ウイルスゲノムの非必須領域(例えば、領域E1またはE3)
への挿入により、感染宿主中で生存活性がありそこで示差的に発現される遺伝子
またはパスウェイ遺伝子タンパク質を発現することができる組換えウイルスがで
きる。(例えば、LoganとShenk、1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81: 3655-3
659)。挿入された示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子コード配
列の効率的な翻訳のために具体的な開始シグナルがまた必要とされる。これらの
シグナルには、ATG開始コドンおよび隣接配列がある。示差的に発現される遺
伝子またはパスウェイ遺伝子の全遺伝子(それ自身の開始コドンと隣接配列を含
む)が適切な発現ベクターに挿入される場合、追加の翻訳制御シグナルは必要な
い。しかし、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子コード配列の一
部のみが挿入される場合、内因性翻訳制御シグナル(おそらく、ATG開始コド
ンを含む)が提供される必要がある。さらに開始コドンは、完全な挿入体の翻訳
を確認するために、開始コドンは目的のコード配列の読みとり枠と同じフェーズ
になければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天
然および合成の種々の起源のものでもよい。発現の効率は、適切な転写エンハン
サー要素、転写ターミネーターなど(Bittner ら、1987,Methods in Enzymol.1
53: 516-544)を含めることにより増強されてもよい。
好適な実施態様において、全長読みとり枠をコードするcDNA配列は、cD
NA発現がCMVプロモーターにより指令されるように、β−ガラクトシダーゼ
遺伝子を置換してpCMVβ中に連結される(Alam,1990,Anal.Biochem.188
: 245-254; MacGregorとCaskey,1989,Nucl.Acids Res.17: 2365; NortonとC
orrin,1985,Mol.Cell.Biol.5: 281)。
さらに、挿入された配列の発現を調節するか、または所望の具体的な方法で遺
伝子産物を修飾しプロセシングする、宿主細胞株が選択される。タンパク質産物
のこのような修飾(例えば、グリコシル化)やプロセシング(例えば、切断)は
、タンパク質の機能にとって重要である。異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳
後プロセシングや修飾の特徴的および特異的機構を有する。適切な細胞株または
宿主系は、発現される外来タンパク質の正しい修飾やプロセシングを確保するよ
うに選択することができる。このために、一次転写物の正しいプロセシング、遺
伝子産物のグリコシル化、およびリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細
胞が使用される。このような哺乳動物宿主細胞には、CHO、VERO、BHK
、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38などがあるが、これ
らに限定されない。
組換えタンパク質の長期、高収率産生のために安定な発現が好ましい。例えば
、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子タンパク質を安定に産生す
る細胞株が操作される。ウイルス性複製開始点を含有する発現ベクターを用いる
より、宿主細胞を、適切な発現制御要素(例えば、プロモーター、エンハンサー
、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など)および選択性マーカー
により制御されるDNAで形質転換することができる。外来DNAの導入後に、
作成した細胞は、高富化培地中で1〜2日間増殖され、次に選択培地に交換され
る。組換えプラスミド中の選択性マーカーは、選択に耐性を与え、細胞が、その
染色体中にプラスミドを安定に組み込み、増殖して増殖巣を形成させ、次にこれ
がクローン化され細胞株に拡大されることを可能にする。この方法は、示差的に
発現されるあるいはパスウェイ遺伝子タンパク質を発現する細胞株を操作するの
に有利に用いられる。このような作成した細胞株は、示差的に発現される遺伝子
またはパスウェイ遺伝子タンパク質の内因性活性に影響を与える化合物のスクリ
ーニングや評価に特に有用である。
多くの選択系が利用でき、例えば単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wi
glerら、1977,Cell 11: 223)、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトラ
ンスフェラーゼ(SzybalskaとSzybalski,1962,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 4
8: 2026)、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowyら、1980,
Cell 22: 817)遺伝子が、それぞれtk-、hgprt-またはaprt-細胞に
用いられるが、これらに限定されない。また、抗代謝物耐性が、dhfr(これ
はメトトレキセートに対する耐性を与える(Wiglerら、1980,Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 77: 3567; O'Hareら、1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1
527);gpt(これは、ミコフェノール酸に対する耐性を与える)(Mulligan
とBerg,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78: 2072);neo(これは、ア
ミノグリコシドG418に対する耐性を与える)(Colberre-Garapinら、1981,
J.Mol.Biol.150: 1);およびhygro(これは、ヒグロマイシンに対する
耐性を与える)(Santerreら、1984,Gene 30: 147)遺伝子の選択の基礎として
使用することができる。
別の融合タンパク質系は、ヒト細胞株で発現される非変性融合タンパク質の容
易な精製を可能にする(Janknechtら、1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:
8972-8976)。この系では、目的の遺伝子は、遺伝子の読みとり枠が一過性に、
6つのヒスチジン残基からなるアミノ末端タグに融合されるように、ワクシニア
組換えプラスミド中にサブクローニングされる。組換えワクシニアウイルスで感
染させた細胞の抽出物を、Ni2+ニトリロ酢酸−アガロースカラムにのせ、ヒス
チジンが付加されたタンパク質をイミダゾール含有緩衝液で選択的に溶出する。
5.5節で後述するような測定系の成分として使用される時、示差的に発現さ
れる遺伝子またはパスウェイ遺伝子タンパク質は、示差的に発現される遺伝子ま
たはパスウェイ遺伝子タンパク質と試験物質の間で形成される複合体の検出を促
進するために、直接または間接に標識される。種々の適切な標識系の任意のもの
が使用でき、例えば、125I;基質に接触させた時、検出可能な発色シグナルま
たは光を産生する酵素標識系;および蛍光標識物があるが、これらに限定されな
い。
このような測定系のために示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子
タンパク質を産生するために組換えDNA技術が使用される時、標識化、固定化
および/または検出を促進できる融合タンパク質を作成することが有利である。
間接標識化では、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子産物に特
異的に結合する、標識抗体のようなタンパク質を使用する。そのような抗体には
、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、1本鎖抗体、Fab
断片およびFab発現ライブラリーにより産生される断片があるが、これらに限
定されない。
5.4.3 示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子産物抗体
本明細書に、1つまたはそれ以上の示差的に発現される遺伝子またはパスウェ
イ遺伝子エピトープを特異的に認識することができる抗体の産生方法が記載され
る。そのような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(mAb)
、ヒト化またはキメラ抗体、1本鎖抗体、Fab断片、F(ab')2断片、Fab発
現ライブラリーから産生される断片、抗イディオタイプ(抗−Id)抗体、およ
び前記いずれかのエピトープ結合断片があるが、これらに限定されない。このよ
うな抗体は、例えば生物試料中のフィンガープリント、ターゲット、またはパス
ウェイ遺伝子の検出に用いられるか、あるいは異常ターゲット遺伝子活性の阻害
方法として使用される。すなわち、このような抗体は、心臓血管病治療法の一部
として、および/または診断法(こうして、患者は、フィンガープリント、ター
ゲット、またはパスウェイ遺伝子タンパク質の異常レベル、あるいはこのような
タンパク質の異常な型の存在の試験のために用いられる)の一部として使用され
る。
示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子に対する抗体の産生のため
に、種々の宿主動物を、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子タン
パク質またはその部分を注射して免疫する。このような宿主動物には、ウサギ、
マウス、およびラットなどがあるが、これらに限定されない。宿主の種に依存し
て、免疫応答を上昇させるために種々のアジュバントが使用できる。例えば、フ
ロイント(完全および不完全)アジュバント、水酸化アルミニウムのような鉱物
ゲル、表面活性物質(例えば、リソレシチン、プルロニックポリオール、ポリア
ニオン、ペプチド、油性エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジ
ニトロフェノール、およびBCG(bacille Calmette-Guerin)やコリネバクテ
リウム・パルブム(Corynebacterium parvum)のような有用である可能性のある
ヒトアジュバントがあるが、これらに限定されない。
好適な実施態様において、ターゲット遺伝子産物のアミノ酸配列に対応するペ
プチド配列が選択され、合成と抗体産生のためにリサーチジェネティクス(Rese
arch Genetics)(ハンツビル(Huntsville)、アラバマ州)に提出された。ペ
プチドは、記載されている(Tam,J.P.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85
: 5409-5413; Tam,J.P.,とZavala,F.,1989,J.Immunol.Methods 124: 53-6
1; Tam,J.P.,とLu,Y.A.,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86: 9084-9088
)ように修飾され、等量のフロイントアジュバントに乳化させ、ウサギの背中側
の皮下に1回の免疫当たり総量1.0ml(ペプチド0.5mg)を注射した。2
週間および6週間後ウサギに追加免疫し、4、8、および10週間目に採血した
。血液を凝固させ、遠心分離して血清を採取した。
ポリクローナル抗体は、ターゲット遺伝子産物のような抗原またはその抗原機
能のある誘導体で免疫した動物の血清から得られる抗体分子の不均一な集団であ
る。ポリクローナル抗体の産生のために、前述のような宿主動物を、これも前述
のアジュバントを補足した示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子産
物を注射して免疫する。
特定の抗原に対する抗体の均一な集団であるモノクローナル抗体は、細胞株の
連続培養により抗体分子の産生を提供する任意の方法により得られる。これらに
は、KohlerとMilstein のハイブリドーマ法(1975,Nature 256: 495-497;およ
び米国特許第4,376,110号)、ヒトB細胞ハイブリドーマ法(Kosborら
、1983,Immunolgy Today 4: 72; Coleら、1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
80: 2026-2030)、およびEBV−ハイブリドーマ法(Coleら、1985,モノクロ
ーナル抗体と癌治療(Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy)、アランア
ールリス社(Alan R.Liss,Inc.)、pp.77-96)があるが、これらに限定され
ない。このような抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgDおよびこれ
らの任意のサブクラスを含む任意の免疫グロブリンクラスである。本発明のmA
bを産生するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボで培養できる。イン
ビボでの高力価のmAbの産生は、本発明の好適な産生方法である。
さらに、適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子からの遺伝子を、適切な生
物活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子とともにスプライスすることによる、
「キメラ抗体」の産生のために開発されている方法(Morrisonら、1984,Proc.N
atl.Acad.Sci.,81: 6851-6855; Neubergerら、1984,Nature,317: 604-608;
Takedaら、1985,Nature,314: 452-454)が使用できる。キメラ抗体は、マウ
スmAb由来の可変領域とヒトの免疫グロブリン定常領域を有するような、異な
る部分が異なる動物種に由来する分子である。
あるいは、1本鎖抗体の産生について記載されている方法(米国特許第4,9
46,778号;Bird,1988,Science 242: 423-426; Hustonら、1988,Proc.N
atl.Acad.Sci.USA85: 5879-5883;およびWardら、1989,Nature 334: 544-54
6)を、示差的に発現される遺伝子またはパスウェイ遺伝子1本鎖抗体を産生
するように応用することができる。1本鎖抗体は、アミノ酸の橋を介してFv領
域の重鎖と軽鎖フラグメントを連結し、1本鎖ポリペプチドを得ることにより形
成される。
特異的エピトープを認識する抗体断片は、既知の方法により産生される。この
ような断片には例えば、抗体分子のペプシン消化により産生されるF(ab')2断片
、およびF(ab')2断片のジスルフィド架橋を還元することにより形成されるFa
b断片があるが、これらに限定されない。あるいは、所望の特異性を有するモノ
クローナルFab断片の迅速で容易な同定を可能にするように、Fab発現ライ
ブラリーが構築される(Huseら、1989,Science,246: 1275-1281)。
5.4.4 細胞ベースおよび動物ベースのモデル系
本明細書において、心臓血管病のモデルとして作用する細胞ベースおよび動物
ベースの系が記載される。これらの系は、種々の応用に使用される。例えば、細
胞ベースおよび動物ベースの系は、前記5.3節に記載したように示差的に発現
される遺伝子またはパスウェイ遺伝子をさらに性状解析するために使用される。
このようなさらなる性状解析は、例えば示差的に発現される遺伝子はターゲット
遺伝子であることを示す。第2に、そのような測定法は、以下の5.5.4節で
説明されるように、心臓血管病症状を緩和することができる化合物を同定するよ
うに設計されるスクリーニング方策の一部として使用することができる。すなわ
ち、動物ベースおよび細胞ベースのモデルは、心臓血管病の治療に有効な薬物、
医薬、治療法および介入方法を同定するのに、使用される。さらに以下の5.7
.1節で詳述されるように、そのような動物モデルは、動物被験体中のLD50お
よびED50を求めるために使用され、そしてそのようなデータは、心臓血管病治
療法の可能性のある方法のインビボの有効性を求めるために使用することができ
る。
5.4.4.1 動物ベースの系
心臓血管病の動物ベースのモデル系には、非組換え動物および作成したトラン
スジェニック動物が含まれるが、これらに限定されない。
心臓血管病の非組換え動物モデルには、例えば遺伝的モデルがある。そのよう
な遺伝的心臓血管病モデルには、例えばapoBまたはapoR欠損ブタ(Rapa
czら、1986,Science 234: 1573-1577)およびワタナベ(Watanebe)遺伝性高脂
血症(WHHL)ウサギ(Kitaら、1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84: 5928-59
31)がある。
動脈硬化の非組換え、非遺伝的動物モデルには、例えばLDLを食餌に補足す
ることによる化学的傷害、または例えばバルーンカテーテル血管形成術による機
械的傷害を受けたブタ、ウサギ、またはラットモデルがある。
さらに、心臓血管病症状を示す動物モデルは、前記5.4.1節に記載のよう
なターゲット遺伝子配列を、当業者に周知のトランスジェニック動物を産生する
技術とともに用いて、作成できる。例えば、ターゲット遺伝子配列は、目的の動
物のゲノム内に導入、およびゲノム内で過剰発現するか、あるいは内因性ターゲ
ット遺伝子配列が存在するなら、過剰発現されるかまたは、例えばマウスのap
oEの破壊について記載(Plumpら、1992,Cell 71: 343-353)されているよう
に、ターゲット遺伝子を低発現するかもしくは発現を不活性化するために破壊さ
れる。
ターゲット遺伝子配列を過剰発現させるために、ターゲット遺伝子配列のコー
ド部分を、目的の型の動物または細胞中の遺伝子発現を指令することができる制
御配列に連結してもよい。そのような制御領域は、当業者に周知であり、過度の
実験をすることなく利用できる。
そのような遺伝子操作により作成した動物ベース系の使用は、ターゲット遺伝
子bcl−2について以下の7節の実施例で詳細に説明される(前記表1、5.
4.1節を参照)。簡単に説明すると、まずbcl−2発現が、apoE欠損動
脈硬化マウスモデルでダウンレギュレーションされることが証明された。次に、
動脈硬化性条件下で誘導されるプロモーターの制御下にヒトbcl−2遺伝子を
有するトランスジェニックマウスを作成した。そのような条件下でbcl−2の
誘導の効果を試験するために、トランスジェニックマウスをapoE欠損マウス
と交配させる。次に、高度に発現可能なbcl−2遺伝子を有するapoE欠損
子孫を、プラーク形成と成長について評価した。これらの子孫のプラーク形成と
成長の低下は、このターゲット遺伝子を介して心臓血管病に介入することの有効
性を確認している。
内因性ターゲット遺伝子配列の低発現のために、そのような配列を単離し、目
的の動物のゲノムに再導入された時、内因性ターゲット遺伝子対立遺伝子が不活
性化されるように作成される。好ましくは、作成されるターゲット遺伝子配列は
、
作成されたターゲット遺伝子配列が動物のゲノム内に組み込まれると内因性標的
配列が破壊されるように、遺伝子ターゲティングにより導入される。遺伝子ター
ゲティングは、本節で後述される。
マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、マイクロブタ、ヤギ、および非
ヒト霊長類(例えば、ヒヒ、サル、およびチンパンジー)など(ただしこれらに
限定されない)の任意の種の動物を用いて、心臓血管病動物モデルを作成できる
。
トランスジェニック動物の創始系統を産生するために動物内にターゲット遺伝
子トランスジーンを導入するのに、当該分野で公知の任意の方法が利用できる。
そのような方法には、前核微量注入法(Hoppe,P.C.とWagner,T.E.,1989,米
国特許第4,873,191号);生殖系列へのレトロウイルス介在遺伝子導入
(Van der Puttenら、1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82: 6148-6152);
胚幹細胞中の遺伝子ターゲティング(Thompsonら、1989,Cell 56: 313-321);
胚の電気穿孔法(Lo,1983,Mol Cell.Biol.3: 1803-1814);および精子介在
遺伝子導入(Lavitranoら、1989,Cell 57: 717-723)などがあるが、これらに
限定されない。そのような方法の総説については、Gordon,1989,トランスジェ
ニック動物(Transgenic Animals)、Intl.Rev.Cytol.115: 171-229(これは
参考のためその全体が本明細書に引用される)を参照のこと。
本発明は、そのすべての細胞中にトランスジーンを有する動物並べにすべてで
はないが一部の細胞にトランスジーンを有する動物(すなわち、モザイク動物)
を提供する。トランスジーンは、単一のトランスジーンとしてまたはコンカタマ
ー(例えば、頭対頭縦列(head-to head tandem)もしくは頭対尾縦列(head-to
-tail tandem)として組み込まれる。トランスジーンはまた、例えばLaskoら(L
asko,M.ら、1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89: 6232-6236)の教示に従っ
て、特定の細胞型中に導入され活性化される。そのような細胞型に特異的な活性
化に必要な制御配列は、目的の特定の細胞型に依存し、当業者には公知である。
ターゲット遺伝子トランスジーンを、内因性ターゲット遺伝子の染色体部位内に
組み込みたい場合は、遺伝子ターゲティングが好ましい。簡単に説明すると、そ
のような方法が使用される時、目的の内因性ターゲット遺伝子に相同的ないくつ
かのヌクレオチド配列を含有するベクターが、染色体配列との相同的組換えを介
して、内因性ターゲット遺伝子のヌクレオチド配列の中に組み込まれ、その機能
を破壊することを目的として設計される。トランスジーンはまた、特定の細胞型
に選択的に導入され、こうして、例えばGuら(Guら、1994,Science 265: 103-1
06)の教示に従って、その細胞型のみの目的の内因性遺伝子を不活性化する。そ
のような細胞型特異的不活性化に必要な制御配列は、目的の特定の細胞型に依存
し、当業者に公知である。ターゲット遺伝子を発現するための組換え法は、前記
5.4.2節に記載されている。
トランスジェニック動物がいったん作成されると、標準的方法を用いて組換え
ターゲット遺伝子およびタンパク質の発現が測定される。最初のスクリーニング
は、サザンブロット解析またはPCR法により行って、動物組織を解析し、トラ
ンスジーンの組み込みが起きた否かを測定することができる。トランスジェニッ
ク動物の組織中のトランスジーンのmRNA発現レベルはまた、動物から得られ
る組織試料のノーザンブロット解析、in situハイブリダイゼーション解
析、およびRT−PCRなどの方法(しかし、これらに限定されない)でも測定
できる。ターゲット遺伝子発現組織の試料はまた、目的のターゲット遺伝子トラ
ンスジーン産物に特異的な抗体を用いて免疫組織化学的に評価される。
容易に検出可能なレベルでターゲット遺伝子mRNAまたはターゲット遺伝子
トランスジーンペプチド(ターゲット遺伝子産物のエピトープに対して作成され
た抗体を用いて免疫組織化学的に検出される)を発現するターゲット遺伝子トラ
ンスジェニック動物は、次にさらに評価して特徴的な心臓血管病症状を示す動物
を同定する。そのような症状には、例えば脂肪の縞および/または心臓血管病班
の数やサイズの増加がある。
さらにトランスジェニック動物内の特異的細胞型を解析し、心臓血管病に特徴
的な細胞表現型について測定する。単核細胞の場合は、そのような表現型には、
LDL摂取率、内皮細胞への接着、遊出、泡沫細胞形成、脂肪縞形成、泡沫細胞
特異的産物の産生の増加があるが、これらに限定されない。細胞表現型測定法は
、以下の5.4.4.2節で詳述される。さらに、そのような細胞表現型は、心
臓血管病症状を示す動物での特定の細胞型の既知のフィンガープリント発現プロ
フィールに比較して、特定の細胞型のフィンガープリントパターンの発現を含ん
でもよい。フィンガープリントプロフィールは、以下の5.8.1節で詳述され
る。そのようなトランスジェニック動物は、心臓血管病の適切なモデル系になる
。
ターゲット遺伝子トランスジェニック創始動物がいったん産生されると、これ
らは育種、同系交配、異系交配、または交雑して特定の動物のコロニーが産生さ
れる。このような育種の例には、創始動物を2つ以上の組み込み部位で異系交配
して別の系統を樹立すること、別の系統を同系交配して、各ターゲット遺伝子ト
ランスジーンの付加的発現の作用のために、より高レベルで目的のターゲット遺
伝子トランスジーンを発現する複合ターゲット遺伝子トランスジェニック体を産
生すること、異型接合トランスジェニック動物を交配させて、特定の組み込み部
位で同型接合である動物を産生させて、発現を増強することおよびDNA解析で
動物をスクリーニングする必要性をなくすこと、別の同系接合系統を交配させて
、複合異型接合または同型接合系統を産生させること、動物を異なる近交系遺伝
的バックグランドに品種改良してターゲット遺伝子トランスジーンの発現および
心臓血管病症状の進展に及ぼす対立遺伝子修飾の影響を調べることがあるが、こ
れらに限定されない。そのような方法の1つは、ターゲット遺伝子トランスジェ
ニック創始動物を野生株と交配させて、心臓血管病症状を示すF1世代を産生す
ることである。次に同型接合ターゲット遺伝子トランスジェニック動物が生存活
性を有することがわかれば、F1世代を同系交配して同型接合系統を出現させる
。
5.4.4.2 細胞ベースの測定法
ターゲット遺伝子タンパク質をコードし、さらに心臓血管病に関連した細胞表
現型を示すターゲット遺伝子配列を含有し発現する細胞は、抗心臓血管病活性を
示す化合物を同定するのに利用される。
そのような細胞は、非組換え単核細胞株、例えばU937(ATCC#CRL
−1593)、THP−1(ATCC#TIB−202)、およびP388D1
(ATCC#TIB−63);内皮細胞、例えばHUVECおよびウシ大動脈内
皮細胞(BAEC);並びに一般的哺乳動物細胞株、例えばHeLa細胞および
COS細胞、例えばCOS−7(ATCC#−1651)がある。さらにそのよ
うな細胞には、組換えトランスジェニック細胞株がある。例えば、前記5.4.
