JPH11309000A - トリコスポロン属菌種の特異的検出方法及び検出用試薬 - Google Patents
トリコスポロン属菌種の特異的検出方法及び検出用試薬Info
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- JPH11309000A JPH11309000A JP10134650A JP13465098A JPH11309000A JP H11309000 A JPH11309000 A JP H11309000A JP 10134650 A JP10134650 A JP 10134650A JP 13465098 A JP13465098 A JP 13465098A JP H11309000 A JPH11309000 A JP H11309000A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 トリコスポロン属菌種の特異的検出方法及び
検出用試薬を提供する。 【解決手段】 検出方法は、塩基配列：AGAGGCCTAC CAT
GGTATCAの少なくとも１８塩基のオリゴヌクレオチド部
分を含有する第１のＤＮＡプライマー、及び塩基配列：
TAAGACCCAA TAGAGCCCTAの少なくとも２０塩基のオリゴ
ヌクレオチド部分を含有する第２のＤＮＡプライマーの
組み合わせと、ＤＮＡポリメラーゼと、水性液体被検試
料とを含む混合液をＤＮＡ増幅工程にかけ、得られた反
応液をＤＮＡ検査工程にかける。検出用試薬は、前記の
第１のＤＮＡプライマー及び第２のＤＮＡプライマーを
含有する。
検出用試薬を提供する。 【解決手段】 検出方法は、塩基配列：AGAGGCCTAC CAT
GGTATCAの少なくとも１８塩基のオリゴヌクレオチド部
分を含有する第１のＤＮＡプライマー、及び塩基配列：
TAAGACCCAA TAGAGCCCTAの少なくとも２０塩基のオリゴ
ヌクレオチド部分を含有する第２のＤＮＡプライマーの
組み合わせと、ＤＮＡポリメラーゼと、水性液体被検試
料とを含む混合液をＤＮＡ増幅工程にかけ、得られた反
応液をＤＮＡ検査工程にかける。検出用試薬は、前記の
第１のＤＮＡプライマー及び第２のＤＮＡプライマーを
含有する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、トリコスポロン属
（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）に属する微生物（以下、
トリコスポロン属菌種と称することがある）の特異的検
出方法とその試薬に関する。
（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）に属する微生物（以下、
トリコスポロン属菌種と称することがある）の特異的検
出方法とその試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】トリコスポロンは、分類学的には担子菌
系不完全酵母に属し、形態学的には分節型分生子、仮性
菌糸及び真性菌糸を産生するのを特徴とする。トリコス
ポロン属菌種による感染症（ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ
ｏｓｉｓ）は、癌や白血病などを有する易感染性宿主
（ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄｈｏｓｔ）の、
特に、好中球減少期に好発する。また急速に全身に播種
することから多臓器不全に陥りやすいため、患者の予後
は極めて悪い。近年では、医療技術の高度化に伴い日和
見真菌感染症の発症頻度が増加しているが、その中でも
トリコスポロン属菌種による感染症は他の日和見真菌感
染症に比べ死亡率が高いことから特に注目されている。
その後の研究により、トリコスポロン属菌種のうち、ト
リコスポロン・アサヒイ（Ｔ．ａｓａｈｉｉ）、トリコ
スポロン・アステロイデス（Ｔ．ａｓｔｅｒｏｉｄｅ
ｓ）、トリコスポロン・クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅ
ｕｍ）、トリコスポロン・インキン（Ｔ．ｉｎｋｉ
ｎ）、トリコスポロン・ムコイデス（Ｔ．ｍｕｃｏｉｄ
ｅｓ）及びトリコスポロン・オボイデス（Ｔ．ｏｖｏｉ
ｄｅｓ）の６菌種が特に感染に関与していることが示さ
れた。
系不完全酵母に属し、形態学的には分節型分生子、仮性
菌糸及び真性菌糸を産生するのを特徴とする。トリコス
ポロン属菌種による感染症（ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ
ｏｓｉｓ）は、癌や白血病などを有する易感染性宿主
（ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄｈｏｓｔ）の、
特に、好中球減少期に好発する。また急速に全身に播種
することから多臓器不全に陥りやすいため、患者の予後
は極めて悪い。近年では、医療技術の高度化に伴い日和
見真菌感染症の発症頻度が増加しているが、その中でも
トリコスポロン属菌種による感染症は他の日和見真菌感
染症に比べ死亡率が高いことから特に注目されている。
その後の研究により、トリコスポロン属菌種のうち、ト
リコスポロン・アサヒイ（Ｔ．ａｓａｈｉｉ）、トリコ
スポロン・アステロイデス（Ｔ．ａｓｔｅｒｏｉｄｅ
ｓ）、トリコスポロン・クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅ
ｕｍ）、トリコスポロン・インキン（Ｔ．ｉｎｋｉ
ｎ）、トリコスポロン・ムコイデス（Ｔ．ｍｕｃｏｉｄ
ｅｓ）及びトリコスポロン・オボイデス（Ｔ．ｏｖｏｉ
ｄｅｓ）の６菌種が特に感染に関与していることが示さ
れた。
【０００３】トリコスポロン感染症の最も確実な診断方
法は、臨床材料より原因菌を分離し、同定することであ
る。従来の同定方法は、形態学的あるいは生理学的性状
の結果に基づいている。しかしながら、前記の形態学的
あるいは生理学的性状による同定方法では、臨床材料よ
り菌株を培養するのに、数日間を要し、その後の同定検