4.1節で考察した本発明の心臓血管病動物モデルは、心臓血管病の細胞培養モ
デルとして使用できる、心臓血管病に関与する1つまたはそれ以上の細胞型を含
有する、細胞株を産生するために使用される。本発明の心臓血管病トランスジェ
ニック動物から得られる初代培養物が利用できるが、連続細胞株の産生が好まし
い。トランスジェニック動物から連続細胞株を得るために使用される方法の例に
ついては、Smallら、1985,Mol.Cell Biol.5: 642-648を参照。
あるいは、心臓血管病に関与することが知られている細胞型の細胞を、細胞内
のターゲット遺伝子発現の量を増加または低下させることができる配列でトラン
スフェクションしてもよい。例えば、ターゲット遺伝子配列は、目的の細胞のゲ
ノム内に導入され過剰発現されるか、またはもし内因性ターゲット遺伝子配列が
存在するなら、これらは過剰発現されるかまたは破壊されてターゲット遺伝子を
低発現または発現を不活性化する。
ターゲット遺伝子配列を過剰発現するために、ターゲット遺伝子配列のコード
部分を、目的の細胞型中で遺伝子発現を指令することができる制御配列に連結す
る。そのような制御配列は当業者に周知であり、過度の実験をすることなく利用
できる。ターゲット遺伝子を発現するための組換え法は、前記5.4.2節に記
載されている。
内因性ターゲット遺伝子配列の低発現のために、そのような配列は単離され、
目的の細胞型のゲノムに再導入される時、内因性ターゲット遺伝子対立遺伝子が
不活性化されるように作成される。好ましくは作成されるターゲット遺伝子配列
は、作成されたターゲット遺伝子配列が細胞のゲノムに組み込まれた時、内因性
標的配列が破壊されるように、遺伝子ターゲティングにより導入される。ターゲ
ット遺伝子を用いる宿主細胞のトランスフェクション法は、前記5.4.4.1
節に記載される。
化合物で処理される細胞またはターゲット遺伝子でトランスフェクションされ
る細胞を、心臓血管病に関連した表現型について調べることができる。単核細胞
の場合は、そのような表現型は、LDL摂取率、内皮細胞への接着、遊出、泡沫
細胞形成、脂肪縞形成、泡沫細胞によるbFGF、IGF−I、VEGF、IL
−I、M−CSF、TGFβ、TGFα、TNFα、HB−EGF、PDGF、
IFN−γ、およびGM−CSFのような成長因子の産生の増加があるが、これ
らに限定されない。例えば、遊出速度は、前記5.1.1.3節に記載のNavab
らのインビトロの系を用いて、内皮単層を通過して移動し内皮下スペースのコラ
ーゲン層に入る単核細胞の数を定量することにより、測定される。
同様に、HUVECは、試験化合物で処理できるか、または前記5.4.2節
に記載の遺伝子操作したターゲット遺伝子によりトランスフェクションできる。
次にHUVECは、心臓血管病に関連する表現型、例えば細胞形態、細胞増殖、
細胞遊走、および単核細胞接着など(ただし、これらに限定されない)、または
心臓血管病に関与する他のタンパク質(例えば、ICAM、VCAM、PDGF
−β、およびE−セレクチン)の産生に及ぼす作用について、試験される。
ターゲット遺伝子配列核酸のトランスフェクションは、標準的方法を使用して
行われる。例えば、Ausubelら、1989(前述)を参照のこと。トランスフェクシ
ョンされた細胞は、組換えターゲット遺伝子配列の有無、ターゲット遺伝子mR
NAの発現と蓄積、および組換えターゲット遺伝子タンパク質産生があることに
ついて評価される。ターゲット遺伝子発現の減少が好ましい場合、標準的方法を
使用して内因性ターゲット遺伝子発現および/またはターゲット遺伝子産物の産
生の減少が達成されるかどうかを証明する。
5.5 ターゲット遺伝子産物と相互作用する化合物のスクリーニング測定法
ターゲット遺伝子産物に結合する化合物、ターゲット遺伝子産物と相互作用す
る他の細胞性または細胞外タンパク質に結合する化合物、およびターゲット遺伝
子産物と他の細胞性または細胞外タンパク質との相互作用を妨害する化合物を同
定するために以下の測定法が設計される。例えば、膜貫通受容体型タンパク質で
あるrchd523遺伝子産物の場合は、そのような方法によりそのような受容
体のリガンドが同定できる。rchd523アップレギュレーションが内皮細胞
に特異的であれば、rchd523遺伝子産物リガンドは、例えば動脈硬化、虚
血/再潅流、高血圧、再狭窄、および動脈炎症のような心臓血管病の緩和の基礎
として作用する。そのような化合物には、ペプチド、抗体または小さい有機もし
くは無機化合物があるが、これらに限定されない。このような化合物の同定方法
は、以下の5.5.1節で説明される。このような化合物には、他の細胞性タン
パク質もある。このような細胞性タンパク質の同定方法は、以下の5.5.2節
で説明される。
本明細書に記載のような測定法により同定される化合物は、例えばターゲット
遺伝子産物の生物学的機能を調べたり、心臓血管病の緩和に有用である。心臓血
管病の状態がターゲット遺伝子発現の総合的な低レベルおよび/または細胞また
は組織でのターゲット遺伝子産物の総合的な低レベルに起因する場合は、ターゲ
ット遺伝子産物と相互作用する化合物は、結合したターゲット遺伝子タンパク質
の活性を強調もしくは増幅する化合物を含んでよい。このような化合物は、ター
ゲット遺伝子産物活性のレベルを有効に上昇させ、こうして症状を緩和する。
ある場合には、病気の状態によりアップレギュレーションされていることが観
察されるターゲット遺伝子は、保護作用を示しているかも知れない。このような
アップレギュレーション遺伝子の発現、またはその遺伝子産物の活性を増強する
化合物はまた、特にターゲット遺伝子が正常な場合にはアップレギュレーション
されない個体で、症状を緩和するであろう。
他の場合には、ターゲット遺伝子内の突然変異は、ターゲット遺伝子タンパク
質の異常な型もしくは過剰量の産生を引き起こし、これは有害作用を引き起こし
心臓血管病をもたらす。同様に生理学的条件が、ターゲット遺伝子発現の過剰な
上昇を引き起こし、心臓血管病をもたらすことがある。このような場合は、結合
したターゲット遺伝子タンパク質の活性を阻害する、ターゲット遺伝子タンパク
質に結合する化合物が同定される。例えばこの節で説明したような方法により同
定される化合物の有効性を試験するための測定法は、5.5.4節で考察される
。
5.5.1.ターゲット遺伝子産物に結合する化合物のインビトロスクリーニン グ測定法
本発明のターゲット遺伝子に結合することができる化合物を同定するために、
インビトロの系を設計することができる。このような化合物は、D−および/ま
たはL−立体配置のアミノ酸から作られるペプチド(例えば、ランダムペプチド
ライブラリーの形で;例えば、Lam,K.S.ら,1991,Nature 354: 82-84を参照の
こと)、ホスホペプチド(例えば、ランダムまたは部分縮重指向性ホスホペプチ
ドライブラリー(partially degenerate,directed phosphopeptide libraries)
の形で;例えば、Songyang,Z.ら,1993,Cell 72: 767-778を参照のこと)、抗
体、および有機または無機低分子を含むが、これらに限定されない。同定される
化合物は、例えば、ターゲット遺伝子タンパク質、好ましくは突然変異ターゲッ
ト遺伝子タンパク質の活性を調節するのに有用であるか、ターゲット遺伝子タン
パク質の生物学的機能を調べるのに有用であるか、正常なターゲット遺伝子相互
作用を破壊する化合物を同定するためのスクリーニングにおいて利用することが
できるか、またはこれら自体がこのような相互作用を妨害しうる。
ターゲット遺伝子タンパク質に結合する化合物を同定するために使用される測
定法の原理は、ターゲット遺伝子タンパク質と試験化合物の2つの成分が相互作
用し結合することが可能な条件下で、かつそのための十分な時間、この2つの成
分の反応混合物を調製して、そして反応混合物中で除去および/または検出する
ことができる複合体を形成することを含む。これらの測定法は、種々の方法で行
うことができる。例えば、このような測定を行うための1つの方法では、固相に
ターゲット遺伝子または試験物質を固定し、固相に固定されたターゲット遺伝子
/試験物質複合体を反応の最後に検出する。このような方法の1つの実施態様に
おいて、ターゲット遺伝子タンパク質は固相表面に固定され、固定されない試験
化合物が、直接または間接に標識される。
実際、マイクロタイタープレートの利用が便利である。固定される成分は、非
共有または共有結合により固定化される。非共有結合は、単に、タンパク質の溶
液で固相表面をコーティングして乾燥することにより行うことができる。あるい
は、タンパク質に特異的な固定化抗体、好ましくはモノクローナル抗体を使用し
て、タンパク質を固相表面に固定する。表面は、前もって調製して保存すること
ができる。
測定を行うために、固定された成分を含有するコーティングされた表面に非固
定化成分を添加する。反応終了後、形成した複合体が固相表面に固定化されて残
る条件下で、未反応成分を除去(例えば、洗浄により)する。固相表面に固定さ
れた複合体の検出は、多くの方法で行うことができる。非固定化成分を前もって
標識してある場合、表面上に固定化された標識の検出は、複合体が形成されたこ
とを示している。非固定化成分を前もって標識しない場合、表面に固定された複
合体を検出するために、間接的標識を使用することができる。例えば、非固定化
成分に特異的な標識抗体を使用する(抗体は、次に標識抗Ig抗体で直接標識ま
たは間接標識されてよい)。
あるいは、反応を液相で行い、反応生成物を未反応成分から分離し、そして複
合体を検出することができる(例えば、溶液中で形成された複合体を固定するた
めのターゲット遺伝子産物または試験化合物に特異的な固定化抗体、および固定
された複合体を検出するための可能な複合体の他の成分に特異的な標識抗体を使
用する)。
前記方法の1つにより特定のターゲット遺伝子産物に結合することが示される
化合物は、さらに、ターゲット遺伝子タンパク質からの生物化学的応答を誘発す
るその能力について試験することができる。rchd523遺伝子産物を含む(
しかし、これに限定されない)シグナル伝達に関与する受容体タンパク質につい
てのある実施態様を、本明細書に記載する。ターゲット遺伝子産物受容体ドメイ
ンと相互作用する化合物は、リガンドとして機能する(すなわち、シグナル伝達
経路を開始させるように、受容体タンパク質に結合する)その能力についてスク
リーニングすることができる。本発明の有用な受容体断片または類似体は、リガ
ンドと相互作用するものである。受容体成分は、機能的に(すなわち、リガンド
に結合し、Ca++を移動するその能力に関して)測定することができる(下記を
参照のこと)。これらの測定は、成分として、結合の検出を可能にする配置の、
リガンドと組換えターゲット遺伝子産物(または適切な断片若しくは類似体)を
含む。
例えば、組換え受容体は、カルシウムのリガンド依存性の移動を媒介するその
能力により、リガンドのスクリーニングのために使用することができるが、これ
に限定されない。ターゲット遺伝子発現ベクター(前記5.4.2節に記載され
た方法により構築される)でトランスフェクションされた細胞、好ましくはミエ
ローマ細胞若しくはアフリカツメガエル卵母細胞は、標準法によりFURA−2
またはINDO−1を付加する。リガンドにより誘導されるCa2+の移動は、す
でに報告(Grynkiewiczら,1985,J.Biol.Chem.260: 3440)されたように蛍
光分光法により測定される。したがってターゲット遺伝子産物の受容体ドメイン
と反応するリガンドは、蛍光シグナルを生成する能力により同定することができ
る。これらの受容体結合活性は、バックグラウンド以上の生成する蛍光のレベル
を測定することにより定量し比較することができる。
rchd523遺伝子産物は、複数の膜貫通ドメインを有するGタンパク結合
受容体よりなる。したがってCa2+移動測定は、rchd523受容体のリガン
ドである化合物をスクリーニングするために使用することができる。このスクリ
ーニング法は、rchd523に関して下記12節の実施例に詳細に記載される
。rchd523リガンドの同定、およびリガンド−受容体複合体の活性の測定
により、下記5.5.3節に記載されるように、この相互作用のアンタゴニスト
を
同定することができる。このようなアンタゴニストは、心臓血管病の治療に有用
である。
5.5.2.ターゲット遺伝子産物と相互作用する細胞性または細胞外タンパク 質の測定
タンパク質−タンパク質相互作用を検出するのに適切な任意の方法を使用して
、新規な標的タンパク質−細胞性または細胞外タンパク質相互作用を同定するこ
とができる。これらの方法は、パスウェイ遺伝子の同定に関して上記5.2.節
に略述されており、そして同定された標的タンパク質と相互作用するタンパク質
の同定に関して本明細書において利用することができる。このような場合に、タ
ーゲット遺伝子は、既知の「餌(bait)」遺伝子として働く。
5.5.3.ターゲット遺伝子産物と他の化合物との間の相互作用を妨害する化 合物の測定
本発明のターゲット遺伝子タンパク質は、インビボで、1つまたはそれ以上の
細胞性または細胞外タンパク質と相互作用しうる。このようなタンパク質は、上
記5.5.2.節に記載されたような方法により同定されるタンパク質を含むが
、これらに限定されない。この考察のために、ターゲット遺伝子産物とこのよう
な細胞性および細胞外タンパク質は、本明細書では「結合パートナー」と呼ぶ。
そのような相互作用を破壊する化合物は、ターゲット遺伝子タンパク質、特に突
然変異ターゲット遺伝子タンパク質の活性を調節するのに有用である。このよう
な化合物は、前記5.5.1.節に記載される、抗体、ペプチドなどのような分
子を含むが、これらに限定されない。
ターゲット遺伝子タンパク質と、その細胞性または細胞外タンパク質結合パー
トナーとの間の相互作用を妨害する化合物を同定するために使用される測定系の
基本的原理は、ターゲット遺伝子タンパク質と結合パートナーが相互作用し結合
することが可能な条件下で、かつそのための十分な時間で、この2つのタンパク
質を含有する反応混合物を調製して、複合体を形成する。阻害活性について化合
物を試験するために、反応混合物は、試験化合物の存在下および非存在下で調製
する。試験化合物は、最初に反応混合物に含ませるか、またはターゲット遺伝子
およびその細胞性または細胞外結合パートナーの添加後に添加してもよい。対照
の反応混合物は、試験化合物なしで、またはプラセボと共にインキュベートする
。
次に、ターゲット遺伝子タンパク質と、細胞性または細胞外結合パートナーとの
間の複合体の形成が検出される。対照反応において複合体の形成があるが、試験
化合物を含有する反応混合物ではそれがないということは、その化合物が、ター
ゲット遺伝子タンパク質とその相互作用性結合パートナータンパク質との相互作
用を妨害していることを示している。さらに、試験化合物と正常なターゲット遺
伝子タンパク質を含有する反応混合物内での複合体形成はまた、試験化合物と突
然変異ターゲット遺伝子タンパク質を含有する反応混合物内での複合体形成と比
較することができる。この比較は、突然変異ターゲット遺伝子タンパク質の相互
作用は妨害するが、正常なターゲット遺伝子タンパク質のそれは妨害しない化合
物を同定することを目的とする場合には重要であろう。
結合パートナーの相互作用を妨害する化合物の測定は、不均一系または均一系
で行うことができる。不均一系測定は、結合パートナーの1つを固相に固定し、
反応の最後に固相に固定されている複合体を検出することを含む。均一系測定で
は、全反応は液相で行われる。いずれのアプローチにおいても、反応物の添加の
順番は、試験化合物に関する異なる情報を得るために変化させてよい。例えば、
結合パートナーの間の相互作用を、例えば競合により妨害する試験化合物は、試
験物質の存在下で反応を行うことにより(すなわち、試験物質を、ターゲット遺
伝子タンパク質と相互作用性細胞性または細胞外タンパク質の前またはこれらと
同時に反応混合物に添加することにより)同定することができる。あるいは、前
もって形成された複合体を破壊する試験化合物(例えば、複合体から結合パート
ナーの1つを置き換える高い結合定数を有する化合物)は、複合体形成後に反応
混合物に試験化合物を添加することにより試験することができる。種々の測定法
を以下に簡単に記載する。
不均一測定系においては、ターゲット遺伝子タンパク質または相互作用性細胞
性あるいは細胞外結合パートナータンパク質のいずれかを固相表面に固定して、
そして固定していないその結合パートナーを、直接的または間接的に標識する。
実際、マイクロタイタープレートの利用が便利である。固定される分子種は、非
共有または共有結合により固定化することができる。非共有結合は、単に、タン
パク質の溶液で固相表面をコーティングして乾燥することにより行うことができ
る。あるいは、タンパク質に特異的な固定化抗体を使用して、タンパク質を固相
表面に固定することができる。表面は、前もって調製して保存することができる
。
測定を行うために、固定化された分子種の結合パートナーを、試験化合物の存
在下または非存在下で、コーティングした表面に暴露する。反応終了後、未反応
成分を除去(例えば、洗浄により)すると、形成した複合体は固相表面に固定化
されて残る。固相表面に固定された複合体の検出は、多くの方法で行うことがで
きる。結合パートナーが前もって標識されていた場合、表面上に固定化された標
識の検出は、複合体の形成を示している。結合パートナーが前もって標識されて
いなかった場合、表面に固定された複合体を検出するために間接標識を使用する
ことができる。例えば、結合パートナーに特異的な標識抗体を使用する(抗体は
、次に標識抗Ig抗体で直接標識または間接標識されてよい)。反応成分の添加
の順番に応じて、複合体形成を阻害するかまたは前もって形成された複合体を破
壊する試験化合物を検出することができる。
あるいは反応は、試験化合物、未反応物成分から分離された反応物生成物、お
よび検出される複合体の存在下または非存在下で液相で行うことができる(例え
ば、溶液中で形成した複合体を固定するための1つの結合パートナーに特異的な
固定化抗体、および固定された複合体を検出するための、もう1つの結合パート
ナーに特異的な標識抗体を使用する)。ここでも再度、液相への反応物の添加の
順番に応じて、複合体を阻害するかまたは前もって形成された複合体を破壊する
試験化合物を同定することができる。
本発明の別の実施態様において、均一測定法を使用することができる。この方
法では、ターゲット遺伝子タンパク質と、相互作用性の細胞性または細胞外タン
パク質との前もって形成される複合体は、結合パートナーの1つが標識されて調
製されるが、標識により生成するシグナルは、複合体形成により消失する(例え
ば、このアプローチを免疫測定法に利用している、Rubensteinの米国特許第4,
109,496号を参照のこと)。前もって形成された複合体からの結合パート
ナーの1つに競合してこれを置き換える試験物質の添加により、バックグラウン
ド以上のシグナルの生成が起こる。このように、ターゲット遺伝子タンパク質−
細胞性または細胞外タンパク質の相互作用を破壊する試験物質を同定することが
できる。
ある実施態様において、ターゲット遺伝子タンパク質は、前記5.4.2節に
記載された組換えDNA技術を使用して固定化のために調製することができる。
例えば、ターゲット遺伝子コード領域は、pGEX−5X−1のような融合ベク
ターを使用して、生じた融合タンパク質中でその結合活性が維持されるように、
グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)遺伝子に融合することができ
る。相互作用性細胞性または細胞外タンパク質は、当該分野で通常行われ上記5
.4.3節に記載した方法を使用して、精製し、かつモノクローナル抗体を作成
するために使用することができる。この抗体は、例えば、放射性同位体125Iを
用いて、当該分野で通常行われる方法により標識することができる。
不均一アッセイでは、例えばGST−ターゲット遺伝子融合タンパク質をグル
タチオン−アガロースビーズに付着させることができる。次に、相互作用的細胞
性又は細胞外結合パートナータンパク質を、相互作用と結合とが起きるような方
法で、試験化合物の存在下又は不在下に加える。反応期間の終わりに、未結合物
質を洗い流し、標識モノクローナル抗体を系に加えて複合体を形成した結合パー
トナーと結合させる。ターゲット遺伝子タンパク質と相互作用的細胞性又は細胞
外結合パートナータンパク質との間の相互作用は、グルタチオン−アガロースビ
ーズと会合したままの状態である放射能量を測定することにより検出できる。試
験化合物によって相互作用がうまく阻害された場合には、測定放射能が減少する
。
あるいは、GST−ターゲット遺伝子融合タンパク質と、相互作用的細胞性又
は細胞外結合パートナータンパク質とを、固体グルタチオン−アガロースビーズ
の不在下に、液体中で混合することができる。結合パートナー間で相互作用が起
きる間又はその後に、試験化合物を加える。この混合物を次にグルタチオン−ア
ガロースビーズに加えて、未結合物質を洗い流す。ここでも、結合パートナー相
互作用の阻害の程度は、標識抗体を加えてビーズと会合した放射能を測定するこ
とにより検出できる。
本発明の別の態様では、ターゲット遺伝子タンパク質及び相互作用的細胞性又
は細胞外タンパク質の一方又は両方の全長タンパク質に代えて、これらのタンパ
ク質の結合ドメインにそれぞれに対応するペプチド断片を用いて同じ方法を行う
ことができる。当業界で日常的に実施されているあらゆる方法を用いてタンパク
質の結合部位を同定し単離することができる。これらの方法は、タンパク質をコ
ードする遺伝子の一つを突然変異誘発し、共免疫沈降アッセイで結合の破壊をス
クリーニングすることを含むが、これに限定されない。ターゲット遺伝子中の代
償性突然変異を選択することができる。それぞれのタンパク質をコードする遺伝
子の配列分析により、相互作用的結合に関与するタンパク質の領域に対応する突
然変異が明らかになるであろう。あるいは、上記の節で記載した方法を用いて、
一つのタンパク質を固体表面に付着させ、トリプシンなどのタンパク質分解酵素
で処理したその標識結合パートナーと相互作用させ結合させる。洗浄後に、結合
ドメインを含む短い標識ペプチドが固体物質と会合したまま残るので、これを単
離しアミノ酸配列決定により同定する。また、細胞性又は細胞外タンパク質をコ
ードする遺伝子がいったん得られると、短い遺伝子セグメントを遺伝子操作して
このタンパク質のペプチド断片を発現させることができ、次いでこの結合活性を
試験し、精製又は合成することができる。
これに限定するものではないが、例えば、GST−ターゲット遺伝子融合タン
パク質を作製し、これをグルタチオンアガロースビーズに結合させることによっ
て、この節で上述したように固体物質にターゲット遺伝子を付着させることがで
きる。相互作用的細胞性又は細胞外結合パートナータンパク質を35Sなどの放射
性同位体で標識し、トリプシンなどのタンパク質分解酵素で切断することができ
る。次に切断産物を、付着させたGST−ターゲット遺伝子融合タンパク質に加
えて結合させる。未結合ペプチドを洗い流した後、細胞性又は細胞外結合パート
ナータンパク質結合ドメインを表す標識された結合物質を溶出、精製し、当業者
に公知の方法、例えばエドマン分解法(例えば、Creighton,1983,Proteins: S
tructures and Molecular Principles,W.H.Freeman & Co.,N.Y.,pp.34-49参
照)によってアミノ酸配列を分析する。このようにして同定されたペプチドは、
合成法(例えば、Creighton,1983,前出,pp.50-60参照)又は、もしも遺伝子が
既に単離されているのであれば、5.4.2節で上述したような組換えDNA法
等の当業者に公知の方法を用いて製造することができる。
本発明の特定の態様は、リガンドと、rchd523遺伝子産物の受容体ドメ
インを含む(ただし、これに限定されない)ターゲット遺伝子産物の受容体ドメ
インとの間の相互作用に拮抗する能力をもつ候補化合物をスクリーニングする方
法を特徴とする。複数の膜貫通ドメインを含むGタンパク質と結合した受容体で
あるrchd523遺伝子産物は、リガンド−受容体相互作用のアンタゴニスト
をスクリーニングするのに特に有用である。この方法は、a)候補アンタゴニス
ト化合物を、受容体ドメインを含む組換えターゲット遺伝子産物(又はリガンド
結合性断片又は類似体)を含む第1化合物と一方で混合し、またリガンドを含む
第2化合物と他方で混合し;b)第1化合物と第2化合物が結合するかどうかを
決定し;そしてc)第1化合物の第2化合物への結合を妨げるか、及び/又はリ
ガンドに媒介される細胞内Ca++の放出を低下する化合物としてアンタゴニスト
化合物を同定する、ことを含んでなる。
”アンタゴニスト”の語は、特定の活性、この場合では、リガンドがターゲッ
ト遺伝子産物受容体ドメインと相互作用する能力及び/又はこのような相互作用
の結果生じる生物学的事象(例えば、細胞内Ca++の放出)を引き起こす能力、
を阻害するような分子を意味する。好ましい治療剤には、リガンド−受容体相互
作用を妨げることによってリガンド又はターゲット遺伝子産物機能をブロックす
る、アンタゴニスト、例えばペプチド断片(特に、N−末端細胞外ドメインに由
来する断片)、抗体(特に、N−末端細胞外ドメインを認識しこれと結合する抗
体)、又は薬剤を含む。
ターゲット遺伝子産物の受容体成分は組換え法で生産され、また候補アンタゴ
ニストはin vitroでスクリーニングされるので、本発明は有用な治療剤を同定す
るための簡単かつ迅速な方法を提供する。
興味のある特異的受容体断片には、リガンドと相互作用できるターゲット遺伝
子産物のあらゆる部分、例えば、N−末端細胞外ドメインの全て又は一部を含む
。このような部分には、膜貫通セグメント及び細胞外であると推論される受容体
の部分を含む。このような断片は、(上述したような)アンタゴニストとして有
用であり、またターゲット遺伝子産物の活性をin vivoで中和する抗体(例えば
、受容体とリガンドとの間の相互作用を妨げることによって;下記参照)を産生
するための免疫源としても有用である。細胞外領域は類似の構造をもつ関連タン
パク質(例えば、G−タンパク質結合受容体スーパーファミリーのその他のメン
バー)と比較することによって同定でき;有用な領域はファミリー中のよく性状
決定されたメンバーの細胞外ドメインと相同性を示すものである。
あるいは、アミノ酸の一次配列から、Chou-Fasman法(例えばChou and Fasman
, Ann.Rev.Biochem.47:251,1978参照)などによる疎水性/親水性の計算を
用いてタンパク質の二次構造、ならびに細胞外ドメイン領域を半経験的に推定で
きる。親水性ドメイン、特に疎水性領域に囲まれた親水性ドメイン(例えば膜貫
通ドメイン)は細胞外ドメインの強力な候補である。最後に、細胞外ドメインは
、トリプシン消化分析などの標準的酵素消化分析を用いて経験的に同定できる。
候補の断片(例えば、膜貫通セグメント又はあらゆる細胞外断片の全て又は一
部)を用いて、本明細書で記載するアッセイ(例えば上述のアッセイ)によって
リガンドとの相互作用を試験する。このような断片を用いて、本明細書で記載す
るアッセイによってリガンドとその内在性受容体との間の相互作用と拮抗する能
力も試験する。有用な受容体断片の類似体(上述したような)を作製してスクリ
ーニング成分又はアンタゴニストとしての有効性を試験することもでき(本明細
書に記載するアッセイを用いて);このような類似体も本発明で有用であると思
われる。
特に興味のあるのは、細胞外主要末端領域を含む受容体断片(又はそのリガン
ド結合性断片)である。同様に興味のあるのは、ターゲット遺伝子産物の細胞外
ループである。これらの細胞外ループに由来するペプチド断片もアンタゴニスト
として使用でき、特にループがアミノ末端ドメインと協力してリガンド結合を可
能にしている場合には使用できる。あるいは、このようなループと細胞外N−末
端ドメインは(全長のターゲット遺伝子産物と同様に)、抗−ターゲット遺伝子
産物抗体を産生するための免疫原を提供する。
リガンドのその受容体への結合は5.5.1節で上述したいかなる方法でアッ
セイしてもよい。好ましくは、組換えターゲット遺伝子産物(又は適当なターゲ
ット遺伝子産物断片又は類似体)を発現する細胞を固体基質(例えばミクロタイ
タープレート又はカラムの壁)に固定し、検出可能に標識されたリガンドと反応
させる(上述したように)。結合は、受容体成分と会合した(従って固体基質と
会合した)検出標識によってアッセイする。標識リガンドの受容体−保持細胞へ
の結合を、アンタゴニストアッセイを測定することに対する”対照”として用い
る。アンタゴニストアッセイには、ターゲット遺伝子産物−保持細胞を適当な量
の候補アンタゴニストとともにインキュベートすることを含む。この混合物に、
標識リガンドと等量を加える。本発明で有用なアンタゴニストは、標識リガンド
の固定化された受容体−発現細胞への結合を特異的に妨げる。
次にアンタゴニストのリガンド機能を妨げる能力、すなわち受容体によって通
常は媒介されるシグナル形質導入をもたらすことなく標識されたリガンド結合を
特異的に妨げる能力を試験する。機能アッセイを用いてこの試験を行うには、タ
ーゲット遺伝子産物を含む安定に形質転換された細胞系を本明細書に記載するよ
うにして調製し、そしてカルシウム結合剤であるFURA−2などのレポーター
化合物を標準的な方法で細胞質に充填した。異種のターゲット遺伝子産物をリガ
ンド又はその他のアゴニストで刺激すると、細胞内カルシウムの放出とこれに付
随するカルシウム−FURA−2複合体の蛍光をもたらす。これはアゴニスト活
性を測定するための便利な手段を提供する。アンタゴニストとなりうるものとリ
ガンドとを含めることによって、蛍光の発生を伴わずに(すなわち、細胞内Ca++
の移動を引き起こすことなく)リガンド結合を有効にブロックするような真性
の受容体アンタゴニストをスクリーニングし同定することが可能になる。このよ
うなアンタゴニストは、心臓血管障害の有用な治療剤となることが期待できる。
適当な候補アンタゴニストには、ターゲット遺伝子産物断片、特に1以上の膜
貫通セグメント又は受容体の細胞外ドメイン(上述したもの)に隣接するか又は
これを含むリガンド−結合性部分を含む断片、を含み;このような断片は好まし
くは5個以上のアミノ酸を含む。その他の候補アンタゴニストには、リガンド類
似体及びその他のペプチドならびに非ペプチド化合物及び受容体の分析からデザ
インされる又はこれに由来する抗−ターゲット遺伝子産物抗体を含む。
このスクリーニング法は下記の12節の実施例でrchd523遺伝子に関し
て詳しく記載する。rchd523遺伝子産物はGタンパク質結合受容体である
ので、rchd523遺伝子産物とその天然のリガンドとの間の相互作用のアン
タゴニストは心臓血管病の治療に有効な化合物のための優れた候補を提供する。
5.5.4.心臓血管病症状の改善のアッセイ
上述したアッセイ系で同定された化合物を含む(ただしこれに限定されない)
あらゆる結合性化合物を用いて、その心臓血管病症状を改善する能力を試験する
ことができる。心臓血管病症状を改善する能力を示す化合物を同定するための細
胞に基づくアッセイ及び動物モデルに基づくアッセイを以下に記載する。
まず、5.4.4.2.節で上述したような細胞に基づく系を用いて心臓血管
病症状を改善できる化合物を同定することができる。例えば、そのような細胞系
を心臓血管病症状を改善する能力を示すと疑われる化合物に、暴露した細胞中で
心臓血管病症状の改善を引き出すのに十分な濃度と時間で暴露する。暴露の後、
細胞を検査して、1以上の心臓血管病の細胞表現型が、より正常な又はより野生
型の非心臓血管病の表現型に似るように変化したかどうかを決定する。例えば単
球の場合では、より正常な表現型には、LDL取り込み速度の低下、内皮細胞へ
の付着、移行(transmigration)、泡沫細胞の形成、脂肪線条の形成、及び泡沫
細胞によるbFGF、IGF−I、VEGF、IL−1、M−CSF、TGFβ
、TGFα、TNFα、HB−EGF、PDGF、IFN−γ、及びGM−CS
Fなどの成長因子の産生を含むが、これに限定されない。例えば移行速度は5.
1.1.3.節で上述したNavabらのin vitro系を用いて、内皮単層を横切って
内皮下空間のコラーゲン層に移動する単球の数を定量することによって測定でき
る。
さらに、5.4.4.1.節で上述したような動物モデルに基づく心臓血管病
系を用いて、心臓血管病症状を改善できる化合物を同定することができる。この
ような動物モデルを、心臓血管病の治療に有効な薬剤、医薬、治療及び介在の同
定のための試験基質として用いることができる。例えば、動物モデルを心臓血管
病症状を改善する能力を示すと疑われる化合物に、暴露した動物中で心臓血管病
症状の改善を引き出すのに十分な濃度と時間で、暴露する。暴露に対する動物の
応答を、心臓血管病と関連する障害の逆転を評価することによって、例えばアテ
ローム性動脈硬化症プラークの数の計数及び/又は治療の前後におけるその大き
さの測定によって、モニターできる。
介在に関しては、心臓血管病症状のいかなる面をも逆転するいかなる治療も、
ヒト心臓血管病の治療的介在の候補として考慮すべきである。試験薬剤の投与量
は下記の5.7.1.節で記載する用量−応答曲線から決定できる。
さらに、遺伝子発現パターンを心臓血管病症状を改善する化合物の能力評価に
用いることができる。例えば、1以上のフィンガープリント遺伝子の発現パター
ンで”フィンガープリントプロフィール”の一部を形成し、次いでこれを用いて
このような評価を行う。本明細書における”フィンガープリントプロフィール”
という語は、一定の条件下における一定の組織又は細胞型について得られたmR
NAの発現パターンをいう。このような条件には、5.1.1.節のパラダイム
で上述したあらゆるコントロール又は実験条件をも含んだ、アテローム性動脈硬
化症、虚血症/再灌流、高血圧症、再狭窄、及び動脈炎症を含むが、これらに限
定されない。フィンガープリントプロフィールは例えば5.1.2.節で上述し
た示差的ディスプレイ法、ノーザン分析及び/又はRT−PCRを用いて作製で
きる。5.4.1.節で上述したあらゆる遺伝子配列を、このようなフィンガー
プリントプロフィールの作製及び確証のためのプローブ及び/又はPCRプライ
マーとして用いることができる。
フィンガープリントプロフィールは、細胞及び/又は動物に基づくモデル系に
おける心臓血管病であるか正常であるかの既知の状態に対して特徴付けることが
できる。次いで、これらの既知のフィンガープリントプロフィールを比較して、
試験化合物がこのようなフィンガープリントプロフィールを修飾したり、またよ
り望ましいフィンガープリントのプロフィールにより似させる効果を確かめるこ
とができる。
例えば、ある化合物の投与は、心臓血管病モデル系のフィンガープリントプロ
フィールを対照系により似させるかも知れない。あるいは、ある化合物の投与は
、対照系のフィンガープリントプロフィールが心臓血管病状態を模倣し始めるよ
うにするかも知れない。このような化合物を用いて例えば、興味のある化合物の
さらなる特徴付けを行い、あるいは別の動物モデルを作製できる。
5.5.5.臨床試験中の効果のモニター
化合物の心臓血管病状態に及ぼす影響のモニターは、基本薬剤スクリーニング
のみでなく、臨床試験においても適用できる。このような臨床試験では、5.1
.1.1節から5.1.1.6節に記載したパラダイムのいずれかに見られる遺
伝子パネルの発現を、心臓血管病状態に及ぼす特定薬剤の効果の”読み取り”と
して用いることができる。
これに限定するものではないが、例えば、パラダイムAは、酸化LDLで処置
した単球においてアップレギュレートされるフィンガープリント遺伝子の同定を
提供する。従って、例えば臨床試験で抗酸化剤の効果を研究するために、このよ
うな薬剤で処置する前及び処置中の種々の段階で患者から血液を抜き取る。次い
でその単球を単離してRNAを調製し、6.1.1及び6.1.2節で記載する
示差的ディスプレイによって分析する。これらのフィンガープリント遺伝子の発
現レベルは、6.1.2節で記載するノーザンブロット分析又はRT−PCR、
又は5.8.1節で記載するいずれかの方法を用いて定量するか、あるいは5.
8.2節で記載するいずれかの方法を用いて産生されたタンパク質の量を測定す
る。このようにして、フィンガープリントプロフィールは、酸化LDLを取り込
んだ単球の生理学的応答を示す代理マーカーとして作用する。従って、薬剤処置
の前及び処置中の種々の時点でこの応答状態を決定する。この方法は下記の10
節の実施例でさらに詳しく説明する。
この方法は本明細書に記載するその他のパラダイムにも応用できる。これに限
定するものではないが、例えば、パラダイムBのフィンガープリントプロフィー
ルは、bcl−2及びグルタチオンパーオキシダーゼがいずれも、例えば高血清
LDLレベルを導くコレステロールや脂肪などの高脂質食に暴露された患者の単
球においてダウンレギュレートされることを明らかにする。例えば、臨床試験で
高コレステロール血症の効果を改善する薬剤の能力を試験できる。薬剤処置の前
及び処置後の種々の段階で高LDLレベルの患者の単球を単離する。薬剤の効果
を、パラダイムAのフィンガープリントプロフィールに記載するように、bcl
−2及びグルタチオンパーオキシダーゼの発現の回復程度を決定することによっ
て測定できる。
5.6.心臓血管病の治療用化合物及び方法
以下に記載するするのは、心臓血管病症状を改善する方法及び組成物について
である。ある種の心臓血管病は少なくとも部分的には、遺伝子産物の過剰レベル
によって、又は異常若しくは過剰活性を示す遺伝子産物の存在によってもたらさ
れる。従って、このような遺伝子産物のレベル及び/又は活性の低下は心臓血管
病症状の改善をもたらすであろう。ターゲット遺伝子の発現レベル又はターゲッ
ト遺伝子産物の活性レベルを低下する方法は下記の5.6.1節で記載する。
あるいは、ある種のその他の心臓血管病は少なくとも部分的には、遺伝子の発
現レベルの欠損若しくは低下、又は遺伝子産物の活性レベルの低下によってもた
らされる。従って、このような遺伝子の発現レベルの上昇及び/又はこのような
遺伝子産物の活性の上昇は心臓血管病症状の改善をもたらすであろう。
いつくかの場合においては、疾患状態での遺伝子のアップレギュレーションは
、疾患状態への応答におけるその遺伝子産物に対する防御的役割を反映する。こ
の
ようなターゲット遺伝子の発現又はターゲット遺伝子産物の活性の増強は、それ
が及ぼす防御的効果を補強するであろう。いつくかの心臓血管病状態は、このよ
うな防御的遺伝子の活性レベルが異常に低いことに由来する。このような場合に
も、遺伝子の発現レベル及び/又はこのような遺伝子産物の活性の上昇は心臓血
管病症状の改善をもたらすであろう。ターゲット遺伝子の発現レベル又はターゲ
ット遺伝子産物の活性を上昇させる方法は下記の5.6.2節で記載する。
5.6.1.突然変異体ターゲット遺伝子活性の発現、合成又は活性を阻害する
化合物
上述したように、心臓血管病障害に関与するターゲット遺伝子は、ターゲット
遺伝子の活性レベルの上昇を介してこのような障害を引き起こすことができる。
上述した表1にまとめ、また下記の8節及び9節の実施例で記載するように、疾
患状態下では多数の遺伝子が内皮細胞でアップレギュレートされていることが今
や知られている。特に、rchd005、rchd024、rchd032及び
rchd036は全て、IL−1で処理した内皮細胞中で上方制御されている。
さらに、rchd502、rchd523、rchd528、rchd534、
COX II及びMnSODは全て、ずれ応力をかけた内皮細胞中でアップレギ
ュレートされている。いくつかの場合では、このようなアップレギュレーション
は疾患状態を引き起こしたり悪化させる効果をもたらす。このようなターゲット
遺伝子及び/またタンパク質の発現、合成又は活性を阻害するために種々の方法
を用いることができる。
例えば、5.5節で上述したアッセイで同定された阻害活性を示す化合物を、
本発明において心臓血管病症状の改善に用いることができる。5.5節で上述し
たように、このような分子には小さい有機分子、ペプチド、抗体などを含まれる
が、これらに限定されない。阻害性抗体法は下記の5.6.1.2節で記載する
。
例えば、rchd523遺伝子産物に対する内在性リガンドと競合する化合物
を投与できる。その結果として、リガンド結合したrchd523遺伝子膜貫通
タンパク質の量が低下すると、内皮細胞の生理機能をモジュレートするであろう
。この目的に特に有用な化合物は、例えばrchd523遺伝子産物の1以上の
細胞外ドメインを含むペプチド又はその部分及び/又は類似体等の可溶性タンパ
ク
質又はペプチド、例えばIg−テイルド融合タンパク質のような可溶性融合タン
パク質を含む。(Ig−テイルド融合タンパク質の生産については例えば米国特
許第5,116,964号を参照されたい)。あるいは、リガンド類似体又は抗体などの
rchd523遺伝子産物受容体部位と結合するがタンパク質を活性化しないよ
うな化合物(例えば、受容体−リガンドアンタゴニスト)は、rchd523遺
伝子産物の活性を阻害するのに有効でありうる。
さらに、ターゲット遺伝子の発現を阻害するアンチセンス又はリボザイム分子
も本発明において異常なターゲット遺伝子活性を阻害するのに用いることができ
る。このような方法は下記の5.6.1.1節で記載する。さらにまた、下記の
5.6.1.1で記載するように、異常なターゲット遺伝子活性の阻害に三重ら
せん分子を用いることもできる。
5.6.1.1.阻害性アンチセンス、リボザイム及び三重らせんによるアプロ
ーチ
心臓血管病症状の改善能を示す化合物には、アンチセンス、リボザイム及び三
重らせん分子がある。突然変異体ターゲット遺伝子活性を低下又は阻害するため
にこのような分子をデザインすることができる。このような分子の製造法及び使
用法は当業者に公知である。
アンチセンスRNA及びDNA分子は標的mRNAとハイブリダイズしてタン
パク質の翻訳を妨げることにより、mRNAの翻訳を直接ブロックする作用を有
する。アンチセンスDNAに関しては、翻訳開始部位、例えば興味のあるターゲ
ット遺伝子のヌクレオチド配列の−10から+10領域に由来するオリゴデオキ
シリボヌクレオチドが好ましい。
リボザイムはRNAの特定の開裂を触媒できる酵素RNA分子である。リボザ
イムの作用メカニズムには、リボザイム分子の相補的標的RNAへの配列特異的
ハイブリダイゼーション及びそれに続くエンドヌクレオ分解的開裂を含む。リボ
ザイム分子の組成物には、ターゲット遺伝子のmRNAと相補的な1以上の配列
を含まねばならず、またmRNAの開裂を行う公知の触媒配列を含まねばならな
い。この配列については、本明細書に参照として組み込まれる米国特許第5,093,
246号を参照されたい。従って、ターゲット遺伝子タンパク質をコードするRN
A配列のエンドヌクレオ分解的開裂を特異的かつ効率的に触媒する遺伝子操作さ
れたハンマーヘッドモチーフリボザイム分子が本発明に含まれる。
可能性のあるあらゆるRNA標的中の特異的リボザイム開裂部位は、まず興味
のある分子をスキャニングして以下の配列:GUA、GUU及びGUCを含むリ
ボザイム開裂部位をさがすことにより同定する。いったんこれを同定すると、開
裂部位を含むターゲット遺伝子の領域に対応する15〜20リボヌクレオチドの
短いRNA配列を用いて、オリゴヌクレオチド配列を不適当なものにする二次構
造などの予測される構造的特徴を評価することができる。候補となる配列が適当
なものかどうかを、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて、相補的オリゴヌク
レオチドとのハイブリダイゼーションを行うことができるかどうかを試験するこ
とによっても評価する。
転写阻害のための三重らせん形成に用いる核酸分子は、一本鎖でデオキシリボ
ヌクレオチドからなるものであるべきである。これらのオリゴヌクレオチドの塩
基組成は、フーグスティーン(Hoogsteen)型塩基対則による三重らせん形成を
促進するようにデザインされねばならず、これは一般に二本鎖のうちの一方の鎖
にプリン又はピリミジンのかなり大きな連なりを必要とする。ヌクレオチド配列
はピリミジンをベースにするものであってよく、このときは生じる三重らせんの
3つの会合した鎖を横切ってTAT又はCGCトリプレットになる。ピリミジン
に富む分子は、二本鎖のうちの一本鎖のプリンに富む領域と、その鎖と平行な方
向において塩基相補性を与える。また、核酸分子は例えばG残基の連なりを含む
プリンに富むものであるように選択できる。これらの分子はGC対に富むDNA
二本鎖と三重らせんを形成することができ、このときプリン残基のほとんどは標
的二本鎖の一本鎖上に位置しており、三重らせん中の3本の鎖を横切ってGGC
トリプレットになる。
あるいは、三重らせん形成のための標的となりうる候補配列を、いわゆる”ス
イッチバック”核酸分子を作ることによって増加できる。スイッチバック分子は
、5’−3’と3’−5’に方向を変えるように合成され、このため二本鎖のう
ちの一本鎖とまず塩基対をつくり、次に他方と塩基対をつくり、従ってプリン又
はピリミジンのいずれかからなるかなりの大きさの連なりが二本鎖の一方の鎖に
存
在するように作製する必要がない。
ここに記載するアンチセンス、リボザイム及び/又は三重らせん分子は、正常
体及び突然変異体の両方のターゲット遺伝子の対立遺伝子によって生産されるm
RNAの転写(三重らせん)及び/又は翻訳(アンチセンス、リボザイム)を低
下又は阻害することができる。実質的に正常なレベルのターゲット遺伝子活性が
維持されていることを確認するために、正常な活性を示すターゲット遺伝子ポリ
ペプチドをコードし発現する核酸分子を、下記の5.7節で記載するような遺伝
子治療法によって細胞中に導入することができ、これにはアンチセンス、リボザ
イム又は三重らせん治療に用いられる可能性のあるいかなる配列も含まない。あ
るいは、細胞又は組織のターゲット遺伝子活性の必要レベルを維持するために、
正常なターゲット遺伝子タンパク質を細胞又は組織に共投与することが好ましい
。
本発明のアンチセンスRNA及びDNA、リボザイム、並びに三重らせん分子
は、DNA及びRNA分子合成のために当業者に公知であるいかなる方法で調製
してもよい。これには、例えば固相ホスホラミダイト化学合成のような当業者に
公知のオリゴデオキシリボヌクレオチド及びオリゴリボヌクレオチドを化学合成
する方法を含む。あるいは、アンチセンスRNA分子をコードするDNA配列の
in vitro又はin vivo転写によってRNA分子を作製してもよい。このようなD
NA配列は、T7又はSP6ポリメラーゼプロモーターなどの適当なRNAポリ
メラーゼプロモーターを導入した種々のベクター中に導入することができる。あ
るいは、使用するプロモーターによってアンチセンスRNAを構成的に又は誘導
的に合成するアンチセンスcDNA構築物を細胞系に安定に導入することができ
る。
細胞内安定性や半減期を増加する手段として種々の公知の修飾をDNA分子に
導入できる。これに限定するものではないが、可能な修飾には、分子の5’及び
/又は3’末端へのリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのフランキ
ング配列の付加、あるいはオリゴデオキシリボヌクレオチド骨格中のホスホジエ
ステラーゼ結合に変えてホスホロチオエート又は2’O−メチルの使用を含む。
5.6.1.2.ターゲット遺伝子産物に対する抗体
ターゲット遺伝子タンパク質に特異的でかつその活性を妨げる抗体をターゲッ
ト遺伝子機能の阻害に用いることができる。このような抗体は5.4.3節で上
述した標準的方法を用いて、タンパク質自体又はタンパク質の一部に対応するペ
プチドに対して作製することができる。このような抗体にはポリクローナル抗体