査に更に数日間が必要である。また、前記の形態学的性
状による同定方法においては、顕微鏡操作にも精通した
高度な技術が必要である。更に、前記の生理学的性状に
よる同定方法においては、市販の検査キット（Ｍｙｃｏ
ｓｅｓ，３７，３−１０，１９９４）を利用することが
できるが、これは表現形質に基づく同定方法であるた
め、一部の形質が欠損した菌株では誤った結果を招く可
能性もある。また、臨床材料より菌を分離培養するので
はなく、すべてのトリコスポロン属菌種を直接、臨床材
料から検出する方法は未だ見いだされていない。
法は、臨床材料より原因菌を分離し、同定することであ
る。従来の同定方法は、形態学的あるいは生理学的性状
の結果に基づいている。しかしながら、前記の形態学的
あるいは生理学的性状による同定方法では、臨床材料よ
り菌株を培養するのに、数日間を要し、その後の同定検
査に更に数日間が必要である。また、前記の形態学的性
状による同定方法においては、顕微鏡操作にも精通した
高度な技術が必要である。更に、前記の生理学的性状に
よる同定方法においては、市販の検査キット（Ｍｙｃｏ
ｓｅｓ，３７，３−１０，１９９４）を利用することが
できるが、これは表現形質に基づく同定方法であるた
め、一部の形質が欠損した菌株では誤った結果を招く可
能性もある。また、臨床材料より菌を分離培養するので
はなく、すべてのトリコスポロン属菌種を直接、臨床材
料から検出する方法は未だ見いだされていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】このように、従来の方
法ではトリコスポロン属菌種の検出方法は煩雑で、判定
までに長時間を要したり、あるいは多量の試料を必要と
する等々の問題点が多く、医療の現場の要求に十分応え
ることが困難であった。従って、短時間に、精度良くト
リコスポロン属菌種を検出する方法（特に、上記の６菌
種のトリコスポロン属菌種を確実に検出する方法）及び
その試薬の開発が望まれていた。
法ではトリコスポロン属菌種の検出方法は煩雑で、判定
までに長時間を要したり、あるいは多量の試料を必要と
する等々の問題点が多く、医療の現場の要求に十分応え
ることが困難であった。従って、短時間に、精度良くト
リコスポロン属菌種を検出する方法（特に、上記の６菌
種のトリコスポロン属菌種を確実に検出する方法）及び
その試薬の開発が望まれていた。
【０００５】本発明者らは、迅速かつ確実にトリコスポ
ロン属菌種を検出する手段を鋭意研究したところ、トリ
コスポロン属菌種を特異的に認識することのできる塩基
配列が存在し、それらをプライマーとして用いることに
よって前記の課題を解決することができることを新たに
見出した。本発明は、こうした知見に基づくものであ
る。
ロン属菌種を検出する手段を鋭意研究したところ、トリ
コスポロン属菌種を特異的に認識することのできる塩基
配列が存在し、それらをプライマーとして用いることに
よって前記の課題を解決することができることを新たに
見出した。本発明は、こうした知見に基づくものであ
る。
【０００６】
【課題を解決するための手段】従って、本発明は、配列
表における配列番号１の配列で表される塩基配列の少な
くとも１８塩基のオリゴヌクレオチド部分を含有する第
１のＤＮＡプライマー、及び配列表における配列番号２
の配列で表される塩基配列の少なくとも２０塩基のオリ
ゴヌクレオチド部分を含有する第２のＤＮＡプライマー
の組み合わせと、ＤＮＡポリメラーゼと、水性液体被検
試料とを含む混合液をＤＮＡ増幅工程にかけ、得られた
反応液をＤＮＡ検査工程にかけることを特徴とする、ト
リコスポロン属に属する微生物の検出方法に関するもの
である。また、本発明は、少なくとも前記の第１のプラ
イマー及び第２のプライマーを含有することを特徴とす
る、トリコスポロン属に属する微生物の検出用試薬にも
関する。本明細書の塩基配列において、Ａはアデニン残
基、Ｃはシトシン残基、Ｇはグアニン残基、そしてＴは
チミン残基の意味である。
表における配列番号１の配列で表される塩基配列の少な
くとも１８塩基のオリゴヌクレオチド部分を含有する第
１のＤＮＡプライマー、及び配列表における配列番号２
の配列で表される塩基配列の少なくとも２０塩基のオリ
ゴヌクレオチド部分を含有する第２のＤＮＡプライマー
の組み合わせと、ＤＮＡポリメラーゼと、水性液体被検
試料とを含む混合液をＤＮＡ増幅工程にかけ、得られた
反応液をＤＮＡ検査工程にかけることを特徴とする、ト
リコスポロン属に属する微生物の検出方法に関するもの
である。また、本発明は、少なくとも前記の第１のプラ
イマー及び第２のプライマーを含有することを特徴とす
る、トリコスポロン属に属する微生物の検出用試薬にも
関する。本明細書の塩基配列において、Ａはアデニン残
基、Ｃはシトシン残基、Ｇはグアニン残基、そしてＴは
チミン残基の意味である。
【０００７】本発明方法で用いる被検試料は、トリコス
ポロン属に属する微生物（すなわち、トリコスポロン属
菌種）の少なくとも１種を含有している疑いのある試料
であれば特に制限されない。例えば、生体由来試料、具
体的には、血清、尿、髄液、糞便、又は喀痰等を用いる
ことができる。
ポロン属に属する微生物（すなわち、トリコスポロン属
菌種）の少なくとも１種を含有している疑いのある試料
であれば特に制限されない。例えば、生体由来試料、具
体的には、血清、尿、髄液、糞便、又は喀痰等を用いる
ことができる。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明による前記のトリコスポロ
ン属菌種の検出方法は、主に、（１）ＤＮＡ増幅工程
と、（２）ＤＮＡ検査工程とからなる。このＤＮＡ増幅
工程（１）では、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈ
ａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）を用いることができる。ＰＣ
Ｒ法を利用すると、微量のＤＮＡから、目的とするＤＮ
Ａ領域のみを自動的に約１００万倍にまで増幅すること
ができる（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，４８７−４９１，