、モノクローナル抗体、Fab断片、一本鎖抗体、キメラ抗体などを含むが、こ
れらに限定されない。
ターゲット遺伝子タンパク質が細胞内性であって全抗体を用いるときには、イ
ンターナリゼーションする抗体が好ましい。しかしながら、ターゲット遺伝子の
エピトープと結合する抗体又はFab領域の断片を細胞に送達するためにリポフ
ェクチンリポソームを用いることができる。抗体断片を用いる場合には、標的タ
ンパク質の結合ドメインに結合する最小の阻害性断片が好ましい。例えば、ター
ゲット遺伝子タンパク質と結合する抗体の可変領域のドメインに対応するアミノ
酸配列をもつペプチドを用いることができる。このようなペプチドは当業者に公
知の方法を用いて化学合成又は組換えDNA法で生産できる(例えば、Creighto
n,1983,前出; 及びSambrookら,1989,前出、参照)。あるいは、細胞内ターゲ
ット遺伝子エピトープと結合する一本鎖中和抗体も投与できる。このような一本
鎖抗体は例えば、Marascoら(Marasco,W.ら,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA 90:7889-7893)の記載するような方法を用いて標的細胞集団中で一本鎖抗体
をコードするヌクレオチド配列を発現させることによって、投与できる。
いくつかの場合には、rchd523遺伝子産物のように、ターゲット遺伝子
タンパク質は細胞外性であるか、又は膜貫通タンパク質である。例えば、rch
d523遺伝子産物の1以上の細胞外ドメインに特異的でかつその活性を妨げる
抗体は、心臓血管病の治療に特に有用である。このような抗体は血流から標的ド
メインに直接アクセスできるので、特に有効である。ペプチド投与に適した下記
の5.7節で記載するあらゆる投与法を用いて、阻害性ターゲット遺伝子抗体を
その作用部位に有効に投与することができる。
5.6.2.ターゲット遺伝子活性を回復又は増強する方法
心臓血管病を引き起こすターゲット遺伝子は心臓血管病の状況では低く発現さ
れていることがある。上述の表1にまとめ、また下記の7節の実施例で記載する
ように、疾患状態の単球ではいくつかの遺伝子がダウンレギュレートされている
ことが知られている。特に、高血清LDLレベルに導くコレステロールや脂肪な
どの高脂質食に暴露された患者の単球では、bcl−2及びグルタチオンパーオ
キシダーゼ遺伝子の発現がダウンレギュレートされている。あるいは、ターゲッ
ト遺伝子産物の活性が低下して、心臓血管病症状の進展を導くのかも知れない。
このようなターゲット遺伝子発現のダウンレギュレーション又はターゲット遺伝
子産物活性の低下は、疾患状態を引き起こしたり悪化させるかも知れない。
いくつかの場合では、疾患状態でアップレギュレートされるターゲット遺伝子
が防御効果を及ぼす。上述の表1にまとめ、また下記の8節及び9節の実施例で
記載するように、多数の遺伝子が疾患状態の内皮細胞中でアップレギュレートさ
れていることが今や知られている。特に、rchd005、rchd024、r
chd032及びrchd036は全て、IL−1で処理した内皮細胞中でアッ
プレギュレートされている。さらに、rchd502、rchd523、rch
d528、rchd534、COX II及びMnSODは全て、ずれ応力をか
けた内皮細胞中でアップレギュレートされている。種々の方法を用いて、このよ
うなターゲット遺伝子の発現、合成又は活性を上昇させ、それらの遺伝子の疾患
状態に応答した防御効果を発揮させることができる。
この節ではターゲット遺伝子の活性レベルを心臓血管病症状が改善されるよう
なレベルまで上昇させる方法を記載する。遺伝子の活性レベルは例えば、ターゲ
ット遺伝子産物の存在レベルを上昇させるか、あるいは存在する活性ターゲット
遺伝子産物のレベルを上昇させることによって上昇させることができる。
例えば、心臓血管病症状の改善に十分なレベルでターゲット遺伝子産物をこの
ような症状を示す患者に投与する。投与には下記の5.7節で記載するあらゆる
方法を用いることができる。下記の5.7.1節に記載する方法を用いて、当業
者であれば正常なターゲット遺伝子タンパク質の有効で無毒性な投与濃度を容易
に知ることができる。
さらに、ターゲット遺伝子タンパク質をコードするRNA配列を、心臓血管病
症状が改善されるようなターゲット遺伝子タンパク質のレベルを生じるのに十分
な濃度で、心臓血管病症状を示す患者に直接投与できる。化合物の細胞内投与を
達成する下記の5.7節で記載するあらゆる方法、例えばリポソーム投与などの
方法を用いて、このようなRNA分子を投与できる。RNA分子は例えば5.4
.2節で上述した組換え法で作製できる。
さらに、遺伝子置換治療によって患者を治療することができる。ターゲット遺
伝子機能をもつ正常なターゲット遺伝子タンパク質の産生を指示する正常なター
ゲット遺伝子又は該遺伝子の一部の1コピー以上を、アデノウイルス、アデノ伴
生ウイルス及びレトロウイルスを含む(ただしこれに限定されない)ベクターを
用いて、リポソームなどのDNAを細胞中に導入するためのその他の分子ととも
に、細胞中に挿入する。また、正常なターゲット遺伝子配列をヒト細胞中に導入
するために上述の方法を用いることができる。
次いで、遺伝子配列を発現する正常なターゲット遺伝子を含む細胞、特にオー
トロガス細胞を、心臓血管病症状の改善を可能にする部位において患者に導入又
は再導入する。このような細胞置換法は、例えばターゲット遺伝子産物が分泌さ
れた細胞外遺伝子産物であるような場合に好ましい。
5.7.医薬調製物及び投与方法
ターゲット遺伝子の発現、合成及び/又は活性を阻害する同定された化合物を
心臓血管病を治療又は改善をするための治療的有効投与量で患者に投与すること
ができる。治療的有効投与量とは、心臓血管病の症状の改善をもたらすのに十分
な化合物の量をいう。
5.7.1.有効投与量
このような化合物の毒性及び治療的有効性は、例えばLD50(集団の50%を
致死にする用量)やED50(集団の50%に治療的有効性をもたらす用量)を決
定するための細胞培養又は実験動物における標準的薬学的方法によって決定でき
る。毒性効果と治療効果との間の用量比を治療インデックスといい、LD50/E
D50で表される。大きい治療インデックスを示す化合物が好ましい。毒性の副作
用を示す化合物を用いるときには、影響されない細胞への損傷の可能性を最少に
し、副作用を減少するように、病気に冒された組織部位へのこのような化合物を
ターゲットするデリバリーシステムをデザインするよう注意すべきである。
細胞培養系及び動物研究から得られたデータを用いてヒトに使用するための用
量範囲を設定する。このような化合物の用量は、ほとんど又は全く毒性を伴わな
いED50を含む循環濃度の範囲内にあるのが好ましい。用量は使用する投与形態
及び投与経路により、この範囲内で変動する。本発明の方法で使用するあらゆる
化合物について、治療的有効投与量を細胞培養系からまず推定できる。動物モデ
ルでは、細胞培養で決定したIC50(すなわち、症状の最大阻害の半分を設定で
きる。このような情報を用いてヒトでの有用投与量をより正確に決定できる。例
えば血漿中のレベルは高性能液体クロマトグラフィーによって測定できる。
5.7.2.製剤及び用途
本発明で使用する医薬組成物は、1以上の生理学的に許容できる担体又は賦形
剤を用いて慣用法で処方できる。
従って、該化合物及びその生理学的に許容できる塩及び溶媒和物は、吸入若し
くは通気法(口又は鼻から)又は経口、頬、腹腔、若しくは直腸投与による投与
用に処方できる。
経口投与には、医薬組成物は例えば、結合剤(例えば、予めゼラチン化したト
ウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロー
ス);充填剤(例えば、ラクトース、微晶質セルロース又はリン酸水素カルシウ
ム);滑沢剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク又はシリカ);崩壊
剤(例えば、ジャガイモ澱粉又は澱粉グリコール酸ナトリウム);又は湿潤剤(
例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)などの薬剤学的に許容できる賦形剤とともに
慣用法で調製した錠剤又はカプセル剤の形態をとりうる。錠剤は、当業者に公知
の方法によりコーティングできる。経口投与用の液体製剤は、例えば溶液、シロ
ップ又は懸濁液の形態をとることができ、あるいは使用前に水又はその他の適当
なビヒクルで構成できるように乾燥粉末としてもよい。このような液体製剤は、
懸濁剤(例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体又は食用硬化脂肪)
;乳化剤(例えば、レシチン又はアラビアゴム);非−水性ビヒクル(例えば、
アーモンド油、油脂エステル、エチルアルコール又は分画植物油);及び保存剤
(例えば、メチル又はプロピル−p−ヒドロキシベンゾエート又はソルビン酸)
などの薬剤学的に許容できる添加物とともに慣用法で調製できる。製剤には緩衝
塩、着香剤、着色剤及び甘味料も適宜含むことができる。
経口投与用製剤は適当に処方することにより活性化合物を制御放出させること
ができる。
頬投与用には、組成物は慣用法で処方した錠剤又はトローチ剤の形態をとりう
る。
吸入による投与用には、本発明の化合物を、例えばジクロロジフルオロメタン
、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素又は
その他の適当なガスなどの適当な噴射剤を用いることにより、加圧パック又はネ
ビュライザーからのエアロゾルスプレー製剤の形態で便宜送達する。加圧エアロ
ゾルの場合、投与単位は計量された量を送達するためのバルブを装備することに
よって決定できる。吸入器又は通気器で使用するゼラチンなどのカプセル及びカ
ートリッジは、化合物とラクトース又は澱粉などの適当な粉末ベースとの粉末混
合物を含むよう処方される。
化合物は、例えばボーラス注射や連続注射などの注射によって非経口投与する
ように処方できる。注射用製剤は、添加の保存料とともにアンプル又は複数投与
量容器中に入れた単位投与量形態とすることができる。組成物は油性又は水性ビ
ヒクル中の懸濁液、溶液又はエマルジョンとしての形態をとることができ、また
懸濁剤、安定化剤及び/又は分散剤などの処方剤を含むことができる。あるいは
、活性成分を、適当なビヒクル、例えば滅菌された発熱質を含まない水で構成す
るように、使用前に粉末形態とすることができる。
化合物は、例えばカカオバターやその他のグリセリドなどの慣用の座薬ベース
を含む座薬又は保持浣腸のような直腸組成物で処方することもできる。
上述した処方に加えて、化合物はデポ製剤として処方することもできる。この
ような長時間作用性製剤は移植(例えば皮下又は筋肉内)又は筋肉内注射により
投与できる。従って、例えば化合物は適当な重合体又は疎水性物質(例えば、許
容できるオイル中のエマルジョンとして)又はイオン交換樹脂とともに、又は例
えばやや溶けにくい塩などのやや溶けにくい誘導体として処方することができる
。
所望するならば、組成物は活性成分を含む1以上の単位投与形態を含むパック
又はディスペンサー装置で提供してもよい。例えばパックは発庖剤(blister)
パックのような金属又はプラスチックホイルからなる。パック又はディスペンサ
ー装置には投与の説明書を付けてもよい。
5.8.心臓血管病の異常の診断
5.4.1節で記載するフィンガープリント遺伝子ヌクレオチド配列のような
試薬、ならびに5.4.2節(ペプチド)及び5.4.3節(抗体)で記載する
示差的に発現された経路遺伝子ペプチドに対する抗体を用いて、種々の方法を実
施できる。特に、このような試薬は例えばターゲット遺伝子の突然変異の存在の
検出、又はターゲット遺伝子mRNAの過剰若しくは不足発現の検出に用いるこ
とができる。
本明細書で記載する方法は、本明細書に記載する少なくとも1つの特異的フィ
ンガープリント遺伝子核酸又は抗−フィンガープリント遺伝子抗体試薬を含んで
なる予めパッケージングされた診断キットを用いて実施することができ、これは
心臓血管病症状を示す患者又は心臓血管病を進行させる危険のある患者を診断す
るために、例えば臨床現場において便宜用い得る。
フィンガープリント遺伝子が発現しているあらゆる細胞型又は組織、好ましく
は単球、内皮細胞、又は平滑筋細胞を下記の診断に使用できる。
5.8.1.フィンガープリント遺伝子核酸の検出
分析すべき細胞型又は組織からのDNA又はRNAは当業者に公知の方法を用
いて容易に単離できる。診断法は、核酸の精製の必要がない、バイオプシーや切
除から得られた患者組織の組織切片(固定及び/又は凍結)上で直接”in situ
”で実施することもできる。5.1節で記載するような核酸試薬をこのようなin
situ法のプローブ及び/又はプライマーとして使用できる(例えば、Nuovo,G.
J.,1992,PCR in situ hybridization: protocols and application,Raven P
ress,NY参照)。
RNA又はDNAのフィンガープリント遺伝子ヌクレオチド配列は、例えば心
臓血管病関連の遺伝子構造及び発現を検出するための生物学的サンプルのハイブ
リダイゼーション又は増幅アッセイに使用できる。このようなアッセイには、サ
ザン又はノーザン分析、一本鎖高次多型分析、in situハイブリダイゼーション
アッセイ、及びポリメラーゼチェインリアクション分析を含むが、これに限定さ
れない。このような分析によって、フィンガープリント遺伝子の発現パターンの
定量的側面と、フィンガープリント遺伝子の発現及び/又は遺伝子組成物の定性
的側面の両方が明らかになる。このような側面には例えば、点突然変異、挿入、
欠失、染色体の組換え、及び/又は遺伝子発現の活性化若しくは不活化を含む。
このようなin situハイブリダイゼーション分析を下記の14節の実施例に記
載する。特に、rchd502及びrchd528遺伝子の高レベルの発現が、
ヒト心臓血管病患者から除去した疾患組織の内皮細胞中で特に検出され、平滑筋
細胞及びマクロファージを含む組織中のいかなる他の細胞型にも検出されなかっ
た。これらの結果は、本明細書で記載するターゲット遺伝子がいかに新規な心臓
血管病の診断を提供するかを明瞭に示すものである。さらに、これらの診断は特
定のターゲット遺伝子と関連するので、心臓血管病の治療法がより特定されるこ
とになる。
フィンガープリント遺伝子−特異的核酸分子を検出する好ましい診断法は、例
えば分析すべき細胞型又は組織に由来する核酸を、5.1節で記載するような1
以上の標識した核酸試薬と、このような試薬が興味のある核酸分子中のその相補
的配列と特異的にアニーリングするのに好ましい条件下に、接触させインキュベ
ートすることを含む。好ましくは、核酸試薬の長さは少なくとも9〜30ヌクレ
オチドである。インキュベーションの後、核酸:フィンガープリント分子ハイブ
リッドから全てのアニーリングしない核酸を除去する。ハイブリダイズしたフィ
ンガープリント組織からの核酸の存在を、もしもそのような分子が存在する場合
には、検出する。このような検出法を用いることにより、興味のある組織又は細
胞型由来の核酸を、例えば膜、又はミクロタイタープレートやポリスチレンビー
ズなどのプラスチック表面のような固体支持体に固定することができる。この場
合には、インキュベーション後に、5.1節で記載する型のアニーリングしなか
った標識フィンガープリント核酸試薬は容易に除去される。残存するアニーリン
グした標識核酸試薬の検出は当業者に公知の標準的方法を用いて実施できる。
フィンガープリント遺伝子特異的核酸分子を検出する別の診断法は、例えばP
CR(Mullis,K.B.,1987,米国特許第4,683,202号に記載の実施態様)、リガ
ーゼ連鎖反応(Barany,F.,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:189-193)
、自己持続性(self sustained)配列複製(Guatelli,J.C.ら,1990,Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA 87:1874-1878)、転写増幅系(Kwoh,D.Y.ら,1989,Proc.
Na
tl.Acad.Sci.USA 86:1173-1177)、Q−βレプリカーゼ(Lizardi,P.M.ら
,1988,Bio/Technology 6:1197)、又はあらゆるその他の核酸増幅法による増
幅と、それに続く当業者に公知の方法を用いる増幅分子の検出を含む。これらの
検出法は、核酸分子が非常に少数で存在する場合の検出に特に有用である。
このような検出法のある態様では、興味のあるRNA分子からcDNA分子を
得る(例えば、RNA分子からcDNAへの逆転写により)。このようなRNA
が単離される細胞型又は組織には、単球、内皮、及び/又は平滑筋を含む(ただ
しこれに限定されない)野生型フィンガープリント遺伝子が発現されることが知
られているあらゆる組織を含む。次にcDNA中のフィンガープリント配列をP
CR増幅反応などの核酸増幅反応のための鋳型として用いる。この方法の逆転写
工程及び核酸増幅工程において合成開始試薬として使用する核酸試薬(例えばプ
ライマー)は、5.1節で記載するフィンガープリント遺伝子核酸試薬の中から
選択される。このような核酸試薬の好ましい長さは、少なくとも15〜30ヌク
レオチドである。増幅産物を検出するには、核酸増幅を放射能又は非放射能で標
識したヌクレオチドを用いて実施する。あるいは、増幅産物が標準の臭化エチジ
ウム染色又はあらゆるその他の適当な核酸染色法で可視化できるのに十分な程度
に増幅産物を生産する。
主として1つの核酸配列の検出に焦点をあてる方法に加えて、5.5.4節で
記載するフィンガープリントプロフィールもこのような検出法で評価できる。例
えば、ノーザン分析及び/又はRT−PCRなどの5.1.2節で記載する差異
ディスプレイ法を用いてフィンガープリントプロフィールを作製する。このよう
なフィンガープリントプロフィールの作製及び確証に5.4.1節で記載するあ
らゆる遺伝子配列をプローブ及び/又はPCRプライマーとして使用できる。
5.8.2.フィンガープリント遺伝子ペプチドの検出
5.4.3節で記載する野生型又は突然変異型フィンガープリント遺伝子ペプ
チドに対する抗体も、例えば本明細書で記載する心臓血管病の診断及び予後判定
に使用できる。このような診断法は、フィンガープリント遺伝子タンパク質の発
現レベルの異常、又はフィンガープリント遺伝子タンパク質の構造及び/又は組
織、細胞、又は細胞下(subcellular)での位置の異常の検出に使用できる。構
造的相違には、例えば正常なフィンガープリント遺伝子タンパク質と比較した突
然変異型フィンガープリント遺伝子タンパク質のサイズ、電気陰性度、又は抗原
性の相違を含む。
分析すべき組織又は細胞型からのタンパク質は、ウエスタンブロット分析を含
む(ただしこれに限定されない)当業者に公知の方法を用いて容易に検出又は単
離できる。ウエスタンブロット分析を行う詳細な説明はSambrookら(1989、前出
)の18章を参照されたい。ここで使用するタンパク質の検出及び単離方法は、
例えばHarlowとLaneの記載する方法(Harlow,E.andLane,D.,1988,"Antibod
ies: A Laboratory Manual",Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spr
ing Harbor,New York)によっても実施でき、この文献の全てを参照としてここ
に援用する。
野生型又は突然変異型のフィンガープリント遺伝子ペプチド分子を検出するた
めの好ましい診断法には、例えばフィンガープリント遺伝子ペプチドと抗−フィ
ンガープリント遺伝子特異的ペプチド抗体との間の相互作用によって検出するイ
ムノアッセイを含む。
例えば、本発明で有用な5.4.3節で記載するような抗体又は抗体断片を、
野生型又は突然変異型のフィンガープリント遺伝子ペプチドの存在の定量的又は
定性的検出に使用できる。これは例えば、蛍光標識した抗体(下記参照)を光学
顕微鏡、フローサイトメトリ、又は蛍光定量的検出とともに用いる免疫蛍光法に
よって実施できる。フィンガープリント遺伝子ペプチドが細胞表面で発現してい
るときにはこの方法は特に好ましい。
本発明で有用な抗体(又はその断片)はさらに、フィンガープリント遺伝子ペ
プチドをin situ検出するための免疫蛍光又は免疫電子顕微鏡において組織学的
に使用することもできる。in situ検出は、患者から組織学的標本を取り、これ
に本発明の標識抗体を適用することによって実施できる。生物学的サンプル上の
標識抗体(又はその断片)に上乗せすることにより抗体(又はその断片)を適用
するのが好ましい。このような方法を用いることにより、フィンガープリント遺
伝子ペプチドの存在のみでなく、試験組織中におけるその分布も決定することが
できる。本発明の方法を用いることにより、このようなin situ検出を行うため
のあらゆる広範な組織学的方法(染色法など)を修飾し得ることを当業者は容易
に認識するであろう。
野生型又は突然変異型のフィンガープリント遺伝子ペプチドのイムノアッセイ
には典型的に、生物学的流体、組織抽出物、新たに回収した細胞、又は組織培養
で予めインキュベートしておいた細胞のような生物学的サンプルを、フィンガー
プリント遺伝子ペプチドを同定できる検出可能に標識された抗体の存在下にイン
キュベートし、そして当業者に公知の多くの方法のいずれかによって結合抗体を
検出することを含む。
生物学的サンプルを、細胞、細胞粒子又は可溶性タンパク質を固定できるニト
ロセルロースのような固相支持体又は担体又はその他の固体支持体と接触させこ
れに固定する。次いで支持体を適当な緩衝液で洗浄し、検出可能に標識されたフ
ィンガープリント遺伝子特異的抗体で処理する。次いで固相支持体を緩衝液で2
度目に洗浄して未結合抗体を除去する。固相支持体に結合した標識の量を次いで
慣用法により検出する。
”固相支持体又は担体”とは、抗原又は抗体を支持できるあらゆる支持体を意
味する。よく知られた支持体又は担体には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピ
レン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然及び修飾セル
ロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩、及び磁鉄鉱を含む。担体の性質は本発明
の目的にとってはいくらか可溶性か又は不溶性のものである。支持体物質は、結
合分子が抗原又は抗体と結合できる限り、実質上いかなる構造的配置をもってい
てもよい。従って、支持体の配置はビーズのような球状であっても、試験管の内
側表面又はロッドの外側表面のような円筒状であってもよい。あるいは、表面は
シート、試験ストリップなどのように平面であってもよい。好ましい支持体には
ポリスチレンビーズを含む。当業者であれば抗体又は抗原を結合するための他の
多くの適当な担体を知っているし、また日常的実験を用いてこれを確認できるで
あろう。
あるロットの抗−野生型又は突然変異型フィンガープリント遺伝子ペプチド抗
体の結合活性は公知の方法により決定できる。当業者は日常的実験を用いて決定
したそれぞれについての作動可能で最適なアッセイ条件を決定できる。
フィンガープリント遺伝子ペプチド−特異的抗体を検出可能に標識する方法の
1つは、これを酵素と結合してエンザイムイムノアッセイ(EIA)に用いる(
Voller,"The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)",Diagnostic Horizo
ns 2:1-7,1978,Microbiological Associates Quarterly Publication,Walker
sville,MD; Voller ら,J.Clin.Pathol.31:507-520(1978); Butler,Meth.
Enzymol.73:482-523(1981); Maggio,(ed.)Enzyme Immunoassay,CRC Press,B
oca Raton,FL,1980; Ishikawa,ら,(eds.)Enzyme Immunoassay,Kagaku Shoin
,Tokyo,1981)。抗体に結合した酵素は適当な基質、好ましくは色原体基質と
、例えば分光光学的、蛍光定量的又は可視手段によって検出できるような化学的
部分を生じるように、反応する。抗体を検出可能に標識するために用いる酵素に
は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ−5−ステロイド
イソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロホスフェート、
デヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホースラディッシュ
ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコース
オキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラ
ーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ及びアセチ
ルコリンエステラーゼを含むが、これに限定されない。酵素のための色原体基質
を用いる比色法によって検出を行うことができる。基質の酵素反応の程度を同様
に調製した標準と目視で比較することによっても検出を行うことができる。
その他の各種イムノアッセイのいずれを用いても検出を行うことができる。例
えば、抗体又は抗体断片を放射能標識することにより、フィンガープリント遺伝
子野生型又は突然変異型ペプチドをラジオイムノアッセイ(RIA)を用いて検
出できる(例えば、Weintraub,B.,Principles of Radioimmunoassays,Sevent
h Training Course on Radioligand Assay Techniques,The Endocrine Society
,March,1986,参照によりここに援用する)。放射性同位体はガンマカウンター
又はシンチレーションカウンター又はオートラジオグラフィーのような手段を用
いて検出できる。
抗体を蛍光化合物で標識することも可能である。蛍光標識された抗体を適切な
波長の光に暴露し、蛍光によってその存在を検出する。最も普通に用いられる蛍
光標識化合物には、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエ
リスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o−フタルアルデヒド及びフ
ルオレスアミンである。
例えば125Eu又はその他のランタニド系のような蛍光発生金属を用いて抗体
を検出可能に標識することもできる。これらの金属はジエチレントリアミン五酢
酸(DTPA)又はエチレンジアミン四酢酸(EDTA)のような金属キレート
基を用いて抗体に結合できる。
抗体を化学発光化合物に結合することによって抗体を検出可能に標識すること
もできる。次いで化学発光標識された抗体の存在を、化学反応中に生じる発光の
存在を検出することによって測定する。特に有用な化学発光標識化合物の例とし
ては、ルミノール、イソルミノール、テロマティックアクリジニウムエステル、
イミダゾール、アクリジニウム塩及びシュウ酸エステルが挙げられる。
同様に、生物発光化合物を本発明の抗体の標識に用いることもできる。生物発
光は生物系で見いだされた化学発光の一種であり、ここでは触媒タンパク質が化
学発光反応の有効性を増加する。生物発光タンパク質の存在は発光の存在を検出
することにより決定できる。標識の目的にとって重要な生物発光化合物は、ルシ
フェリン、ルシフェラーゼ及びエクオリンである。
5.8.3.心臓血管病状態の画像処理
いくつかの場合では、本明細書で同定した異なって発現した遺伝子産物は、心
臓血管病状態下ではアップレギュレートされて影響を受けた組織の表面で発現す
る。このようなターゲット遺伝子産物は、病気の診断及び治療を指示する目的で
、損傷を受けたり病気の心臓血管組織を非侵入的に画像処理することができる。
例えば、このような異なって発現する遺伝子産物には、動脈硬化症発生の原因と
なるアテローム性動脈硬化症特異的付着分子、又は2節で上述した酸化LDLに
応答してアップレギュレートされる単球スカベンジャー受容体を含むが、これに
限定されない。あるいは、虚血症/再灌流に悩む組織、あるいはアテローム性動
脈硬化症又は再狭窄病変をもつ他の組織においては、別のこのような表面タンパ
ク質が特異的にアップレギュレートされているかも知れない。
後記第9欄の実施例に記載するように、rchd523遺伝子は、ずれ応力を受けて
いる内皮細胞でアップレギュレートされている遺伝子である。また、このrchd52
3遺伝子は、7つの膜貫通ドメインに加えて細胞外のアミノ末端ドメインを含有
する新規なGタンパク質結合受容体をコードしている。したがって、rchd523遺
伝子産物は、心臓血管病の状態をイメージング(撮像)するための優れた手段を
提供する。この技術は、rchd502やrchd528の遺伝子産物のような他の膜貫通遺伝
子産物にも同様に応用することができる。本発明に従ってこの方法を使用する一
例を後記第11欄に挙げる。
上記第5.6.1.2欄で記載した、rchd523遺伝子産物のような表面タンパ
ク質と特異的に結合するモノクローナル抗体は、in vivo組織イメージング技術
によって心臓血管病の診断に使用することができる。ターゲット遺伝子産物に対
して特異的な抗体、好ましくはその抗原結合性断片に、検出可能な信号を生成す
る標識(たとえば、ガンマ線放出性の放射性同位体)を結合し、心臓血管病の疑
いがある被検体(人間または動物)に投与する。その検出可能なように標識され
た抗体が罹病または損傷組織部位(1つまたは複数)に局在化するのに充分な時
間が経過した後標識が生成する信号を光走査装置によって検出する。次いで、こ
の検出された信号をその組織の画像に変換する。この画像により、in vivoで組
織の位置を確定することが可能になる。次にこのデータを使用して適切な治療法
を考案することができる。
一般に組織イメージングに使用するには抗体分子全体よりも抗体断片の方が好
ましい。抗体断片は全抗体分子より迅速に分配されるので迅速に組織(1つまた
は複数)に蓄積される。したがって、全抗体を使用するよりも短い時間で画像を
得ることができる。また、これらの断片は、より迅速に組織から除去され、その
結果バックグラウンド信号が低くなる。たとえば、Haberらの米国特許第4,036,9
45号、Goldenbergらの米国特許第4,331,647号参照。二価の抗原結合性断片(F
ab′)2および一価のFabが特に好ましい。このような断片は、よく知られ
ているいくつかのプロトコルのいずれかに従って全イムノグロブリン分子を酵素
ペプシンまたはパパインで消化することによって調製することができる。罹病ま
たは損傷組織の位置確定用のモノクローナル抗体に結合するのに適したタイプの
標識としては、放射性標識(すなわち、放射性同位体)、螢光性標識およびビオ
チン標識があるがこれらに限られることはない。
抗体または抗体断片を標識するのに使用することができる放射性同位体のうち
、ガンマ線エミッター、ポジトロンエミッター、X線エミッターおよび螢光エミ
ッターが位置確定に適している。抗体標識用に適した放射性同位体としては、ヨ
ウ素‐131、ヨウ素‐123、ヨウ素‐125、ヨウ素‐126、ヨウ素‐1
33、臭素‐77、インジウム‐111、インジウム‐113m、ガリウム‐6
7、ガリウム‐68、ルテニウム‐95、ルテニウム‐97、ルテニウム‐10
3、ルテニウム‐105、水銀‐107、水銀‐203、レニウム‐99m、レ
ニウム‐105、レニウム‐101、テルル‐121m、テルル‐122m、テ
ルル‐125m、ツリウム‐165、ツリウム‐167、ツリウム‐168、テ
クネチウム‐99mおよびフッ素‐18がある。ハロゲンは多かれ少なかれ相互
に互換的に使用することができる。というのは、ハロゲンで標識された抗体およ
び/または通常のイムノグロブリンはほとんど同じ動力学および分布ならびに類
似の代謝性をもっているからである。
ガンマ線エミッターであるインジウム‐111とテクネチウム‐99mが好ま
しい。すなわち、これらの放射性金属はガンマカメラで検出可能であり、in viv
oでのイメージングに好適な半減期をもっているからである。抗体は、DTPA
(ジエチレントリアミンペンタ酢酸)のような複合金属キレート剤によってイン
ジウム‐111またはテクネチウム‐99mで標識することができる。Krejcare
kら、1977年、Biochem.Biophys.Rec.Comm.77:581、Khawら、1980年
、Science 209:295、Gansowらの米国特許第4,472,509号、Hnatowichの米国特許
第4,479,930号(これらの教示は引用したことにより本明細書に含まれているも
のとする)参照。
モノクローナル抗体に結合するのに適した螢光性化合物としては、フルオレセ
インナトリウム、フルオレセインイソチオシアネートおよびテキサスレッドスル
ホニルクロライドがある。DeBelder & Wik、1975年、Carbohydrate Researc
h 44:254-257参照。当業者は、モノクローナル抗体を標識するのに適した他の螢
光性化合物を知っているであろうし、または通常以上の実験をすることなく確か
めることができるであろう。
6.実施例:例Aに応答して選択(差次)的に発現する遺伝子の同定:in vitro
泡沫細胞の例
本発明によると、示差的ディスプレイを用いて、アテローム形成の間に泡沫細
胞が発生する条件をシミュレートするように処理した単球で選択的に発現する遺
伝子を検出することができる。
6.1.材料と方法
6.1.1.細胞の単離と培養
クエン酸リン酸デキストロース(Sigma)3mlを入れた20mlの冷却vacutai
nerチューブに血液(〜200ml)を吸い込んだ。次に血液を50mlのチュ
ーブにプールし、Beckman GS-6R中において1250RPM、4℃で15分間遠
心した。次いで透明な上層(〜25ml)をピペットで取って捨て、代わりに同
容量の4℃のPBSを入れた。その後血液を混合し、再び2680RPM、4℃
で15分間遠心した。次いで上層を取って捨て、界面のバフィーコートを〜5m
l取り出し、別の50mlのチューブに入れ、ピペットを20mlのPBSで洗
浄した。細胞をTフラスコに入れ、4℃で16時間保存した。次に細胞試料を少
し取り出し、血球計を用いて計数した。次いでバフィーコート集団中の最終赤血
球細胞濃度をPBSで1.5×109/mlに調節し、その細胞を室温に戻した
後Leucoprepチューブ(Becton Dickinson)に入れ、2300RPM、25℃で2
5分間遠心した。透明な上層を取って捨て、ゲル上の濁った層を取り出して50
mlのチューブにプールした。次にサンプルをPBS(25℃)で50mlに希
釈し、1000RPMで10分間遠心した。次いで上清を除き、ペレットを50
mlのPBSに再懸濁させた。この手順をさらに三回繰り返した。最後の遠心後
細胞を小容量のPBSに再懸濁させ、計数した。
単球を拡げる前に組織培養皿をウシコラーゲンで被覆した。1/6容量の7×
RPMI(JRH Biosciences)をVitrogen 100コラーゲン(Celtrix)に入れた後
これをRPMIで1:10に希釈して最終濃度を0.35mg/mlとした。次
にコラーゲン混合物をプレートに加え(2.5ml/100mm皿)、少なくと
も1時間37℃にしてゲルを形成させた。ゲルが生成した後RPMIを除き、細
胞をRPMI/10%血漿由来血清(PDS)に加えた。PDSは、1/10倍
容量の3.8%クエン酸ナトリウムを含有する排気し冷却したチューブに血液を
吸い込んで調製した。次に血液を新しいSorvallチューブに移し、14,000
〜16,000RPM、4℃で20分間遠心した。血漿層を取り、1/50倍容
量の1MのCaCl2を加えた新しいチューブにプールした。血漿を混合し、そ
の試料を新しいSorvallチューブに入れ、37%で2時間インキュベートしてフ
ィブリンクロットを形成させた。次にこのクロットをピペットで掻き混ぜて収縮
させ、チューブを14,500RPM、25℃で20分間遠心した。上清を集め
、プールし、56℃で熱不活化させてから滅菌濾過し凍結した。
精製したヒト単球を、5単位/mlのGenzyme組換えヒトMCSFを含有する
10%PDS/RPMI中で5日間培養した後、LDL、酸化LDL、アセチル
化LDL(LDLは全て50μg/ml)、リゾホスファチジルコリン(Sigma
、37.5μM)またはホモシステイン(Sigma、1mM)で処理した。これら
の試薬と共に2時間から3日間までの範囲の期間インキュベーションした後、培
地を除去し、細胞をRNA溶菌バッファーに溶解させ、上記第6.1欄に記載し
たようにしてRNAを調製した。
リポタンパク質。酸化のためには、最初にヒトLDL(Sigam)をPBSで1
mg/mlに希釈した後、4℃でPBSに対して一晩透析した。次に、LDLを
PBSで0.3mg/mlに希釈した。次いで、CuSO4・5H2Oを5μMの
最終濃度まで加え、その溶液を37℃のインキュベーターにおいてTフラスコ中
で24時間インキュベートした。次にLDL溶液を4℃で0.15M NaCl
/0.3mM EDTAに対して2日間数回交換しながら透析した後取り出し、
Amiconスピンカラムを用いて1時間4000RPM、4℃で遠心することによっ
て遠心分離した。
アセチル化のためには、1mlの5mg/mlLDLを4℃のシェーカー上の
氷上で15mlのチューブ中の1mlのNaOAc飽和溶液に加えた。8μlの
無水酢酸を一度に2μlずつ1時間かけて加えた。次にLDLを4℃で48時間
0.15M NaCl/0.3mM EDTAに対して数回交換しながら48時
間透析した。誘導体化したLDLの最終濃度はOD290で分析した天然LDLの
希釈曲線と比較することによって決定した。いずれの場合も希釈剤としては0.
15M NaCl/0.3mM EDTAを使用した。
6.1.2.実例材料の分析
示差的ディスプレイ:
DNAの除去:RNAペレットをH2Oに再懸濁させ、OD260で分光光度法によ
って定量した。次に、サンプルのほぼ半分をDNAseIで処理して夾雑する染
色体DNAを除去した。以下の手順を用いてPCRによりRNAを増幅した。5
0μlのRNAサンプル(10〜20μg)、5.7μlの10×PCRバッフ
ァー(Perkin-Elmer/Cetus)、1μlのRNAse阻害剤(40単位/μl)(
Boehringer Mannheim、ドイツ)を一緒に混合し、ボルテックスで掻き混ぜ、簡
単に遠心した。2μlのDNAseI(10単位/μl)(Boehringer Mannhei
m)を反応混合物に加え、これを37℃で30分間インキュベートした。DEP
C H2Oで全容量を200μlにし、フェノール/クロロホルムで一回、クロ
ロホルムで一回抽出し、そして、20μlの3M NaOAc、pH4.8(D
EPC処理したもの)、500μlの無水ETOHを加えドライアイス上で1時
間または−20℃で一晩インキュベートすることによって沈殿させた。こうして
沈殿したサンプルを15分間遠心分離し、ペレットを70%ETOHで洗浄した
。サンプルを再度遠心分離し、残った液体を吸引し、ペレットを100μlのH2
Oに再懸濁させた。RNAの濃度はOD260で読み取ることによって測定した。
第一ストランドcDNA合成:各RNAサンプルに対して重複反応を平行して
行なった。400ngのRNA+DEPC H2O(合計容量10μl)を4μ
lのT11XX逆プライマー(10μM)(Operon)に加えた。各実験で使用した
特異的プライマーは上記第4欄の図面の説明に挙げてある。混合物を70℃で5
分間インキュベートしてRNAを変性させた後室温にした。以下の成分を含有す
る26μlの反応混合物を各変性RNA/プライマーサンプルに加えた。8μl
の5×First Strand Buffer(Gibco/BRL、Gaithersburg、MD)、4μlの0.1
M DTT(Gibco/BRL)、2μlのRNAse阻害剤(40単位/μl)(Boe
hringer Mannheim)、4μlの200μM dNTP混合物、6μlのH2O、
2μlのSuperscript逆転写酵素(200単位/μl)(Gibco/BRL)。反応混合
物を穏やかに混合し、42℃で30分間インキュベートした。次に60μlのH2
O(最終容量=100μl)を加え、サンプルを85℃で5分間変性させ、−
20℃で保存した。
PCR反応:13μlの反応混合物を氷上の96ウェルプレートの各チューブ
に加えた。この反応混合物は、6.4μlのH2O、2μlの10×PCRバッ
ファー(Perkin-Elmer)、2μlの20μM dNTP、0.4μlの35S d
ATP(12.5μCi/μl、合計50μCi)(Dupont/NEN)、2μlの前
方プライマー(10μM)(Operon)、および0.2μlのAmpliTaqポリメラー
ゼ(5単位/μl)(Perkin-Elmer)を含有していた。次に、2μlの逆プライ
マー(T11XX、10μM)を各チューブの側に加えた後、5μlのcDNAも
これらチューブの側(これらはまだ氷上にあった)に加えた。各実験で使用した
特異的プライマーは上記第4欄の図面の説明に挙げてある。チューブに蓋をし、
混合し、遠心管中で1000RPMまで上げた後すぐに氷に戻した。このPCR機
(Perkin-Elmer 9600)は、示差的ディスプレイ用に以下のようにプログラムを
組んだ。
このPCR機が94℃に達したときプレートを氷から取り出し、Perkin-Elmer
9600PCR機に直接入れた。PCRの後15μlの負荷(loading)染料(80%
ホルムアミド、10mM EDTA、1mg/mlのキシレンシアノール、1m
g/mlのブロモフェノールブルーを含有する)を加えた。負荷染料と反応混合
物を混合し、85℃で5分間インキュベートし、氷で冷却し、遠心分離し、氷上
に載せた。各チューブから約4μlを取ってprerun(60V)6%アクリルアミ
ドゲルに載せた。このゲルを約80Vで、最上の染料前面が底から約1インチに
達するまで走らせた。ゲルを3MM紙(Whatman Paper、英国)に移し、真空中
で乾燥した。バンドはオートラジオグラフィーで可視化した。
バンドの単離と増幅:選択的に発現したバンドを、乾燥したゲルからかみそり
の刃で切り出し、100μlのH2Oと共にマイクロ遠心管(microfuge tube)に
入れ、5分間100℃に加熱し、ボルテックスで掻き混ぜ、再び5分間100℃
に加熱し、再度ボルテックスで掻き混ぜた。冷却後、100μlのH2O、20
μlの3M NaOAc、1μlのグリコーゲン(20mg/ml)、および5
00μlのエタノールを加え、冷却した。遠心分離後ペレットを洗浄し、10μ
lのH2Oに再懸濁させた。
次に、こうして単離した選択発現したバンドを、以下の反応条件を用いてPC
Rにより増幅した。
58 μl H2O
10 μl 10×PCRバッファー
10 μl 200μm dNTP
10 μl 10μM 逆プライマー
10 μl 10μM 前方プライマー
1.5μl 増幅したバンド
0.5μl AmpliTaqポリメラーゼ(5単位/μl)(Perkin-Elmer)
PCRは、本欄で示差的ディスプレイに関して前記したプログラムを用いて実
施した。PCRの後、グリセロール負荷染料を加え、サンプルを2%調製用TAE/
Biogel(Bio101、La Jolla、CA)アガロースゲルにかけ、溶出した。次いでバン
ドをかみそりの刃でゲルから切り出し、室温にて15分間ボルテックスで掻き混
ぜ、Bio101製のMermaidキットを用い、マイクロ遠心管中で3容量のMermaid高塩
結合性溶液と8μlの再懸濁したglassfogを加えることによって精製した。次に
glassfogをペレット化し、エタノール洗浄溶液で3回洗浄した後、DNAを50
℃で10μl中に二回溶出させた。
サブクローニング:増幅したバンドをサブクローニングするにはTAクローニ
ングキット(Invitrogen、San Diego、CA)を用いた。典型的な連結反応混合物
は4μlの無菌H2O、1μlの連結バッファー、2μlのTAクローニングベ
クター、2μlのPCR産物、および1μlのT4DNAリガーゼから成ってい
た。PCR産物の容量は変えることができるが、PCR産物とH2Oの合計容量
は常に6μlとした。(ベクターのみを含む)連結混合物は細菌の形質転換前に
12℃で一晩インキュベートした。TAクローニングキットのコンピテント細菌
(INVαF′:endal,recAl,hsdR17(r-k,m+k),supE44,λ-,thi-1,gyrA
,relA1,φ80lacZαΔM15Δ(lacZYA-argF),deoR+,F')を氷上で解凍し、各チュ
ーブに2μlの0.5M β‐メルカプトエタノールを加えた。各連結混合物の
2μlを各チューブのコンピテント細胞(50μl)に加え、ボルテックスで掻
き混ぜることなく混合し、氷上で30分間インキュベートした。次にチューブを
42℃の浴にちょうど30秒入れた後、2分間氷に戻した。次いで、450μl
のSOC培地(Sambrookら、1989年、上掲)を各チューブに加えた後37℃
で1時間振盪した。次に細菌をペレット化し、〜200μlのSOCに再懸濁さ
せ、X‐galおよび60μg/mlのアンピシリンを含有するLuriaブロス寒
天プレートに撒き、37℃で一晩インキュベートした。次に白色のコロニーを摘
出し、PCRを用いてインサートに関してスクリーニングした。
2μlの10×PCRバッファー、1.6μlの2.5mM dNTP、0.