１９８８）。ＰＣＲ法では、増幅させる領域を挟んで、
＋鎖に対するプライマー（１）及び−鎖に対するプライ
マー（２）の２種のプライマーを用いる。
ン属菌種の検出方法は、主に、（１）ＤＮＡ増幅工程
と、（２）ＤＮＡ検査工程とからなる。このＤＮＡ増幅
工程（１）では、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈ
ａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）を用いることができる。ＰＣ
Ｒ法を利用すると、微量のＤＮＡから、目的とするＤＮ
Ａ領域のみを自動的に約１００万倍にまで増幅すること
ができる（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，４８７−４９１，
１９８８）。ＰＣＲ法では、増幅させる領域を挟んで、
＋鎖に対するプライマー（１）及び−鎖に対するプライ
マー（２）の２種のプライマーを用いる。
【０００９】本発明方法においては、前記配列番号１の
配列の少なくとも１８塩基からなる第１のプライマー
〔ＤＮＡプライマー（１）〕及び前記配列番号２の配列
の２０塩基からなる第２のプライマー〔ＤＮＡプライマ
ー（２）〕は、トリコスポロン属菌種のリボソームＲＮ
Ａ遺伝子の一部に相当する約１７０ｂｐ部分を、短時間
のうちに特異的に大量に増幅することができる。これら
のプライマーを用いることにより、被検試料中にトリコ
スポロン属菌種が存在する場合には、トリコスポロン属
菌種の存在を極めて特異的に検出することができる。な
お、前記のプライマー結合部位は、サッカロミセス・セ
レビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ）の小サブユニット リボソームＤＮＡ配列
において、配列番号１の配列の２０塩基からなるＤＮＡ
フプライマー（１）が１５４〜１７３番目の塩基配列に
相当し、配列番号２の配列の２０塩基からなるＤＮＡプ
ライマー（２）が３５４〜３３５番目の塩基配列に相当
する。
配列の少なくとも１８塩基からなる第１のプライマー
〔ＤＮＡプライマー（１）〕及び前記配列番号２の配列
の２０塩基からなる第２のプライマー〔ＤＮＡプライマ
ー（２）〕は、トリコスポロン属菌種のリボソームＲＮ
Ａ遺伝子の一部に相当する約１７０ｂｐ部分を、短時間
のうちに特異的に大量に増幅することができる。これら
のプライマーを用いることにより、被検試料中にトリコ
スポロン属菌種が存在する場合には、トリコスポロン属
菌種の存在を極めて特異的に検出することができる。な
お、前記のプライマー結合部位は、サッカロミセス・セ
レビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ）の小サブユニット リボソームＤＮＡ配列
において、配列番号１の配列の２０塩基からなるＤＮＡ
フプライマー（１）が１５４〜１７３番目の塩基配列に
相当し、配列番号２の配列の２０塩基からなるＤＮＡプ
ライマー（２）が３５４〜３３５番目の塩基配列に相当
する。
【００１０】前記のプライマー（１）は、好ましくは１
８ｍｅｒ〜３０ｍｅｒであることができ、一般的には２
０ｍｅｒ〜２５ｍｅｒであるのがより好ましい。１８ｍ
ｅｒ未満であるとアニーリングの際の特異性が減少し、
非特異的結合が増加する。また、３０ｍｅｒを越えると
プライマー分子間あるいは分子内での二次構造を取り易
くなるので好ましくない。前記のプライマー（２）は、
好ましくは２０ｍｅｒ〜３０ｍｅｒであることができる
か、一般的には２０ｍｅｒ〜２５ｍｅｒであるのがより
好ましい。２０ｍｅｒ未満であるとアニーリングの際の
特異性が減少し、非特異的結合が増加する。また、３０
ｍｅｒを越えるとプライマー分子間あるいは分子内での
二次構造を取り易くなるので好ましくない。
８ｍｅｒ〜３０ｍｅｒであることができ、一般的には２
０ｍｅｒ〜２５ｍｅｒであるのがより好ましい。１８ｍ
ｅｒ未満であるとアニーリングの際の特異性が減少し、
非特異的結合が増加する。また、３０ｍｅｒを越えると
プライマー分子間あるいは分子内での二次構造を取り易
くなるので好ましくない。前記のプライマー（２）は、
好ましくは２０ｍｅｒ〜３０ｍｅｒであることができる
か、一般的には２０ｍｅｒ〜２５ｍｅｒであるのがより
好ましい。２０ｍｅｒ未満であるとアニーリングの際の
特異性が減少し、非特異的結合が増加する。また、３０
ｍｅｒを越えるとプライマー分子間あるいは分子内での
二次構造を取り易くなるので好ましくない。
【００１１】本発明方法で用いる第１プライマー及び第
２プライマーのそれぞれを構成する各塩基は、公知の任
意の態様で修飾（例えば、ビオチン化又は発光物質によ
るラベル化）されていてもよい。本発明による前記のそ
れぞれの第１プライマー及び第２プライマーは、通常の
ＤＮＡ自動合成機（例えばアプライドバイオシステム社
製）を用いて、公知のＤＮＡ合成法（例えばホスホアミ
ダイト法）によって調製することができる。
２プライマーのそれぞれを構成する各塩基は、公知の任
意の態様で修飾（例えば、ビオチン化又は発光物質によ
るラベル化）されていてもよい。本発明による前記のそ
れぞれの第１プライマー及び第２プライマーは、通常の
ＤＮＡ自動合成機（例えばアプライドバイオシステム社
製）を用いて、公知のＤＮＡ合成法（例えばホスホアミ
ダイト法）によって調製することができる。
【００１２】本発明のＤＮＡ増幅工程（１）では、第１
プライマー及び第２プライマーと共に、ＤＮＡポリメラ
ーゼ、特には耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅サ
イクルを繰り返す。耐熱性ポリメラーゼとしては、特に
９５℃までの温度で活性を維持することのできるＤＮＡ
ポリメラーゼ、例えば、市販のＴａｑポリメラーゼを用
いることができる。
プライマー及び第２プライマーと共に、ＤＮＡポリメラ
ーゼ、特には耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅サ
イクルを繰り返す。耐熱性ポリメラーゼとしては、特に