1μlの25mM MgCl2、0.2μlのM13逆プライマー(100ng
/μl)、0.2μlのM13前方プライマー(100ng/μl)、0.1μ
lのAmpliTaq(Perkin-Elmer)、および15.8μlのH2Oを含有するマスタ
ーミックスを作成した。40μlのマスターミックス試料を96ウェルプレート
のチューブに入れ、PCRの前にピペットチップで全細菌を加えた。PCR機(
Perkin-Elmer 9600)は、インサートスクリーニング用に以下のようにプログラ
ムを組んだ。
反応生成物を2%アガロースゲル上で溶出し、ベクターコントロールと比較し
た。インサートを含有するベクターを有するコロニーをLB/Ampプレート上
に画線することによって精製した。そのような菌株からベクターを単離し、Appl
ied Biosystems Automated Sequencer(Applied Biosystems,Inc.Seattle,WA
)を用いて配列を解析した。
ノーザン解析:ノーザン解析を実施して、増幅したバンドに対応する遺伝子の
選択発現を確認した。mRNAを検出するのに使用したプローブは以下のように
して合成した。典型的には2μlの増幅したバンド(〜30ng)、7μlのH2
O、および2μlの10×Hexanucleotide mix(Boehringer-Mannheim)を混合し
、5分間95℃に加熱した後、氷上で冷却した。増幅したバンドの容量は変える
ことができるが、バンドとH2Oの合計容量は常に9μlとした。3μlのdA
TP/dGTP/dTTP混合物(各々0.5mMで1:1:1)、5μlのα32
PdCTP(3000Ci/mM、合計50μCi)(Amersham,Arlington
,Heights,IL)、および1μlのKlenow(2単位)(Boehringer-Mannheim)を
混合し、37℃でインキュベートした。1時間後、30μlのTEを加え、反応
混合物をBiospin-6(登録商標)カラム(Biorad,Hercules,CA)上に載せ、遠
心分離した。溶出液の試料1μlを用い、scintillantを用いたシンチレーショ
ンカウンターで取込みを測定して、106cpm/μlの取込みが達成されたこと
を確認した。
サンプルを変性アガロースゲル上に載せた。300mlの1%ゲルは、3gの
アガロース(SeaKemTM LE,FMC BioProducts,Rockland,ME)と60mlの5×
MOPSバッファーを210mlの無菌H2Oに加えることによって作成した。
5×MOPSバッファー(0.1M MOPS(pH7.0)、40mM Na
OAc、5mM EDTA(pH8.0))は、20.6gのMOPSを800
mlの50mM NaOAc(800mlの無菌H2O中の13.3mlの3M
NaOAc pH4.8)に加え、次に10MのNaOHでpHを7.0に調節
し、0.5MのEDTA(pH8.0)を10ml加え、最終容量1Lになるま
でH2Oを加えることによって作成した。混合物を融解するまで加熱した後50
℃に冷却し、この時点で5μlの臭化エチジウム(5mg/ml)と30mlの
37%ホルムアルデヒドのゲルを加えた。このゲルをすばやく回転させて混合し
た後すぐに注いだ。
2μgのRNAサンプル、1×最終1.5×RNA負荷染料(60%ホルムア
ミド、9%ホルムアルデヒド、1.5×MOPS、0.075%XC/BPB染
料)およびH2Oを混合して最終容量を40μlとした。チューブを5分間65
℃に加熱した後氷上で冷却した。10μgのRNA MW標本(New England Bi
olabs,Beverly,MA)も染料で変性させ、ゲル上に載せた。ゲルをMOPS泳動
バッファー中32Vで一晩泳動した。
次にゲルを0.5μg/mlの臭化エチジウムに45分間、50mMのNaO
H/0.1MのNaClに30分間、0.1MのTris(pH8.0)に30
分間、そして20×のSSCに20分間浸した。各々の浸漬ステップは室温で振
盪しながら行なった。次にゲルを螢光ルーラーに沿って写真に取った後、Sambro
okら、1989年、上掲の方法に従ってHybond-Nメンブラン(Amersham)を用いて
20×のSSCに一晩ブロッティングした。
ハイブリダイゼーションでは、ブロットを、10mlのプレハイブリダイゼー
ション溶液(50%ホルムアミドと1×Denhardt溶液から成る)を含有するロー
ラーボトルに入れ、30分間65℃のインキュベーターに入れた。次にプローブ
を95℃に加熱し、氷上で冷却し、10mlのハイブリダイゼーション溶液(5
0%ホルムアミド、1×Denhardt溶液、10%硫酸デキストランから成る)に1
06cpm/mlの最終濃度まで加えた。次いでプレハイブリダイゼーション溶
液をプローブ溶液と交換し、42℃で一晩インキュベートした。次の日、ブロッ
トを室温の2×SSC/0.1%SDS中で30分間かけて三回洗浄した後、プ
ラスチックラップで覆い、露出させた。
RT−PCR解析:RT−PCRを実施して、増幅したバンドに対応する遺伝
子から選択発現したmRNAのレベルを検出した。第一ストランド合成は、20
μlのDNaseを加えたRNA(〜2μg)、1μlのオリゴdT(Operon)(
1μg)、および9.75μlのH2Oを混合することによって実施した。サ
ンプルを10分間70℃に加熱した後、氷上で冷却した。反応混合物に10μl
の第一ストランドバッファー(Gibco/BRL)、5μlの0.1M DTT、1.2
5μlの20mM dNTP(最終500μM)、1μlのRNAsin(40
単位/μl)(Boehringer Mannheim)および2μlのSuperscript逆転写酵素(
200単位/μl)(Gibco/BRL)を加え、1時間42℃にインキュベートした後
、5分間85℃にし、−20℃に保存した。
この逆転写したサンプルでPCRを実施した。各反応混合物は、2μlの10
×PCRバッファー、14.5μlのH2O、0.2μlの20mM dNTP
(最終200μM)、0.5μlの20μM前方プライマー(最終0.4μM)
、0.5μlの20μM逆プライマー(最終0.4μM)、0.3μlのAmpliT
aqポリメラーゼ(Perkin-Elmer/Cetus)、2μlのcDNA希釈または陽性コン
トロール(〜40pg)を含有していた。各実験で使用した特異的プライマーは
上記第4欄の図面の説明に挙げてある。サンプルを94℃のPCR9600機に
入れた(高温開始)。このPCR機は以下のようにプログラムを組んだ。
反応はcDNA希釈系列に対して行ない、いろいろなサイクルで72℃のステ
ップ中にチューブを機械から取り出した。反応生成物を1.8%アガロースゲル
上で溶出させ、臭化エチジウムで可視化した。
6.1.3.ターゲット遺伝子の染色体上位置確定
ヌクレオチド配列が決定されれば特定の染色体上の遺伝子の存在が検出される
。ターゲット遺伝子のヌクレオチド配列に基づいたオリゴヌクレオチドプライマ
ーを、個々のヒト染色体を鋳型として用いるPCR反応に使用する。各23のヒ
ト染色体の個々のサンプルは市販されている(Coriel Institute for Medical Re
search,Camden,NJ)。次の条件に従って染色体DNAを増幅する。10ngの
染
色体DNA、2μlの10×PCRバッファー、1.6μlの2.5mM dN
TP、0.1μlの25mM MgCl2、0.2μlの逆プライマー(100
ng/μl)、0.2μlの前方プライマー(100ng/μl)、0.1μl
のTaqポリメラーゼおよび15.8μlのH2O。サンプルを94℃のPCR
9600機に入れた(高温開始)。このPCRは以下のようにプログラムを組ん
だ。
7.実施例:例Bに応答して選択的に発現する遺伝子の同定:in vivo単球
本発明の別の態様においては、単球で選択的に発現した遺伝子を生理学的に極
めて適切なin vivo条件で検出した。実例Bでは、ヒト被検者を臨床設定条件に
保ち、その食事の脂肪/コレステロール含量を調節した。処置のいろいろな段階
で単球を単離し、その遺伝子発現パターンをコントロール群と比較した。
例Bを使用することにより、ヒトbcl-2遺伝子を同定した。その発現は高脂肪
/高コレステロールのアテローム形成状態に応じて低下する(図1)。アポE−
/−マウスは、ヒトプラーク発生に似た病理を有するアテローム性動脈硬化症の
最初のマウスモデルである(Plumpら、1992年、Cell 71:343-353)。食事(cho
w diet)中のこれらのマウスの血清コレステロールレベルはコントロールのlitte
rmatesより5倍高い。マウスbcl-2遺伝子の調節もまた血清コレステロールレベ
ルの影響を受けるかどうか確かめるために、アポE欠損マウスとlittermate野生
型コントロールから得た単球を精製し、定量RT−PCRを用いてマウスbcl-2
mRNAレベルを比較した。この方法によると、アポE欠損マウスでは、野生型
コントロールと比較してマウスbcl-2mRNAレベルが大幅に低かった(図3)
。
ヒトグルタチオンペルオキシダーゼ遺伝子(HUMGPXP1)の選択的発現パターンも
発見された。HUMGPXP1の選択発現は最初、後記第7.1.2欄に記載する予備
検出系で検出された。HUMGPXP1配列が得られた後、その遺伝子の選択的発現パタ
ーンが例Bの生理学的に適した条件下で確認・特徴付けされた。グルタチオンペ
ルオキシダーゼは、通常の好気性条件下および酸化性ストレス下における生育お
よび代謝の過程で生成する毒性の過酸化物の除去に関与することが知られている
。ヒト血漿グルタチオンペルオキシダーゼ遺伝子は最初、ヒト胎盤cDNAライ
ブラリーから単離された(Takahashiら、1990年、J.Biochem.108:145-148)
。これは骨髄系統の2つのヒト細胞系で発現することが示されている(Porterら
、1992年、Clinical Science 83:343-345)。また他の研究ではこの酵素の低
下したレベルと心臓発作の危険とが関連付けられてもいる(Guidiら、1986年
、J.Clin.Lab Invest.46:549-551; Wangら、1981年、Klin.Wochenschr
.59:817-818; Kokら、1989年、J.Am.Med.Assoc.261:1161-1164;および
Gromadzinska & Sklodowska、1990年、J.Am.Med.Assoc.263:949-950)。
グルタチオンペルオキシダーゼは、本明細書に記載するように心臓血管病の状態
でヒト単球においてダウンレギュレートされるということがすでに知られている
。
興味深いことに、bcl-2はアポトーシス(apoptosis)を予防するのに重要な役
割を果たしていると認識されており、bcl-2が存在しないときのグルタチオンペ
ルオキシダーゼの発現はアポトーシスを予防することによってその損失を相殺す
ることが可能である(Hockenbery ら、1993年、Cell 75:241-251)。本明細書
中で本欄に記載したbcl-2およびHUMGPXP1に関するこれらの知見は、細胞内部で
の高LDL濃度によって、または恐らくは酸化したLDLにより媒介される細胞
内の酸化性ストレスによって、引き起こされる細胞消滅誘発を含むプラーク形成
における単球の新規な役割を示唆していた。
アポトーシスとアテローム性動脈硬化症とのこの関係を確認するために、bcl-
2発現がアテローム性動脈硬化症を改善する能力を試験する。bcl-2は通常アテロ
ーム形成条件でダウンレギュレートされているので、スカベンジャー受容体プロ
モーター(これはアテローム形成条件下で単球泡沫細胞で誘発される)の制御下
でヒトbcl-2遺伝子が発現されるようにトランスジェニックマウス株を工学処理
する。次にこのトランスジェニックマウスをアポE欠損アテローム動脈硬化症マ
ウスモデルと交配させる。bcl-2ターゲット遺伝子の増大した発現がアテローム
性動脈硬化性を改善する能力は、トランスジェニックアポE欠損マウスで観察さ
れるプラーク形成の開始と進行の低下によって立証される。
したがって、これらの遺伝子の選択的発現を同定すると、心臓血管病の治療・
診断のターゲットが得られる。Bcl-2とグルタチオンペルオキシダーゼを介して
アポトーシス経路に干渉することにより、損傷の退行またはプラーク形成の防止
または両方が可能である。また、アポトーシスとアテローム性動脈硬化症との関
連の発見により、本明細書に記載した方法がアテローム性動脈硬化症過程に関与
する遺伝子産物の完全な一組(panoply)を同定するのに有効であることが立証さ
れる。さらに、実例Bの下におけるbcl-2とHUMGPXP1のダウンレギュレーション
によって、過剰のLDLの単球に及ぼす影響の研究に対するフィンガープリント
が得られる。
7.1.材料と方法
7.1.1.in vivoコレステロール研究
患者を合計9週間臨床設定条件に保ち、その間脂質摂取を極めて厳密に制御し
た。全部で3種の食事があり、各患者は各々の食事で3週間処置した。患者は、
心臓病または二重脂血症(dislipidemias)の病歴も症状ももたない健康な青年(
30代)の個人であった。この3種の食事は以下の通り。
アメリカ心臓関連食II
脂肪 25%
コレステロール 80mg/1000Kcal
多不飽和/飽和脂肪 1.5
平均的アメリカ食
脂肪 43%
コレステロール 200mg/1000Kcal
多不飽和/飽和脂肪 0.34
組合せ食
脂肪 43%
コレステロール 80mg/1000Kcal
多不飽和/飽和脂肪 0.34
これら3種の食事は等カロリーであり、食事中の脂質レベルが保たれる限り各
々の食事の個々の成分は参加者の好みによって変えることができる。
細胞の単離
各3週間の食事処置期間の終了時、12時間の絶食の後各患者から血液を採取
し、単球を精製した。50mlの血液を取り、凝血を防ぐために各々1.4ml
のクエン酸リン酸デキストロースを含有する排気した5つのチューブに入れた。
血液を50mlのチューブにプールし、400g(1250RPM/Sorvall RC
3B)、4℃で15分間遠心した。次に、血清上層(〜25ml)をピペットで取
り出し、4℃のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で置換した。血液を混合した後
、1850×g(2680RPM)、4℃で15分間遠心した。透明な上層のほ
とんどをピペットで取り出した後、界面のバフィーコートを〜5ml取り出した
。このバフィーコートを別の50mlのチューブに入れ、その取り出しに用いた
ピペットを20mlのPBSで洗浄した。次に、これらの細胞の試料を少し取っ
てPBSで1:1000に希釈し、細胞血球計を用いて顕微鏡下で計数した。次
いで赤血球細胞濃度をPBSで最終濃度1.5×109/mlに調節し、その試
料10mlを単球単離用にLeucoprep Becton Dickinson)に入れた。brake offを
備えたSorvall RT6000中において25℃で25分間チューブを遠心した。透明な
上層のほとんどを捨て、ゲル上の濁った層を貯蔵し50mlのチューブにプール
した。次に各チューブの容量を25℃のPBSで50mlに増やし、1000R
PM(Sorvall RC3B)、4℃で10分間遠心した。次いで液体を捨て、ペレットを
50mlのPBSに再懸濁させ、再度遠心した。この工程をさらに三回繰り返し
た。その後最終細胞ペレットを2mlのRNA溶解バッファー(Sambrookら、1
989年、上掲)に再懸濁させ、その後のRNA単離のために上記第6.1.1
欄に記載したように凍結した。
示差的ディスプレイ、ノーザン解析、RT−PCR、サブクローニングおよび
DNA配列決定は、上記第6.1.2欄に記載したようにして実施した。
7.1.2.予備検出系
本欄に記載する予備検出系を使用して、容易に検定されるin vitro系で選択的
に発現する配列を同定した。次に、心臓血管病に関与すると考えられているもの
となんらかの相同性を示した配列を実例Bで特異的プライマーまたはプローブま
たは両方として使用した。この実例Bでは上記第7.1.1欄に記載したように
生理学的に適した条件下で選択的発現が確かめられた。
細胞培養 健常ヒトドナーから血液(〜100ml)を採取してヘパリン(Bec
ton Dickinson)を含有するvacutainerチューブに入れた。血液をPD(Caまた
はMgを含まないリン酸緩衝生理食塩水(PBS)+0.3mMのEDTA)で
1:1に希釈し、Ficoll(リンパ球分離培地−Organon Teknikon)上に、青の蓋
をした50mlのFalconチューブ中で、30ml血液/7ml ficollとして重
層し、2000RPM、室温(r.t.)で25分間遠心分離した。バフィーコ
ートをピペットで取り出し、別の50mlのチューブに移し、PDで30mlに
希釈し、1200RPM、r.t.で10分間遠心分離した。ペレットを30m
lのPDに再懸濁させ、前記遠心分離ステップを繰り返した。このペレットを4
0mlのRPMI(2mMの1‐グルタミン+ペニシリン/ストレプトマイシン
)に再懸濁させ、4つのプレートに拡げ、37℃で2時間インキュベートした。
上清を除き、プレートを37℃のPBSで三回洗浄した。最後にプレートをRP
MI/20%ヒトAB血清(Sigma,St.Louis,MO)と共に各々10mlに再懸濁
させた。5日目培地を変え、100単位/mlのヒトγ‐IFN(Genzyme)を加
えた。7日目培地を取り出し、代わりにRPMI/20%ヒトLDL欠損血清+
100単位/mlのヒトγ‐IFNを入れた。天然LDL、酸化LDLおよびア
セチル化LDLをそれぞれひとつのプレートに加え、4番目のプレートはコント
ロールとして使った。決まったインキュベーション時間(5時間または24時間
)後培地を取り出し、細胞を2mlのグアニジンイソチオシアネートRNA溶解
バッファー(Sambrookら、1989年、上掲)に再懸濁させた。次に、溶菌した細
胞を23G.ニードルで洗浄し、5.7MのCsCl上に重層し、35KRPM
で20時間遠心分離した。Sambrookら、1989年、上掲の方法に従ってRNA
を単離した。
リポタンパク質は上記第6.1.1欄に記載したようにして調製した。示差的
ディスプレイ、ノーザン解析、RT−PCR、サブクローニングおよびDNA配
列決定は、上記第6.1.2欄に記載したようにして実施した。示差的ディスプ
レイに使用したプライマーはT11CC(逆)およびOPE4(前方)であり、5'
GTGACATGCC3'から成っていた。RT−PCRの場合、第一のストランドcDNA
をT11CCでプライムし、PCR反応はrfhma15プライマー(for-catgcctgtagaa
aaaggtt/rev-cttcatagaatctaagccta)およびマウスγアクチンプライマー(for-
cctgatagatgggcactgtgt/rev-gaacacggcattgtcactaact)を用いて実施した。
7.1.3.ヒトbcl-2を発現するトランスジェニックアポE欠損マウス
ヒトbcl-2遺伝子(hbcl-2)の発現を司るマウススカベンジャー受容体調節要
素(5kb)(M.Freemanら、1995年、未公表結果)を有する構築物(図3
2)をもつトランスジェニックマウスを製造した。このスカベンジャー受容体調
節要素(ScR)はトランスジェニックマウスの腹膜マクロファージにおけるレ
ポーター遺伝子発現を活性化することが知られている(M.Freemanら、1995
年、未公表結果)。この5kbの断片をNotI制限部位を介してヒトbcl-2cD
NA(Clearyら、1986年、上掲)に連結する。次に、ヒト成長ホルモン(hG
H)配列(Mayoら、1983年、Nature 306:86-88)を、充填したBamHI部位
とEcoRV部位を介してこの構築物の3′端に連結してメッセージ安定性を与
える。その後この構築物をXhoIで消化し、9kbのScR-hbcl2-hGH配列をベ
クター配列から精製する。別のプラスミドサンプルをKpnIで消化して低めの
レベルの発現を提供する1.5kbのスカベンジャー受容体調節配列のみを有す
る断片を得る。次にこれらの断片を、標準プロトコル(Hoganら、Manipulating t
he Mouse Embryo,1994,Cold ESpring EHarbor Laboratory Press)に従ってマ
ウスのFVB株およびC57BL/6株に由来するマウスの胚に別々に注入する
。生誕後、注入した胚由来のマウスから尾部を切り取り、サザンブロットにおい
てプローブとしてhbcl-2配列を用いてトランス遺伝子配列の存在を分析する。
次いで、ScR-hbcl2-hGH構築物を有するトランスジェニックマウスをそれぞれ
同じ株の野生型マウスと交配した後、その子を戻し交配してマウスのホモ接合株
を製造する。次にこれらのマウスをアポE欠損マウスと交配する。尾セクション
を調製しhbcl-2配列をプローブとするサザンブロットで、その子にScR-hbcl2-hG
Hが存在するか否か分析する。その後、Plumpら、1992年、上掲の方法に従っ
てその子の損傷の形成および進行について分析する。
7.2.結果
食事中の脂肪/コレステロール摂取量によって血清コレステロールレベルを操
作した患者の血液から得た単球RNAについて示差的ディスプレイ分析を実施し
た。図1は、低食事脂肪/低血清コレステロール状態で存在していたが高食事脂
肪/高血清コレステロール状態ではなくなるバンド#14を示している。バンド
#14から放射活性標識したプローブを調製し、同じ患者に由来するRNAから
調製したノーザンブロットとハイブリダイズさせたとき(図2)、低血清コレス
テロールで存在し高血清コレステロール状態では消失した8kbのバンドがみら
れた。バンド#14配列をサブクローニングし、配列を決定し、配列データベー
スと比較したところ、ヒトbcl-2遺伝子(Clearyら、1986年、Cell 47,19-28
)と98%(203/207bp)の配列類似性が得られたが、これはバンド#
14がbcl-2であることを示している。
単球で発現するグルタチオンペルオキシダーゼ(HUMGPXP1)を検査してbcl-2と
の生理学的関連性を決定した。HUMGPXP1の選択発現はin vitroで培養した単球を
用いた予備検出系で最初に検出された。ヒト単球は上記第7.1.2.欄に記載
したようにして調製した。5時間後細胞を溶解し、RNAを調製した。示差的デ
ィスプレイ分析を実施し、調節されたバンドを単離して特性決定した。そのよう
に調節されたひとつのバンド(バンド15と称する)の増幅した配列の独立した
たくさんのサブクローンからDNA配列を決定した。BLASTプログラム(Altschul
ら、1990年、J.Mol.Biol.215:403-410)を用いて、ヒト血漿グルタチオン
ペルオキシダーゼエキソン1(HUMGPXP1)に対する配列とバンド15の間で176
/177(99%)の配列類似性が見出された。この配列は報告された転写開始
部位の上流にみられる。にもかかわらず、RT−PCR分析で、実際バンド15
配列が報告された転写開始部位の下流の配列と同じ転写単位の内部にあることが
確認された。
この予備的結果に基づき、グルタチオンペルオキシダーゼ(HUMGPXP1)の遺伝子
発現パターンを実例Bの生理学的に関連するサンプルにおいて確定・特性決定す
るためにさらに解析した。アテローム形成性の条件下(高血清コレステロール)
および健常の状態(低血清コレステロール)のヒト血液から得られた単球をRT
−PCRで検査した。図4に示したように、高脂肪/コレステロール単球に由来
するHUMGPXP1プライマーによって増幅されたcDNAは、低脂肪/コレステロー
ル単球の場合より2〜3倍少ないようであるが、アクチンコントロールバンドは
同じである。
アポE欠損マウスとlittermate野生型コントロールに由来する単球を精製し、
定量RT−PCRを用いてマウスbcl-2mRNAレベルを比較した。この方法に
よると、マウスbcl-2mRNAレベルは、野生型コントロールと比較してアポR
欠損マウスでかなり低かった(図3)。
これらの結果は、bcl-2が損傷の形成と進行に干渉するための優れたターゲッ
ト遺伝子であることを立証している。正常な条件下でbcl-2発現がアポトーシス(
apoptosis)を防ぐことはすでに知られていた。したがって、アテローム形成性の
条件によって引き起こされたbcl-2の観察されたダウンレギュレーションは、そ
のようなアテローム形成性の条件がどのようにプラーク形成に導き得るかの説明
を提供する。通常の保護性bcl-2遺伝子のダウンレギュレートによって、高血清
コレステロールが一連の事象を誘発し、アポトーシス経路の誘導を引き起こし、
その結果細胞が死滅するようにプログラムされることになり、次いで炎症性の応
答、そして引き続くプラーク形成を生じる。
このモデルは、bcl-2の観察されたダウンレギュレーションを相殺することに
よって試験することができる。ヒトbcl-2遺伝子を、アテローム形成性条件下の
単球泡沫細胞中で活性化されるプロモーターによって転写されるScR-hbcl2-hGH
構築物に入れる。次にこの構築物を、他の場合にはアテローム性動脈硬化症に対
するモデルとして使用できるアポR欠損マウスに導入する。bcl-2発現のアテロ
ーム性動脈硬化症に対する効果は、この構築物を有するアポE欠損マウスにおけ
るプラーク開始・進行の低下によって立証される。したがって、bcl-2ターゲッ
ト遺伝子のダウンレギュレーションに対するそのような干渉によってアテローム
性動脈硬化症の軽減を達成することが可能である。
8.実施例:例Cに応答して選択的に発現する遺伝子の同定:内皮細胞のIL−
1誘発
本発明により、示差的ディスプレイを用いて、IL−1でin vitro処理した内
皮細胞中で選択的に発現する4つの新規な遺伝子を検出した。これらの遺伝子の
うちの3つ、rchd024、rchd032およびrchd036はいかなる公知の遺伝子とも相同
ではない。4番目の遺伝子rchd005はbumetanide感受性Na−K−Clコトラン
スポータータンパク質といわれるクローン化したサメ遺伝子と70%相同である
。この遺伝子のヒト同族体はすでに報告されているがその配列はまだ発表されて
いない(1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:2201-2205)。
これら4つの遺伝子のアップレギュレーションの発見により、IL−1によっ
て誘発された内皮細胞のフィンガープリントプロフィールが得られる。このフィ
ンガープリントプロフィールは、限定されるわけではないがアテローム性動脈硬
化症、虚血/再灌流、高血圧症、再狭窄および動脈炎症を始めとする心臓血管病
の治療および診断に使用することができる。
8.1.材料および方法
すでに記載されているようにして(In Progress in Hemostasis and Thrombosi
s,Vol.3,P.Spaet,editor,Grune & Stratton Inc.,New York,1-28)、正
常期の臍帯からHUVECの一次培養物を確立した。細胞を20%牛胎児血清完全培
地(1989,J.Immunol.142:2257-2263)で増殖させ、活性化の前に1〜3回継代
した。
活性化のためには、細胞を10単位/mlのヒトIL−1βと共に1時間また
は6時間培養してから、イソチオシアン酸グアニジニウムRNA溶解バッファー
(Sambrookら、1989年、上掲)で溶菌した。次に、溶解した細胞を23Gニー
ドルで洗浄し、5.7MのCsCl上に重層し、35Kで20時間遠心分離した
。
あるいは、細胞を100μMのリゾホスファチジルコリンまたは50μg/m
lの酸化されたヒトLDL(Sigma)の存在下で1時間または6時間インキュベー
トした。上記第6.1欄に記載したようにしてRNAを単離した。示差的ディス
プレイ、ノーザン解析、RT−PCR、サブクローニングおよびDNA配列決定
は上記第6.1.2欄に記載したようにして行なった。ただし、ノーザンブロッ
トハイブリダイゼーションは次のようにして行なった。プレハイブリダイゼーシ
ョンのために、ブロットを10mlのrapid-hyb溶液(Amersham)を含有するロー
ラーボトルに入れ、少なくとも1時間65℃のインキュベーター中に入れた。次
にハイブリダイゼーションのために、1×107cpmのプローブを95℃に加
熱し、氷上で冷却し、10mlのrapid-hyb溶液に加えた。次にこのプレハイブ
リダイゼーション溶液をプローブ溶液と交換し、65℃で3時間インキュベート
した。次の日、ブロットを室温の2×SSC/0.1%SDS中20分間で一回
、65℃の0.1×SSC/0.1%SDS中15分間で二回洗浄した後、プラ
スチックのラップで覆い、露出させた。
上記第6.1.3欄に記載した方法に従って染色体上の位置を決定した。rchd
024で使用したプライマーはfor-cccatagactaggctcatagおよびrev-tttaaagagaaat
tcaaatcであった。
8.2.結果
HUVECを10単位/mlのIL−1βで1時間または6時間活性化し、示差的
ディスプレイを用いて活動していないHUVECと比較した。図5に示してあるよう
に、rchd005と印したバンドがレーン11と12(IL−1、6時間)には存在
するが、レーン9と10(コントロール)またはレーン7と8(IL−1、1時
間)にはない。このバンドrchd005を単離し、サブクローニングして配列決定し
た。このバンドから調製したプローブを使用してノーザンブロットをスクリーニ
ングしたところ、発現は6時間でみられたが1時間またはコントロールではみら
れなかった(図6)。しかし、この同じプローブを、後記第9欄に記載する例D
に従って、ずれ応力を受けているRNAから調製したノーザンブロットにハイブ
リダイズさせたところ、やはり異なるパターンのアップレギュレーションがみら
れた(図7)。発現は1時間で高く、次いで6時間までにほぼ消滅した。増幅し
たrchd005DNAをサブクローニングして配列を決定した。配列解析により、bum
etanide感受性Na−K−Clコトランスポータータンパク質といわれるクロー
ン化したサメ遺伝子と配列類似性が70%である約360bpのインサートが見
出された(図8)。別のIL−1で誘発可能なバンドrchd024を図9に示す。I
L−1によってアップレギュレートされたRNAのノーザン解析によって6時間
で10kbのメッセージが存在することが示された(図10)が、これもずれ応
力下6時間でのアップレギュレーションの低いレベルを示している(図11)。
増幅したDNAのサブクローンからDNA配列を得た(図12)。データベース
を調査したところ大きな配列類似性はみられなかった。PCR増幅実験によって
、このrchd024遺伝子がヒト第4染色体に位置していることが決定された。
RT−PCR解析によって確認された(図14)IL−1による6時間の処理
後選択的に増大された発現(図13)に基づいてバンドrchd032を単離した。増
幅したrchd032配列をサブクローニングして配列を決定した(図15)。いかな
る公知の遺伝子とも大きな相同性はみられなかった。
またバンドrchd036もIL−1処理の6時間後の選択的発現に基づいて単離し
た(図16)。ノーザン解析(図17)によって、IL−1処理の6時間後にア
ップレギュレートされた8kbのバンドが見出された。別のノーザン解析を実施
して、後記第9欄の実施例に記載する実例Dのずれ応力条件下のrchd036を試験
した。興味あることに、処理1時間後でも6時間後でもバンドがない(図33)
ことによって示されているように、rchd036はずれ応力によって誘発されない。
この結果から、ずれ応力によって調節されないIL−1誘発性内皮細胞遺伝子の
一例が得られ(これはこれらの誘発経路は分離することができることを示唆して
いる)、炎症やアテローム性動脈硬化症の治療に高い特異性を示す薬剤が得られ
る可能性がある。増幅したDNAのサブクローンからDNA配列を得(図18)
、データベースの調査により配列類似性は見出されなかった。PCR増幅実験に
よって、rchd036遺伝子がヒト第15染色体に位置していることが決定された。
9.実施例:例Dに応答して選択的に発現する遺伝子の同定:内皮細胞ずれ応力
本発明により、示差的ディスプレイを用いて、in vitroで流体ずれ応力にかけ
た内皮細胞中で選択的に発現する遺伝子を検出した。ずれ応力は、正常な循環流
の領域におけるアテローム性動脈硬化症の損傷の原因として有力であると考えら
れている。実例Dの方法を用いて新規なDNA配列をもつ4つのバンドが同定さ
れた。
rchd502はラットmatrinF/GmRNA配列(Hakesら、1991年、Proc.Nat
l.Asad.Sci.U.S.A.88:6186-6190)と相同である。このラット遺伝子はプロス
タグランジン輸送体として機能するタンパク質をコードしていることが示されて
おり、PGTと指称されている(Kanaiら、1995年、Science 268:866-869)。
実際、rchd502の配列はPGT遺伝子にみられる相同な12個の膜貫通ドメイン
をコードしている。さらに、rchd502はずれ応力によってアップレギュレートさ
れるがIL−1ではされないことが立証されている。したがって、心臓血管病の
診断・治療のための優れた新規な手段となる。
rchd523遺伝子の完全な配列から、これは375個のアミノ酸と7つの膜貫通
ドメインから構成される新規なGタンパク質結合受容体タンパク質をコードして
いることが分かる。アミノ酸レベルでrchd523はアンジオテンシンII受容体と4
0%同一である。このような新規なタンパク質の発見は、心臓血管病の治療なら
びに診断およびモニター系を企画するのに特に有用である。シグナル伝達を行な
う際、Gタンパク質は、細胞生理に変化を起こす経路で初期に重要な役割をする
。したがって、rchd523遺伝子産物は、心臓血管病の治療における干渉用の優れ
たターゲットとなる。
rchd528に対するコード領域の配列を部分的に決定した。配列を並べてみたと
ころ、この部分rchd528配列は、表皮成長因子(EGF)リピートと特に強い相
同性をもつ細胞外ドメインを含有していることが判明した。
また、膜貫通タンパク質として、rchd502、rchd523およびrchd528の遺伝子産
物は内皮細胞表面において他の化合物によって容易にアクセスまたは検出され得
る。したがってこれらは、診断系において、また臨床試験で化合物の有効性をモ
ニターする際に、心臓血管病の状態の検出用として優れたターゲットとなる。さ
らに、これら4つの遺伝子産物の細胞外ドメインにより、これらに結合する化合
物を同定するための特に効率的なスクリーニング系となる。そのような化合物は
膜貫通遺伝子産物の活性を調節することによって心臓血管病を治療するのに有用
であり得る。
rchd534遺伝子の完全なコード領域の配列も得られた。このrchd534遺伝子はDr
osophila gene Mothers against decapentaplegic(Mad)(Sekelskyら、19
95年、Genetics 139:1347-1358)と相同である235個のアミノ酸で構成され
る新規なタンパク質をコードしている。またこのrchd534遺伝子は、C.elegans
ゲノムプロジェクト(Wilsonら、1994年、Nature 368:32-38)で同定されたCa
enorhabditis elegans由来の未知の機能の配列と極めてよく似ている。MAD
は、骨形態形成タンパク質‐4/形質転換成長因子‐β(TGF−β)のDrosop
hila同族体であるDecapentaplegic(dpp)と同じ経路内にある。
また、実例Dの方法を用いて、以前に同定されているシクロオキシゲナーゼII
(COXII)ともいわれるヒトプロスタグランジンエンドペルオキシドシンタ
ーゼII型も同定された(バンドrchd505)。この遺伝子は炎症に関与しておりI
L−1によってアップレギュレートされることがすでに知られていた(Jonesら、
1993年、J.Biol.Chem.268:9049-9054)が、そのずれ応力によるアップレ
ギュレーションは知られていなかった。この結果により、心臓血管病に関与する
遺伝子の検出における、本発明で使用した技術の一般的有効性が確認された。
rchd530と指称する別のアップレギュレートされた遺伝子の配列はすでに同定
されているヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子(MnSOD)と
同一であることが示された。MnSODのずれ応力下でのアップレギュレーショ
ンは以前に知られていなかった。
ずれ応力を受けた内皮細胞におけるこれら6つの遺伝子のアップレギュレーシ
ョンにより、限定されるわけではないがアテローム性動脈硬化症、虚血/再灌流
、高血圧症および再狭窄を始めとする心臓血管病の研究のためのフィンガープリ
ントが得られる。これらの遺伝子のうちのひとつrchd502が実例C(IL−1誘
発)でアップレギュレートされなかったという事実により、ずれ応力に特異的な
生理学的現象を区別しターゲットとする極めて有用な手段が得られる。
病気の状態における内皮細胞でのこれらの遺伝子の誘発の重要性をさらに解析
するために、その発現に対するエストロゲンの影響を試験した。エストロゲン置
換療法を受けている閉経後の婦人および動物モデルにおける研究によって、エス
トロゲンは、冠動脈症の発生を減らすのに粥状保護効果(atheroprotective effe
ct)を有することが立証された。これらの研究によりエストロゲンが肝臓におい
てLDLレベルを低下させてHDLレベルを増大させるのに効果があることを立
証しているが、これらのリポタンパク質の変化がエストロゲンの心臓保護効果(c
ardioprotective)を全て受け持っていると考えられるわけではない。
ある種の病気の状態で選択的に発現するターゲット遺伝子の同定により、エス
トロゲンの心臓血管病に対する効果をさらに解析できる。したがって、内皮細胞
におけるターゲット遺伝子発現に対するエストロゲンの効果を特定の実例による
発現パターンと比較した。特に、エストロゲン受容体が転写因子である(Kumaran
d Chambon,Cell 55:145-156,1988)として、ずれ応力によって誘発された遺伝
子の、HUVEC内におけるエストロゲンによる調節を検査した。エストロゲンの他
に、同様に心臓保護効果を有することが報告されているエストロゲン受容体アゴ
ニスト/アンタゴニストタモキシフェン(Graingerら、Nature Medicine 1:1067-
1073,1995)およびラロキシフェン(Blackら、J.Clin.Invest.93:63-69,1994
)による処理も検査した。その結果、ずれ応力によってアップレギュレートされ
るrchd528はエストロゲンによってもアップレギュレートされることが立証され
、ずれ応力とエストロゲンは心血管症において類似の役割を果たし得ることが示
唆された。
9.1.材料および方法
すでに記載されているようにして(In Progress in Hemostasis and Thrombosi
s,Vol.3,P.Spaet,editor,Grune & Stratton Inc.,New York,1-28)、正
常期の臍帯からHUVECの一次培養物を確立した。細胞を20%牛胎児血清完全培
地(1989,J.Immunol.142:2257-2263)で増殖させ、ずれ応力誘発の前に1〜3
回継代した。
誘発のためには、第二継代HUVECを組織培養処理ポリスチレンに載せ、すでに
記載されているようにして(1994年、J.Clin.Invest.94:885-891)10d
yn/cm2の層流に1時間および6時間、またはすでに記載されているように
して(1986年、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83:2114-2117)3〜10dy
n/cm2の乱流にかけた。
ターゲット遺伝子発現に対するエストロゲンの影響を試験するために、HUVEC
を、1μg/mlのインシュリン、1μg/mlのトランスフェリン、50μg
/mlのゲンタマイシンおよび200μg/mlの脂肪酸不含BSAを補充した
無血清内皮細胞基礎培地で培養した。細胞を最終濃度1nmのエストラジオール
、タモキシフェンまたはラロキシフェンで4時間または16時間処理した後溶解
し、RNAを単離した。rchd528の場合はノーザン解析用のプローブとして、塩
基1600〜2600を含むDNA断片を使用した。
上記第6.1欄に記載したようにしてRNAを単離した。示差的ディスプレイ
、ノーザン解析、RT−PCR、サブクローニングおよびDNA配列決定は上記
第6.1.2欄に記載したようにして行なった。ただし、ノーザンブロットハイ
ブリダイゼーションは上記第8.1欄に記載したようにして行なった。
RACEにより、またはcDNAライブラリーをプローブ探査することにより
、または両方により、遺伝子の大きめの部分または完全なコード領域を含有する
cDNAを得た。RACE法はキットを用いてその製造業者の指示に従って実施
した(Clontech,Palo Alto,CA。また、Chenchikら、1995年、CLONTECHniqu
es(X)1:5-8、Barnes,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:2216-2220、およ
びChengら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:5695-5699参照)。プライマーは、
増幅した配列か、またはcDNAライブラリー由来の単離体から得た配列に基づ
いて設計した。鋳型のmRNAはずれ応力を受けているHUVECから単離した。
遺伝子の一部を含有する増幅した配列をサブクローニングした後、別個に使用
してcDNAライブラリー内の対応する遺伝子をコードしているcDNAを回収
した。プローブは、上記第6.1.2欄に記載したようにして、ベクターDNA
に由来するサブクローニングしたインサートDNAを単離し32Pで標識すること
によって調製した。使用したライブラリーは個々のヒト心臓、ヒト膵臓およびヒ
ト肺cDNAライブラリー(Clontech,Palo Alto,CA)、ならびに本欄に上記し
たようにずれ応力を受けているHUVECから単離したmRNAから調製したcDN
Aライブラリーを含んでいた。HUVECcDNAライブラリーは、バクテリオファ
ージλ‐ZAPベクター(Stratagene,La Jolla,CA)を用いて周知の方法(Samb
rookら、1989年、上掲)に従って製造した。ライブラリーを周知の方法(Sa
mbrookら、1989年、上掲)を用いてそれぞれのプローブによってスクリーニ
ングした。プローブによって検出されたライブラリーから得たプラークを単離し
、ファージベクター内のcDNAインサートを配列決定した。
上記第6.1.3欄に記載した方法に従って染色体上の位置を決定した。rchd
523で使用したプライマーはfor-atgccgtgtgggttagtcおよびrev-attttatgggaaggt
ttttaca、rchd534ではfor-cttttctgcgtctcccatおよびrev-agacatcagaaactccaacc
であった。
各種ヒト臓器および組織から抽出したRNAのノーザンブロット解析は、市販
されているプレブロットフィルター(Clontech,Palo Alto,CA)を用いて行なっ
た。
9.2.結果
HUVECに層状ずれ応力を1時間または6時間加え、静的コントロール細胞と示
差的ディスプレイで比較した。図19に示したように、バンド(rchd502)が同定
された。これはレーン5、6(6時間)でみられたがレーン1,2(コントロー
ル)ではみられなかった。このバンドを切り出し、増幅し、配列を決定した。増
幅したrchd502配列を用いてノーザン解析をしたところ、コントロールと比較し
て6時間でアップレギュレートされた4.5kbのバンドが明らかになった(図
20)。rchd502プローブをIL−1で誘発した内皮細胞から調製したノーザン
ブロットにハイブリダイズさせたところ、4.5kbバンドのアップレギュレー
ションはみられない(図21)。この結果により、IL−1によって調節されな
いがずれ応力によって誘発可能な内皮細胞遺伝子の第一の例が得られ、これはこ
れらの誘発経路が分離することができることを示唆している。また、炎症やアテ
ローム性動脈硬化症の治療に大きな特異性を有する薬剤が得られ得る。rchd502
の増幅した領域の配列を使用して遺伝子全体をクローニングするためのプローブ
を設計した。
5′および3′RACE反応を実施してrchd502遺伝子の全コード配列を含有
する2.2kbのcDNAを得た。RACEから得た配列情報に基づき、ヒト膵
臓ライブラリーからrchd502コード領域の最初の200塩基対を除く全てを含有
するファージクローンを単離した。このクローンをpFCHD502SFと指称する。残り
の200塩基対は、特異的なプライマーを用いたPCRによってヒト肺ライブラ
リーから増幅させて得た。rchd502遺伝子の塩基対1〜265を含む断片をTA
クローニングベクターにサブクローニングしてプラスミドpFCHD502SJを製造した
。すなわち、rchd502は、塩基対1〜265を含むpFCHD502SJと、塩基対201
からコード領域の3′端まで、さらに3′非翻訳配列を含むpFCHD502SFとの2つ
のサブクローンによって表わされる。
コード領域全体を含む完全配列を図22に示す。rchd502は、プロスタグラン
ジン輸送体(Kanaiら、1995年、上掲)をコードしているラットPGT遺伝
子と強い相同性(81.4%)を示す。これは12の膜貫通(TM)ドメインを
含有している。これら12のTMドメインの各々の概略の境界は次の通りである
。
TM1:ほぼアミノ酸31〜ほぼアミノ酸52
TM2:ほぼアミノ酸68〜ほぼアミノ酸89
TM3:ほぼアミノ酸102〜ほぼアミノ酸121
TM4 :約第173アミノ酸から約第194アミノ酸。
TM5 :約第206アミノ酸から約第227アミノ酸。
TM6 :約第259アミノ酸から約第280アミノ酸。
TM7 :約第315アミノ酸から約第337アミノ酸。
TM8 :約第366アミノ酸から約第385アミノ酸。
TM9 :約第403アミノ酸から約第423アミノ酸。
TM10:約第510アミノ酸から約第530アミノ酸。
TM11:約第555アミノ酸から約第575アミノ酸。
TM12:約第607アミノ酸から約第627アミノ酸。
未処理の対照細胞に比較して、ずれ応力バンド rchd505はずれ応力の1時間お
よび6時間後に減少した(図23)。ノーザン分析によって、rchd505 が1時間お
よび6時間のずれ応力処理後にアップレギュレートされたことを除いて、示差的
発現をすることが明らかにした(図24)。Paradigm CにしたがってIL-1で処理さ
れた細胞において、このバンドが同様にアップレギュレートされた(図25)。配
列分析によって、rchd505 はすでに特性決定されており、シクロオキシゲナーゼ
II(cox II)としても知られている、ヒトエンドペルオキシドシンターゼII型で
あることが明らかになった。
rchd523 は示差的ディスプレイにおいて1時間および6時間のずれ応力処理後
にアップレギュレートされたバンドとして検出された(図26)。rchd523 の6時
間後のアップレギュレーションはRT−PCRによって確認された(図27)。増
幅されたrchd523 配列をサブクローン化し、そして単離物を配列決定し、pRCHD5
23と命名した。rchd523 遺伝子の全コード配列を含有する2.5 kbのcDNAを得
るため、RACE操作法を利用した。rchd523 の完全コード配列を含有するcDNA
単離物をpFCHD523と命名する。配列分析によって、rchd523 遺伝子産生物は375
アミノ酸からなり、7つの膜貫通ドメインからなっている、新規なG−タンパク
質と結合した受容体であることが明らかになった。アミノ酸レベルにおいては、
rchd523 はアンギオテンシンII受容体と40%同一性である。PCR増幅実験によ
って、rchd523 遺伝子はヒト第7染色体に位置していることが決定された。
rchd528 もまた1時間および6時間のずれ応力処理後にアップレギュレートさ
れたバンドとして検出された(図29)。この結果はノーザン分析によって確認さ
れた。この分析では、rchd523 の増幅された配列のプローブが、1時間後に中程
度にアップレギュレートされ、6時間後に非常に強くアップレギュレートされる
約8 kbのメッセージを検出した(図30)。増幅された配列をサブクローン化し、
配列決定した。rchd528 遺伝子の単離用のcDNAライブラリーを最初にプロー
ブするために、この配列の情報を使用した。
rchd528 の部分クローンを単離するため、ずれ応力HUVEC cDNAライブラリ
ーを最初にプローブするために、この増幅された配列を使用した。その後、全rc
hd528 コード領域を包含する重複クローンを得るため、ヒト心臓cDNAライブ
ラリーのプローブおよびPCR増幅と組み合わせて、RACE操作法を使用した。rc
hd528 遺伝子の完全コード領域は、それぞれpBluescript 中にクローン化された
rchd528 遺伝子のセグメントを含有している以下の3つのプラスミド中に含まれ
る:核酸1-1200を含有するpFCHD528A 、核酸237-2982を含有するpFCHD528B 、お
よび核酸2982からコード領域の3'末端までを含有するpFCHD528C 。rchd528 遺伝
子の完全コード領域を含有するDNA配列を図31に示す。
多数の異なるタンパク質との相同性に基づいて、rchd528 遺伝子産生物は表皮
成長因子(EDF )の反復単位を有する細胞外ドメインを含有することが示された
。EGF 反復のおよその範囲は約第1089アミノ酸から約第1122アミノ酸である。そ
こには約第5アミノ酸から約第28アミノ酸の範囲のシグナルペプチドがある。ま
た、約第1348アミノ酸から約第1370アミノ酸の範囲の膜貫通ドメインがある。そ
の上、約第1140アミノ酸から約第1151アミノ酸のアスパラギン加水分解部位共通
配列がある。各種のヒト器官および組織から単離したmRNAのノーザンブロッ
ト分析によって、rchd528 が心臓において非常に高度に発現されることが明らか
になった。
内皮細胞におけるrchd528 の発現に対するエストロゲンの影響もまた試験した
。ノーザンブロット分析によって、対照細胞に対して、エストロゲンで一晩処理
した後のrchd528 の有意なアップレギュレーションが明らかになった。
rchd530 と命名したバンドは、6時間のずれ応力後にHUVEC 中で強くアップレ
ギュレートされた配列に相当する(図36)。このアップレギュレーションは乱流
ずれ応力に対するよりも層流ずれ応力に対する方が大きい。配列分析によってrc
hd530 はヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ(MnSOD)と同一であるこ
とが明らかになった。ずれ応力によるMnSOD の誘導は以前には知られていなかっ
た。MnSOD はIL-1での6時間の処理によって誘導されることもまた示された。
rchd534 もまたずれ応力に応答してアップレギュレートされるものとして検出
された。ノーザン分析によって、rchd534 が6時間のずれ応力処理後に強く誘導
されることが明らかになった(図34)。増幅された配列をサブクローン化し配列
決定して、全長rchd534 のcDNAを回収するためのプローブとして使用するた
めに再単離した。3.3 kbのλ-ZAPクローンを配列決定して全長rchd534 のcDN
Aを明らかにした(図35)。rchd534 遺伝子の全コード領域を含有するこのクロ
ーンをpFCHD534クローンと命名した。コードされたタンパク質は235 アミノ酸か
らなっている。PCR増幅試験によつて、rchd534 遺伝子がヒト第15染色体に位
置することが決定された。
データベース中の配列との最初の比較ではrchd534 はいずれの既知のDNA配
列とも相同性は示されなかった。その後実施した探索の結果、rchd534 はショウ
ジョウバエ遺伝子 Mothers against decapentaplegic(Mad)(Sekelskyら,1995,G
enetics 139:1347-1358)の相同体であること、またCaenorhabditis elegans ゲ