９５℃までの温度で活性を維持することのできるＤＮＡ
ポリメラーゼ、例えば、市販のＴａｑポリメラーゼを用
いることができる。
【００１３】本発明のＤＮＡ増幅工程では第１プライマ
ーと第２のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ及び液体被
検試料を含む混合液を用いる。第１プライマー、第２プ
ライマー及びＤＮＡポリメラーゼの使用量は、液体被検
試料の種類によって変化するが、ＰＣＲ法によるＤＮＡ
増幅工程を実行することができる範囲で容易に決定する
ことができる。この混合液は場合により、緩衝液（例え
ば、トリス塩酸緩衝液）、安定化剤（例えば、グリセリ
ン）、又は塩類（例えば、塩化マグネシウム）を含有す
ることができる。
ーと第２のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ及び液体被
検試料を含む混合液を用いる。第１プライマー、第２プ
ライマー及びＤＮＡポリメラーゼの使用量は、液体被検
試料の種類によって変化するが、ＰＣＲ法によるＤＮＡ
増幅工程を実行することができる範囲で容易に決定する
ことができる。この混合液は場合により、緩衝液（例え
ば、トリス塩酸緩衝液）、安定化剤（例えば、グリセリ
ン）、又は塩類（例えば、塩化マグネシウム）を含有す
ることができる。
【００１４】本発明方法では、前記の混合液を用いてＰ
ＣＲ法の増幅サイクルを実施する。増幅サイクルは、
（ｉ）ＤＮＡの変性工程（約９０℃〜９８℃で、約１０
秒間から３分間） （ii）一本鎖ＤＮＡと第１プライマー及び第２プライマ
ーとのアニーリング工程（約３７℃〜７０℃で、約１０
秒間から約３分間）、及び（iii)ＤＮＡポリメラーゼに
よるＤＮＡ合成工程（約６５℃〜８０℃で、約１０秒間
から約５分間）とからなる。１サイクル毎にＤＮＡ量は
最高２倍に増幅され、ｎサイクル後には２n 倍に増幅さ
れる。本発明においては、前記の増幅サイクルを１０〜
６０回、好ましくは２０〜４０回繰り返す．最後のサイ
クルにおいては、工程（iii)の加熱時間を約７〜１０分
間に延長してＤＮＡ合成が完全に行われるようにするの
が好ましい。
ＣＲ法の増幅サイクルを実施する。増幅サイクルは、
（ｉ）ＤＮＡの変性工程（約９０℃〜９８℃で、約１０
秒間から３分間） （ii）一本鎖ＤＮＡと第１プライマー及び第２プライマ
ーとのアニーリング工程（約３７℃〜７０℃で、約１０
秒間から約３分間）、及び（iii)ＤＮＡポリメラーゼに
よるＤＮＡ合成工程（約６５℃〜８０℃で、約１０秒間
から約５分間）とからなる。１サイクル毎にＤＮＡ量は
最高２倍に増幅され、ｎサイクル後には２n 倍に増幅さ
れる。本発明においては、前記の増幅サイクルを１０〜
６０回、好ましくは２０〜４０回繰り返す．最後のサイ
クルにおいては、工程（iii)の加熱時間を約７〜１０分
間に延長してＤＮＡ合成が完全に行われるようにするの
が好ましい。
【００１５】被検試料中にトリコスポロン属菌種が存在
する場合には、前記の増幅サイクル終了後に、約ｌ７０
ｂｐのＤＮＡが大量に合成される。このＤＮＡを次のＤ
ＮＡ検査工程によって検出する。ＤＮＡ検査工程として
は、ゲル電気泳動及びエチジウムブロマイド染色を利用
して、ＰＣＲ反応生成物の分子量から検査する方法、特
異的なプローブを利用するサザンハイブリッド法、又は
ジデオキシ法による塩基配列決定法などを用いることが
できる。ゲル電気泳動を行う場合には、例えば、アガロ
ースゲルを担体としたサブマリーン型電気泳動又はアク
リルアミドを用いたスラブ型電気泳動を使用することが
できる。
する場合には、前記の増幅サイクル終了後に、約ｌ７０
ｂｐのＤＮＡが大量に合成される。このＤＮＡを次のＤ
ＮＡ検査工程によって検出する。ＤＮＡ検査工程として
は、ゲル電気泳動及びエチジウムブロマイド染色を利用
して、ＰＣＲ反応生成物の分子量から検査する方法、特
異的なプローブを利用するサザンハイブリッド法、又は
ジデオキシ法による塩基配列決定法などを用いることが
できる。ゲル電気泳動を行う場合には、例えば、アガロ
ースゲルを担体としたサブマリーン型電気泳動又はアク
リルアミドを用いたスラブ型電気泳動を使用することが
できる。
【００１６】ドットブロット法、サザンブロットハイブ
リッド法又はｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド法を行う場合
には、前記の約ｌ７０ｂｐのＤＮＡにおける塩基配列か
ら特異的なプローブを適宜選択し、放射性プローブ、又
は非放射性プローブ（例えば、酵素標識プローブ、ビオ
チン化プローブ、ジゴキシゲニン化プローブ、又は化学
発光物質、蛍光物質で標識したプローブ）として用いる
ことができる。更に、ジデオキシ法による塩基配列決定
法を利用する場合には、蛍光標識を利用したＤＮＡオー
トシークエンサー（アプライドバイオシステム社）を用
いることができる。
リッド法又はｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド法を行う場合
には、前記の約ｌ７０ｂｐのＤＮＡにおける塩基配列か
ら特異的なプローブを適宜選択し、放射性プローブ、又
は非放射性プローブ（例えば、酵素標識プローブ、ビオ
チン化プローブ、ジゴキシゲニン化プローブ、又は化学
発光物質、蛍光物質で標識したプローブ）として用いる
ことができる。更に、ジデオキシ法による塩基配列決定
法を利用する場合には、蛍光標識を利用したＤＮＡオー
トシークエンサー（アプライドバイオシステム社）を用
いることができる。
【００１７】本発明は、更に、トリコスポロン属菌種の
特異的な検出に用いることのできる試薬を提供するもの
である。従って、本発明は、少なくとも配列表における
配列番号１の配列で表される塩基配列の少なくとも１８
塩基のオリゴヌクレオチド部分を含有する第１のＤＮＡ
プライマー、及び配列表における配列番号２の配列で表
される塩基配列の少なくとも２０塩基のオリゴヌクレオ
チド部分を含有する第２のＤＮＡプライマーの組み合わ
せと、ＤＮＡポリメラーゼを含むＤＮＡ増幅工程用組成
物から構成されるものである。
特異的な検出に用いることのできる試薬を提供するもの
である。従って、本発明は、少なくとも配列表における
配列番号１の配列で表される塩基配列の少なくとも１８
塩基のオリゴヌクレオチド部分を含有する第１のＤＮＡ
プライマー、及び配列表における配列番号２の配列で表
される塩基配列の少なくとも２０塩基のオリゴヌクレオ
チド部分を含有する第２のＤＮＡプライマーの組み合わ
せと、ＤＮＡポリメラーゼを含むＤＮＡ増幅工程用組成
物から構成されるものである。
【００１８】
【作用】本発明方法において、プライマー（１）及びプ
ライマー（２）の組合せを用いると、被検試料中にトリ
コスポロン属菌種が存在する場合にのみリボソームＲＮ
Ａの遺伝子の一部に相当する約１７０ｂｐ塩基部分が短
時間の内に特異的に大量に増幅、合成される。更に、被
検試料中のトリコスポロン属菌種ＤＮＡが微量であって
も、ＤＮＡが増幅合成されるので高感度である。特に、
感染に関与しているトリコスポロン・アサヒイ（Ｔ．ａ
ｓａｈｉｉ）、トリコスポロン・アステロイデス（Ｔ．
ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、トリコスポロン・クタネウム
（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、トリコスポロン・インキン
（Ｔ．ｉｎｋｉｎ）、トリコスポロン・ムコイデス
（Ｔ．ｍｕｃｏｉｄｅｓ）、又はトリコスポロン・オボ
イデス（Ｔ．ｏｖｏｉｄｅｓ）が存在する場合には、そ
れらのリボソームＲＮＡの遺伝子の一部に相当する約１
７０ｂｐ塩基部分が短時間の内に特異的に大量に増幅、
合成されるので、それらの菌種を確実に検出することが
できる。
ライマー（２）の組合せを用いると、被検試料中にトリ
コスポロン属菌種が存在する場合にのみリボソームＲＮ
Ａの遺伝子の一部に相当する約１７０ｂｐ塩基部分が短
時間の内に特異的に大量に増幅、合成される。更に、被
検試料中のトリコスポロン属菌種ＤＮＡが微量であって
も、ＤＮＡが増幅合成されるので高感度である。特に、
感染に関与しているトリコスポロン・アサヒイ（Ｔ．ａ
ｓａｈｉｉ）、トリコスポロン・アステロイデス（Ｔ．
ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、トリコスポロン・クタネウム
（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、トリコスポロン・インキン
（Ｔ．ｉｎｋｉｎ）、トリコスポロン・ムコイデス
（Ｔ．ｍｕｃｏｉｄｅｓ）、又はトリコスポロン・オボ
イデス（Ｔ．ｏｖｏｉｄｅｓ）が存在する場合には、そ
れらのリボソームＲＮＡの遺伝子の一部に相当する約１
７０ｂｐ塩基部分が短時間の内に特異的に大量に増幅、
合成されるので、それらの菌種を確実に検出することが
できる。
【００１９】
【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。
【実施例１】《プライマーの合成》３８１型自動ＤＮＡ
合成装置（アプライドバイオシステム社）に、シトシン
ＣＰＧカラムを装着して、配列表における配列番号ｌの
配列の塩基２０個からなるプライマー（１）を合成し、
更にグアニンＣＰＧカラムを装着して、配列表における
配列番号２の配列の塩基２０個からなるプライマー
（２）を合成した。アンモニア水（約３０％）２．５ｍ
ｌを入れたデイスポシリンジ（約２．５ｍｌ）を、合成
工程が完了したＣＰＧカラムに接続し、アンモニア水を
カラム内に押し出して、合成したＤＮＡフラグメントを
溶出した。回収したＤＮＡアンモニア溶液の入ったバイ
アル瓶を密栓し、６５℃で６時間加熱した後、室温まで
冷やしてから濃縮した。濃縮物を凍結乾燥し、１０ｍＭ
トリエチルアンモニウムアセテート（以下、ＴＥＡ−Ａ
と称す）（ｐＨ７．４）に溶解し、沈殿を除いてから、
Ｌ−６２００型高速液体クロマトグラフィー装置（日立
製作所）（以下、ＨＰＬＣと称す）に分離用カラム（Ｙ
ＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＭ３１３：ＹＭＣ社）を装
着し、５％アセトニトリルを含んだ９５ｍＭ−ＴＥＡ−
Ａとアセトニトリルとによる濃度勾配を用いて精製し、
メインピークを集めた。得られた残渣に８０％酢酸（ア
セトニトリルで調整）を加えて懸濁させ、室温で３０分
間保持してから減圧乾燥した。乾燥物を１０ｍＭ−ＴＥ
Ａ−Ａに溶解し、ジエチルエーテルで抽出してから減圧
乾燥した。乾燥したＤＮＡ試料をＴＥＡ−Ａに溶解し、
沈殿を除いてから、２回目のＨＰＬＣによる精製を行
い、メインピークを集めた。こうして得られた精製ＤＮ
Ａプライマーを減圧乾燥して保存し、後記の実施例２で
用いた。
合成装置（アプライドバイオシステム社）に、シトシン
ＣＰＧカラムを装着して、配列表における配列番号ｌの
配列の塩基２０個からなるプライマー（１）を合成し、
更にグアニンＣＰＧカラムを装着して、配列表における
配列番号２の配列の塩基２０個からなるプライマー
（２）を合成した。アンモニア水（約３０％）２．５ｍ
ｌを入れたデイスポシリンジ（約２．５ｍｌ）を、合成
工程が完了したＣＰＧカラムに接続し、アンモニア水を
カラム内に押し出して、合成したＤＮＡフラグメントを
溶出した。回収したＤＮＡアンモニア溶液の入ったバイ
アル瓶を密栓し、６５℃で６時間加熱した後、室温まで
冷やしてから濃縮した。濃縮物を凍結乾燥し、１０ｍＭ
トリエチルアンモニウムアセテート（以下、ＴＥＡ−Ａ
と称す）（ｐＨ７．４）に溶解し、沈殿を除いてから、
Ｌ−６２００型高速液体クロマトグラフィー装置（日立
製作所）（以下、ＨＰＬＣと称す）に分離用カラム（Ｙ
ＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＭ３１３：ＹＭＣ社）を装
着し、５％アセトニトリルを含んだ９５ｍＭ−ＴＥＡ−
Ａとアセトニトリルとによる濃度勾配を用いて精製し、
メインピークを集めた。得られた残渣に８０％酢酸（ア
セトニトリルで調整）を加えて懸濁させ、室温で３０分
間保持してから減圧乾燥した。乾燥物を１０ｍＭ−ＴＥ
Ａ−Ａに溶解し、ジエチルエーテルで抽出してから減圧
乾燥した。乾燥したＤＮＡ試料をＴＥＡ−Ａに溶解し、