ノムプロジェクト中で同定された、C.elegans からの機能が未知の1配列(Wils
onら、1994,Nature 368:32-38)に有意に類似していることが明らかになった。
rchd534 はまた、上記第8節に記載したようなParadigm Cの条件下で試験した
時、IL-1によって調節されないことが示された。rchd502 と全く同様に、rchd53
4 はIL-1によって調節されないずれ応力誘導性の内皮細胞遺伝子の一例であって
、これらの誘導経路を分離することができることの確証となるものであり、そし
て炎症およびアテローム性動脈硬化の治療のためのより特異的な薬剤を提供する
ことになるかも知れない。
10.実施例:臨床試験の代用マーカーとしてのパラダイムA下での遺伝子の使 用
本発明にしたがって、5.1.1.1 節から5.1.1.6 節に記載したいずれかのパラダ
イムから誘導されたフィンガープリントプロフィールを使用して、ヒト患者にお
ける薬剤の臨床試験をモニターすることができる。上記5.5.4 節で一般的に記載
したフィンガープリントプロフィールは特定の病状に対応する特定的な遺伝子調
節の特性的なパターンを示す。5.1.1.1 節に記載した、および例えば上記第6節
の例で示したパラダイムAは酸性ストレス下における単球のフィンガープリント
プロフィールを提供する。このプロフィールは指標となる読みを与えるので、し
たがって、酸化IDL の取り込みに対する単球の生理的応答を与える。これによっ
て、臨床試験を実施している患者の単球上に示差的ディスプレイが表れることに
よって、酸化ポテンシャルに対する抗酸化薬剤の影響を測定することができる。
10.1.患者の処置および細胞の単離
抗酸化活性を有すると推測される化合物を試験患者に投与することができる。
対照患者にはプラシーボを与える。12時間の絶食後に各患者から血液を取り、上
記第7.1.1 節のように単球を精製する。上記第6.1.1 節にしたがってRNAを単
離することができる。
10.2.サンプルの分析
上記第6.1.2 節にしたがって、RNAを示差的ディスプレイ分析に供すること
ができる。上記第6.2 節にしたがって、パラダイムAにおいて酸化IDL によって
アップレギュレートされたバンドの強度の減少、およびパラダイムAにおいて酸
化IDL によってダウンレギュレートされたバンドの強度の増加によって、単球の
生理的応答状態の減少が示される。
11.実施例:心臓血管病の状態のイメージング
本発明にしたがって、病気のまたは損傷された組織を画像化するために、患部
組織の表面に位置する示差的に発現された遺伝子産生物をマーカーとして使用す
ることができる。示差的に発現された遺伝子産生物に特異的な複合抗体を患者ま
たは試験動物に静脈内投与することができる。この方法は、病気のまたは損傷し
た組織を侵害しないで可視化させるという利点を与える。
説明の目的で、この方法をrchd523 遺伝子産生物について詳細に記載する。こ
の原理および手法を、例えばrchd502 およびrchd528 遺伝子産生物を含む、いず
れの同定された膜貫通ターゲット遺伝子産生物に対しても適用することができる
。
11.1.モノクローナル複合抗体
上記第5.4.2 節の方法を使用して、rchd523 遺伝子産生物などの示差的に発現
された表面遺伝子産生物が組換え体ホスト中に発現され、精製される。好ましく
は、rchd523 産生物の1以上の細胞外ドメインを含有するタンパク質断片が産生
される。精製後、上記第5.4.3 節にしたがって、F(ab')2またはFab 断片を産生
させるのに使用される。その後、上記第5.8.3 節にしたがって、DTPAなどの複合
金属キレート剤を使用して、これらの断片をテクネチウム-99m(99mTc)で標識
する。
11.2.画像化剤の投与および検出
アテローム性動脈硬化、再狭窄、または虚血/再潅流と診断された患者に対し
て、標識Mab を静脈内投与することができる。検出を可能にするために標識した
抗体が病気のまたは損傷した組織部位(または複数の部位)に局在して、rchd52
3 遺伝子産生物と結合するのに十分な時間を与える。標識によって発生するシグ
ナルを光走査装置によって検出する。その後、検出されたシグナルを、rchd523
遺伝子発現がアップレギュレートされる内皮細胞などの細胞を示す組織の画像に
転換する。
12.実施例:rchd523 遺伝子産生物のリガンドおよびrchd523 遺伝子産生物− リガンド相互作用のアンタゴニストのスクリーニング
rchd523 遺伝子産生物は多数の膜貫通ドメインを含有する、Gタンパク質が連
結している受容体タンパク質ファミリーの一つである。このタンパク質ファミリ
ーの受容体結合活性を、この受容体遺伝子が発現される細胞の膜を通過するCa2+
の移動度をアッセイすることによって検出する。以下に記載するこのアッセイ
はrchd523 遺伝子産生物受容体に結合するリガンドを同定するために使用される
。このリガンド−受容体活性を確立することによって、リガンド−受容体相互作
用のアンタゴニストを同定するためのスクリーニング法が提供される。アンタゴ
ニストはリガンド−受容体結合によって誘導されるCa2+の移動度を阻害する能
力として検出される。したがって、こうしたアンタゴニストは疾病状態において
アップレギュレートされるこのターゲット遺伝子の産生活性を妨害することによ
って、心臓血管疾患の治療に有効な化合物を提供する。
rchd523 遺伝子産生物へのリガンドの結合は以下のようにして測定される。pF
CHD523からrchd523 遺伝子の全コード領域を含有するcDNAを取り出して、哺
乳類細胞中で高度に発現されるプロモーターの制御下で好適な発現ベクター中に
入れる。生成した構築物を骨髄細胞中にトランスフェクトし、その後標準的手法
によってFURA-2またはINDO-1を添加する。細胞培養物にリガンドを添加して、細
胞膜を通過するCa2+の移動によって測定されるシグナルの導入を誘発するよう
な方法で、リガンドのrchd523 受容体への結合能力を試験する。リガンドによっ
て誘導されるCa2+の移動は、Grynkiewicz ら、1985,J.Biol.Chem.260:3440 の
記載にしたがって、蛍光分光分析によって測定する。ターゲット遺伝子産生物の
受容体ドメインと反応するリガンドはそれらの蛍光シグナルを生成する能力によ
って同定される。バックグラウンドに対して生成された蛍光レベルを測定するこ
とによって、それらの受容体との結合活性を定量し、比較する。
その後、リガンド−受容体結合を妨害する能力について、候補となるアンタゴ
ニストをスクリーニングする。rchd523 遺伝子産生物を発現するトランスフェク
トされた骨髄をリガンドのみ、および候補アンタゴニストの存在下のリガンドで
処理する。蛍光シグナルを減少させる候補アンタゴニストをリガンド−rchd523
受容体相互作用のアンタゴニストに選定する。
13.ターゲット遺伝子ペプチド配列に対するポリクローナル抗体
示されたcDNAのアミノ酸配列に相当するペプチド配列を選定し、合成およ
び抗体の製造のためにResearch Genetics(Huntsville,AL)に提出した。ペプチド
を文献の記載(Tam,J.P.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5409-5413;Tam,J.P
.,and Zavala,F.,1989,J.Immunol.Methods 124:53-61;Tam,J.P.,and Lu,Y.A.,1
989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9084-9088)にしたがって改変し、同容量の Fr
eund アジュバンド中で乳化し、ウサギの背部の3,4箇所に1免疫当たり総量
で1.0ml(ペプチド0.5 mg)となるように皮下注入した。この動物に2および6
週間後に追加免疫し、4,8,および10週間目に採血した。血液を凝固させて、
遠心分離によって血清を採取した。
使用したペプチドを下記に要約する。
14.in situ ハイブリダイゼーションによる新規遺伝子の位置決定
2つのターゲット遺伝子、rchd502 およびrchd528 の発現をin situハイブリ
ダイゼーションによって試験した。発現を、心臓血管疾患を有する生存している
患者から取り出した、ヒト頸動脈内膜切除サンプル、すなわちヒト心臓血管組織
中で検出した。各遺伝子についての発現パターンは、内皮細胞中で構成的に発現
することが知られている陽性対照について検出されるパターンに類似しているこ
とが観察された。これらの結果は、心臓血管疾患におけるrchd502 およびrchd52
8 の両者の役割の証拠をさらに提供するものである。病態組織の内皮細胞内にお
けるこれらのターゲット遺伝子の発現の特異的な高数値の検出は、アテローム性
動脈硬化の病変の単なる検出が提供するよりも、より明確な診断およびより明確
な治療方法を与えることになる。
14.1 方法
ヒト頸動脈内膜切除サンプルのパラフィン包埋切片 7μm をキシレン中で脱パ
ラフィンし、エタノール勾配シリーズで再水和し、4% PFA/PBSで15分、ポスト
フィックスした。PBS で洗浄後、切片を37°で15分、2μg/mlプロテナーゼKで
消化し、再び4% PFA/PBSで10分インキュベートした。その後切片をPBS で洗浄
し、0.2 N HClとともに10分インキュベートし、PBS で洗浄し、0.25%無水酢
酸/1 M トリエタノールアミンとともに10分インキュベートし、PBS で洗浄し、
70%エタノールおよび100%エタノールで脱水した。
50%ホルムアミド、10%硫酸デキストラン、1x Denhardt 溶液、600 mMNaC
l、10 mM DTT 、0.25% SDSおよび100μg/mltRNAの存在下で、55°で18時
間、1)ヒトフォン・ウィルブランド(von Willebrand)因子遺伝子のコード領域
の 0.8 kB SmaI断片セグメント、2)新規遺伝子 rchd502の部分を含有する断片
(塩基396-622 を除く塩基対配列3-1195)、および3)新規遺伝子 fchd528の断
片(塩基対配列3718-6407)をコードする35S放射性標識(5×107cpm/ml)cR
NAプローブでハイブリダイゼーションを実施した。ハイブリダイゼーション後
、スライドを5x SSCで55°で、50%ホルムアミド/2x SSCで55°で30分、10 mM
Tris−HCl(pH7.6)/500 mMNaCl/1 mM EDTA(TNE)で37°で10分洗浄し、TNE
中の10μg/mlRNase中で37°で30分インキュベートし、TNE で37°で10分洗浄
し、2x SSC中で50°で30、1回インキュベートし、70%エタノールおよび100%
エタノールで脱水した。スライドをKodak NBT-2 写真乳剤に浸漬し、4°で7日間
露光し、続いてKodak Dektol現像機で現像することによって、mRNA転写物の
位置を検出した。スライドをヘマトキシリンおよびエオシンで対比染色して、撮
影した。in situ ハイブリダイゼーション試験のための対照の中に、バックグラ
ウンド数値以上のシグナルを示さないセンスプローブの使用が含まれた。
14.2 結果
rchd502 およびrchd528 遺伝子はそれぞれ、構造的に発現される内皮細胞マー
カーである、フォン・ウィルブランド因子からの陽性対照シグナルに類似した発
現パターンを表した。シグナルはフォン・ウィルブランド因子について観察され
るものと同様に、rchd502 およびrchd528 の両者について、頸動脈の内腔表面を
被覆するほとんどの内皮細胞から検出された。試験した3つの遺伝子はいずれも
平滑筋細胞およびマクロファージを含む、組織中に存在するその他の細胞型にお
いて発現を示さなかった。
15.微生物の寄託
以下の微生物を、1995年1月11日、Agricultural Research Service Culture
Collection(NRRL),Peoria,Illinoisに寄託し、以下に示す受託番号が定められた
。
以下の微生物を、1995年6月6日、Agricultural Research Service Culture
Collection(NRRL),Peoria,Illinoisに寄託し、以下に示す受託番号が定められた
。
以下の微生物を、1996年2月7日、American Type Culture Collection(ATCC)
,Rockville,Marylandに寄託し、以下に示す受託番号が定められた。
以下の微生物を、1996年2月9日、American Type Culture Collection(ATCC)
,
Rockville,Marylandに寄託し、以下に示す受託番号が定められた。
本発明はここに記載した特定の態様の範囲に限定されるべきものではなく、こ
れらの態様は本発明の個々の様相の一説明のためのものであり、機能的に等価な
方法および成分が本発明の範囲内に含まれるものである。実際に、ここまでの記
載および添付した図面から、ここに示し、そして記載したものの他に、本発明の
各種の改変が、当業者にとって明らかになるであろう。そうした改変が請求範囲
の中に含まれることを意図するものである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 FI
A61K 48/00 ABU G01N 33/15 Z
C12Q 1/68 33/50 T
G01N 33/15 33/53 N
33/50 C07K 14/47
33/53 A61K 37/50 ABS
// C07K 14/47 37/02
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FR,GB,GR,IE,IT,LU,M
C,NL,PT,SE),AU,CA,JP
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.次のヌクレオチド配列: rchd005 (配列番号1)、 rchd024 (配列番号2)、 rchd032 (配列番号3)、 rchd036 (配列番号4)、 rchd502 (配列番号5)、 rchd523 (配列番号6)、 rchd528 (配列番号7)、もしくは rchd534 (配列番号36) またはNRRLに寄託された次のクローン: pRCHD005(NRRL受託番号B-21376)、 pRCHD024(NRRL受託番号B-21377)、 pRCHD032(NRRL受託番号B-21378)、 pRCHD036(NRRL受託番号B-21379)、 pRCHD502(NRRL受託番号B-21380)、 pFCHD502SF(ATCC受託番号 )、 pFCHD502SJ(ATCC受託番号 )、 pRCHD523(NRRL受託番号B-21381)、 pFCHD523(NRRL受託番号B-21458)、 pRCHD528(NRRL受託番号B-21382)、 pFCHD528A (ATCC受託番号 )、 pFCHD528B (ATCC受託番号 )、 pFCHD528C (ATCC受託番号 )、もしくは pFCHD534(NRRL受託番号B-21459) に含まれる遺伝子もしくは遺伝子断片のヌクレオチド配列を含む、単離された 核酸。 2.請求項1に記載のヌクレオチド配列もしくはその相補配列に、またはNRRLに 寄託された請求項1に記載のクローンに含まれる遺伝子もしくは遺伝子断片にス トリンジェント条件下でハイブリダイズする、単離された核酸。 3.請求項1に記載のヌクレオチド配列もしくはその相補配列、またはNRRLに寄 託された請求項1に記載のクローンに含まれる遺伝子もしくは遺伝子断片により コードされるアミノ酸配列をコードする、単離された核酸。 4.請求項1、2または3に記載のヌクレオチド配列を含有するヌクレオチドベ クター。 5.宿主細胞内で請求項1、2または3に記載のヌクレオチド配列の発現をコン トロールするヌクレオチド調節要素と機能的に結合された該ヌクレオチド配列を 含有する発現ベクター。 6.請求項1、2または3に記載のヌクレオチド配列を含有する遺伝子工学的に 作製された宿主細胞。 7.宿主細胞内で請求項1、2または3に記載のヌクレオチド配列の発現をコン トロールするヌクレオチド調節要素と機能的に結合された該ヌクレオチド配列を 含有する、遺伝子工学的に作製された宿主細胞。 8.請求項1、2または3に記載の核酸によりコードされる、実質的に純粋な遺 伝子産物。 9.請求項8に記載の遺伝子産物と免疫特異的に結合する抗体。 10.請求項1、2または3に記載の核酸が動物のゲノムに含まれて発現されるト ランスジーンであるトランスジェニック動物。 11.請求項8に記載の遺伝子産物をコードするゲノム配列の発現が妨害または抑 制されているトランスジェニック動物。 12.心臓血管病の診断方法であって、患者サンプルにおいて、心臓血管病の状態 で示差的に発現される遺伝子またはその遺伝子産物を検出することを含んでなる 方法。 13.心臓血管病がアテローム性動脈硬化症である、請求項12に記載の方法。 14.心臓血管病が虚血/再灌流である、請求項12に記載の方法。 15.心臓血管病が高血圧症である、請求項12に記載の方法。 16.心臓血管病が再狭窄である、請求項12に記載の方法。 17.前記遺伝子が心臓血管病に遺伝的になりやすい個体においてアップレギュレ ートされる、請求項12に記載の方法。 18.前記遺伝子が Na-K-Clコトランスポータータンパク質相同体、rchd024 タン パク質、rchd032 タンパク質、rchd036 タンパク質、ラットGPT の相同体、COX IIタンパク質、rchd523 タンパク質、rchd528 タンパク質、MnSOD タンパク質ま たはrchd534 タンパク質をコードする、請求項17に記載の方法。 19.前記遺伝子が心臓血管病に遺伝的になりやすい個体においてダウンレギュレ ートされる、請求項12に記載の方法。 20.前記遺伝子がグルタチオンペルオキシダーゼタンパク質またはBcl-2 タンパ ク質をコードする、請求項19に記載の方法。 21.前記遺伝子がIL−1処理によりアップレギュレートされる、請求項12に記 載の方法。 22.前記遺伝子が Na-K-Clコトランスポータータンパク質相同体、rchd024 タン パク質、rchd032 タンパク質、rchd036 タンパク質、COX IIタンパク質またはMn SOD タンパク質をコードする、請求項21に記載の方法。 23.前記遺伝子がずれ応力で処理することによりアップレギュレートされる、請 求項12に記載の方法。 24.前記遺伝子が Na-K-Clコトランスポータータンパク質相同体、rchd024 タン パク質、ラットGPT タンパク質相同体、COX IIタンパク質、rchd523 タンパク質 、rchd528 タンパク質、MnSOD タンパク質またはrchd534 タンパク質をコードす る、請求項23に記載の方法。 25.前記遺伝子が高脂肪/高コレステロール食で個体を処置することによりダウ ンレギュレートされる、請求項12に記載の方法。 26.前記遺伝子がグルタチオンペルオキシダーゼタンパク質またはBcl-2 タンパ ク質をコードする、請求項25に記載の方法。 27.心臓血管病の治療方法であって、かかる治療を必要としている患者に、ター ゲット遺伝子の発現、またはターゲット遺伝子産物の合成もしくは活性を調節す る化合物を投与することを含んでなる方法。 28.心臓血管病がアテローム性動脈硬化症である、請求項27に記載の方法。 29.心臓血管病が虚血/再灌流である、請求項27に記載の方法。 30.心臓血管病が高血圧症である、請求項27に記載の方法。 31.心臓血管病が再狭窄である、請求項27に記載の方法。 32.前記化合物がターゲット遺伝子の発現、またはターゲット遺伝子産物の合成 もしくは活性を抑制する、請求項27に記載の方法。 33.前記遺伝子が Na-K-Clコトランスポータータンパク質相同体、rchd024 タン パク質、rchd032 タンパク質、rchd036 タンパク質、ラットGPT タンパク質の相 同体、COX IIタンパク質、rchd523 タンパク質、rchd528 タンパク質、MnSOD タ ンパク質またはrchd534 タンパク質をコードする、請求項32に記載の方法。 34.前記化合物がターゲット遺伝子の翻訳をブロックするアンチセンスまたはリ ボザイム分子である、請求項27に記載の方法。 35.前記遺伝子が Na-K-Clコトランスポータータンパク質相同体、rchd024 タン パク質、rchd032 タンパク質、rchd036 タンパク質、ラットGPT タンパク質の相 同体、COX IIタンパク質、rchd523 タンパク質、rchd528 タンパク質、MnSOD タ ンパク質またはrchd534 タンパク質をコードする、請求項34に記載の方法。 36.前記化合物がターゲット遺伝子の5'領域に相補的であり、三重らせん形成に より転写をブロックする、請求項27に記載の方法。 37.前記遺伝子が Na-K-Clコトランスポータータンパク質相同体、rchd024 タン パク質、rchd032 タンパク質、rchd036 タンパク質、ラットGPT タンパク質の相 同体、COX IIタンパク質、rchd523 タンパク質、rchd528 タンパク質、MnSOD タ ンパク質またはrchd534 タンパク質をコードする、請求項36に記載の方法。 38.前記化合物がターゲット遺伝子産物の活性を中和する抗体である、請求項27 に記載の方法。 39.前記遺伝子産物が Na-K-Clコトランスポータータンパク質相同体、rchd024 タンパク質、rchd032 タンパク質、rchd036 タンパク質、ラットGPT タンパク質 の相同体、COX IIタンパク質、rchd523 タンパク質、rchd528 タンパク質、 MnSOD タンパク質またはrchd534 タンパク質である、請求項38に記載の方法。 40.前記化合物がターゲット遺伝子の発現、またはターゲット遺伝子産物の合成 もしくは活性を増強する、請求項27に記載の方法。 41.ターゲット遺伝子がBcl-2 またはグルタチオンペルオキシダーゼをコードす る、請求項40に記載の方法。 42.心臓血管病の治療方法であって、かかる治療を必要としている患者に、活性 なターゲット遺伝子産物をコードする核酸を投与することを含んでなる方法。 43.前記核酸がBcl-2 またはグルタチオンペルオキシダーゼをコードする、請求 項42に記載の方法。 44.心臓血管病の治療方法であって、かかる治療を必要としている患者に、有効 量のターゲット遺伝子産物を投与することを含んでなる方法。 45.前記遺伝子産物がBcl-2 またはグルタチオンペルオキシダーゼである、請求 項44に記載の方法。 46.心臓血管病を治療する臨床試験で化合物の効力をモニターする方法であって 、患者サンプルにおいて、心臓血管病の状態で示差的に発現される遺伝子または その遺伝子産物を検出することを含んでなる方法。 47.心臓血管病がアテローム性動脈硬化症である、請求項46に記載の方法。 48.心臓血管病が虚血/再灌流である、請求項46に記載の方法。 49.心臓血管病が高血圧症である、請求項46に記載の方法。 50.心臓血管病が再狭窄である、請求項46に記載の方法。 51.前記遺伝子が心臓血管病に遺伝的になりやすい個体においてアップレギュレ ートされる、請求項46に記載の方法。 52.前記遺伝子が Na-K-Clコトランスポータータンパク質相同体、rchd024 タン パク質、rchd032 タンパク質、rchd036 タンパク質、ラットGPT タンパク質の相 同体、COX IIタンパク質、rchd523 タンパク質、rchd528 タンパク質、MnSOD タ ンパク質またはrchd534 タンパク質をコードする、請求項51に記載の方法。 53.前記遺伝子が心臓血管病に遺伝的になりやすい個体においてダウンレギュレ ートされる、請求項46に記載の方法。 54.前記遺伝子がグルタチオンペルオキシダーゼタンパク質またはBcl-2 タンパ ク質をコードする、請求項53に記載の方法。 55.前記遺伝子がIL−1処理によりアップレギュレートされる、請求項46に記 載の方法。 56.前記遺伝子が Na-K-Clコトランスポータータンパク質相同体、rchd024 タン パク質、rchd032 タンパク質、rchd036 タンパク質、COX IIタンパク質またはMn SOD タンパク質をコードする、請求項55に記載の方法。 57.前記遺伝子がずれ応力で処理することによりアップレギュレートされる、請 求項46に記載の方法。 58.前記遺伝子が Na-K-Clコトランスポータータンパク質相同体、rchd024 タン パク質、ラットGPT タンパク質相同体、COX IIタンパク質、rchd523 タンパク質 、rchd528 タンパク質、MnSOD タンパク質またはrchd534 タンパク質をコードす る、請求項57に記載の方法。 59.前記遺伝子が高脂肪/高コレステロール食で個体を処置することによりダウ ンレギュレートされる、請求項46に記載の方法。 60.前記遺伝子がグルタチオンペルオキシダーゼタンパク質またはBcl-2 タンパ ク質をコードする、請求項59に記載の方法。 61.多重膜貫通ドメイン受容体ターゲット遺伝子産物の活性を調節する化合物の 同定方法であって、 多重膜貫通ドメイン受容体ターゲット遺伝子産物を発現する第1の細胞を、 試験化合物および多重膜貫通ドメイン受容体ターゲット遺伝子産物の活性化剤と 接触させ、第1の細胞の細胞内カルシウム放出レベルを測定し、そして、そのレ ベルを、該活性化剤と接触させたが試験化合物とは接触させていない第2の多重 膜貫通ドメイン受容体ターゲット遺伝子産物を発現する細胞の細胞内カルシウム 放出レベルと比較することを含んでなり、その際、第1の細胞の細胞内カルシウ ム放出レベルが第2の細胞の該レベルと異なるとき、多重膜貫通ドメイン受容体 ターゲット遺伝子産物の活性を調節する化合物が同定されたことになる、上記方 法。 62.多重膜貫通ドメイン受容体ターゲット遺伝子産物が rchd523遺伝子産物であ る、請求項61に記載の方法。 63.前記細胞がツメガエル(Xenopus)の卵母細胞である、請求項61に記載の方法 。 64.前記細胞がミエローマ細胞である、請求項61に記載の方法。
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