沈殿を除いてから、２回目のＨＰＬＣによる精製を行
い、メインピークを集めた。こうして得られた精製ＤＮ
Ａプライマーを減圧乾燥して保存し、後記の実施例２で
用いた。
【００２０】
【実施例２】《ＰＣＲ法によるトリコスポロン属菌種の
増幅》表１及び表２に示す３２種の菌株（保存菌株）に
ついてＰＣＲを実施した。保存菌株からのＤＮＡ抽出は
以下の方法に従った。少量の菌体を１００ｍＭ−Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ−ＥＤＴＡ（ｐＨ
８．０）、０．５％ＳＤＳに懸濁し、１００℃で１５分
間加熱した。遠心上清に等量の２．５Ｍ酢酸カリウム溶
液を加え、遠心により沈殿物を除去した。等量のフェノ
ール−クロロホルム−イソアミルアルコール（２５：２
４：１，ｖ／ｖ／ｖ）を加えて除タンパクを行った後、
更にクロロホルム−イソアミルアルコール（２４：１，
ｖ／ｖ）を加えて溶液を混和した。遠心上清に等量の２
−プロパノールを加えて、遠心によりＤＮＡを沈殿物と
して回収した。７０％エタノールを加えてＤＮＡを洗浄
し、乾燥後、少量の１０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）、３０ｍＭ−ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）に溶解
し、これをＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡとした。こうして抽
出したＤＮＡ１０ｎｇを、２．５ｍＭ−ｄＡＴＰ、２．
５ｍＭ−ｄＣＴＰ、２．５ｍＭ−ｄＴＴＰ、２．５ｍＭ
−ｄＧＴＰ、５０ｍＭ−ＫＣｌ、ｌ０ｍＭトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ８．３）、１．０ｍＭ−ＭｇＣｌ2 、５０ｍ
Ｍ−ＫＣｌ、２ｍＭのプライマー及び０．５単位のＴａ
ｑポリメラーゼ（Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ：宝酒造
製）を含むＰＣＲ反応液１００μｌに加えた。ＰＣＲ法
は９４℃で３分間加温後、（ｉ）９４℃で３０秒間、
（ii）５６℃で１５秒間、（iii)７２℃で１５秒間から
なるサイクルを３０サイクル行った後、最後に７２℃で
１０分間のプログラムでＤＮＡの増幅を行った。
増幅》表１及び表２に示す３２種の菌株（保存菌株）に
ついてＰＣＲを実施した。保存菌株からのＤＮＡ抽出は
以下の方法に従った。少量の菌体を１００ｍＭ−Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ−ＥＤＴＡ（ｐＨ
８．０）、０．５％ＳＤＳに懸濁し、１００℃で１５分
間加熱した。遠心上清に等量の２．５Ｍ酢酸カリウム溶
液を加え、遠心により沈殿物を除去した。等量のフェノ
ール−クロロホルム−イソアミルアルコール（２５：２
４：１，ｖ／ｖ／ｖ）を加えて除タンパクを行った後、
更にクロロホルム−イソアミルアルコール（２４：１，
ｖ／ｖ）を加えて溶液を混和した。遠心上清に等量の２
−プロパノールを加えて、遠心によりＤＮＡを沈殿物と
して回収した。７０％エタノールを加えてＤＮＡを洗浄
し、乾燥後、少量の１０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）、３０ｍＭ−ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）に溶解
し、これをＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡとした。こうして抽
出したＤＮＡ１０ｎｇを、２．５ｍＭ−ｄＡＴＰ、２．
５ｍＭ−ｄＣＴＰ、２．５ｍＭ−ｄＴＴＰ、２．５ｍＭ
−ｄＧＴＰ、５０ｍＭ−ＫＣｌ、ｌ０ｍＭトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ８．３）、１．０ｍＭ−ＭｇＣｌ2 、５０ｍ
Ｍ−ＫＣｌ、２ｍＭのプライマー及び０．５単位のＴａ
ｑポリメラーゼ（Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ：宝酒造
製）を含むＰＣＲ反応液１００μｌに加えた。ＰＣＲ法
は９４℃で３分間加温後、（ｉ）９４℃で３０秒間、
（ii）５６℃で１５秒間、（iii)７２℃で１５秒間から
なるサイクルを３０サイクル行った後、最後に７２℃で
１０分間のプログラムでＤＮＡの増幅を行った。
【００２１】
【実施例３】《電気泳動によるＰＣＲ反応生成物の確
認》電気泳動用のゲルは、トリス塩酸４．８４ｇ、氷酢
酸１．１４２ｇと０．５Ｍ−ＥＤＴＡ２ｍｌを含む緩衝
液（ｐＨ８．０）（以下１ｘＴＡＥと称する）１リット
ルにアガロースゲルを１．５〜３％になるように溶解
し、ミューピッド（アドバンス社）のゲルプレートに流
して調製した。次に、ＰＣＲ反応後の溶液５μｌに、１
％ＳＤＳ、５０％グリセリン、及び０．０２％ブロムフ
ェノールブルーを含むローディング溶液１μｌを加え
て、その混合物の全量をサンプルウエルに入れた。１ｘ
ＴＡＥを電極槽に入れて、室温で１００Ｖにて３０分間
電気泳動を行った。電気泳動終了後に、アガロースゲル
をエチジウムブロマイド染色し、ＵＶイルミネイター照
射下で電気泳動の結果を確認した。結果を図１並びに表
１及び表２に示す。なお、図１のレーン１は、分子量マ
ーカー（φΧ１７４ＤＮＡ／Ｈａｅ ＩＩＩ ｄｉｇｅ
ｓｔｉｏｎ；宝酒造）である。図１のエチジウムブロマ
イド染色によれば、本発明プライマーを用いたＰＣＲ法
において、トリコスポロン属菌種のみが増幅されるのに
対し、他の病原性カンジダ属菌種、クリプトコックス属
菌種、及びマラセチア属菌種のバンドは検出されず、ト
リコスポロン属菌種ＤＮＡのみが特異的に確実に増幅し
た。表１及び表２において、＋はＰＣＲ反応生成物が得
られることを意味し、−はＰＣＲ反応生成物が得られな
いことを意味する。
認》電気泳動用のゲルは、トリス塩酸４．８４ｇ、氷酢
酸１．１４２ｇと０．５Ｍ−ＥＤＴＡ２ｍｌを含む緩衝
液（ｐＨ８．０）（以下１ｘＴＡＥと称する）１リット
ルにアガロースゲルを１．５〜３％になるように溶解
し、ミューピッド（アドバンス社）のゲルプレートに流
して調製した。次に、ＰＣＲ反応後の溶液５μｌに、１
％ＳＤＳ、５０％グリセリン、及び０．０２％ブロムフ
ェノールブルーを含むローディング溶液１μｌを加え
て、その混合物の全量をサンプルウエルに入れた。１ｘ
ＴＡＥを電極槽に入れて、室温で１００Ｖにて３０分間
電気泳動を行った。電気泳動終了後に、アガロースゲル
をエチジウムブロマイド染色し、ＵＶイルミネイター照
射下で電気泳動の結果を確認した。結果を図１並びに表
１及び表２に示す。なお、図１のレーン１は、分子量マ
ーカー（φΧ１７４ＤＮＡ／Ｈａｅ ＩＩＩ ｄｉｇｅ
ｓｔｉｏｎ；宝酒造）である。図１のエチジウムブロマ
イド染色によれば、本発明プライマーを用いたＰＣＲ法
において、トリコスポロン属菌種のみが増幅されるのに
対し、他の病原性カンジダ属菌種、クリプトコックス属
菌種、及びマラセチア属菌種のバンドは検出されず、ト
リコスポロン属菌種ＤＮＡのみが特異的に確実に増幅し
た。表１及び表２において、＋はＰＣＲ反応生成物が得
られることを意味し、−はＰＣＲ反応生成物が得られな
いことを意味する。
【００２２】
【表１】 種又は変種 ＰＣＲ生成物 図１のレーン 血清型Ｉグループ Trichosporon cutaneum CBS 2466 ＋ 2 Trichosporon mucoides CBS 7625 ＋ 3 Trichosporon jirovecii CBS 6864 ＋ 4 Trichosporon moniliiforme CBS 2467 ＋ 5 血清型IIグループ Trichosporon asahii var. asahii CBS 2479 ＋ 6 Trichosporon asahii var. coremiformis CBS 2482 ＋ 7 Trichosporon asahii var. faecalis CBS 4828 ＋ 8 Trichosporon asteroides CBS 2481 ＋ 9 Trichosporon aquatile CBS 5973 ＋ 10 Trichosporon inkin CBS 5585 ＋ 11 Trichosporon ovoides CBS 7556 ＋ 12 血清型IIIグループ Trichosporon brassicae CBS 6382 ＋ 13 Trichosporon domesticum M 9401 ＋ 14 Trichosporon montevideense CBS 6721 ＋ 15
【００２３】
【表２】 種又は変種 ＰＣＲ生成物 図１のレーン 血清型Ｉ−IIIグループ Trichosporon dulcitum CBS 8257 ＋ 16 Trichosporon gracile CBS 8189 ＋ 17 Trichosporon loubieri var. loubieri CBS 7065 ＋ 18 Trichosporon loubieri var. laibachii CBS 5970 ＋ 19 Trichosporon sporotrichoides CBS 8245 ＋ 20 非反応グループ Trichosporon pullulans CBS 2532 ＋ 21 他の病原性酵母 Cryptococcus neoformans var. neoformans CBS 132 − 22 Cryptococcus neoformans var. gattii NIH 191 − 23 Malassezia furfur CBS 1878 − 24 Malassezia pachydermatis CBS 1079 − 25 Candida albicans CBS 562 − 26 Candida glabrata IFO 0622 − 27 Candida guilliermondii CBS 566 − 28 Candida kefyr JCM 9556 − 29 Candida lusitaniae CBS 4413 − 30 Candida parapsilosis ATCC 22019 − 31 Candida tropicalis ATCC 7349 − 32 Debaryomyces hansenii var. hansenii JCM 1990 − 33
【００２４】表１及び表２に示す保存機関は以下のとお
りである。 ATCC: American Type Culture Collection, Manassas,
VA, USA CBS: Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn,
The Netherlands. JCM: Japan Collection of Microorganisms, The Insti
tute of Physical and Chemical Research (RIKEN), Sa
itama, Japan. IFO: Institute of Fermentation, Osaka, Japan NIH: National Institutes of Health, Bethesda, MI,
USA. M: Meiji College of Pharmacy, Tokyo, Japan.
りである。 ATCC: American Type Culture Collection, Manassas,
VA, USA CBS: Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn,
The Netherlands. JCM: Japan Collection of Microorganisms, The Insti
tute of Physical and Chemical Research (RIKEN), Sa
itama, Japan. IFO: Institute of Fermentation, Osaka, Japan NIH: National Institutes of Health, Bethesda, MI,
USA. M: Meiji College of Pharmacy, Tokyo, Japan.
【００２５】
【実施例４】《臨床検査試料によるＰＣＲ反応生成物の
確認》臨床検査試料からのＤＮＡ抽出は、血液を用いて
以下の方法に従って行った。１００μｌ中に１００ｍＭ
−ＫＣｌ、２０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
３）、５ｍＭ−ＭｇＣｌ2 、０．２ｍｇ／ｍｌゼラチ
ン、及び０．９％Ｔｗｅｅｎ２０となるように、各試薬
を溶解し、これに等量の患者血液を加えて、５５℃で６
０分間、ついで、９５℃で１０分間反応させた。遠心上
清をＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡとした。その鋳型ＤＮＡを
用い、前記実施例２及び３と同様の操作を繰り返した。
トリコスポロン・クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕ
ｍ）、トリコスポロン・ムコイデス（Ｔ．ｍｕｃｏｉｄ
ｅｓ）、トリコスポロン・アサヒイ・バル・アサヒイ
（Ｔ．ａｓａｈｉｉ ｖａｒ．ａｓａｈｉｉ）、トリコ
スポロン・アサヒイ・バル・コレミフォルミス（Ｔ．ａ
ｓａｈｉｉ ｖａｒ．ｃｏｒｅｍｉｆｏｒｍｉｓ）、ト
リコスポロン・アサヒイ・バル・ファエカリス（Ｔ．ａ
ｓａｈｉｉ ｖａｒ．ｆａｅｃａｌｉｓ）、トリコスポ
ロン・オボイデス（Ｔ．ｏｖｏｉｄｅｓ）、及びトリコ
スポロン・ドメスチクム（Ｔ．ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｍ）
に感染した患者血液から調製した試料では、約１７０ｂ
ｐのＤＮＡの合成が認められたのに対し、カンジダ・グ
イルリエルモンデイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅ
ｒｍｏｎｄｉｉ）、及びクリプトコッカス・ネオフォル
マンス・バル・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ ｖａｒ．ｎｅｏｆｏｒ
ｍａｎｓ）に感染した患者血液から調製した試料では、
約１７０ｂｐのＤＮＡの合成は認められなかった。
確認》臨床検査試料からのＤＮＡ抽出は、血液を用いて
以下の方法に従って行った。１００μｌ中に１００ｍＭ
−ＫＣｌ、２０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
３）、５ｍＭ−ＭｇＣｌ2 、０．２ｍｇ／ｍｌゼラチ
ン、及び０．９％Ｔｗｅｅｎ２０となるように、各試薬
を溶解し、これに等量の患者血液を加えて、５５℃で６
０分間、ついで、９５℃で１０分間反応させた。遠心上
清をＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡとした。その鋳型ＤＮＡを
用い、前記実施例２及び３と同様の操作を繰り返した。
トリコスポロン・クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕ
ｍ）、トリコスポロン・ムコイデス（Ｔ．ｍｕｃｏｉｄ
ｅｓ）、トリコスポロン・アサヒイ・バル・アサヒイ
（Ｔ．ａｓａｈｉｉ ｖａｒ．ａｓａｈｉｉ）、トリコ
スポロン・アサヒイ・バル・コレミフォルミス（Ｔ．ａ
ｓａｈｉｉ ｖａｒ．ｃｏｒｅｍｉｆｏｒｍｉｓ）、ト
リコスポロン・アサヒイ・バル・ファエカリス（Ｔ．ａ
ｓａｈｉｉ ｖａｒ．ｆａｅｃａｌｉｓ）、トリコスポ
ロン・オボイデス（Ｔ．ｏｖｏｉｄｅｓ）、及びトリコ
スポロン・ドメスチクム（Ｔ．ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｍ）
に感染した患者血液から調製した試料では、約１７０ｂ
ｐのＤＮＡの合成が認められたのに対し、カンジダ・グ
イルリエルモンデイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅ
ｒｍｏｎｄｉｉ）、及びクリプトコッカス・ネオフォル
マンス・バル・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ ｖａｒ．ｎｅｏｆｏｒ
ｍａｎｓ）に感染した患者血液から調製した試料では、
約１７０ｂｐのＤＮＡの合成は認められなかった。
【００２６】
【発明の効果】本発明方法によれば、トリコスポロン属
菌種のＤＮＡに特異的な１対のオリゴヌクレオチドをプ
ライマーとして用いるので、トリコスポロン属菌種のＤ
ＮＡを特異的に増幅することができる。従って、トリコ
スポロン属菌種の感染症を、高精度で、迅速に、しかも
特異的に識別することができ、その結果を診断及び治療
に役立てることができる。
菌種のＤＮＡに特異的な１対のオリゴヌクレオチドをプ
ライマーとして用いるので、トリコスポロン属菌種のＤ
ＮＡを特異的に増幅することができる。従って、トリコ
スポロン属菌種の感染症を、高精度で、迅速に、しかも
特異的に識別することができ、その結果を診断及び治療
に役立てることができる。
【００２７】
【００２８】配列番号：１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列 AGAGGCCTAC CATGGTATCA 20
【００２９】配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列 TAAGACCCAA TAGAGCCCTA 20
【図１】実施例３にて行った電気泳動の結果を示す図面
に代わる写真である。
に代わる写真である。
Claims (2)
- 【請求項１】 配列表における配列番号１の配列で表さ
れる塩基配列の少なくとも１８塩基のオリゴヌクレオチ
ド部分を含有する第１のＤＮＡプライマー、及び配列表
における配列番号２の配列で表される塩基配列の少なく
とも２０塩基のオリゴヌクレオチド部分を含有する第２
のＤＮＡプライマーの組み合わせと、ＤＮＡポリメラー
ゼと、水性液体被検試料とを含む混合液をＤＮＡ増幅工
程にかけ、得られた反応液をＤＮＡ検査工程にかけるこ
とを特徴とする、トリコスポロン属に属する微生物の検
出方法。 - 【請求項２】 少なくとも請求項１に記載の第１のＤＮ
Ａプライマー及び第２のＤＮＡプライマーを含有するこ
とを特徴とする、トリコスポロン属に属する微生物の検
出用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10134650A JPH11309000A (ja) | 1998-04-28 | 1998-04-28 | トリコスポロン属菌種の特異的検出方法及び検出用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10134650A JPH11309000A (ja) | 1998-04-28 | 1998-04-28 | トリコスポロン属菌種の特異的検出方法及び検出用試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11309000A true JPH11309000A (ja) | 1999-11-09 |
Family
ID=15133340
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10134650A Pending JPH11309000A (ja) | 1998-04-28 | 1998-04-28 | トリコスポロン属菌種の特異的検出方法及び検出用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11309000A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002005936A (ja) * | 2000-06-26 | 2002-01-09 | Shino Test Corp | 酵素免疫測定法による測定試薬及び測定方法 |
-
1998
- 1998-04-28 JP JP10134650A patent/JPH11309000A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002005936A (ja) * | 2000-06-26 | 2002-01-09 | Shino Test Corp | 酵素免疫測定法による測定試薬及び測定方法 |
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